WO2002092618A1 - 17alpha-hydroxy-4-androsten-3-on und dessen 14, 15-methylen-derivate - Google Patents

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WO2002092618A1
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androsten
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Jens Berlau
Wolfgang Römer
Gerhard Schreiber
Michael Oettel
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Schering Ag
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    • C07J1/0014—Androstane derivatives substituted in position 17 alfa, not substituted in position 17 beta
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    • C07J53/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by condensation with a carbocyclic rings or by formation of an additional ring by means of a direct link between two ring carbon atoms, including carboxyclic rings fused to the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton are included in this class
    • C07J53/002—Carbocyclic rings fused
    • C07J53/004—3 membered carbocyclic rings

Definitions

  • the invention relates to 17 ⁇ -hydroxy-4-androsten-3-one and derivatives, processes for their preparation and medicaments containing these compounds.
  • testosterone and follicle-stimulating hormone are important endocrine regulatory components of spermatogenesis. Since germ cells themselves have no receptors for FSH, hormone-like signals must be transferred via Sertoli cells, which produce unknown signals necessary for spermatogenesis (de Kretser DM et al., Hum. Reprod., 1998, 13, 1-8 ). The regulation of the FSH concentration takes place via inhibin B (negative feedback), which is released by the Sertoli cells. Inhibin B itself inhibits FSH secretion and thus suppresses spermatogenesis. Therefore, inhibin B is also considered a marker of spermatogenesis (Pierik FH et al., J. Clin.
  • Epitestosterone an androgen secreted in testes, has long been considered an inactive epimer of testosterone. In recent years, however, it has been found that it acts on the plasma FSH level in a dose-dependent manner, either inhibiting or increasing (Bicikova M. et al., J. Steroid. Biochem. Mol. Biol., 1993, 45, 321-324) . In this context, epitestosterone is described as a competitive inhibitor of androgen receptors (anti-androgen) (Lapcik O. et al., J. Endocrinol., 1994, 143, 353-358; Starka L. et al., Vnitr. Lek., 1996, 42, 620-623).
  • the invention lies inter alia. the task is to provide known and new compounds with high effectiveness for contraceptive use and hormone replacement therapy in men.
  • the radicals R independently of one another each represent a hydrogen atom or a radical OR2, the radicals R 2 independently of one another each being hydrogen atoms, saturated or unsaturated, straight-chain or branched alkyl or acyl groups having 1 to 6 carbon atoms, Ri denotes a saturated or unsaturated, straight-chain or branched acyl group with 1 to 18 carbon atoms, a benzoyl, methylbenzoyl or alkylbenzoyl group with up to 10 carbon atoms, a sulfite or a glucuronyl radical and the radicals R 'each represent a hydrogen atom or together with the single bond between Cn and C- ⁇ 2 form a double bond and their pharmaceutically acceptable salts.
  • R-i is an undecanoyl, lauroyl, tri-decanoyl, myristoyl, pentadecanoyl, palmitoyl, acetyl, caproyl, benzoyl, valeroyl, sulfite or glucuronyl radical.
  • the compounds of general formula I according to the invention can be administered in free form or in the form of a pharmacologically active salt.
  • Suitable examples of these salts of the compounds of the general formula I include acid addition salts using customary physiologically compatible inorganic and organic acids, such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, sulfuric acid, oxalic acid, maleic acid, fumaric acid, lactic acid, tartaric acid, malic acid, citric acid, salicylic acid, Adipic acid and benzoic acid.
  • Other acids that can be used are described, for example, in Progress in Pharmaceutical Research, vol. 10, pages 224-225, Birkhäuser Verlag, Basel and Stuttgart, 1966, and Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 66, pages 1-5 (1977).
  • the acid addition salts are generally prepared in a manner known per se by mixing the free base or its solutions with the corresponding acid or their solutions in an organic solvent, for example a lower alcohol such as methanol, ethanol, n-propanol or isopropanol or a lower one Ketone such as acetone, methyl ethyl ketone or methyl isobutyl ketone or an ether such as diethyl ether, tetrahydrofuran or dioxane. Mixtures of the solvents mentioned can also be used for better crystal deposition.
  • physiologically acceptable aqueous solutions of acid addition salts of the compound of formula I can be prepared in an aqueous acid solution.
  • the acid addition salts of the compounds of general formula I can in a conventional manner, for. B. with alkalis or ion exchangers, are converted into the free base. Further salts can be obtained from the free base by reaction with inorganic or organic acids, in particular those which are suitable for forming therapeutically usable salts. These or other salts of the new compound, e.g. the picrate can also be used to purify the free base by converting the free base into a salt, separating it and releasing the base from the salt.
  • novel derivatives of 17-hydroxy-4-androsten-3-one according to the invention are partially synthesized (see Tetrahedron Lett. 35, 2329 (1994)).
  • 14,15-unsaturated 17 ⁇ -hydroxy-4-androsten-3-one is reacted with dihalomethanes and a zinc-copper pair or diazomethane and zinc iodide to give corresponding 14 ⁇ , 15 ⁇ -methylene-17 ⁇ -ols.
  • the synthesis of the derivatives according to the invention containing a 14.15-methylene group is carried out with knowledge of the chemical reactions according to the patent DE 42 39 946.
  • the procedure can also be as follows: To maintain an existing 17-oxo group, the reaction is carried out to Ethylene ketal.
  • the 17-oxosteroids present are reduced at -10 to + 10 ° C. using complex metal hydrides or diborane in a solution of tetrahydrofuran.
  • the introduction of various substituents, e.g. B. in 11- or 12-position, also takes place in a partially synthetic way. Accordingly, a corresponding oxygen function is carried out in the molecule by adding cerium (IV) ammonium nitrate (see Terahedron Lett. 35, 8599 (1994)).
  • the present invention also relates to pharmaceutical preparations for oral, parenteral, topical, rectal, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, intrabuccal or sublinual application which, in addition to conventional carriers and diluents, contain at least one compound of the general formula I or whose acid addition salt contain as an active ingredient.
  • the medicaments of the invention are produced in a known manner with the customary solid or liquid carriers or diluents and the commonly used pharmaceutical-technical auxiliaries in accordance with the desired type of application with a suitable dosage.
  • the preferred preparations are in a dosage form which is suitable for oral administration.
  • dosage forms are, for example, tablets, film-coated tablets, dragees, capsules, pills, powders, solutions or suspensions or depot forms.
  • parenteral preparations such as injection solutions are also suitable. Suppositories may also be mentioned as preparations.
  • Corresponding tablets can be prepared, for example, by mixing the active ingredient with known auxiliaries, for example inert diluents such as dextrose, sugar, sorbitol, mannitol, polyvinylpyrrolidone, disintegrants such as corn starch or alginic acid, binders such as starch or gelatin, lubricants such as magnesium stearate or talc and / or agents Achieving a depot effect such as carboxyl polymethylene, carboxylmethyl cellulose, cellulose acetate phthalate or polyvinyl acetate can be obtained.
  • auxiliaries for example inert diluents such as dextrose, sugar, sorbitol, mannitol, polyvinylpyrrolidone, disintegrants such as corn starch or alginic acid, binders such as starch or gelatin, lubricants such as magnesium stearate or talc and / or agents Achieving a depot effect such
  • Coated tablets can accordingly be produced by coating cores produced analogously to the tablets with agents conventionally used in tablet coatings, for example polyvinylpyrrolidone or shellac, gum arabic, talc, titanium dioxide or sugar.
  • the coated tablet cover can also consist of several layers, the auxiliary substances mentioned above for the tablets being able to be used.
  • Solutions or suspensions with the active ingredient according to the invention can additionally taste-improving agents such as saccharin, cyclamate or sugar and z.
  • B. contain flavorings such as vanillin or orange extract. They can also contain suspending agents such as sodium carboxymethyl cellulose or preservatives such as p-hydroxybenzoates.
  • Capsules containing active ingredients can be produced, for example, by mixing the active ingredient with an inert carrier such as milk sugar or sorbitol and encapsulating it in gelatin capsules.
  • Suitable suppositories can be produced, for example, by mixing them with carriers such as neutral fats or polyethylene glycol or their derivatives.
  • the invention also relates to transdermal systems.
  • transdermal systems are plasters, patches or topical application forms as well as injectable implants.
  • the manufacture of these systems is known to the person skilled in the art.
  • FSH served as a comparison to the compounds according to the invention at optimized test concentrations (FIG. 1).
  • Figure 1 shows the time-dependent inhibin B secretion by Sertoli cells (1 x
  • FIG. 10 shows the time-dependent inhibin B secretion by Sertoli cells (1 x 10 6 per ml medium) after addition of 17 ⁇ -hydroxy-4-androsten-3-one (Epitest-osterone; EpiT; 1 M) according to the invention, average values 2 series of measurements.
  • the in vitro stimulation effect on the inhibin B generation was measured using the inhibin B dimer assay from Serotec, Oxford, UK.
  • the effect of the respective compound is characterized by the statement regarding the increased inhibin B values (FIG. 2).
  • the difference between the amount of inhibin B released with and without the test substance is an expression of the effectiveness of the corresponding test substance.
  • inhibitor B secretion could not be influenced after the addition of the naturally occurring steroids progesterone, testosterone and dihydrotestosterone.
  • a second digestion was carried out in 20 ml of DMEM, containing 40 mg of collagenase II, 40 mg of hyaluronidase and 0.1 mg of DNase, for 30 min at 37 ° C., followed by a centrifugation step at 500 rpm. After a washing step in DMEM without additives and again Centrifugation was followed by a third enzymatic digestion in DMEM, containing 40 mg collagenase II, 40 mg hyaluronidase and 0.1 mg DNase in 20 ml for 30 min. at 37 ° C., followed by centrifugation at 1000 rpm.
  • the pellet was resuspended, washed once in DMEM without additives and then supplemented in DMEM with 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 5 ⁇ g / ml human transferrin, 2 ⁇ g / ml insulin, 50 ng / ml vitamin A (all from Sigma), 200 ng / ml vitamin E (from Merck) and 3 mg / ml cytosine arabinoside (from Sigma) (DMEM-Z) in 24-well microtiter plates sown. After 48 h, the cultured cells were treated with 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) with the aim of removing remaining germ cells, followed by a change of media with DMEM-Z.
  • Reaction mixture 0.1 ml culture supernatant was mixed with 0.05 ml SDS of the inhibin B assay (Serotec, Oxford, UK) in 1.8 ml Eppendorf reaction vessels and heated at 100 ° C. for 3 min. After the Ansate had cooled, 0.1 ml of assay diluent and 0.05 ml of 6% H 2 O 2 solution were added, mixed and then incubated at RT for 30 min.
  • the content of the alkaline phosphatase-conjugated antibody against human inhibin B contained in the assay was taken up in 6 ml assay diluent, in each case 0.05 ml of this solution was pipetted into the wells and incubated at RT for 3 h.
  • reaction mixtures were then washed 8 times in washing buffer as above, incubated in this buffer for 15 min and washed a further 3 times. Then 0.05 ml of the substrate solution contained in the assay was added to each well and incubated for 1 h at RT. Then 0.05 ml of the amplifier solution contained in the assay was added to each well and the absorption values at 620 nm were measured against the blank value when a red color occurred. When the inhibin B standard of 1000 pg / ml carried out within the calibration curve has reached an absorption of 2.0, the reaction is stopped using the supplied stop solution and the corresponding values for the individual reaction batches are recorded.
  • the cell culture approach which contains no test substance but contains the vehicle ethanol, serves as a comparison value.

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Abstract

Beschrieben sind 17α-Hydroxy-4-androsten-3-on und dessen neue Derivate der allgemeinen Formel (I) sowie ein Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel. Die erfindungsgemäben Verbindungen dienen zur Regulation der Spermatogenese sowie zur Hormonsubstitutionstherapie beim Mann durch Stimulation der Inhibin B-Sekretion der Sertoli-Zellen. Die erhöhte Inhibin B-Konzentration unterdrückt die Spermatogenese in den Hoden, da sie die Ausschüttung des für die Spermatogenese essentiellen follikelstimulierenden Hormons (FSH) aus der Hypophyse hemmt.

Description

Beschreibung
17ALPHA-HYDROXY-4.-ANDROSTEN-3-ON UND DESSEN 14. , 15-METHYLEN-DERIVATE
Die Erfindung betrifft 17α-Hydroxy-4-androsten-3-on und Derivate, Verfahren zu deren Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß natürlich vorkommendes Testosteron ebenso wie follikelstimulierendes Hormon (FSH) wichtige endokrine Regulationskomponenten der Spermatogenese sind. Da Keimzellen selbst keine Rezeptoren für FSH besitzen, müssen hormoneile Signale über Serto- li-Zellen transferiert werden, welche unbekannte, für die Spermatogenese notwendige Signale produzieren (de Kretser D. M. et al., Hum. Reprod., 1998, 13, 1-8). Die Regulation der FSH-Konzentration erfolgt über Inhibin B (negative Rückkopplung), welches von den Sertoli-Zellen freigesetzt wird. Inhibin B selbst hemmt die Sekretion von FSH und unterdrückt somit die Spermatogenese. Deshalb wird Inhibin B auch als Marker der Spermatoge- nese angesehen (Pierik F. H. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 1998, 83, 3110-3114) und spielt eine überragende Rolle bei der para- und endokrinen Regulation der Spermatogenese in Abhängigkeit von seiner Konzentration. Auch ist von einer Korrelation von Inhibin B und der Spermienkonzentration berichtet worden (Klingmuller D. et al., Hum. Reprod., 1997, 12, 3276-3278; Jensen D. K. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 1997, 82, 4059-4063).
Epitestosteron, ein in Hoden sezerniertes Androgen, wurde lange Zeit als ein inaktives Epimer des Testosterons betrachtet. In den letzten Jahren wurde jedoch gefunden, daß es auf den FSH-Spiegel im Plasma dosisabhängig entweder hemmend oder erhöhend (Bicikova M. et al., J. Steroid. Biochem. Mol. Biol., 1993, 45, 321-324) wirkt. In diesem Zusammenhang wird Epitestosteron als ein kompetitiver Inhibitor von Androgenrezeptoren (Antian- drogen) beschrieben (Lapcik O. et al., J. Endocrinol., 1994, 143, 353-358; Starka L. et al., Vnitr. Lek., 1996, 42, 620-623). Darüberhinaus wurde beschrieben, daß Epitestosteron die epididymale und prostatische 5 -Reduktase hemmt (Monsalve A. and Blaquier J. A., Steroids, 1977, 30, 41-51 ; Starka L et al., J. Steroid. Biochem., 1989, 33, 1019-1021). Daß ein Zusammenhang zwischen antiandrogener Aktivität und der 5α- Reduktase-Hemmung besteht, wurde bereits von Starka et al. erörtert (Starka L. et al., J. Steroid. Biochem., 1989, 33, 1019-1021). Weiterhin beeinflußt es die Aromatisierung von Testosteron zu Östrogenen (Broulik P. D. et al., Bone, 1997, 20, 473-475).
Der Erfindung liegt u.a. die Aufgabe zugrunde, bekannte und neue Verbindungen mit hoher Wirksamkeit zur kontrazeptiven Anwendung und zur Hormonsubstitutionstherapie beim Mann zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß 17α-Hydroxy-4- androsten-3-on bzw. dessen Derivate entsprechend der allgemeinen Formel I
Figure imgf000003_0001
zur Verfügung gestellt werden,
worin
die Reste R unabhängig voneinander jeweils ein Wasserstoffatom oder ei- nen Rest OR2 darstellen, wobei die Reste R2 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff-atome, gesättigte oder ungesättigte, geradkettige oder verzweigte Alkyl- oder Acylgruppen mit 1 bis 6 C-Atomen sind, R-i eine gesättigte oder ungesättigte, geradkettige oder verzweigte Acylgrup- pe mit 1 bis 18 C-Atomen, eine Benzoyl-, Methylbenzoyl- oder Alkylben- zoylgruppe mit bis zu 10 C-Atomen, ein Sulfit- oder ein Glucuronylrest be- deutet und die Reste R' jeweils ein Wasserstoffatom darstellen oder zusammen mit der Einfachbindung zwischen C-n und C-ι2 eine Doppelbindung bilden sowie deren pharmazeutisch verträglichen Salze.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, wenn R-i ein Undecanoyl-, Lauroyl-, Tri- decanoyl-, Myristoyl-, Pentadecanoyl-, Palmitoyl-, Acetyl-, Caproyl-, Benzoyl-, Valeroyl-, Sulfit- oder Glucuronylrest ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I können in freier Form oder in Form eines pharmakologisch wirksamen Salzes verabreicht werden. Geeignete Beispiele dieser Salze der Verbindungen der allgemeinen Formel I umschließen Säureadditionssalze unter Verwendung von üblichen physiologisch verträglichen anorganischen und organischen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoff-säure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Milchsäure, Weinsäure, Apfelsäure, Citronensäure, Salicylsäure, Adipinsäure und Benzoesäure. Weitere verwendbare Säuren sind beispielsweise in Fortschritte der Arzneimittelforschung, Bd. 10, Seiten 224-225, Birkhäuser Verlag, Basel und Stuttgart, 1966, und Journal of Pharmaceutical Sciences, Bd. 66, Seiten 1-5 (1977) beschrieben.
Die Säureadditionssalze werden in der Regel in an sich bekannter Weise durch Mischen der freien Base oder deren Lösungen mit der entsprechenden Säure oder deren Lösungen in einem organischen Lösungsmittel, bei- spielsweise einem niederen Alkohol wie Methanol, Ethanol, n-Propanol oder Isopropanol oder einem niederen Keton wie Aceton, Methylethylketon oder Methylisobutylketon oder einem Ether wie Diethylether, Tetrahydrofuran oder Dioxan, erhalten. Zur besseren Kristallabscheidung können auch Mischungen der genannten Lösungsmittel verwendet werden. Darüber hinaus können physiologisch verträgliche wäßrige Lösungen von Säureadditionssalzen der Verbindung der Formel I in einer wäßrigen Säurelösung hergestellt werden.
Die Säureadditionssalze der Verbindungen der allgemeinen Formel I können in an sich bekannter Weise, z. B. mit Alkalien oder Ionenaustauschern, in die freie Base überführt werden. Von der freien Base lassen sich durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Säuren, insbesondere solchen, die zur Bildung von therapeutisch verwendbaren Salzen geeignet sind, weite- re Salze gewinnen. Diese oder auch andere Salze der neuen Verbindung, wie z.B. das Pikrat, können auch zur Reinigung der freien Base dienen, indem man die freie Base in ein Salz überführt, dieses abtrennt und aus dem Salz wiederum die Base freisetzt.
Die erfindungsgemäßen neuen Derivate des 17 -Hydroxy-4-androsten-3-on werden partialsynthetisch (s. Tetrahedron Lett. 35, 2329 (1994)) hergestellt. Dazu wird 14,15-ungesättigtes 17α-Hydroxy-4-androsten-3-on mit Dihalo- genmethanen und einem Zink-Kupfer-Paar oder Diazomethan und Zinkjodid zu entsprechenden 14α,15α-Methylen-17α-olen umgesetzt wird. Die Synthe- se der eine 14,15-Methylengruppe enthaltenden erfindungsgemäßen Derivate erfolgt in Kenntnis der chemischen Reaktionen gemäß des Patents DE 42 39 946. Alternativ dazu läßt sich auch wie folgt verfahren: Zur Erhaltung einer vorhandenen 17-Oxo-Gruppierung erfolgt die Umsetzung zum Ethylen- ketal. Der Brom-Additionsschritt zur Herstellung zur entsprechenden 16 - Bromverbindung und anschließend die Umsetzung zur Δ15 -Verbindung unter Verwendung eines Hydrobromierungsschrittes folgen. Nach der zur Δ14- Verbindung stattfindenden Isomerisierung und deren Spaltung werden die vorliegenden 17-Oxosteroide mit komplexen Metallhydriden oder Diboran in einer Lösung von Tetrahydrofuran bei -10 bis +10°C reduziert . Die Einfüh- rung verschiedener Substituenten, z. B. in 11- oder 12-Position, erfolgt e- benfalls auf partialsynthetischem Weg. Demnach wird eine entsprechende Sauerstoffunktion in das Molekül durch Zugabe von Cer(IV)ammoniumnitrat durchgeführt (s. Terahedron Lett. 35, 8599 (1994)). Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch pharmazeutische Präparate zur oralen, parenteralen, topischen, rektalen, subkutanen, intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen, intranasalen, intrabukkalen oder sublin- gualen Applikation, die neben üblichen Träger- und Verdünnungsmitteln mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung der allgemeinen Formel I oder deren Säureadditionssalz als Wirkstoff enthalten.
Die Arzneimittel der Erfindung werden mit den üblichen festen oder flüssigen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln und den üblicherweise verwendeten pharmazeutisch-technischen Hilfsstoffen entsprechend der gewünschten Applikationsart mit einer geeigneten Dosierung in bekannter Weise hergestellt. Die bevorzugten Zubereitungen bestehen in einer Darreichungsform, die zur oralen Applikation geeignet ist. Solche Darreichungsformen sind beispielsweise Tabletten, Filmtabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Pulver, Lö- sungen oder Suspensionen oder Depotformen.
Selbstverständlich kommen auch parenterale Zubereitungen wie Injektionslösungen in Betracht. Weiterhin seien als Zubereitungen beispielsweise auch Suppositorien genannt.
Entsprechende Tabletten können beispielsweise durch Mischen des Wirkstoffs mit bekannten Hilfsstoffen, beispielsweise inerten Verdünnungsmitteln wie Dextrose, Zucker, Sorbit, Mannit, Polyvinylpyrrolidon, Sprengmitteln wie Maisstärke oder Alginsäure, Bindemitteln wie Stärke oder Gelantine, Gleit- mittein wie Magnesiumstearat oder Talk und/oder Mitteln zur Erzielung eines Depoteffektes wie Carboxylpolymethylen, Carboxylmethylcellulose, Cellulo- seacetatphthalat oder Polyvinylacetat, erhalten werden. Die Tabletten können auch aus mehreren Schichten bestehen.
Entsprechend können Dragees durch Überziehen von analog den Tabletten hergestellten Kernen mit üblicherweise in Drageeüberzügen verwendeten Mitteln, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon oder Schellack, Gummiarabicum, Talk, Titandioxid oder Zucker, hergestellt werden. Dabei kann auch die Drageehülle aus mehreren Schichten bestehen, wobei die oben bei den Tab- letten erwähnten Hilfsstoffe verwendet werden können. Lösungen oder Suspensionen mit dem erfindungsgemäßen Wirkstoff können zusätzlich geschmacksverbessernde Mittel wie Saccharin, Cyclamat oder Zucker sowie z. B. Aromastoffe wie Vanillin oder Orangenextrakt enthalten. Sie können außerdem Suspendierhilfsstoffe wie Natriumcarboxy- methylcellulose oder Konservierungsstoffe wie p-Hydroxybenzoate enthalten. Wirkstoffe enthaltende Kapseln können beispielsweise hergestellt werden, indem man den Wirkstoff mit einem inerten Träger wie Milchzucker oder Sorbit mischt und in Gelatinekapseln einkapselt.
Geeignete Suppositorien lassen sich beispielsweise durch Vermischen mit dafür vorgesehenen Trägermitteln wie Neutralfetten oder Polyäthylenglykol bzw. deren Derivaten herstellen.
Auch transdermale Systeme gehören zum Gegenstand der Erfindung. Derartige Systeme sind Pflaster, Patches oder topische Applikationsformen sowie injizierbare Implantate. Der Herstellung dieser Systeme ist dem Fachmann bekannt.
Die Vorteile der Erfindung ergeben sich im wesentlichen dadurch, daß neue pharmazeutische Präparate zur Regulation der Spermatogenese und zur Hormonsubstitutionstherapie beim Mann zur Verfügung gestellt werden, nämlich mit Wirkstoffen, deren Wirkprofil neu ist und/oder mit Wirkstoffen, die eine hohe Wirksamkeit bezüglich der Stimulation des Inhibin B besitzen.
Die vorteilhafte Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Stimula- toren der Inhibin B-Sekretion wird in Figur 2 dargestellt.
Als Vergleich zu den erfindungsgemäßen Verbindungen diente FSH bei op- timierten Test-Konzentrationen (Figur 1).
Figur 1 zeigt die zeitabhängige Inhibin B-Sekretion durch Sertoli-Zellen (1 x
10 -Λ6 ) nach FSH-Zugabe (300 ng/ml). Die dargestellten Durchschnittswerte repräsentieren die Test-ergebnisse von 4 unabhängigen Experimenten. Figur 2 zeigt die zeitabhängige Inhibin B-Sekretion durch Sertoli-Zellen (1 x 106 pro ml Medium) nach Zugabe von erfindungsgemäßem 17α-Hydroxy-4- androsten-3-on (Epitest-osteron; EpiT; 1 M), Durchschnittswerte aus 2 Meßreihen.
Die Messung der in vitro Stimulationswirkung auf die Inhibin B-Generation wurde mittels des Inhibin-B-Dimer-Assays der Fa. Serotec, Oxford, UK, vorgenommen. Mit der Aussage zu den erhöhten Inhibin B-Werten wird die Wirkung der jeweiligen Verbindung charakterisiert (Figur 2). Die Differenz zwi- sehen der freigesetzten Inhibin B-Menge mit und ohne Testsubstanz ist ein Ausdruck für die Wirksamkeit der entsprechenden Testsubstanz.
Es wurde untersucht, inwieweit erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Formel I, bestehend aus 17 -Hydroxy-4-androsten-3-on und seinen chemisch modifizierten Derivaten sowie seinen Estern und Salzen, vorzugsweise Sulfat- und Glucuronidkonjugaten, die Inhibin B-Sekretion durch Ser- tolizellen stimulieren, und somit indirekt supprimierend auf den FSH-Spiegel wirken und der Regulation der Spermatogenese dienen können. Da FSH eine wichtige Komponente der Spermatogenese darstellt, wird vermutet, daß durch Hemmung von FSH die notwendige endokrine Stimulation der Spermatogenese herabgesetzt wird bzw. unterbleibt.
Anhand von Versuchsreihen in hormon- und steroidfreien Sertoli-Zellkulturen konnte gezeigt werden, daß diese Zellen zwischen 20 und 92 Stunden eine ansteigende basale Inhibin B-Menge freisetzen.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß erfindungsgemäß nach Zugabe von 17 -Hydroxy-4-androsten-3-on bzw. dessen Derivaten der allgemeinen Formel I signifikant erhöhte Inhibin B-Konzentrationen im Kulturüberstand im Vergleich zu den Kontrollexperimenten (Figur 2), beispielsweise nach 44 und
52 Stunden Inkubation, exprimiert wurden. Besonders auffällig war dieser Effekt bei EpiT-Konzen-trationen von 10 nM bis 1 μM. Andererseits konnte nach Zugabe der natürlich vorkommenden Steroide Progesteron, Testosteron und Dihydrotestosteron die Inhibin B-Sekretion nicht beeinflußt werden. Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung:
Beispiel
Untersuchung zur pharmakoloαischen Wirksamkeit der Sertoli-Zellen- Stimulatoren auf die Inhibin B-Sekretion
Die Untersuchung der Substanzen auf die stimulierende Wirkung hinsichtlich der Inhibin B-Sekretion wurde im in vitro Modell unter Verwendung von bis zu 4 Tagen kultivierten Sertoli-Zellen von Wistar-Ratten durchgeführt:
Gewinnung des biologischen Materials
18 Tage alte Wistar-Ratten wurden mittels CO2 getötet; den Tieren wurden die Hoden entnommen und mit einem Skalpell mechanisch zerkleinert. Der entstandene Zellbrei wurde mittels Kollagenase II, Hyaluronidase und DNase enzymatisch aufgeschlossen, wobei folgendes Verfahren verwendet wurde: Der Zellbrei wurde in 20 ml Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM), enthaltend 20 mg Kollagenase II, für 15 min bei 37 °C verdaut, anschließend erfolgte die Sedimentation für 7 min bei RT. Der Überstand wurde verworfen. Das verbliebene Pellet wurde in DMEM resuspendiert, anschließend erfolgte eine weitere Sedimentation für 7 min. Ein zweiter Aufschluß erfolgte in 20 ml DMEM, enthaltend 40 mg Kollagenase II, 40 mg Hyaluronidase und 0,1 mg DNase, für 30 min bei 37 °C, gefolgt von einem Zentrifugationsschritt bei 500 rpm. Nach einem Waschschritt in DMEM ohne Zusätze und erneuter Zentri- fugation erfolgte ein dritter enzymatischer Aufschluß in DMEM, enthaltend 40 mg Kollagenase II, 40 mg Hyaluronidase und 0,1 mg DNase in 20 ml für 30 min. bei 37 °C, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1000 rpm. Das Pellet wurde resuspendiert, einmal in DMEM ohne Zusätze gewaschen und an- schließend in DMEM supplimiert mit 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Strepto- mycin, 5 μg/ml humanes Transferrin, 2 μg/ml Insulin, 50 ng/ml Vitamin A (alle Fa. Sigma), 200 ng/ml Vitamin E (Fa. Merck) und 3 mg/ml Cytosinarabinosid (Fa. Sigma) (DMEM-Z) in 24-Well Mikrotiterplatten ausgesät. Nach 48 h erfolgte eine hypotonische Behandlung der kultivierten Zellen mittels 20 mM Tris-HCI (pH 7,4) mit dem Ziel, restliche Keimzellen zu entfernen, danach erfolgte ein Medienwechsel mit DMEM-Z.
Zellkulturansatz
1 ml biologische Probe, enthaltend 106 Sertoli-Zellen in 990 ml DMEM-Z und Testsubstanzen im Konzentrationsbereich 0,1 nM bis 1 μM, jeweils gelöst in 10 μl abs. Ethanol (1% w/v des Gesamtansatzes), wurde für 48 h bei 34 °C und 5% C02 inkubiert. Anschließend wurde der Kulturüberstand von den Zellen dekantiert, bei -20 °C eingefroren und bis zur Inhibin B-Bestimmung aufbewahrt.
Reaktionsansatz 0,1 ml Kulturüberstand wurden mit 0,05 ml SDS des Inhibin-B-Assays (Fa. Serotec, Oxford, UK) in 1 ,8 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäßen gemischt und für 3 min auf 100 °C erhitzt. Nach dem abkühlen des Ansates, wurden 0,1 ml Assay-Verdünner sowie 0,05 ml 6%ige H202-Lösung zugegeben, gemischt und anschließend 30 min bei RT inkubiert.
Jeweils 80 ml des obigen Reaktionsgemisches und jeweils 80 ml der im Assay enthaltenen 7 Inhibin B-Standards zur Eichkurvenerstellung wurden in die Wells der im Assay enthaltenen Mikrotiterplatte pipettiert und bei RT über Nacht inkubiert. Anschließend wurden die Wells 3 mal mit Inhibin- Waschpuffer gewaschen.
Der Inhalt des im Assay enthaltenen Alkalische Phosphatase-konjugierten Antikörpers gegen humanes Inhibin B wurde in 6 ml Assay-Verdünner aufgenommen, jeweils 0,05 ml dieser Lösung wurde in die Wells pipettiert und bei RT für 3 h inkubiert.
Nachfolgend wurden die Reaktionsansätze 8 mal wie oben in Waschpuffer gewaschen, 15 min in diesem Puffer inkubiert und weitere 3 mal gewaschen. Anschließend wurde in jedes Well 0,05 ml der im Assay enthaltenen Sub- stratlösung gegeben und für 1 h bei RT inkubiert. Danach wurde jedem Well 0,05 ml der im Assay enthaltenen Amplifier- Lösung zugegeben und bei Auftreten einer Rotfärbung die Absorptionswerte bei 620 nm gegen den Blindwert gemessen. Wenn der innerhalb der Eichkurvenerstellung mitgeführte Inhibin B-Standard von 1000 pg/ml eine Absorption von 2,0 erreicht hat, wird die Reaktion mittels der mitgelieferten Stopp-Lösung beendet und die entsprechenden Werte für die einzelnen Reaktionsansätze registriert. Als Vergleichswert dient der Zellkultur-Ansatz, der keine Testsubstanz, jedoch das Vehikel Ethanol enthält.

Claims

Patentansprüche
1. 17α-Hydroxy-4-androsten-3-on und dessen Derivate der allgemeinen Formel I
Figure imgf000012_0001
worin
die Reste R unabhängig voneinander jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Rest OR2 darstellen, wobei die Reste R2 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoffatome, gesättigte oder ungesättigte, geradkettige oder verzweigte Alkyl- oder A- cylgruppen mit 1 bis 6 C-Atomen sind,
R-i eine gesättigte oder ungesättigte, geradkettige oder verzweigte A- cylgruppe mit 1 bis 18 C-Atomen, eine Benzoyl-, Methylbenzoyl- oder Alkylbenzoylgruppe mit bis zu 10 C-Atomen, ein Sulfit- oder eine Glucu- ronylgruppe bedeutet
und die Reste R' jeweils ein Wasserstoffatom darstellen oder zusammen mit der Einfachbindung zwischen C-π und C-|2 eine Doppelbindung bilden
sowie deren pharmazeutisch verträglichen Salze. 17α-Hydroxy-4-androsten-3-on und dessen Derivate nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß R-i ein Undecanoyl-, Lauroyl-, Trideca- noyl-, Myristoyl-, Pentadecanoyl-, Palmitoyl-, Acetyl-, Caproyl-, Benzoyl-, Valeroyl-, Sulfit- oder Glucuronylrest ist.
Verfahren zur Herstellung von 17 -Hydroxy-4-androsten-3-on und dessen Derivaten der allgemeinen Formel I
Figure imgf000013_0001
wobei die Reste R, R-i, R2 und R' die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, dadurch gekennzeichnet, daß 14,15-ungesättigtes 17α-Hydroxy-4-androsten-3-on mit Dihalogenmethanen und einem Zink-Kupfer-Paar oder Diazomethan und Zinkjodid zu 14 ,15α- Methylen-17α-olen umgesetzt wird.
4. Verfahren zur Herstellung von 17 -Hydroxy-4-androsten-3-on und dessen Derivaten der allgemeinen Formel I
Figure imgf000013_0002
wobei die Reste R, R-i, R2 und R' die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erhaltung einer 17- Oxo-Gruppierung die Umsetzung zum Ethylenketal erfolgt, daß mittels eines Brom-Additionsschrittes die Herstellung der entsprechenden 16 - Bromverbindung und anschließend die Umsetzung zur Δ15 -Verbindung mittels eines Hydrobromierungsschrittes erfolgt und daß nach einer I- somerisierung zur Δ14-Verbindung und deren Spaltung die erhaltenen 17-Oxosteroide mit komplexen Metallhydriden oder Diboran in einer Lösung von Tetrahydrofuran bei -10 bis +10°C reduziert werden.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Sauerstoffunktion durch Verwendung von Cer(IV)ammoniumnitrat eingeführt wird.
6. Pharmazeutische Präparate, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Verbindung oder ihr pharmakologisch wirksames Salz nach Anspruch 1 als Wirkstoff enthalten ist.
7. Verwendung von 17α-Hydroxy-4-androsten-3-on und dessen Derivaten nach dem Anspruch 1 oder 2 als pharmazeutische Präparate zur Regulation der Spermatogenese und zur Hormonsubstitutionstherapie beim Mann.
8. Verwendung von 17α-Hydroxy-4-androsten-3-on und dessen Derivaten nach dem Anspruch 1 oder 2 als pharmazeutische Präparate zur oralen, parenteralen, topischen, rektalen, subkutanen, intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen, intranasalen, intrabukkalen oder sub- lingualen Applikation.
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