WO2002103003A1 - Lipid-modified enzymes, process for producing the same and biosensor - Google Patents

Lipid-modified enzymes, process for producing the same and biosensor Download PDF

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WO2002103003A1
WO2002103003A1 PCT/JP2002/005820 JP0205820W WO02103003A1 WO 2002103003 A1 WO2002103003 A1 WO 2002103003A1 JP 0205820 W JP0205820 W JP 0205820W WO 02103003 A1 WO02103003 A1 WO 02103003A1
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lipid
enzyme
modifying enzyme
biosensor
cholesterol
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PCT/JP2002/005820
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Yoshiko Miyamoto
Toshihiko Yoshioka
Shiro Nankai
Original Assignee
Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes

Definitions

  • the present invention provides a biosensor for quantifying a substrate (specific component) contained in a biological sample such as blood and urine, raw materials and products in the food industry, and a sample such as fruit juice with high accuracy, quickly and easily.
  • a biological sample such as blood and urine, raw materials and products in the food industry, and a sample such as fruit juice with high accuracy, quickly and easily.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. H03-220264 discloses that an electrode system is formed on an insulating substrate by a method such as screen printing, and a redox enzyme and an electron carrier are formed on the electrode system.
  • a biosensor obtained by forming a reaction layer containing (electron acceptor) is disclosed.
  • This biosensor determines the substrate concentration in a sample as follows. ⁇ First, a sample solution is dropped on a reaction layer of a biosensor, and the reaction layer is dissolved in the sample solution. Thereby, an enzymatic reaction proceeds between the substrate in the sample solution and the oxidoreductase in the reaction layer. After a certain period of time when the electron carrier is reduced due to this enzymatic reaction, a voltage is applied to the electrode of the sensor, and the reduced electron carrier is electrochemically oxidized. The substrate concentration in the sample solution can be determined.
  • a biosensor using a lipid-modifying enzyme is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-110313. Enzymes become insoluble in water and soluble in organic solvents by lipid modification, and are separated from water-soluble electron carriers. A reaction layer can be formed. As a result, a biosensor having quick and high storage reliability can be provided.
  • a conventional biosensor that does not use a lipid-modifying enzyme has the advantage that the reaction is started immediately when the sample solution is supplied because the enzyme and the electron carrier are present in the same reaction layer.
  • an enzyme is stored for a long time in a mixed state with a compound such as an electron carrier, its activity is reduced, and the response characteristics of the sensor are deteriorated.
  • Another problem is that an oxidation current value (blank value) can be obtained for a sample solution containing no substrate. Therefore, a configuration that separates the enzyme and the electron mediator into separate layers is conceivable. However, it is difficult to completely separate the enzyme and the electron mediator because both are soluble in water.
  • lipid-modifying enzyme As a method for producing a lipid-modifying enzyme, a method is known in which a lipid dispersion and an enzyme solution are mixed (ThinSolidFilms, 180, p65 (1989)). However, it is difficult to obtain a highly active lipid-modifying enzyme in high yield depending on the type of enzyme.
  • the present invention solves the above-mentioned problems while taking advantage of the biosensor of the conventional configuration, and has an object to provide a method for producing a highly active lipid-modifying enzyme in a high yield.
  • the present invention provides a biosensor that uses the lipid-modifying enzyme to provide high storage reliability, low response value (blank value) when the substrate concentration is 0, and high-precision quantification of the substrate. It also aims to provide. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a lipid-modifying enzyme comprising a lipid and glucose dehydrogenase, cholesterol oxidase or cholesterol esterase modified with the lipid.
  • the lipid is a cationic lipid.
  • the present invention also provides (1) a step of adding an enzyme to a medium containing lipids in the presence of an inorganic salt to form a complex of the lipid and the enzyme, and (2) precipitating the formed complex. And (3) a method for producing a lipid-modifying enzyme, comprising a step of separating and drying the precipitate to obtain a lipid-modifying enzyme.
  • the production method is particularly effective when the enzyme is glucose dehydrogenase, cholesterol oxidase or cholesterol esterase.
  • the inorganic salt is preferably at least one selected from the group consisting of chloride, bromide, iodide, phosphate, dalconate, acetate, sulfate and nitrate.
  • the lipid is a cationic lipid.
  • the lipid has the formula (1):
  • the counter ion X— in the formula (1) is preferably a chloride ion (C 1—) or a bromide ion (Br—).
  • the present invention comprises an electrically insulating substrate, an electrode system having a working electrode and a counter electrode formed on the substrate, and a reaction layer formed on or near the electrode system, wherein the reaction layer is A lipid and glucose dehydrogenase, cholesterol oxidase or Provided is a biosensor comprising: a layer containing a lipid-modifying enzyme composed of a sterol esterase; and a layer containing an electron carrier.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of a biosensor according to one embodiment of the present invention, from which a reaction layer is removed.
  • FIG. 2 is a schematic longitudinal sectional view of the biosensor shown in FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention relates to a lipid-modifying enzyme comprising a lipid and glucose dehydrogenase. Cholesterol oxidase or cholesterol esterase modified with the lipid.
  • the lipid is a cationic lipid.
  • the method for producing a lipid-modifying enzyme according to the present invention includes: (a) a step of adding an enzyme to a medium containing lipid in the presence of an inorganic salt to form a complex of the lipid and the enzyme; (b) (C) separating the precipitate and drying to obtain a lipid-modifying enzyme.
  • a cationic lipid (dialkyldimethylammonium salt) represented by the formula (1) is dispersed or dissolved in a medium to prepare a lipid dispersion or a lipid solution.
  • the medium used at this time include water, alcohols such as methanol, ethanol and butanol, ethers such as ethyl ether, organic solvents such as acetone, and buffers such as Tris buffer and Good buffer.
  • water is preferable, but when the organic solvent is used, the generated lipid-modifying enzyme does not dissolve, so that it can be easily separated from the medium.
  • an enzyme is added to the liquid (dispersion liquid or solution).
  • the mixing ratio of lipid and enzyme may be in the range of 1: 0.2 to 1: 5 by weight of lipid: enzyme. If the amount of the enzyme is less than this range, the amount of the enzyme may be insufficient and a sufficient binding reaction may not proceed. On the other hand, if the amount of the enzyme is larger than the above range, the amount of the lipid bound to the enzyme is reduced, so that all the enzymes cannot be modified with the lipid, and the proportion of the lipid-modified enzyme which is insoluble in water and can be precipitated is reduced. It will be.
  • Examples of enzymes modified by lipids in the present invention include dalco-soxidase, glucose dehydrogenase, lactate oxidase, lactate dehydrogenase, fructose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, cholesterol esterase. Rase, mutarotase, ymbeldase, ascorbate oxidase and alcohol oxidase.
  • the enzyme used in the present invention is glucose dehydrogenase, cholesterol oxidase or cholesterol esterase.
  • glucose dehydrogenase cholesterol oxidase
  • cholesterol esterase cholesterol esterase
  • an inorganic salt is added to the solution containing the enzyme and the lipid to improve the cationicity of the lipid, and the lipid and the enzyme are chemically bonded to form a complex of the lipid and the enzyme.
  • the addition amount of the inorganic salt may be about 5 to 500 mM, and is preferably the same as that of the lipid. If it is less than 5 mM, the effect of improving the cationicity of the lipid will be insufficient, while if it exceeds 50 O mM, the concentration of the salt in the obtained solution will be high. Too much, and cationic lipids precipitate.
  • the amount of the inorganic salt to be added is preferably 5 to 100 mM, more preferably 10 to 50 mM.
  • the greatest feature of the present invention resides in the addition of this inorganic salt.
  • the present inventors have found that the presence of the inorganic salt improves the cationicity of the lipid, facilitates the reaction with the enzyme, and facilitates the binding of the enzyme to the lipid.
  • the present inventors have found that the present invention has an effect of achieving the above, and have completed the present invention.
  • chloride salts bromide salts, iodide salts, phosphate salts, dalconate salts, and acetate salts are preferable because those having a high degree of dissociation and having a counter ion interacting with lipids are preferred. It is preferable to use at least one selected from the group consisting of sulfates and nitrates.
  • sodium chloride, potassium chloride, sodium dalconate, potassium dalconate, sodium phosphate, and potassium phosphate are preferred.
  • a buffer can be used.
  • the pH in this case is preferably 7.
  • the solution containing the complex of the enzyme and the lipid is kept at a low temperature to precipitate the complex of the lipid and the enzyme. Then, the precipitate is separated, washed with water, and dried to obtain a powdery lipid-modifying enzyme. Drying at this time is performed in an atmosphere at a temperature equal to or lower than room temperature, and it is effective to use a freeze-drying method.
  • the enzyme modified with the lipid thus obtained is soluble in organic solvents and insoluble in water. Therefore, when forming an enzyme layer on a biosensor.
  • a simple method is to dissolve the lipid-modifying enzyme in an organic solvent, drop it on or near the electrode of the substrate, and dry it.
  • the aqueous solution can be dropped at a predetermined place and dried to form a layer. Therefore, when each layer is formed by such a method, regardless of the order in which the layer containing the lipid-modifying enzyme and the layer containing the electron carrier are provided in any order, the enzyme and the electron carrier contained in each layer affect each other. It is possible to form a uniform layer without suffering from the problem.
  • the reaction layer of the biosensor of the present invention includes an electron carrier as described above.
  • electron carriers include ferricyanide salts, P-benzoquinone and its derivatives, phenazine methosulfate, methylene blue, and ferrocene and its derivatives.
  • the electron carrier one or more of these can be used, and it is particularly preferable to use a ferricyanide salt.
  • the reaction layer of the biosensor of the present invention may contain a hydrophilic polymer in addition to the enzyme and the electron carrier.
  • a hydrophilic polymer By adding a hydrophilic polymer to the reaction layer, the separation of the reaction layer from the substrate or the surface of the electrode system can be prevented.
  • the addition of the hydrophilic polymer also has the effect of preventing cracks on the surface of the reaction layer, and is therefore effective in increasing the reliability of the biosensor.
  • hydrophilic polymer examples include carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, ethylcellulose, ethylhydroxyethylcellulose, carboxymethylethylcellulose, and polyvinylpyrrolidone. , Polyvinyl alcohol, polyamino acids such as polylysine, polystyrene sulfonic acid, gelatin and its derivatives, acrylic acid or its derivatives, anhydrous maleic acid and its salts and polymers, and starch and its Derivatives and the like. In particular, carboxymethylcellulose is preferred.
  • a method for measuring the oxidation current there are a two-electrode method using only a measurement electrode and a counter electrode, and a three-electrode method including a reference electrode.
  • the three-electrode method enables more accurate measurement.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of an example of a biosensor according to the present invention from which a reaction layer has been removed.
  • Leads 2 and 3 are formed by printing a silver paste by screen printing on an electrically insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate. Further, on the substrate 1, a working electrode 4 made of a conductive carbon paste containing a resin binder and an electrode system containing a counter electrode 5, and an electric insulating layer 6 made of an electric insulating paste are formed by the same printing method.
  • the electric insulating layer 6 keeps the area of the exposed portion of the working electrode 4 and the counter electrode 5 constant and partially covers the lead.
  • the lead In addition to silver and carbon, platinum, gold, palladium, and the like can be used as the material of the lead and the electrode.
  • the lead In the case of a disposable type biosensor, the lead is made of silver paste and carbon paste is used. It is appropriate to form the electrode with.
  • FIG. 2 is a schematic longitudinal sectional view of the biosensor of the present invention shown in FIG. 1 having a reaction layer.
  • a first layer 7a containing an electron carrier is formed on an electrically insulating substrate 1 on which an electrode system is formed as shown in Fig. 1, and a second layer 7b containing enzymes is formed thereon.
  • a reaction layer 7 is formed.
  • This biosensor is assembled by combining an insulating substrate 1 made of polyethylene carbonate, a cover 9, and a spacer 18 sandwiched between the substrate 1 and the cover 9. These are adhered in a positional relationship as shown by a broken line in FIG. 1 to constitute the biosensor of the present invention.
  • the spacer 8 has a slit 10 forming a sample liquid supply path, and the cover 9 has an air hole 11.
  • a space serving as a sample liquid supply path is formed between the substrate 1 and the cover 9.
  • the open end of the slit 10 is a sample liquid supply port, and the end is connected to the air hole 11.
  • the force bar member can be formed by combining the cover 9 and the spacer 18 first, but a groove corresponding to the slit 10 is provided in a single member, and a single member is used.
  • the cover member may be used.
  • reaction layer does not necessarily need to be formed on the electrode system, but may be formed on a portion exposed in the sample liquid supply channel, and the sample liquid may be any structure that dissolves the reaction layer and reaches the electrode system. .
  • a glucose sensor having the structure shown in FIG. 1 was manufactured.
  • the amount of potassium ferricyanide contained in the first layer 7a was l mg per square centimeter.
  • a layer containing a lipid-modified enzyme was formed on the first layer 7a as follows.
  • the dispersion thus obtained was added to a pH 7 sodium phosphate buffer. (Inorganic salt) was added to 50 mM, and then glucose dehydrogenase (GDH) lOmg was dissolved. The obtained solution was cooled in an ice bath for 2 hours, and then cooled in a refrigerator for 24 hours to precipitate and precipitate a complex of lipid and enzyme.
  • Inorganic salt was added to 50 mM, and then glucose dehydrogenase (GDH) lOmg was dissolved.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • the precipitate was collected, washed with deionized water, and dried using a freeze dryer to obtain a powdery lipid-modifying enzyme.
  • the yield of the lipid-modifying enzyme was 80%, and the ratio of the enzyme protein in the lipid-modifying enzyme was 40% by weight.
  • the powder of the lipid-modifying enzyme was dissolved in toluene, and the solution was dropped on the first layer 7a and dried to form a second layer 7b.
  • the previously formed layer of potassium ferricyanide and the layer of lipid-modifying enzyme are formed in a completely separated state.
  • the amount of the lipid-modifying enzyme contained in the second layer 7b was 0.2 mg per square centimeter of the reaction layer.
  • a glucose sensor was manufactured by forming the first layer 7a containing potassium ferricyanide in the same manner as in Example 1.
  • a lipid-modifying enzyme was produced in the same manner as in Example 1.
  • Sodium dalconate was used as the inorganic salt to be present.
  • the yield of the lipid-modifying enzyme was 75%, and the ratio of the enzyme protein in the lipid-modifying enzyme was 45%.
  • the second layer 7b containing the lipid-modifying enzyme thus obtained was formed.
  • the amount of the lipid-modifying enzyme contained in the second layer 7b was 0.3 mg per square centimeter of the reaction layer. there were.
  • the sensor response current value for the glucose standard solution was measured in the same manner as in Example 1, and as a result, the response current value showed good linearity with respect to the glucose concentration.
  • the blank value was 0 A.
  • Table 1 shows the inorganic salts and enzymes used, the yield of the lipid-modifying enzyme, and the weight ratio of the enzyme protein in the lipid-modifying enzyme. Comparative Example 1
  • lipid-modifying enzyme was produced in the same manner as in Example 1.
  • the yield of lipid-modifying enzyme The rate was 5%.
  • a glucose sensor was prepared in the same manner as in Example 1, and the sensor response current value to the Darcos standard solution was measured. As a result, the response current value did not show good linearity with respect to the concentration of the glucose.
  • the blank value was 0.1 xA.
  • Table 1 shows the inorganic salts and enzymes used, the yield of the lipid-modifying enzyme, and the weight ratio of the enzyme protein in the lipid-modifying enzyme.
  • a first layer 7a containing potassium ferricyanide was formed as in Example 1, and a cholesterol sensor having the structure shown in FIG. 1 was produced.
  • lipid-modifying enzyme was produced in the same manner as in Example 1.
  • a sodium phosphate buffer solution at pH 7 was added to a concentration of 5 OmM.
  • the yield of the lipid-modifying enzyme was 82%, and the ratio of the enzyme protein in the lipid-modifying enzyme was 50% (Example 3).
  • cholesterol esterase (CE) is modified with lipids in a similar manner.
  • lipid dioctadecyldimethylammonium chloride
  • CE cholesterol Esterase
  • an inorganic salt to be present a sodium phosphate buffer solution of pH 7 was added to a concentration of 5 OmM. At this time, the yield of the lipid-modifying enzyme was 90%, and the ratio of the enzyme protein in the lipid-modifying enzyme was 48% (Example 4).
  • the powders of the two kinds of lipid-modifying enzymes thus obtained were dissolved in toluene, and the obtained solution was dropped on the first layer 7a and dried to form a second layer 7b.
  • the amount of the lipid-modifying enzyme contained in the second layer 7b was 0.5 mg cholesterol-loxidase and 0.2 mg cholesterol esterase per square centimeter of the reaction layer.
  • the response current value of the sensor to a sample solution containing cholesterol was measured.
  • the response current value showed a good linearity with respect to the cholesterol concentration.
  • the blank value was 0 A.
  • Table 2 shows the inorganic salts and enzymes used, the yield of the lipid-modifying enzyme, and the weight ratio of the enzyme protein in the lipid-modifying enzyme.
  • Example 3 As in Example 3, a first layer 7a containing potassium ferricyanide was formed, and a cholesterol sensor was produced.
  • lipid-modifying enzyme was produced in the same manner as in Example 1. In this case.
  • Existence As the inorganic salt to be used, 50 mM sodium chloride was used. At this time, the yield of the lipid-modifying enzyme was 78%, and the percentage of the enzyme protein in the lipid-modifying enzyme was 40% (Example 5).
  • cholesterol esterase (CE) was modified with lipids in the same manner to produce lipid-modifying enzymes.
  • 50 mM sodium chloride was used as the inorganic salt to be present.
  • the yield of the lipid-modifying enzyme was 75%, and the ratio of the enzyme protein in the lipid-modifying enzyme was 40% (Example 6).
  • a second layer 7b containing the enzyme was formed.
  • the amount of the lipid-modifying enzyme contained in the second layer 7b was 0.3 mg of cholesterol oxidase and 0.1 mg of cholesterol-leestella-se per square centimeter of the reaction layer.
  • the cholesterol sensor obtained in the same manner as in Example 3 was used to measure the sensor response current value for a sample solution containing cholesterol.
  • the response current value showed good linearity with respect to the cholesterol concentration.
  • the blank value was 0 A.
  • Table 2 shows the inorganic salts and enzymes used, the yield of the lipid-modifying enzyme, and the weight ratio of the enzyme protein in the lipid-modifying enzyme. Comparative Examples 3 and 4
  • a lipid-modifying enzyme was prepared in the absence of an inorganic salt.
  • a cholesterol esterase (CE) lipid-modifying enzyme was prepared in the same manner.
  • the yield is 5% in which was (Comparative Example 4) of lipid-modifying enzyme to t Table 2, inorganic salts and enzymes were used, the lipid-modifying enzyme yield, and the weight ratio of the enzyme protein in the lipid-modifying the enzyme showed that.
  • a mixed aqueous solution of potassium ferricyanide, cholesterol oxidase (ChO x) and cholesterol esterase (CE) was dropped and dried to form a reaction layer 7.
  • the amount of potassium ferricyanide contained in the reaction layer 7 was 1 square centimeter of the reaction layer.
  • the amount of (:) was 0.1 mg and the amount of CE was 0.5 mg.
  • the second layer was formed because a mixed layer of potassium ferricyanide and Ch ⁇ X was formed in the first layer. No layer was formed.
  • the response current value of the biosensor was measured in the same manner as in Examples 3 and 4. As a result, there was a certain correlation between the response current value and the cholesterol concentration, showing good linearity. This linearity was almost the same as that shown in Examples 3 and 4. However, the blank value was 1. ⁇ nA. The blank value of the biosensor using the lipid-modifying enzyme was 0 ⁇ A. Table 3 shows the response characteristics of a sensor using a lipid-modifying enzyme and a biosensor using an unmodified enzyme.
  • the lipid-modifying enzyme according to the present invention was prepared in the same manner as in Example 1, except that cholesterol oxidase (ChOx) was used as the enzyme and the inorganic salts shown in Table 4 were used. did.
  • ChoOx cholesterol oxidase
  • substrate (specific component) contained in the sample of biological samples, such as blood and urine, the raw material in food industry, and a product can be quantified with high precision quickly and easily.
  • the layer containing the water-soluble electron carrier and the layer containing the lipid-soluble lipid-modifying enzyme are separated and formed, they are not mixed with each other, and the resulting biosensor can be used for a long time. It can be stored effectively for a long time.

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Description

明 細 書 脂質修飾酵素およびその製造方法ならびにバイオセンサ 技術分野
本発明は、 血液および尿などの生体試料、 食品工業における原料およ び製品、 ならびに果汁などの試料に含まれる基質 （特定成分） を、 高精 度で、 迅速かつ容易に定量するためのバイォセンサに関する。 背景技術
生体試料および食品中の特定成分である基質を、 希釈および撹拌など を行うことなく簡易に定量し得るバイオセンサが提案されている。 その 一例として、 特開平 3 _ 2 0 2 7 6 4号公報には、 絶縁性基板上にスク リーン印刷などの方法によって電極系を形成し、 この電極系上に酸化還 元酵素および電子伝達体 （電子受容体） を含有する反応層を形成して得 られるバイォセンサが開示されている。
このバイォセンサは、 以下のようにして試料中の基質濃度を定量する < まず、 試料液をバイオセンサの反応層上に滴下し、 試料液に反応層を溶 解させる。 これにより、 試料液中の基質と反応層の酸化還元酵素との間 で酵素反応が進行する。 この酵素反応に伴い、 電子伝達体が還元される 一定時間後、 センサの電極に電圧を印加して、 この還元された電子伝達 体を電気化学的に酸化し、 このとき得られる酸化電流値から試料液中の 基質濃度を定量することができる。
また、 脂質修飾酵素を用いたバイオセンサが特開平 7 - 1 1 0 3 1 3 号公報に開示されている。 酵素は、 脂質修飾することによって、 水に不 溶、 有機溶媒に可溶となり、 水に可溶な電子伝達体とは分離した状態で 反応層を形成することができる。 このことにより、 迅速かつ高い保存信 頼性を持ったバイォセンサを提供することができる。
脂質修飾酵素を用いない従来の構成のバイオセンサでは、 酵素と電子 伝達体とが同一反応層中に存在するため、 試料液が供給されると速やか に反応が開始されるという利点がある。 しかし、 酵素は電子伝達体など の化合物と混在状態で長期間保存されると、 その活性が低下し、 センサ の応答特性が劣化するという問題がある。 さらに、 基質を含まない試料 液に対して酸化電流値 （ブランク値） が得られるという問題もある。 そこで、 酵素と電子伝達体を別々の層へ分離させる構成が考えられる, しかし、 酵素および電子伝達体はいずれも水溶性であるため、 完全な分 離状態にすることが困難である。
一方、 脂質修飾酵素の製造方法としては、 脂質分散液と酵素溶液を混 合する方法が知られている （Th i n So l i d F i lms, 180, p65 (1989) ) 。 し かし、 酵素の種類によっては高収率で高活性な脂質修飾酵素を得ること は困難である。
そこで、 本発明は、 従来構成のバイオセンサの利点を活かしつつ、 上 記のような問題点を解決するもので、 高活性の脂質修飾酵素を高収率で 得る製造方法を提供することを目的とする。
また、 本発明は、 その脂質修飾酵素を用いて、 保存信頼性が高く、 し かも基質濃度が 0の場合の応答値 （ブランク値） が低く、 基質を高精度 で定量することができるバイオセンサを提供することをも目的とする。 発明の開示
本発明は、 脂質と前記脂質で修飾されたグルコースデヒドロゲナーゼ, コレステロールォキシダ一ゼまたはコレステロールエステラーゼとで構 成される脂質修飾酵素に関する。 前記脂質はカチオン性脂質であるのが好ましい。
また、 本発明は、 （ 1) 無機塩の存在下で、 脂質を含む媒体に酵素を 添加して前記脂質と酵素の複合体を生成させる工程、 （ 2) 生成した前 記複合体を析出させる工程、 および （3) 前記析出物を分離して乾燥し て脂質修飾酵素を得る工程を有することを特徴とする脂質修飾酵素の製 造方法にも関する。
前記製造方法は、 前記酵素がグルコースデヒドロゲナーゼ、 コレステ ロールォキシダーゼまたはコレステロールエステラーゼである場合に特 に有効である。
また、 前記無機塩は、 塩化物塩、 臭化物塩、 ヨウ化物塩、 リン酸塩、 ダルコン酸塩、 酢酸塩、 硫酸塩および硝酸塩よりなる群から選択される 少なく とも 1種であるのが好ましい。
また、 前記脂質はカチオン性脂質であるのが好ましい。
前記脂質は、 式 （ 1 ) ：
CmH2m+l ,C H3
、N+ X"
CnH2n+i 、Ch
(式 （ 1 ) において、 mは 1 4〜 1 8の整数、 nは 1 4〜： 1 8の整数、 X C l—、 B r -、 I—、 H2P〇4—、 H S O 4—または N〇 3_) で表される カチオン性脂質 （ジアルキルジメチルアンモニゥム塩） であるのが好ま しい。 ここで、 式 （ 1 ) における対イオン X—は塩化物イオン （C 1—) ま たは臭化物イオン （B r—) であるのが好ましい。
さらに、 本発明は、 電気絶縁性の基板、 前記基板上に形成された作用 極および対極を有する電極系、 ならびに前記電極系上またはその近傍に 形成された反応層を具備し、 前記反応層が、 脂質と前記脂質で修飾され たグルコースデヒドロゲナーゼ、 コレステロールォキシダ一ゼまたはコ レステロールエステラーゼとで構成される脂質修飾酵素を含む層、 およ び電子伝達体を含む層とを具備することを特徴とするバイオセンサを提 供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の一実施例におけるバイオセンサの反応層を除いた分 解斜視図である。
図 2は、 図 1に示すバイオセンサの概略縦断面図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 脂質と前記脂質で修飾されたグルコースデヒドロゲナ一ゼ. コレステロールォキシダ一ゼまたはコレステロールエステラーゼとで構 成される脂質修飾酵素に関する。 前記脂質はカチオン性脂質であるのが 好ましい。
本発明に係る脂質修飾酵素の製造方法は、 （ a ) 無機塩の存在下で、 脂質を含む媒体に酵素を添加して前記脂質と酵素の複合体を生成させる 工程、 （b ) 生成した前記複合体を析出させる工程、 および （ c ) 前記 析出物を分離して乾燥して脂質修飾酵素を得る工程を有する。
まず、 工程 （ a ) において、 前記式 （ 1 ) で表されるカチオン性脂質 (ジアルキルジメチルアンモニゥム塩） を媒体に分散または溶解させ、 脂質分散液または脂質溶液を調製する。 このときに用いる媒体としては， 例えば水、 メタノール、 ェタノ一ルおよびブ夕ノールなどのアルコール, ェチルエーテルなどのエーテル、 アセトンなどの有機溶媒、 トリス緩衝 液、 グッドバッファーなどの緩衝液などが挙げられる。 なかでも水を用 いるのが好ましいが、 前記有機溶媒を用いると、 生成した脂質修飾酵素 が溶解しないため容易に媒体から分離することができる。 つぎに、 前記液 （分散液または溶液） に酵素を添加する。 このとき、 固体粉末状の酵素を添加する方法、 および酵素を含む液体を添加する方 法のいずれを用いてもよい。 ここで、 脂質および酵素の混合割合として は、 脂質 ： 酵素が重量比で 1 ： 0 . 2〜 1 ： 5の範囲であればよい。 酵 素がこの範囲よりも少ない場合、 酵素の量が不足し、 充分な結合反応が 進行しないおそれがある。 一方、 酵素が前記範囲より多く過剰な場合、 結合する脂質の量が少なくなり、 すべての酵素を脂質で修飾することが できず、 水に不溶で沈殿し得る脂質修飾酵素の割合が減ってしまうこと になる。
本発明において脂質によって修飾される酵素としては、 例えばダルコ —スォキシダ一ゼ、 グルコースデヒドロゲナーゼ、 乳酸ォキシダ一ゼ、 乳酸デヒドロゲナーゼ、 フルクトースォキシダーゼ、 コレステロ一ル才 キシダ一ゼ、 コレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼ、 コレステロールエステ ラーゼ、 ムタロタ一ゼ、 ィンベルダ一ゼ、 ァスコルビン酸ォキシダ一ゼ およびアルコールォキシダーゼなどが挙げられる。
なかでも、 本発明において用いる酵素は、 グルコースデヒドロゲナ一 ゼ、 コレステロールォキシダ一ゼまたはコレステロ一ルエステラーゼで あるのが有効である。 従来、 これらを脂質で修飾する場合には収率が充 分には高くなかったという問題があつたところ、 後述する無機塩を用い れば、 比較的高い収率で脂質修飾酵素が得られる。
そして、 この酵素と脂質を含む液に無機塩を添加し、 脂質のカチオン 性を向上させるとともに、 脂質と酵素を化学的に結合させて、 前記脂質 と酵素の複合体を生成させる。 無機塩の添加量は、 5〜 5 0 0 m M程度 であればよく、 好ましくは脂質と同量であるのがよい。 5 m M未満の場 合、 脂質のカチオン性を向上させるという効果が不充分になってしまう, 一方、 5 0 O m Mを超える場合、 得られる溶液における塩の濃度が高く なり過ぎ、 カチオン性脂質が析出してしまう。
前記無機塩の添加量は、 さらに 5〜 1 0 0 m Mであるのが好ましく、 1 0〜 5 O m Mであるのが特に好ましい。
ここで、 本発明の最大の特徴は、 この無機塩を添加することにある。 本発明者らは、 前記無機塩の存在により前記脂質のカチオン性が向上し て酵素との反応が進行し易くなり、 酵素と脂質が結合し易くなるため、 脂質修飾酵素としての沈殿が生じ易くなるという効果を有することを見 出し、 本発明を完成するに至ったのである。
このような無機塩としては、 解離度が高く、 対イオンが脂質と相互作 用するものが好ましいという理由から、 塩化物塩、 臭化物塩、 ヨウ化物 塩、 リン酸塩、 ダルコン酸塩、 酢酸塩、 硫酸塩および硝酸塩よりなる群 から選択される少なくとも 1種を用いるのが好ましい。
具体的には、 塩化ナトリウム、 塩化カリウム、 臭化カリウム、 リン酸 カリウム、 ダルコン酸ナトリウム、 ダルコン酸カリウム、 酢酸ナトリウ ム、 硫酸ナトリウム、 硫酸カリウム、 硝酸ナトリウム、 リン酸ナトリウ ム、 リン酸カリウムなどが挙げられる。
なかでも、 塩化ナトリウム、 塩化カリウム、 ダルコン酸ナトリウム、 ダルコン酸カリウム、 リン酸ナトリウム、 およびリン酸カリウムが好ま しい。 特にリン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムについては、 緩衝液 を用いることができる。 この場合の p Hは 7であるのが好ましい。
ついで、 この酵素および脂質の複合体を含む液を低温に保ち、 脂質と 酵素の複合体を析出させる。 そして、 析出物を分離して水で洗浄した後. 乾燥させて粉末状の脂質修飾酵素を得る。 このときの乾燥は常温以下の 温度雰囲気下で行い、 好ましくは凍結乾燥法を用いるのが有効である。
このようにして得られる脂質で修飾された酵素は、 有機溶媒に可溶で. 水に不溶となる。 そのため、 バイオセンサに酵素の層を形成する際には. 脂質修飾酵素を有機溶媒に溶解して基板の電極上またはその近傍に滴下 して乾燥させる方法が簡便である。
一方、 水溶性の電子伝達体は、 その水溶液を所定の場所に滴下し、 乾 燥して層を形成することができる。 したがって、 このような方法により , 各層を形成すると、 脂質修飾酵素を含む層および電子伝達体を含む層を いずれの順序で設けても、 それぞれの層に含まれる酵素および電子伝達 体が互いの影響を受けることなく、 均一な層を形成することが可能であ る。
本発明のバイオセンサの反応層は、 前述のように電子伝達体を含む。 電子伝達体としては、 フェリシアン化物塩、 P—べンゾキノンおよびそ の誘導体、 フエナジンメトサルフエ一ト、 メチレンブルー、 ならびにフ エロセンおよびその誘導体などが挙げられる。 電子伝達体としては、 こ れらの 1種または 2種以上を用いることができるが、 特に、 フェリシア ン化物塩を用いることが好ましい。
本発明のバイォセンサの反応層には、 上記酵素や電子伝達体の他に、 親水性高分子を含有させてもよい。 反応層中に親水性高分子を添加する ことにより、 基板または電極系表面からの反応層の剥離を防ぐことがで きる。 親水性高分子の添加は、 反応層表面の割れを防ぐ効果も有してい るから、 バイォセンサの信頼性を高めるのに効果的である。
このような親水性高分子としては、 例えばカルボキシメチルセルロー ス、 ヒドロキシェチルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 メ チルセルロース、 ェチルセルロース、 ェチルヒドロキシェチルセルロー ス、 カルボキシメチルェチルセルロース、 ポリビニルピロリ ドン、 ポリ ビニルアルコール、 ポリリジンなどのポリアミノ酸、 ポリスチレンスル ホン酸、 ゼラチンおよびその誘導体、 アクリル酸またはその誘導体、 無 水マレイン酸およびその塩および重合体、 ならびにスターチおよびその 誘導体などが挙げられる。 特に、 カルボキシメチルセルロースが好まし い。
酸化電流の測定方法としては、 測定極と対極のみの二電極方式と、 参 照電極を加えた三電極方式があり、 三電極方式の方が、 より正確な測定 が可能である。
ここで、 図 1は、 本発明によるバイオセンサの一例の反応層を取り除 いた分解斜視図である。 ポリエチレンテレフタレ一トからなる電気絶縁 性の基板 1の上に、 スクリ一ン印刷によって銀ペーストを印刷してリ一 ド 2および 3を形成する。 さらに基板 1上には、 同様の印刷法により、 樹脂バインダ一を含む導電性カーボンペーストからなる作用極 4および 対極 5を含む電極系、 ならびに電気絶縁性ペーストからなる電気絶縁層 6を形成する。
電気絶縁層 6は作用極 4および対極 5の露出部分の面積を一定とし、 かつリ一ドを部分的に覆っている。
上記リ一ドおよび電極の材料としては、 銀およびカーボン以外にも、 白金、 金およびパラジウムなどを用いることができるが、 使い捨てタイ プのバイオセンサでは、 銀ペーストでリードを構成し、 カーボンペース トで電極を構成するのが適当である。
図 2は、 反応層を具備する図 1に示す本発明のバイオセンサの縦断面 略図である。 図 1のようにして電極系を形成した電気絶縁性の基板 1上 に、 電子伝達体を含む第一の層 7 aを形成し、 その上に酵素類を含む第 2の層 7 bを形成することにより反応層 7を形成する。
このバイオセンサは、 ポリエチレンカーボネートからなる絶縁性基板 1、 カバー 9、 ならびに基板 1およびカバ一 9の間に挟まれるスぺーサ 一 8を組み合わせることによって組み立てる。 これらを、 図 1中の破線 で示すような位置関係で接着し、 本発明のバイオセンサを構成する。 スぺ—サー 8には、 試料液供給路を形成するスリッ ト 1 0が形成され, カバ一 9には空気孔 1 1が形成されている。 基板 1、 カバー 9およびス ぺ一サ一 8を図 1に示したように接着すると、 基板 1 とカバー 9との間 に試料液供給路となる空間部が形成される。 この空間部はスリツ ト 1 0 の解放端部が試料液供給口となり、 終端部は空気孔 1 1につながる。
ここで、 まずカバー 9とスぺ一サ一 8を組み合わせることによって力 バー部材を構成することもできるが、 単一の部材にスリッ ト 1 0に相当 する溝を設けて、 単一の部材で前記カバ一部材とすることもできる。
また、 反応層は必ずしも電極系上に形成する必要はなく、 試料液供給 路内に露出する部分に形成すればよく、 試料液は反応層を溶解して電極 系上に達する構成であればよい。
以下に、 具体的な実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、 本発明 はこれらのみに限定されるものではない。 実施例 1
本実施例においては図 1に示す構造を有するグルコースセンサを作製 した。 まず、 図 1の基板 1の電極系上に、 フェリシアン化カリウムの水 溶液を滴下し、 乾燥させて第 1の層 7 aを形成した。 この第 1の層 7 a 内に含まれるフェリシアン化カリウムの量は 1平方センチメ一トルあた り l m gであった。
つぎに、 第 1の層 7 aの上に、 以下のようにして、 脂質で修飾した酵 素を含む層を形成した。 まず、 脂質修飾酵素を以下の方法で作製した。 式 （ 1 ) において m = 1 8、 n = 1 8で表される脂質 （ジォクタデシル ジメチルアンモニゥムクロライド） 1 0 m gと脱イオン水 1 0 m l を混 合し、 超音波洗浄機を用いて脂質を脱イオン水に分散させた。
このようにして得られた分散液に、 p H 7のリン酸ナトリゥム緩衝液 (無機塩） を 5 0 mMになるように添加したのち、 グルコースデヒドロ ゲナ一ゼ （GDH) l Omgを溶解させた。 得られた溶解液を、 氷浴中 で 2時間冷却した後、 24時間冷蔵庫にて冷却し、 脂質と酵素の複合体 を析出、 沈殿させた。
この沈殿物を分取し、 脱イオン水で洗浄した後に、 凍結乾燥機を用い て乾燥させ、 粉末状の脂質修飾酵素を得た。 この際の脂質修飾酵素の収 率は 8 0 %であり、 脂質修飾酵素中の酵素蛋白質の割合は重量比で 4 0 %であった。
つぎに、 脂質修飾酵素の粉末をトルエンに溶解し、 その溶液を前記第 1の層 7 a上に滴下し乾燥させ、 第 2の層 7 bを形成した。 このとき、 先に形成したフェリシアン化力リウムの層と脂質修飾酵素の層は完全に 分離した状態で形成される。 この第 2の層 7 bに含まれる脂質修飾酵素 の量は、 反応層 1平方センチメートルあたり 0. 2mgであった。
グルコースを含む試料液が反応層 7に供給されると、 試料液内のダル コ一スは、 GDHによって酸化される。 そして、 これと同時に反応層中 の電子伝達体が還元される。 続いて、 試料液を供給して 1分後に対極 5 に対して作用極 4に + 0. 5 Vの電圧を印加して電子伝達体の還元体を 酸化した。
そして、 5秒後の電流値を測定した。 この電流値は、 生成した電子伝 達体の濃度、 すなわち試料液中の基質濃度に比例するので、 この電流値 を測定することにより、 試料液のグルコース濃度を求めることができた, つぎに、 Omg/d l、 1 8 0mg/d l、 3 6 0mg/d lおよび 5 4 O mgZd 1 のグルコース濃度の試料を用意し、 それぞれに対する センサの応答電流値を測定した結果、 応答電流値とグルコース濃度との 間には表 1に示したような一定の相関性があり、 良好な直線性を示した, また、 ブランク値は 0 Aであった。 表 1に、 用いた無機塩および酵素、 脂質修飾酵素の収率、 および脂質 修飾酵素中における酵素蛋白質の重量割合を示した。 実施例 2
本実施例では、 実施例 1と同様にフェリシアン化カリウムを含む第 1 の層 7 aを形成してグルコースセンサを作製した。
まず、 実施例 1 と同様の方法で脂質修飾酵素を作製した。 この場合、 式 （ 1 ) において m= 1 8、 n = 1 8で表される脂質 （ジォクタデシル ジメチルアンモニゥムクロライ ド） 1 0 m gと脱イオン水 1 0 m 1、 そ して、 GDH l O mgを用いた。 存在させる無機塩としてはダルコン酸 ナトリウムを用いた。 このとき、 脂質修飾酵素の収率は 7 5 %であり、 脂質修飾酵素中の酵素蛋白質の割合は 4 5 %であった。
このようにして得られた脂質修飾酵素を含む第 2の層 7 bを形成した < この第 2の層 7 bに含まれる脂質修飾酵素の量は、 反応層 1平方センチ メートルあたり 0. 3mgであった。
実施例 1 と同様の方法でグルコース標準液に対するセンサ応答電流値 を測定した結果、 応答電流値はグルコース濃度に対し良好な直線性を示 した。 また、 ブランク値は 0 Aであった。
表 1に、 用いた無機塩および酵素、 脂質修飾酵素の収率、 および脂質 修飾酵素中における酵素蛋白質の重量割合を示した。 比較例 1
本比較例では、 実施例 1 と同様の方法で脂質修飾酵素を作製した。 こ の場合、 式 （ 1 ) において m= 1 8、 n= 1 8で表される脂質 （ジォク 夕デシルジメチルアンモニゥムク口ライ ド） 1 0mgと脱イオン水 1 0 m l、 そして、 GDH l Omgを用いた。 このとき、 脂質修飾酵素の収 率は 5 %であった。
また、 実施例 1 と同様の方法でグルコースセンサを作製し、 ダルコ一 ス標準液に対するセンサ応答電流値を測定した結果、 応答電流値はダル コース濃度に対して良好な直線性を示さなかった。 また、 ブランク値は 0. 1 xAであった。
表 1に、 用いた無機塩および酵素、 脂質修飾酵素の収率、 および脂質 修飾酵素中における酵素蛋白質の重量割合を示した。
Figure imgf000014_0001
実施例 3および 4
本実施例においては、 実施例 1 と同様にフェリシアン化カリウムを含 む第 1の層 7 aを形成し、 図 1に示す構造を有するコレステロールセン サを作製した。
つぎに、 実施例 1と同様の方法で脂質修飾酵素を作製した。 この場合. 式 （ 1 ) において m= 1 8、 n= 1 8で表される脂質 （ジォクタデシル ジメチルアンモニゥムクロライ ド） 1 0 m gと脱イオン水 1 0 m 1、 そ して、 コレステロールォキシダ一ゼ （C h〇 x) 1 O mgを用いた。 存 在させる無機塩として、 pH 7のリン酸ナトリウム緩衝液を 5 O mMに なるように添加した。 このとき、 脂質修飾酵素の収率は 8 2 %であり、 脂質修飾酵素中の酵素蛋白質の割合は 5 0 %であった （実施例 3 ) 。 一方、 同様の方法でコレステロールエステラーゼ （C E) を脂質で修 飾して脂質修飾酵素を作製した。 この場合、 式 （ 1 ) において m= 1 8、 n = 1 8で表される脂質 （ジォクタデシルジメチルアンモニゥムクロラ イ ド） 1 0 mgと脱イオン水 1 0 m 1、 そして、 コレステロールエステ ラ一ゼ （C E) 1 0 m gを用いた。 存在させる無機塩として、 p H 7の リン酸ナトリゥム緩衝液を 5 OmMになるように添加した。 このとき、 脂質修飾酵素の収率は 9 0 %であり、 脂質修飾酵素中の酵素蛋白質の割 合は 4 8 %であった （実施例 4) 。
このようにして得た 2種類の脂質修飾酵素の粉末をトルエンに溶解し、 得られた溶液を前記第 1の層 7 a上に滴下して乾燥させ、 第 2の層 7 b を形成した。 この第 2の層 7 bに含まれる脂質修飾酵素の量は、 反応層 1平方センチメートルあたりコレステロ一ルォキシダ一ゼ 0. 5 m g、 コレステロールエステラーゼ 0. 2mgであった。
また、 得られたコレステロールセンサを用い、 コレステロールを含む 試料液に対するセンサ応答電流値を測定した結果、 応答電流値はコレス テロール濃度に対して良好な直線性を示した。 またブランク値は 0 A であった。
表 2に、 用いた無機塩および酵素、 脂質修飾酵素の収率、 および脂質 修飾酵素中における酵素蛋白質の重量割合を示した。
実施例 5および 6
本実施例においては、 実施例 3と同様に、 フェリシアン化カリウムを 含む第 1の層 7 aを形成し、 コレステロールセンサを作製した。
つぎに、 実施例 1と同様の方法で脂質修飾酵素を作製した。 この場合. 式 （ 1 ) において m= 1 8、 n = 1 8で表される脂質 （ジォクタデシル ジメチルアンモニゥムクロライ ド） 1 0 mgと脱イオン水 1 0 m 1、 そ して、 コレステロールォキシダーゼ （C h〇 x) 1 O mgを用いた。 存 在させる無機塩として、 5 0 mM塩化ナトリウムを用いた。 このとき、 脂質修飾酵素の収率は 7 8 %であり、 脂質修飾酵素中の酵素蛋白質の割 合は 4 0 %であった （実施例 5) 。
一方、 同様の方法でコレステロールエステラーゼ （C E) を脂質で修 飾して脂質修飾酵素を作製した。 この場合、 式 （ 1 ) において m= 1 8. n = 1 8で表される脂質 （ジォクタデシルジメチルアンモニゥムク口ラ イ ド） 1 0 m gと脱イオン水 1 0 m 1、 そして、 コレステロールエステ ラーゼ （C E) 1 0 m gを用いた。 存在させる無機塩として、 5 0mM 塩化ナトリウムを用いた。 このとき、 脂質修飾酵素の収率は 7 5 %であ り、 脂質修飾酵素中の酵素蛋白質の割合は 4 0 %であった （実施例 6 ) , このようにして得た 2種類の脂質修飾酵素を含む第 2の層 7 bを形成 した。 この第 2の層 7 bに含まれる脂質修飾酵素の量は、 反応層 1平方 センチメートルあたりコレステロールォキシダーゼ 0. 3 m g、 コレス テロ一 レエステラ一セ 0. l mgであった。
また、 実施例 3と同様にして得たコレステロールセンサを用い、 コレ ステロールを含む試料液に対するセンサ応答電流値を測定した結果、 応 答電流値はコレステロール濃度に対して良好な直線性を示した。 また、 ブランク値は 0 Aであった。
表 2に、 用いた無機塩および酵素、 脂質修飾酵素の収率、 および脂質 修飾酵素中における酵素蛋白質の重量割合を示した。 比較例 3および 4
ここでは、 無機塩の非存在下で脂質修飾酵素を作製した。 この場合、 式 （ 1 ) において m= 1 8、 n = 1 8で表される脂質 （ジォクタデシル ジメチルアンモニゥムクロライ ド） 5mgと脱イオン水 1 0m l、 そし て、 コレステロールォキシダーゼ （C h〇 X ) 1 0mgを用いた。 この とき、 脂質修飾酵素は生成しなかった （比較例 3) 。
一方、 同様の方法でコレステロールエステラーゼ （C E) の脂質修飾 酵素を作製した。 ここで、 式 （ 1 ) において m= 1 8、 n = 1 8で表さ れる脂質 （ジォクタデシルジメチルアンモニゥムクロライ ド） 1 Omg と脱イオン水 1 0m l、 そして、 コレステロールエステラーゼ 1 0 m g を用いた。 このとき、 脂質修飾酵素の収率は 5 %であった （比較例 4) t 表 2に、 用いた無機塩および酵素、 脂質修飾酵素の収率、 および脂質 修飾酵素中における酵素蛋白質の重量割合を示した。
表 2
Figure imgf000017_0001
比較例 5
ここでは、 実施例 3および 4に示した脂質修飾酵素の脂質修飾の効果 を確認するために、 脂質修飾をしていない酵素を用いたバイオセンサの 応答性とブランク値を評価した。
図 1の基板 1の電極系上に、 フェリシアン化カリウムとコレステロ一 ルォキシダーゼ （C h O x) とコレステロールエステラーゼ （C E) の 混合水溶液を滴下し乾燥させて反応層 7を形成した。 この反応層 7に含 まれるフェリシアン化カリゥムの量は反応層 1平方センチメートルあた り l mgであり、 （： 11〇 量は0. l mg、 C E量は 0. 5mgであつ た。 第 1の層にフェリシアン化カリウムと C h〇 Xの混合層を形成した ため、 第 2の層は形成しなかった。
つぎに、 実施例 3および 4と同様の方法でバイォセンサの応答電流値 を測定した。 その結果、 応答電流値とコレステロール濃度との間には一 定の相関性があり、 良好な直線性を示した。 この直線性は実施例 3およ び 4で示したものとほぼ同じであった。 しかしブランク値は 1. ί n A であった。 脂質修飾酵素を用いたバイォセンサのブランク値は 0 ^ Aで あった。 脂質修飾酵素を用いたセンサと未修飾酵素を用いたバイオセン サの応答特性を表 3に示した。
表 3
Figure imgf000018_0001
実施例 7〜 1 2
本実施例においては、 コレステロールォキシダーゼ （C h O x) を酵 素として用い、 表 4に示す無機塩を用いた他は、 実施例 1 と同様の方法 により本発明に係る脂質修飾酵素を作製した。
そして、 脂質修飾酵素の生成、 すなわち沈殿に最適な無機塩の添加量. および脂質修飾酵素の収率を求めた。 結果を表 4に示した。 表 4
Figure imgf000019_0001
なお、 上記実施例においては、 グルコースデヒドロゲナ一ゼを酵素と して用いたグルコースセンサと、 コレステロ一ルォキシダ一ゼおよびコ レステロールエステラーゼを用いたコレステロ一ルセンサとについて説 明したが、 その他の酵素を用いたグルコースセンサ、 乳酸センサ、 コレ ステロ一ルセンサ、 果糖センサ、 しょ糖センサ、 アルコールセンサおよ びァスコルビン酸センサなどのセンサ、 ならびにそれぞれに用いられる 酵素についても同様の結果が得られた。 産業上の利用の可能性
本発明に係るバイオセンサによれば、 血液、 尿などの生体試料、 食品 工業における原料、 製品などの試料中に含まれる基質 （特定成分） を高 精度で、 迅速かつ容易に定量し得る。 特に、 水溶性の電子伝達体を含む 層と脂溶性の脂質修飾酵素を含む層とが分離されて形成および保持され ているため、 両者が互いに混合することがなく、 得られるバイオセンサ は長期間にわたつて有効に保存することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 脂質と前記脂質で修飾されたグルコースデヒドロゲナーゼ、 コレス テロールォキシダーゼまたはコレステロールエステラーゼとで構成され る脂質修飾酵素。
2 . 前記脂質がカチオン性脂質である請求の範囲第 1項記載の脂質修飾
3 . ( 1 ) 無機塩の存在下で、 脂質を含む媒体に酵素を添加して前記脂 質と酵素の複合体を生成させる工程、 （ 2 ) 前記複合体を析出させるェ 程、 および （ 3 ) 前記析出物を分離して乾燥して脂質修飾酵素を得るェ 程を有する脂質修飾酵素の製造方法。
4 . 前記酵素が、 グルコースデヒドロゲナーゼ、 コレステロールォキシ ダーゼまたはコレステロールエステラ一ゼである請求の範囲第 3項記載 の脂質修飾酵素の製造方法。
5 . 前記無機塩が、 塩化物塩、 臭化物塩、 ヨウ化物塩、 リン酸塩、 ダル コン酸塩、 酢酸塩、 硫酸塩および硝酸塩よりなる群から選択される少な くとも 1種である請求の範囲第 3項記載の脂質修飾酵素の製造方法。
6 . 前記脂質がカチオン性脂質である請求の範囲第 3項記載の脂質修飾 酵素の製造方法。
7 . 電気絶縁性の基板、 前記基板上に形成された作用極および対極を有 する電極系、 ならびに前記電極系上またはその近傍に形成された反応層 を具備し、
前記反応層が、 脂質と前記脂質で修飾されたグルコースデヒドロゲナ —ゼ、 コレステロールォキシダ一ゼまたはコレステロールエステラーゼ とで構成される脂質修飾酵素を含む層、 および電子伝達体を含む層とを 具備するバイオセンサ。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112723367A (zh) * 2019-10-28 2021-04-30 中石化南京化工研究院有限公司 环保型钻井液用有机膨润土的制备方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4839451B2 (ja) * 2006-02-02 2011-12-21 国立大学法人東京海洋大学 バイオセンサとその製造方法
JP4083213B2 (ja) 2006-07-13 2008-04-30 松下電器産業株式会社 電気化学的免疫測定チップ
WO2011087033A1 (ja) * 2010-01-14 2011-07-21 グンゼ株式会社 バイオセンサー

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6480282A (en) * 1987-09-22 1989-03-27 Nippon Oils & Fats Co Ltd Nonaqueous highly active enzyme
JPH07110313A (ja) * 1993-10-08 1995-04-25 Matsushita Electric Ind Co Ltd バイオセンサおよびその製造法
JPH07255478A (ja) * 1994-03-25 1995-10-09 Mitsui Saitetsuku Kk 酵素の固定化方法ならびに固定化酵素

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6480282A (en) * 1987-09-22 1989-03-27 Nippon Oils & Fats Co Ltd Nonaqueous highly active enzyme
JPH07110313A (ja) * 1993-10-08 1995-04-25 Matsushita Electric Ind Co Ltd バイオセンサおよびその製造法
JPH07255478A (ja) * 1994-03-25 1995-10-09 Mitsui Saitetsuku Kk 酵素の固定化方法ならびに固定化酵素

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112723367A (zh) * 2019-10-28 2021-04-30 中石化南京化工研究院有限公司 环保型钻井液用有机膨润土的制备方法

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