WO2002088374A1

WO2002088374A1 - Processus de production d'isomaltose et utilisation de celui-ci

Info

Publication number: WO2002088374A1
Application number: PCT/JP2002/004166
Authority: WO
Inventors: Michio Kubota; Tomoyuki Nishimoto; Takanobu Higashiyama; Hikaru Watanabe; Shigeharu Fukuda; Toshio Miyake
Original assignee: Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
Priority date: 2001-04-27
Filing date: 2002-04-25
Publication date: 2002-11-07
Also published as: KR20040002408A; AU2002255280B2; KR100875576B1; AU2002255280A2; CA2413164C; EP1382687A4; EP1382687A1; CN100415894C; CN1462310A; ATE469234T1; CA2413164A1; DE60236503D1; JPWO2002088374A1; EP1382687B1; JP4224302B2; US20040253690A1; TWI273138B

Description

明細書

イソマルトースの製造方法並びに用途

技術分野

本発明は、イソマルトースの新規な製造方法とその用途に関し、より詳細には、非還元末端の結合様式として α— 1 , 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度 2以上の糖質からイソマルトースを高収率で得るためのイソマルトースの製造方法とその用途に関する。

背景技術

ィソマルト一スは、醱酵食品などに微量存在している難結晶性で優れた保湿性を有する低甘味糖質で、従来、グルコース、マルトース、パノースなどとの混合糖質として、各種食品、化粧品、医薬品等に幅広く使用されている有用な糖質である。

イソマルトースは、天然界に於いては、醌酵食品などに微量存在するに過ぎない希少糖質で、工業的には、酸触媒を用いるデキストランの部分加水分.解反応、デキストラナ一ゼゃィソマルトデキストラナーゼなどを用いる酵素反応、グルコースからのダルコアミラーゼ又は酸触媒を用いる逆合成反応、マルトース又はマルトデキストリンからのひ一ダルコシダ—ゼを用いるグルコース糖転移反応などによる製造方法が知られている。しかしながら、従来法により得られる反応液中のイソマルトース含有量は、固形物当り約 1 0乃至約 2 5 % ( w / w ) (以下、本明細書に於いては、特にことわらない限り、「％ ( w / w ) 」を単に「％J と略記する。）程度に過ぎず、イソマルトースの工業的製造方法としては純度が低く、到底満足できるものではなかった。この問題点を改善する方法として、例えば、特開昭 5 8 — 7 2 5 9 8号公報に開示されたカラムクロマトグラフィーがある。この方法によれば、固形物当り、イソマルト一ス含有量が約 1 0乃至約 2 5 %の原料糖液から、高純度ィソマルト一スを得ることができる。しかしながら、このイソマルトースの製造方法に於いても、得られるイソマルト一スの純度、収率は、原料糖液中のイソマルト一ス含有量に依存せざるを得ないとの問題点があった。斯かる状況下、イソマルトースを工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得る新規な製造方法の確立が鶴首されていた。

本発明は、前記従来技術に鑑み、イソマルト一スを工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得るイソマルト一スの製造方法とその用途を確立することを課題とする。発明の開示

本発明者等が前記課題を解決することを目的として鋭意研究する中、『ョ一ロピアン ' ジャーナル ' ォブ ' バイオケミストリー（E u r o p e a n J o u r n a l o f B i o c h e m i s t r y ) 』、第 2 2 6巻、 6 4 1 乃至 6 4 8頁（ 1 9 9 4年）に於いて、主として、 4個のグルコース残基がひ一 1 , 3結合と α — 1 , 6結合により交互に連なつた構造を有するアルテルナン（ a 1 t e r n a n ) に加水分解酵素ァルテルナナーゼ（ a 1 t e r n a n a s e ) を作用させて得られる、分子内にイソマルト一ス構造を有するサイクロ {→ 6 ) — Q! — D—ダルコピラノシルー ( 1 → 3 ) 一 α _ D—ダルコピラノシル一 ( 1 → 6 ) - 一 D—ダルコビラノシルー（ 1 → 3 ) — α _ D —ダルコビラノシル _ ( 1 →} の構造を有する四糖類（以下、『環状四糖』と略記する。）の報告があった。

一方、本発明者等は、特願 2 0 0 0 - 2 2 9 5 5 7号明細書に於いて. パノース等の澱粉由来の糖質から環状四糖を生成する、 _α—イソマルトシル転移酵素を用いる環状四糖の製造方法を開示すると共に、特願 2 0 0 0 - 2 3 4 9 3 7号明細書に於いては、前記 Q!—ィソマルトシル転移酵素と、マルトオリゴ糖等から Q! —イソマルトシルダルコ糖質を生成する α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素とを澱粉原料に作用させて環状四糖を効率よく製造する方法を開示している。

その後、本発明者等は、前記 0；—イソマルトシルダルコ糖質及び環状四糖が、それら分子内にイソマルト一ス構造を有していることに着目し. これらの糖質からイソマルトースを製造する方法について研究した。即ち、本発明者等は、これら α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と α 一イソマルトシル転移酵素の酵素反応メカニズムについて研究した結果. 非還元末端の結合様式として α— 1 , 4ダルコシル結合を有するグルコ —ス重合度 2以上の糖質に、 ο; —イソマルトシル転移酵素の非存在下又は存在下で α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素とイソマルト一スを遊離する作用を有するイソマルトース遊離酵素とを作用させると、イソマルトースの生成収率が飛躍的に向上し、しかも、工業的に容易に実施し得ることを見出した。更に、本発明者等は、斯かる製造方法により得られるイソマルトースの用途を確立して本発明を完成した。具体的には本発明は、非還元末端の結合様式として α — 1 ， 4 ダルコ.シル結合を有するグルコース重合度 2以上の糖質に、 0!—イソマルトシル転移酵素の非存在下又は存在下で、 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元性末端の結合様式として α — 1 ， 6 ダルコシル結合を有し、この非還元性末端以外の結合様式としてひ — 1 , 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度 3以上のひ一イソマルトシルダルコ糖質及ぴ /又はサイクロ {→ 6 ) — α — D —ダルコピラノシルー ( 1 → 3 ) 一 — D —ダルコビラノシル一（ 1 → 6 ) — a — D —ダルコビラノシル一（ 1 → 3 ) 一 α _ D _ダルコビラノシルー（ 1→} を生成させ、この生成物にイソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、この生成したイソマルトースを採取することを特徴とするイソマルトースの製造方法とその用途を確立して、本発明の課題を解決したものである < 図面の簡単な説明

第 1 図は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。第 2図は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の ο; —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす p Hの影響を示す図である。第 3図は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。

第 4図は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の ρ Η安定性を示す図である。

第 5図は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の一イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。

第 6図は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の《—イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす ρ Ηの影響を示す図である。

第 7図は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の α —イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。

第 8図は、バチルスグロビスポルス C 9 由来の一イソマルトシル転移酵素の ρ Η安定性を示す図である。

第 9 図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。第 1 0図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす ρ Ηの影響を示す図である第 1 1 図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。

第 1 2図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の ρ Η安定性を示す図である。

第 1 3図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α—イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。

第 1 4図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α—イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす Ρ Ηの影響を示す図である。

第 1 5図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α—イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。

第 1 6図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α—イソマルトシル転移酵素の ρ Η安定性を示す図である。

第 1 7図は、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素反応により得られた α—イソマルトシルマルトトリオースの ¹ Η— NMRスぺクトルを示す図である。

第 1 8図は、 α;—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素反応により得られた a—イソマルトシルマルトテトラオースの ¹ Η— NMRスペクトルを示す図である。

第 1 9図は、 a—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素反応により得られた α—イソマルトシルマルトトリオ一スの ^{1 3} C— NMRスぺクトルを示す図である。

第 2 0図は、一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素反応により得られた α—イソマルトシルマルトテトラオースの ^{1 3} C— NMRスぺクトルを示す図である。

第 2 1図は、生成物 Αの ¹ Η— N M Rスペクトルを示す図である。第 2 2図は、生成物 Aの ^{1 3} C— NMRスぺクトルを示す図である。発明を実施する最良の形態

本発明で用いる α—ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素とは、澱粉質から α —イソマルトシルグルコース（別名、パノース）、 α—イソマルトシノレマノレトース、 α —イソマノレトシノレマノレトトリオース、 a —イソマルトシノレテトラオースなどの a—ィソマルトシルダルコ糖質を生成する酵素を意味し、具体的には、特願 2 0 0 0 — 2 3 4 9 3 7号明細書に開示された、 2000年 4月 25日付で、日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号 F E RM B P— 7 1 4 3 として寄託されているバチノレスグロビスポノレス ( B a c i l l u s g l o b i s p o r u s ) C 9、及ぴ、 2000年 4月 25日付で、日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号 F E RM B P— 7 1 4 4 として寄託されているノチノレスグロビスポノレス（ B a c i l l u s g l o b i s p o r u s ) C I 1 由来の α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素、及ぴ特願 2 0 0 1 - 5 4 4 1 号明細書に開示された遺伝子組換え型 —ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド等を例示することができる。

又、本発明で用いる α—イソマルトシル転移酵素とは、パノース、ィソマルトシルマルトースのような α —ィソマノレトシルダルコ糖質から環状四糖を生成する酵素を意味し、特願 2 0 0 0 — 2 2 9 5 5 7号明細書に開示されたバチルスグロビスポルス（ B a c i 1 1 u s g 1 o b i s p o r u s ) C 9 ( F E RM B P — 7 1 4 3 ) 及びバチルスグ口ビスポルス（ B a c i 1 1 s g l o b i s p o r u s ) C l l ( F E RM B P — 7 1 4 4 ) 由来の α;—イソマノレトシル転移酵素、及び特願 2 0 0 0 〜 3 5 0 1 4 2号明細書に開示された遺伝子組換え型 α—ィソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチド等を例示することができる。 ' ' 更に、本発明で用いるイソマルトース遊離酵素は、 α —イソマルトシルグルコ糖質や環状四糖から、イソマルトースを遊離する作用を有する酵素を意味し、例えば、『ジャーナル ' ォブ ' バイオケミストリー（ J o u r n a 1 o f B i o c h e m i s t r y ) 、 fe 7 5 、 1 0 iD 乃至 1 1 2頁（ 1 9 7 4年）に報告されているァルスロバクタ一グロビフオルミス (A r t h r o b a c t e r g l o b i f o r m i s ) T 6 (N R R L B— 4 4 2 5 ) 、東京大学応用微生物研究所から分譲提供される、ァルスロバクタ一グロビフオルミス ( A r t h r o b a c t e r g l o b i f o r m i s ) ( I AM 1 2 1 0 3 ) 、及ぴ『力一ボノヽイドレート ' リサーチ（C a r b o h y d r a t e R e s e a r c h ) 』、第 8 9卷、 ' 2 8 9乃至 2 9 9頁（ 1 9 8 1年）に報告されている、ァクチノマジユラ（A c t i n o m a d u r a ) R 1 0 ( N R R L B — 1 1 4 1 1 ) 等の微生物由来のィソマルトデキストラナーゼ ( E C 3 . 2. 1 . 9 4 ) を例示することができる。

本発明で用いる非還元末端の結合様式として α — 1 , 4 ダルコシル結合を有するグルコース重合度 2以上の糖質とは、例えば、とうもろこし澱粉、米澱粉、小麦澱粉などの地上澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピォカ澱粉などの地下澱粉及びそれら部分加水分解物（澱粉部分分解物）を意味する。前記澱粉部分分解物は、通常、上記した地上乃至地下澱粉を水に懸濁して、通常、濃度 1 0 %以上、より好ましくは、 1 ⁵ %乃至 6 5 %、更に好ましくは、 2 0 %乃至 5 0 %の澱粉乳とし、これを加熱して液化するか、又は、上記した地上乃至地下澱粉を酸剤或いは酵素剤により液化して得ることができる。液化の程度は、比較的低く設定するのがよく、通常、 D E 1 5未満、好ましくは、 D E 1 0未満、より好ましくは、 D E 9乃至 0 . 1 の範囲とするのが望ましい。酸剤で液化する場合には、例えば、塩酸、燐酸、蓚酸などの酸剤により液化した後、通常、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、炭酸ナトリウムなどのアルカリ剤を用いて所望の Ρ Ηに中和する方法を採用する。酵素剤で液化する場合には、 α—アミラーゼ、殊に、耐熱性の液化型 α —アミラーゼが本発明に於いては好適に用いることができる。これら非還元末端の結合様式として α — 1， 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度 2以上の糖質に、 α —イソマルトシル転移酵素の非存在下又は存在下で、 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元性末端の結合様式として α — 1 , 6 グルコシル結合を有し、この非還元性末端以外の結合様式として a— 1， 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度 3以上の α—ィソマルトシルダルコ糖質、及ぴ又は、サイクロ {→ 6 ) 一 α — D —グルコピラノシノレー ( 1→ 3 ) ― a _ D —ダルコビラノシル一（ 1→ 6 ) — α — D—ダルコピラノシル― ( 1 → 3 ) 一 α — D—ダルコピラノシルー ( 1→ } を生成させ、この生成物にイソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、この生成したイソマルトースを採取することにより、イソマルトースを高収率で得ることができる。又、 a—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を作用させるに際し、 α —イソマルトシル転移酵素、シクロマルトデキストリングルカノ卜ランスフェラーゼ (以下、 Γ C G T a s e』と略記する。）、 α —ダルコシダーゼ、グルコアミラーゼ及び澱粉枝切酵素（ィソアミラーゼ、プルラナーゼ等）から選ばれる 1種又は 2種以上の酵素を作用させるカ又は、 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を作用させた後に、 α —イソマノレトシル転移酵素、 C G T a s e、 -グノレコシダーゼ、グルコアミラーゼ及びイソアミラーゼから選ばれる 1種又は 2 種以上の酵素を作用させることにより、イソマルトースをより高収率で製造することができる。殊に、非還元末端の結合様式として α— 1 , 4 ダルコシル結合を有するグルコース重合度 2以上の糖質に、 α —イソマルトシル転移酵素の存在下で α—ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素を作用させて得られる環状四糖にイソマルトース遊離酵素を作用させる場合、環状四糖からのイソマルトース生成率を最大 1 0 0 %にまで高めることが可能となる。本発明に於いて複数の酵素を用いる場合の順序は、イソマルトースの生成収率、反応時間、反応条件等を勘案しながら設定すればよく、複数の酵素を同時に作用させることも、又、これら酵素の必要量を数回に分けて、異なるタイミングで作用させることも可能である。本発明で用いる酵素を作用させるときの p Hは、前記酵素がそれらの酵素活性を発揮し得る p Hであればよく、通常、 p H 4乃至 1 0、好ましくは、 p H 5乃至 8の範囲から選択される。又、酵素を作用させるときの温度は、通常、 1 0乃至 8 0 °<0、好ましくは、 3 0乃至 7 0 の範囲から選択される。酵素量は、各酵素の反応条件、反応時間を考慮して適宜増減すればよく、通常、基質固形物グラム当たり、 G; —イソマルトシル転移酵素及びひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素は、それぞれ 0. 0 1乃至 1 0 0単位の範囲から、イソマルトース遊離酵素及び澱粉枝切酵素は、それぞれ 1乃至 1 0 , 0 0 0単位の範囲から、及び C G T a s e、 α—ダルコシダーゼ、ダルコアミラーゼ及びイソアミラーゼは、 0. 0 5乃至 7 , 0 0 0単位の範囲から適宜選択して用いられる。又、用いる酵素反応時間は、酵素量に依存するものの、イソマルト一スの生成収率を勘案しながら適宜選択すればよく、通常、 1乃至 2 0 0時間、好ましくは、 5乃至 1 5 0時間、 1 0乃至 1 0 0時間で全酵素反応を完結するよう設定する。尚、個々の酵素反応時の ρ Η及び温度は、本発明に於ける酵素反応が完了する迄の工程で適宜変更することも可能である。

斯くして得られる酵素反応液中のイソマルトース含有量は、固形物当たり、通常、 3 0 %以上、好ましくは、 4 0 %以上、より好ましくは、 5 0 %以上、最大 9 9 %以上にも達する。とりわけ、これら非還元末端の結合様式として α— 1 , 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度 2以上の糖質に、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素、一イソマルトシル転移酵素及びィソマルト一ス遊離酵素を同時又はこの順序で添加するときには、固形物当たりのイソマルトース含有率が 5 0 %以上の酵素反応液を容易に得ることができる。前記酵素反応液は、通常、濾過. 遠心分離などの常法により酵素反応液中の不溶物を除去し、次いで、活性炭により脱色し、 H型、 O H型イオン交換樹脂等で脱塩し精製し、濃縮してシラップ状製品とするか、更に、これを乾燥して粉末状製品とする。必要ならば、更に、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー. 活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィ —などのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコール及びァセトンなど有機溶媒を用いる分別、膜分離法等の 1種又は 2種以上を適宜組み合わせて精製し、イソマルト一ス高含有物とすることも可能である。とりわけ、イソマルト一ス高含有物の工業的大量製造方法としては、ィオン交換樹脂力ラムクロマトグラフィ一の採用が好適である。具体的には、例えば、特開昭 5 8— 2 3 7 9 9号公報及び特開昭 5 8 — 7 2 5 9 8号公報などに開示されている、スルフォン基を結合したスチレンージビニルベンゼン架橋共重合体樹脂の N a +形、 K +形等のアルカリ金属形. 及ぴ C a ^{2 +}形、 M g ^{2 +}形等のアルカリ土類金属形の 1種又は 2種以上の強酸性カチオン交換樹脂を用いるイオン交換樹脂カラムクロマトダラフィ一によるときには、イソマルト一ス髙含有物を工業的に高収率、大量、容易かつ安価に製造することができる。前記強酸性カチオン交換樹脂の市販品としては、ダウケミカル社製の商品名『ダウエックス 5 0 W X 2』、『ダウエックス 5 0 WX 4』及び『ダウエックス 5 0 WX 8』 . ローム · アンド ' ハース社製の商品名『アンバーライト C G— 1 2 0』 . 東京有機化学工業社製の商品名『XT— 1 0 2 2 E』、三菱化成工業社製の商品名『ダイヤイオン S K 1 B』、『ダイヤイオン S K 1 0 2』及び『ダイヤイオン S K 1 0 4』等を例示することができる。前記イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーに於いては、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも可能である。斯かる方法によれば、イソマルトースの固形物当たりの純度を、通常、 6 0 % 以上、好ましくは、 8 0 %以上、より好ましくは、 9 9 %以上の最高純度にまで高めることが可能である。尚、最高純度のイソマルトース以外のイソマルトース、つまり、イソマルト一ス髙含有物は、通常、イソマルト一ス以外に、グルコース、マルト一ス、マルトトリオース、マルトテトラオース、他の澱粉部分加水分解物、 α —ソマルトシルダルコ糖質. 及ぴ α—ダルコシル— （ 1→ 6 ) — α _ダルコシル— ( 1→ 3 ) - - ダルコシル— （ 1→ 6 ) — α—グルコース（以下、『開環四糖』と略称することもある。）から選ばれる 1種又は 2種上の糖質を、固形物当たり、通常、 1 乃至 6 0 %含んでいる。

斯くして得られる本発明のイソマルトース及びイソマルト一ス髙含有物は、良質で上品な甘味を有すると共に、虫歯の原因の一つであるデキストランの生成を阻害する作用を有しており、虫歯を起こしにくい甘味料として好適に利用される。又、本発明のイソマルトース及びイソマルト一ス高含有物は、保存安定性も優れている。殊に、イソマルト一ス結晶高含有製品の場合には、プルラン、ヒドロキシェチルスターチ、ポリビニルピ口リドンなどの公知の結合剤と併用して、錠剤の糖衣剤としても有利に用いることができる。又、本発明のイソマルト一ス及びイソマルトース高含有物は、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醱酵性、糊化澱粉の老化防止性などの有用な性質をも兼備している。従って、本発明のイソマルトース及びイソマルトース高含有物は、甘味料、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、安定剤、陚形剤などとして、食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などの各種組成物に有利に用いることができる。本発明のイソマルト一ス及びイソマルトース高含有物は、各種物品の甘味付けのための調味料としても用いることができる。必要に応じて、例えば、粉飴、ブドウ糖、フラクト一ス、ラクトスクロ一ス、マルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メ一プルシュガー、イソマルトオリゴ糖、ガラタトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ソルビトール、マルチ卜ール、ラクチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、一グリコシルステビオシド、レバウディオシド、グリチルリチン、 Lーァスパルチル— L 一フエ二ルァラニンメチルエステル、スクラロース、アセスルファム K . サッカリン、グリシン、ァラニンなどのような他の甘味料の 1種又は 2 種以上と併用することも、必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などの増量剤の 1種又は 2種以上と併用することも随意である。

又、本発明のイソマルトース及びイソマルト一ス高含有物、とりわけ. これらの粉末状製品は、そのままで、又は必要に応じて、適宜の増量剤. 賦形剤、結合剤、甘味料などの 1種又は 2種以上と併用して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体状、錠剤状、フィルム状又はシート状などの各種形状に成型して用いることも随意である。

更に、本発明のイソマルト一ス及びイソマルト一ス高含有物の甘味は酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、自体、耐酸性、耐熱性も大きいので、各種飲食物の甘味付け、呈味改良に、又品質改良を目的として用いることができる。具体的には、例えば、アミノ酸、ペプチド類、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麵つゆ、ソース、ケチャップ、焼肉のタレ、カレールゥ、シチューの素、スープの素、ダシの素、核酸系調味料、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コ一ヒ —シュガーなど各種調味料として有利に利用できる。又、例えば、せんベい、あられ、おこし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼ ¹： I—、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカ一、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタ一ドクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナッ、チョコレート、チューィンガム、キャラメル、キャンディ一などの洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬, 氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フル一ッぺ一スト、スプレッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べつたら潰, 千枚漬、らつきよう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜溃の素などの漬物の素類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソ一セージ、かまぼこ、ちくわ、天ぶらなどの魚肉製品、ゥニ、イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などの惣菜食品、ヨーグルト、チーズなどの乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、コーヒー、紅茶、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケ一キミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品、健康食品などの各種飲食物に有利に利用できる。

更に、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物用の飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、夕バコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤などの各種固形物用甘味剤として、又はそれらの呈味改良剤、矯味剤、品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。

本発明のイソマルト一ス及びイソマルト一ス高含有物は、品質改良剤及び/又は安定剤として、有効成分、活性成分又は生理活性物質を含む健康食品、医薬品などに配合することにより、安定で高品質の液状、ぺ —スト状又は固状の健康食品や医薬品を得ることができる。前記有効成分や生理活性物質としては、例えば、インターフェロン一 α、インターフエロン一 /3、インターフェロン一ァ、 T N F— α、 T N F — 、マク口ファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクタ一、インタ一ロイキンなどのリンホカイン、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポェチン、卵細胞剌激ホルモンなどのホルモン、 B C Gワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソィド、八ブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフエニコール、テトラサイクリン、スプレブトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質、チアミン、リボフラビン、 Lーァスコルビン酸、 α —グリコシルァスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフエロール、ルチン、ひーグリコシルルチン、ナリンジン、 α —グリコシルナリンジン、ヘスペリジン、ーグリコシルヘスペリジンなどのビタミン類、リパ一ゼ、エラス夕ーゼ、ゥロキナーゼ、プロテアーゼ、 /3 — アミラーゼ、イソアミラーゼ、ダルカナーゼ、ラクタ一ゼなどの酵素、薬用人参エキス、笹エキス、梅エキス、松エキス、スツボンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌、ローヤルゼリーなどを例示することができる。

以上述べた各種組成物に、本発明のイソマルトース又はイソマルトース高含有物を含有させる方法は、これらの組成物が完成するまでの工程で含有させればよく、例えば、混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶出、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常、前記組成物重量当たり、 0. 1 %以上、好ましくは、 1 %以上、より好ましくは、 2乃至 9 9. 9 9 %配合する。

以下、本発明を実験例により具体的に説明する。実験例 1 ： α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と α—イソマルトシル転移酵素の調製

澱粉部分分解物（商品名『パインデックス # 4』、松谷化学株式会社製） 4. 0 w/v %、酵母抽出物（商品名『アサヒミ一スト』（アサヒビール株式会社製) 1. 8 w/v %、リン酸二カリウム 0. 1 w/ V %■ リン酸一ナトリウム . 1 2水塩 0. 0 6 wZv %、硫酸マグネシウム · 7水塩 0. 0 5 w/ V %、および水からなる液体培地を、 5 0 0 m l容三角フラスコに 1 0 0 m l ずつ入れ、オートクレープで 1 2 1 °C , 2 0 分間滅菌し、冷却して、バチルスグロビスポルス C 9 ( F E R M

B P - 7 1 4 3 ) を接種し、 2 7 °C、 2 3 0 r pmで 4 8時間回転振盪培養したものを種培養とした。

容量 3 0 Lのフアーメン夕一に種培養の場合と同組成の培地を約 2 0 L入れて、加熱滅菌、冷却して温度 2 7 °Cとした後、種培養液 1 V / V % を接種し、温度 2 7 ° (：、 ρ Η 6. 0乃至 8. 0に保ちつつ、 4 8時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中の α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性は約 0 . 4 5単位 111 1 で、 —イソマルトシル転移酵素活性は約 1. 5単位/ m 1 で、環状四糖生成活性は約 0. 9 5単位 Zm l であり、遠心分離（ 1 0 , 0 0 0 r p m、 3 0分間）して回収した上清約 1 8 Lの酵素活性を測定したところ、当該上清は、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素は約 0. 4 5単位/ m 1 の活性（総活性約 8 , 1 1 0単位）で、 Οί —イソマルトシル転移酵素は約 1. 5単位/ m l の活性（総活性約 2 6 , 9 0 0単位）を有していた。当該上清は、 ο;—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素及びひ一イソマルトシル転移酵素含有酵素剤として用いることができる。

尚、前記酵素活性は次のようにして測定した。即ち、ひ—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性は、マルトトリオースを濃度 2 w Z V %となるよう l O O mM酢酸緩衝液（p H 6. 0 ) に溶解させて基質液とし，その基質液 0. 5 m l に酵素液 0. 5 ni l加えて、 3 5 °Cで 6 0分間酵素反応し、その反応液を 1 0分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成するイソマルトシルマルトースとマルト一スのうち、このマルト一ス量を、高速液体クロマトグラフィー（以下、『H P L C 法』と略記する。）で定量して行った。 H P L C法は、『YMC P a c k OD S— AQ 3 0 3』カラム（株式会社ワイ ' ェム ' シー製）を用い力ラム温度 4 0で、流速 0. 5 m l /m i n水の条件で行い、検出は示差屈折計『 R I — 8 0 1 2』（東ソ一株式会社製）を用いて行なつた。 α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性 1単位は、上記の条件下で 1分間に 1 μモルのマルトースを生成する酵素量と定義した。又、 a;—イソマルトシル転移酵素活性は、パノースを濃度 2 wZv % となるよう l O O mM酢酸緩衝液（p H 6. 0 ) に溶解させ基質液とし. その基質液 0. 5 m l に酵素液 0. 5 m l 加えて、 3 5 °Cで 3 0分間酵素反応し、その反応液を 1 0分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成する環状四糖とグルコースのうち、このグルコース量をダルコ一スォキシダーゼ法で定量して行つた。 α—ィソマルトシル転移酵素の活性 1単位は、上記の条件下で 1分間に 1 モルのグルコースを生成する酵素量と定義した。

更に、環状四糖生成活性は、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス # 1 0 0』、松谷化学株式会社製）を濃度 2 w/v %となるよう 5 0 mM酢酸緩衝液（ p H 6. 0 ) に溶解させ基質液とし、その基質液 0. 5 m l に酵素液 0. 5 m l 加えて、 3 5 °Cで 6 0分間酵素反応し、その反応液を 1 0 0 °Cで 1 0分間熱処理して反応を停止させた後、更に、 α —ダルコシダーゼ (商品名『トランスダルコシダ一ゼ L 「ァマノ」』、天野製薬製） 7 0単位/ m 1 とダルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売） 2 7単位 1 とを含む 5 0 mM酢酸緩衝液（ p H 5. 0 ) l m l を加えて、 5 0 °Cで 6 0分間処理し、その液を 1 0 0 °Cで 1 0分間熱処理して酵素を失活させた後、環状四糖量を上記 H P L C法で定量した。環状四糖生成活性 1単位は、上記条件下で 1分間に 1 モルの環状四糖を生成する酵素量と定義した。実験例 2 ：ひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と a—イソマルトシル転移酵素の単離

<実験例 2— 1 ： α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の単離 > 実験例 1で得た培養上清約 1 8 Lを 8 0 %飽和硫安液で塩析して 4 °C.

24時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（ 1 0， O O O r pm.

3 0分間）して回収し l O mMリン酸緩衝液（ p H 7. 5 ) に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約 4 0 0 m l を得た。この粗酵素液は、一イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を 8， 1 1 0単位と、 α—イソマルトシル転移酵素活性を 2 4 , 7 0 0単位と、環状四糖生成活性を約 1 5 , 6 0 0単位有していた。この粗酵素液を三菱化学株式会社製『セパビーズ（S e p a b e a d s ) F P— D A 1 3』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量 1 , 0 0 0 m l ) に供したこの際、ひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素、 a—イソマルトシル転移酵素および環状四糖のいずれも、『セパビーズ（ S e p a b e a d s ) F P - D A 1 3』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を 1 M硫安を含む 1 O mMリン酸緩衝液（p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不純物を除き、アマシャム · フアルマシア ' バイオテク株式会社製『セフアクリル（S e p h a c r y 1 ) H R S 一 2 0 0』ゲルを用いたァフィ二ティークロマトグラフィー（ゲル量 5 0 0 m l ) に供した。酵素活性成分は、『セフアクリル（ S e p h a c r y 1 ) H R S - 2 0 0』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから O Mのリニアグラジェント、更に続いて、マルトテトラオース O mMから 1 0 O mM のリニアグラジェントで溶出させたところ、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と α—イソマルトシル転移酵素とは分離して溶出し、 α— ィソマルトシル転移酵素活性は硫安のリ二アグラジェントでその濃度が約 0 Μ付近に溶出し、 α—ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジェントでその濃度が約 3 O mM付近に溶出した。そこで、 α;—イソマルトシル転移酵素活性画分と α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性画分とを別々に集め回収した。

更に、前記 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性画分を 1 Μ硫安を含む 1 O mMリン酸緩衝液（p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『プチルートヨパール（B u t y l - T o y o p e a r 1 ) 6 5 0 M』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィ一（ゲル量 3 5 O m l ) に供した。本酵素活性成分は、『プチルートヨパール（B u t y l — T o y o p e a r 1 ) 6 5 0 M』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mのリニアグラジェントで溶出させたところ、硫安濃度約 0. 3 M付近で吸着した酵素活性成分が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を 1 M硫安を含む 1 O m Mリン酸緩衝液（P H 7. 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セフアクリル（S e p h a e r y 1 ) HR S— 2 0 0』ゲルを用いたァフィ二ティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおける 0!—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表 1 に示す。

精製した a—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を 7 . 5 w/ v %濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により本酵素の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い酵素標品であった。ぐ実験例 2 — 2 ： a—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の性質 > 実験例 2 - 1で得た精製 a—ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素を S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度 7 . 5 wZ V ) に供し、同時に泳動した分子量マ一カー（日本バイオ · ラッド · ラポラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約 1 4 0， 0 0 0 土 2 0 , 0 0 0 ダルトンであった。

精製 a —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を 2 wノ V %アンフ才ライン（アマシャム ' フアルマシア · バイォテク社製）含有等電点ポリァクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルの P Hを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は p I 約 5. 2 ± 0. 5であった。本酵素活性に及ぼす温度、 p Hの影響を活性測定の方法に準じて調べた。尚、温度の影響については、 C a ^{2 +}非存在下と 1 mM存在下で測定した。これらの結果を第 1図（温度の影響）、第 2図（ p Hの影響）を示した。酵素の至適温度は、 p H 6. 0、 6 0分間反応で約 4 0 °C (C a ^{2 +}非存在）、約 4 5 t: (C a ^{2 +} l mM存在）、至適 p Hは、 3 5 °C、 6 0分間反応で約 6. 0乃至 6. 5であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（ 2 O mM酢酸緩衝液、 p H 6. 0 ) を C a ^{2 +}非存在下又は 1 mM存在下で各温度に 6 0分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、 p H安定性は、本酵素を各 p H 5 0 mM緩衝液中で 4 °C、 2 4時間保持した後、 p Hを 6. 0に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を第 3図 (温度安定性）、第 4図（p H安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約 3 5 まで（ C a ^{2 +}非存在）、約 4 0 °Cまで ( C a ^{2 +} 1 mM存在）で、 P H安定性は約 4. 5乃至 9. 0であった。

本酵素活性に及ぼす金属ィオンの影響を濃度 I mMの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表 2に示す。

表 2 ：

表 2の結果から明らかなように、本酵素活性は、 H g ^{2 +}、 C u EDTAで著しく阻害され、 B a ^{2 +}、 S r ^{2 +}で阻害された。 C a ^{2 +}、 M n ^{2 +}で活性化されることも判明した。く実験例 2— 3 ： α—イソマルトシル転移酵素の単離 >

実験例 2— 1で得た α—イソマルトシル転移酵素画分を 1 Μ硫安を含む 1 0 mMリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソ一株式会社製『プチルートョパール（B u t y 1 — T o y o p e a r 1 ) 6 5 0 M』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィ一（ゲル量 3 5 0 m l ) に供した。本酵素は、『プチルートョパール（B u t y l — T o y o p e a r 1 ) 6 5 0 M』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mのリニアグラジェントで溶出させたとき、硫安濃度約 0. 3 M付近でゲルから溶出し、本酵素活性画分を集めた。再度、この回収画分を 1 M硫安を含む 1 OmMリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セフアクリル（ S e p h a c r y 1 ) H R S _ 2 0 0』ゲルを用いるァフィ二ティーク口マトグラフィ一により精製した。各精製ステップに於ける α—イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表 3に示ず。

表 3

<実験例 2— 4 ： α—イソマルトシル転移酵素の性質 >

実験例 2— 3で得た精製ひ一イソマルトシル転移酵素を S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度 7. 5 w/ V % ) に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイォ ' ラッド ' ラボラトリ一ズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約 1 1

2， 0 0 0 ± 2 0， 0 0 0ダルトンであった。

精製 a—イソマルトシル転移酵素を 2 wZv %アンフオライン（アマシャム ' フアルマシア ' バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルの P Hを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は p I約 5 · 5 ± 0 · 5であった。

本酵素活性に及ぼす温度、 ρ Ηの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を第 5図（温度の影響）、第 6図（ρ Ηの影響）を示した。酵素の至適温度は、 ρ Η 6 · 0、 3 0分間反応で約 4 5 °C、至適 ρ Ηは、 3 5 °C、 3 0分間反応で約 6. 0であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（ 2 0 mM酢酸緩衝液、 p H 6. 0 ) を各温度に 6 0分間保持し. 水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、 P H 安定性は、本酵素を各 p H 5 0 mM緩衝液中で 4 、 2 4時間保持した後、 p Hを 6. 0に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を第 7図（温度安定性）、第 8図（ p H安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約 4 0 °Cまでで、 p H安定性は約 4. 0乃至 9. 0であった。

本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度 1 mMの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表 4に示す。

表 4 ：

表 4の結果から明らかなように、本酵素活性は、 H g ^{2 +}で著しく阻害され、 C u ^{2 +}で阻害された。又、 C a ^{2 +}で活性化されないことも、 E D T Aで阻害されないこともわかった。

前記したバチルスグロビスポルス C 9 (F E RM B P - 7 1 4 3 ) 由来のひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素及び 0；—イソマルトシル転移酵素のいずれも本発明に於いては好適に用いることができる。実験例 3 ： α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素及び —イソマルトシル転移酵素の調製

澱粉部分分解物『パインデックス # 4』 4. O wZ v %、酵母抽出物『アサヒミースト』 1 . 8 w/ v %、リン酸二カリウム 0. l w/ v % . リン酸ーナトリウム ' 1 2水塩 0. 0 6 w/ V %、硫酸マグネシウム · 7水塩 0 . 0 5 wノ V %、および水からなる液体培地を、 5 0 0 m 1 容三角フラスコに 1 0 O m l ずつ入れ、ォ一トクレーブで 1 2 1 °C、 2 0 分間滅菌し、冷却して、バチルスグロビスポルス C 1 1 ( F E R M B P— 7 1 4 4 ) を接種し、 2 Ί。C、 2 3 0 r p mで 4 8時間回転振盪培養したものを種培養とした。

容量 3 0 Lのフアーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約 2 0 L入れて、加熱滅菌、冷却して温度 2 7 °Cとした後、種培養液 1 V / V % を接種し、温度 2 7 °C、 p H 6. 0乃至 8 . 0 に保ちつつ、 4 8時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中の本酵素活性は約 0 . 5 5単位 Zm 1 で、 α—イソマルトシル転移酵素活性は約 1 . 8単位/ m l で、環状四糖生成活性は約 1 . 1単位/ m 1 であり、遠心分離（ 1 0 , 0 0 0 r p m、 3 0分間）して回収した上清約 1 8 1 の酵素活性を測定したところ、 0；—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素は約 0. 5 1単位 Z m 1 の活性（総活性約 9、 1 8 0単位）で、 —イソマルトシル転移酵素は約 1 . 7単位/ m l の活性（総活性約 3 0 , 4 0 0単位）であった。

更に、前記培養上清約 1 8 Lを 8 0 %飽和硫安液で塩祈して 4 ° (：、 2 4時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（ 1 0， 0 0 0 r p m、 3 0分間）して回収し 1 0 mMリン酸緩衝液（ p H 7 . 5 ) に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約 4 1 6 m l を得た。この粗酵素液は、ひ —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を 8 , 4 4 0単位、 α 一イソマルトシル転移酵素活性を約 2 8， 0 0 0単位、環状四糖生成活性を約 1 7， 7 0 0単位を有することが判明した。この粗酵素液を、実験例 2— 1に記載の『セパビーズ（ S e p a b e a d s ) F P— D A 1 3』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性、 α—イソマルトシル転移酵素活性、環状四糖生成活性のいずれも、『セパビーズ（ S e p a b e a d s ) F P— D A 1 3』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この非吸着画分を 1 M硫安を含む 1 O mMリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム · フアルマシア · バイオテク株式会社製『セフアクリル（S e p h a c r y 1 ) H R S — 2 0 0』ゲルを用いたァフィ二ティークロマトグラフィー（ゲル量 5 0 0 m l ) に供した。酵素活性は、『セフアクリル（S e p h a c r y 1 ) HR S - 2 0 0』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから O Mのリニアグラジェント、更に続いて、マルトテトラオース O mMから 1 0 O mMのリ二アグラジェン卜で溶出させたところ、 a—イソマルトシル転移酵素活性成分と α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素は分離して溶出し、ひ —イソマルトシル転移酵素活性成分は、硫安のリニアグラジェントでその濃度が約 0. 3 Μ付近で溶出し、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジェントでその濃度が約 3 O mM付近で溶出した。そこで、 α—イソマルトシル転移酵素活性画分と α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素画分とを別々に集め回収した。実験例 4 ： α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と α—イソマルトシル転移酵素の単離

<実験例 4— 1 ： α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の単離 > 実験例 3で得た 0；—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素画分を 1 Μ硫安を含む 1 O mMリン酸緩衝液（p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソ一株式会社製『プチルートヨパール（B u t y l -T o y o p e a r 1 ) 6 5 0 M』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィ一（ゲル量 3 5 0 m 1 ) に供した。本酵素は、『ブチルートヨパール（B u t y l — T o y o p e a r 1 ) 6 5 0 M』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mのリニアグラジェントで溶出させたところ、硫安濃度約 0. 3 M付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を 1 M硫安を含む 1 O mMリン酸緩衝液（p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セフアクリル（S e p h a c r y 1 ) H R S— 2 0 0』ゲルを用いたァフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステツプにおける α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表 5に示す。

表 5 ：

精製した ο; —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を 7. 5 w/ V %濃度ポリァクリルアミドを含むゲル電気泳動により本酵素の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い酵素標品であった。ぐ実験例 4一 2 ：一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の性質 > 実験例 4一 1で得た精製一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度 7. 5 w/ V %) に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイォ · ラッド · ラボラトリ一ズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約 1 3 7 , 0 0 0 ± 2 0 , 0 0 0ダルトンであった。

精製 —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を 2 wZv %ァンフオライン (アマシャム · フアルマシア ' バイオテク社製) 含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白パンドおよびゲルの p Hを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は p I約 5. 2 ± 0. 5であった。

本酵素活性に及ぼす温度、 p Hの影響を活性測定の方法に準じて調べた。尚、温度の影響については、 C a ^{2 +}非存在下と 1 mM存在下で測定した。これらの結果を第 9図（温度の影響）、第 1 0図（p Hの影響）を示した。酵素の至適温度は、 p H 6. 0、 6 0分間反応で約 4 5 °C ( C a ^{2 +}非存在）、約 5 0 °C (C a ^{2 +} l mM存在）、至適 p Hは、 3 5 °C、 6 0分間反応で約 6. 0であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（ 2 O mM酢酸緩衝液、 p H 6. 0 ) を C a ^{2 +}非存在下又は 1 m M存在下で各温度に 6 0分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、 p H安定性は、本酵素を各 p H 5 0 mM緩衝液中で 4 、 2 4時間保持した後、 p Hを 6. 0に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を第 1 1図（温度安定性）、第 1 2図（ p H安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約 4 0 °C まで（C a ^{2 +}非存在）、約 4 5でまで（C a ^{2 +} l mM存在）で、 p H 安定性は約 5. 0乃至 1 0. 0であった。

本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度 1 m Mの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表 6 に示す,

表 6 ：

表 6 の結果から明らかなように、本酵素活性は、 H g ^{2 +}、 C u ^{2 +}、 E D T Aで著しく阻害され、 B a ^{2 +}、 S r ^{2 +}で阻害された。 C a ^{2 +}、 M n ^{2 +}で活性化されることも判明した。

<実験例 4 _ 3 ： α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素のアミノ酸配列 >

本発明は α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素自体に関する発明ではないこと、又、その詳細なアミノ酸配列の分析方法については、特願 2 0 0 1 一 5 4 4 1号明細書に詳細に開示されていることから割愛するが、実験例 4 — 1 で得た α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素は、特願 2 0 0 1 一 5 4 4 1号明細書に開示されているポリべプチドと同様、配列表に於ける配列番号 1 に併記したアミノ酸配列に於ける第 3 6乃至 1 2 8 4番目のアミノ酸配列を有する。

<実験例 4 一 4 ： α —イソマルトシル転移酵素の単離〉

実験例 3で得た α —イソマルトシル転移酵素画分を、 1 Μ硫安を含む 1 0 mMリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『プチル— トヨパール（B u t y 1 -T o y o p e a r 1 ) 6 5 0 M』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィ一（ゲル量 3 5 0 m 1 ) に供した。本酵素は、『プチル— トヨパール (B u t y l — T o y o p e a r l ) 6 5 0 M』ゲルに吸着し、硫安 1 から 0 Mのリニアグラジェントで溶出させたところ、硫安濃度約 0. 3 M付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を 1 M硫安を含む 1 O mMリン酸緩衝液（p H 7 , 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セフアタリル（S e p h a c r y l ) HR S— 2 0 0』ゲルを用いたァフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおける α—イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表 7に示す。表 7 ：

<実験例 4一 5 ： α;—イソマルトシル転移酵素の性質 >

実験例 4一 4で得た精製一イソマルトシル転移酵素を S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 (ゲル濃度 7. 5 w / V % ) に供し、同時に泳動した分子量マ一カー（日本バイォ · ラッド · ラボラトリ一ズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約 1 0 2 , 0 0 0 ± 2 0 , 0 0 0ダルトンであった。

精製 α—イソマルトシル転移酵素を 2 wZv %アンフオライン（アマシャム · フアルマシア · バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルの p Hを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は p I約 5. 6 ±0. 5であった。

本酵素活性に及ぼす温度、 p Hの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を第 1 3図（温度の影響）、第 1 4図（p Hの影響）を示した < 酵素の至適温度は、 p H 6. 0、 3 0分間反応で約 5 0 °C、至適 p Hは. 3 5 °C、 3 0分間反応で約 5. 5乃至 6. 0であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（ 2 0 mM酢酸緩衝液、 p H 6. 0 ) を各温度に 6 0 分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、 p H安定性は、本酵素を各 p H 5 0 mM緩衝液中で 4 °C、 2 4 時間保持した後、 p Hを 6. 0に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を第 1 5図（温度安定性）、第 1 6 図（P H安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約 4 0 °Cまでで、 p H安定性は約 4. 5乃至 9. 0であった。

本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度 1 mMの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表 8に示す。表 8 ：

表 8の結果から明らかなように、本酵素活性は、 H g ^{2 +}で著しく阻害され、 C u ^{2 +}で阻害された。又、 C a ² +で活性化されないことも、 E D T Aで阻害されないこともわかった。

<実験例 4 一 6 ：ひ —イソマルトシル転移酵素のアミノ酸配列 > 本発明は α—イソマルトシル転移酵素自体に関する発明ではないこと又、その詳細なアミノ酸配列の分析方法については、特願 2 0 0 0 — 3 5 0 1 4 2号明細書に詳細に開示されていることから割愛するが、実験例 4 一 4で得た α —イソマルトシル転移酵素は、特願 2 0 0 0 - 3 5 0 1 4 2号明細書に開示されているとおり、配列表に於ける配列番号 2 に併記したアミノ酸配列に於ける第 3 0乃至 1 0 9 3番目のアミノ酸配列を有する。実験例 5 ： —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の各種糖質への作用各種糖質（基質）に対する α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の作用について試験した。即ち、マルト一ス、マルトトリオ一ス、マルトテトラオース、マルトペン夕オース、マルトへキサオース、マルトヘプ夕オース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、 a， CK — トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレ八ロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、セラギノース、マルトシルダルコシド、ィソマルトシルダルコシドを含む溶液を調製し、これらの溶液に、実験例 2 — 1 で得たバチルスグロビスポルス C 9 由来の精製 α—ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素、又は実験例 4 一 1 で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 a —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素標品を基質固形物グラム当たりそれぞれ 2単位ずつ加え、基質濃度を 2 % ( w / V ) に調製し、 3 0 ° (：、 p H 6 . 0 で 2 4時間反応させた。酵素反応前後の反応液を、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、『T L C法』と略記する。）分析に供した。 T L C 法は、展開溶媒として n —ブタノール、ピリジン、水混液（容量比 6 ： 4 ： 1 ) 、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル 6 0』（アルミプレート、 2 0 X 2 0 c m ) を用い 2回展開して糖質を分離し、次いで、アルミプレート上に硫酸一メタノールを噴霧して発色させて全糖質を検出し、更に、還元糖質は、ジフエ二ルァミンーァニリン法で発色させて検出する方法により行った。 T L C法の結果を表 9 に示す。

表 9 ：

注）酵素 ®s前後で、

「一」は、変化無しを示し、

Γ +」は、基質のスポツ卜が僮かに減少し、他の生成物が認められるを示し、

「+ +」は、基質のスボッ卜がかなり、し、他の生成物が認められるを示し、

「+ + +」は、基質のスボッ卜がほとんど消失し、他の生成物が認められるを示す。

表 9の結果から明らかなように、 —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素は、試験した多種の糖質のうち、グルコース重合度 3以上で、非還元末端にマルト一ス構造を有する糖質によく作用することが判明した。又、グルコース重合度が 2 の糖質では、マルト一ス、コ一ジピオ一ス、ニゲロース、ネオトレハロース、マル卜トリイト一ル、エルロースにも僅かに作用することが判明した。実験例 6 ：マルトオリゴ糖からの生成物

濃度 1 %のマルト一ス、マルトトリオース、マルトテトラオース又はマルトペン夕オース水溶液に、実験例 4一 1 で得た精製ひ —ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素を、固形物グラム当たり、マルト一スおよびマルトトリオースに対しては 2単位、マルトテトラオースに対しては 0. 2単位、マルトペン夕オースに対しては 0. 1単位加え、 3 5 °C、 p H 6. 0で 8時間作用させた後、 1 0 0 °Cで 1 0分間保持して酵素を失活させて反応を停止した。得られた酵素反応液の糖組成を H P L C法により測定した。 H P L C法としては、『YMC P a c k O D S - A Q 3 0 3』カラム（株式会社ワイ · ェム · シ一社製）を用いカラム温度 4 0 °C、流速 0. 5 m l /m i n水の条件下で行い、検出は示差屈折計（商品名『 R I — 8 0 1 2』、東ソー株式会社製）を用いて行なった。その結果を表 1 0に示す。

¾≠ 5丁 ^一，^ »湘：^ s J； 1 ¾ ¾θ 0 S ¾ Q： ο 反応で生成した糖質の種類マノレト一スマノレト卜リ才ースマノレトテ卜ラオ一マノレ卜ペンタ才一ス

ス

グルコース U . 丄 u - υ

マノレ卜ース 1

1 0. U 丄マ a π υ . 0. (J

マル卜トリオース 1

ί 1

マルトテ卜ラオース o . o 1. 8 35. 1 i g. 2

マル卜ペン夕オース 0. 0 0. 0 3. 5 34. 4

マルトへキサオース 0. 0 0， 0 0. 0 4. 6

イソマルト一ス 0. 5 0. 0 0. 0 0. 0

ダルコシルマルト一ス 8. 2 1. 2 0. 0 0. 0

グルコシルマル卜トリオ—ス 2. 4 31. 5 6. 8 0. 0

X 0. 0 2. 1 30. 0 1 1. 4

Y 0. 0 0. 0 1. 4 26. 8

Z 0. 0 0. 0 0. 0 1. 7

その他 0. 6 0， 1 0. 2 0. 0

表中の ₂

グルコシルマルト一スは、 a—イソマルトシルグルコース（別名、 6 — 0— α—グノレコシルマルト一ス、ノヽ "ノース）で、

グノレコシルマル卜トリオースは、 α ("ソマノレトシノレマル ! ~一ス（別名、 6 — 0— α—グノレコシルマノレト卜リオ—ス）で、

Xは、実験例フに記載の α—イソマル卜シルグノレコトリオ一ス（別名、 6 _0— α—グルコシルマル卜テ卜ラオース）で、

Υは、実験例 7に記載の α—イソマルトシルグルコテ卜ラオ—ス（別名、 6⁵— 0— α—ダルコシルマル卜ペンタオース)で、

m Ζは、未同定の糖質である。

7β

ースからは、主にグルコースと α —イソマルトシルグルコース (別名、 6 ²—〇一 α —ダルコシルマルト一ス、パノース）とが生成し、マルトトリオース、イソマルトース、 en 一イソマルトシルマルトース (別名、 6 ³ - 0 - a; _ダルコシルマルトトリオ一ス）を少量生成することが判明した。又、基質マルトトリオースからは、主にマルトースと α —イソマルトシルマルトースとが生成し、少量ながらグルコース、マルトテトラオース、 α —イソマルトシルグルコース (別名、 6 ²— Ο— α —ダルコシルマルト一ス、パノース）、生成物 Xが生成することが判明した。基質マルトテトラオースからは、主にマルトトリオースと生成物 Xが生成し、少量ながらマルトース、マルトペン夕オース、 0!—イソマルトシルマルト一ス（別名、 6 ³— Ο— α —ダルコシルマル卜トリオ一ス）、生成物 Υが生成することが判明した。基質マルトペン夕オースからは、主にマルトテトラオースと生成物 Υが生成し、少量ながらマルトトリオース、マルトへキサオース、生成物 X及び生成物 Ζが生成することが判明した。

基質マルトテトラオースからの主生成物である生成物 X並びに基質マルトペン夕オースからの主生成物である生成物 Υの単離 · 精製を行った分取用 H P L Cカラム『Y M C— P a c k O D S — A R 3 5 5 - 1 5 S - 1 5 1 2 A』（株式会社ヮイエムシィ製）を用いて精製し、上記のマルトテトラオースからの反応物、マル卜ペン夕オースからの反応物それぞれから、純度 9 9 . 9 %以上の生成物 Xを固形物収率約 8 . 3 % で、純度 9 9 . 9 %以上の生成物 Yを固形物収率約 1 1 . 5 %で単離した。実験例 7 ：生成物の構造解析

実験例 6 の方法で得た生成物 Xおよび生成物 Yを用いて、常法に従つてメチル化分析と N M R分析を行なった。メチル化分析の結果は表 1 1 にまとめた。 NMR分析の結果については、 i H— NMRスペクトルを第 1 7図（生成物 X) 、第 1 8図（生成物 Y) に、 ^{1 3} C— NMRスぺクトルおよび帰属を第 1 9図（生成物 X) 、第 2 0図（生成物 Y) 、表 1 2にまとめた。

組成比

分析メチル化物の種類

生成物 X 生成物 Y

2, 3， 4一トリメチノレイ匕物 1. 00 1. 00

2, 3, 6—トリメチル化物 3. 05 3. 98

2, 3, 4, 6—テトラメチル化物 0. 82 0. 85

表 1 2

これらの結果から、ひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素によるマルトテトラオースからの生成物 Xは、マルトテトラオースの非還元末端グルコースの 6位水酸基にグルコース基が α結合した 5糖で、構造式 1 で表わされる α—イソマルトシルダルコトリオース (別名、 6 ⁴— 0— a―ダルコシルマルトテトラオース）であることが判明した。

構造式 1 ：

a D - G l c p ( 1→ 6 ) a D - G l c p ( 1→ 4 ) a D - G l c p ( 1 → 4 ) a D - G l c p ( 1→ 4 ) D - G 1 c p

又、マルトペン夕オースからの生成物 Yは、マルトペン夕オースの非還元末端グルコースの 6位水酸基にダルコシル基が a結合した 6糖で、構造式 2で表わされる a—イソマルトシルダルコテトラオース（別名、 6 ⁵— 0— a—ダルコシルマルトペン夕オース）であることが判明した。構造式 2 ：

a D - G l c p ( 1→ 6 ) a D - G l c p ( 1—4 ) a D - G l c p ( 1 → 4 ) a D - G l c p ( 1→ 4 ) a D - G l c p ( 1→ 4 ) D - G 1 c P

以上のことから、 a;—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素のマルトォリゴ糖に対する作用は以下のように判断された。

( 1 ) 本酵素は、基質として、 a— 1 ， 4結合からなるグルコース重合度 2以上の糖質（マルトオリゴ糖）に作用し、その非還元性末端のダルコシル残基を他の分子の非還元性末端のダルコシル残基の 6位に転移する作用を有する分子間 6—ダルコシル転移を触媒して、非還元末端に 6 一 O— 一ダルコシル基を有するグルコース重合度が 1増加した a—ィソマルトシルダルコ糖質（別名、 6 — O _ a—ダルコシルマルトオリゴ糖）と、グルコース重合度が 1減じたマルトオリゴ糖とを生成する。

( 2 ) 本酵素は、 4一ダルコシル転移も僅かに触媒し、マルトオリゴ糖から、グルコース重合度が 1増加したマルトオリゴ糖と、グルコース重合度が 1減じたマルトオリゴ糖とを僅かに生成する。実験例 8 転移受容体特異性

各種糖質を用いて、本酵素の糖転移受容体になり得るかどうかの試験をした。即ち、 D—グルコース、 D—キシロース、 Lーキシロース、 D 一ガラクトース、 D—フラクト一ス、 D—マンノース、 D—ァラビノース、 D—フコース、 L —ソルポース、 L 一ラムノース、メチル一 α —グルコシド、メチル一 j3 —ダルコシド、 N—ァセチル—ダルコサミン、ソルビトール、 a , α — トレ八ロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビ才一ス、ゲンチビオース、マルチトール、ラクト一ス、スクロース、 α _サイクロデキストリン、一サイクロデキストリン又はアーサイクロデキストリンを用いて濃度 1 . 6 %の溶液（糖転移受容体溶液）を調製し、これに、糖供与体として «粉部分分解物『パインデックス # 1 0 0』（濃度 4 % ) を加え、実験例 2 — 1 の方法で得たバチルスグロビスポルス C 9 由来の精製 —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素又は実験例 4 一 1 で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を、糖供与体固形物グラム当たり、それぞれ 1単位ずつ加え、これを 3 0 °C、 p H 6 . 0で 2 4時間反応させた。酵素反応後の反応液を、糖受容体が単糖又は二糖類の場合はガスクロマトグラフィー法（以下、『 G L C法』と略記する。）で、糖受容体が三糖類以上の場合は H P L C法で分析し、それぞれの糖受容体が、本酵素による糖転移受容体になるか否かを確認した。尚、 G L C法に於いて、 G L C装置は『 G C — 1 6 A』（株式会社島津製作所製）、カラムはジ一 ' エル ' サイエンス株式会社製『 2 %シリコン O V 一 1 7 /クロモゾルブ』を充填したステンレス製カラム（ 3 mm <i) X 2 m) 、キャリアーガスは窒素ガスを流量 4 0 m l /分で 1 6 0 °Cから 3 2 0 °Cまで 7 . 5 °C/分の速度で昇温し、検出は水素炎イオン検出器で分析した。 H P L Cでは、 H P L Cの装置は東ソ一株式会社製『 C C

^ヾ u

「一」は、受容体への糖転移物が検出されなかったを示し、

「土」は、受容体への糖転移物が検出されたが，その生成量が 1 %未満であったを示し、

「十」は、受容体への糖転移物が 1以上 1 0 %未溝であったを示し、

は、受容体への糖転移物が 1 0 96以上であったを示す。

"CO

Α β ¾』 ¾7Λ Λ ¾: Λ〇 D S 303Η A ¾ D『< ダルコシド、 a , - トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、ラクト一ス及びスクロースによく転移し、次いで、 D—グルコース、 D —フラクト一ス、 D—フコース、 L 一ソルポース及び N—ァセチルダルコサミンにも転移し、更には、 D—ァラビノースにも転移する作用を有する酵素である。実験例 9 ：培養物からの環状四糖の調製

澱粉部分分解物（商品名『パインデックス # 1 』、松谷化学式会社製） 5 w/ v %、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、アサヒビ一ル株式会社製） 1 . 5 w/v %、リン酸二カリウム 0 . l wZv %、リン酸ーナトリウム · 1 2水塩 0 . 0 6 w/ v %、硫酸マグネシウム · 7 水塩 0 . 0 5 w/ v %、および水からなる液体培地を、 5 0 0 m l 容三角フラスコに 1 0 0 m l を入れ、ォ一トクレーブで 1 2 1 °C、 2 0分間滅菌し、冷却して、バチルスグロビスポルス C 9 ( F E R M B P - 7 1 4 3 ) を接種し、 2 7 °C、 2 3 0 r p mで 4 8時間回転振盪培養した後、遠心分離して菌体を除き培養上清を得た。さらに、その培養上清をオートクレープ（ 1 2 0 ° (：、 1 5分間）し、放冷した後、不溶物を遠心分離して除き上清を回収した。この上清約 9 0 m l を p H 5 . 0、温度 4 5 °Cに調整した後、 α —ダルコシダーゼ（商品名『トランスダルコシダ一ゼ L 「ァマノ」』、天野製薬株式会社製）を固形物グラム当り 1 , 5 0 0単位とダルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物グラム当り 7 5単位添加して 2 4時間処理し、続いて、水酸化ナトリウムで ρ Ηを 1 2 に調整し 2時間煮沸して、残存する還元糖を分解した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダィャアイオン Ρ Κ 2 1 8』と『ダイヤイオン WA 3 0』を用いて脱色、脱塩し、さらに、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイヤイオン S K— 1 B』とオルガノ製ァ二オン交換樹脂『 I R A 4 1 1』で再度脱塩し、活性炭で脱色し、精密濾過した後、エバポレー夕で濃縮し凍結真空乾燥して固形物として約 0 . 6 gの糖質粉末を得た。本糖質粉末は、環状四糖を 9 9 . 9 %以上含有していた。実験例 1 0 ：環状四糖の生成

各種糖質を用いて、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素および α —ィソマルトシル転移酵素の作用による環状四糖生成試験を行った。糖質として、マルト一ス、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペン夕オース、アミロース、可溶性澱粉、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス # 1 0 0』、松谷化学株式会社製）'又はグリコーゲン（力キ由来、和光純薬株式会社販売）を用い、それらの水溶液を別々に調製した。

これらの水溶液（濃度 0 . 5 % ) に、実験例 4 一 1で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 a —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり 1単位と、実験例 4 一 4の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマルトシル転移酵素を固形物グラム当り 1 0単位とを加え、これらを 3 O ：、 p H 6 . 0で作用させた。作用条件は、以下の 4つの系で行った。

( 1 ) α—ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素を各種糖質に 2 4時間作用させた後、酵素を熱失活し、続いて、 α —イソマルトシル転移酵素を 2 4時間作用させた後、酵素を熱失活させた。

( 2 ) α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と α—イソマルトシル転移酵素とを 2 4時間作用させた後、酵素を熱失活させた。

( 3 ) 'α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素のみを 2 4時間作用させた後、酵素を熱失活させた。

( 4 ) 一イソマルトシル転移酵素のみを 2 4時間作用させた後、酵素を熱失活させた。

これら熱失活させた反応液中の環状四糖の生成量を調べるために、実験例 1 と同様の α―ダルコシダーゼとダルコァミラ一ゼとを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、 H P L C法で環状四糖を定量した。それらの結果を表 1 4に示す。

表 1 4 ：

表 1 4の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質も、 α—ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素のみの作用および α—イソマルトシル転移酵素のみの作用では、環状四糖は全く生成しなかったのに対して、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と α—イソマルトシル転移酵素を併用することにより環状四糖が生成した。その生成量は、 a—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を作用させた後に α—イソマルトシル転移酵素を作用させた場合には、約 1 1 %以下と比較的に低いのに対して、一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と α —イソマルトシル転移酵素とを併用すると、いずれの糖質でも環状四糖の生成量は向上し、特に、ダリコーゲンでは約 8 7 %に増加し、澱粉部分分解物では約 6 4 %に増加することが判明した。

この α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と α —イソマルトシル転移酵素との併用における環状四糖の生成メカニズムは、両酵素の反応特性から以下のように推察される。

( 1 ) α: —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素は、グリコーゲンや部分分解物などの α— 1 , 4グルカン鎖の非還元末端グルコース基に作用し. そのグルコース基を他のひ一 1， 4グルカン鎖の非還元末端グルコース基の 6位水酸基に分子間転移させ、非還元末端に α —イソマルトシル基を有する 0：— 1， 4グルカン鎖が生成する。

( 2 ) —イソマルトシル転移酵素は、非還元末端にイソマルトシル基を有するひ一 1 , 4グルカン鎖に作用し、そのイソマルトシル基を、他の非還元末端にイソマルトシル基を有する α— 1 , 4グルカン鎖の非還元末端グルコース基の 3位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にイソマルトシルー 1 , 3 —イソマルトシル基を有する α — 1 , 4グルカン鎖が生成する。

( 3 ) 続いて、 α —イソマルトシル転移酵素は、その非還元末端にイソマルトシルー 1， 3 —イソマルトシル基を有する ο;— 1， 4グルカン鎖に作用し、分子内転移作用によってイソマルトシルー 1 , 3 —イソマルトシル基を α— 1 , 4 グルカン鎖から切り離し、環状化して環状四糖が生成する。

( 4 ) 切り離された一 1 , 4グルカン鎖は、再度、（ 1 ) 乃至（ 3 ) の反応を経由することによって、新たに環状四糖が生成する。 α; —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と一イソマルトシル転移酵素との併用で、上記のように両酵素が繰り返し作用して環状四糖の生成量が増加すると推定される。実験例 1 1 ：澱粉液化度の影響

とうもろこし澱粉を濃度 1 5 %澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを 0. 1 %加えて p H 6. 0に調整し、ひ一アミラーゼ（商品名『ターマミール 6 0 L』、ノポ社製）を澱粉グラム当り 0. 2乃至 2. 0 %を加え、 9 5 °Cで 1 0分間反応させ、次いで、 1 2 0 °Cで 2 0分間ォ一トクレ一ブし、約 3 5 °Cに急冷して、 D E 3. 2乃至 2 0. 5の液化溶液を得、これに、実験例 4— 1で得たバチルスグロビスポルス C 1 1由来の精製 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり 2単位と、実験例 4一 4の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製ひ一イソマルトシル転移酵素を固形物グラム当り 2 0単位とを加え、 3 5 °Cで 2 4時間反応させた。 1 0 0でで 1 5分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験例 1 と同様にひ—ダルコシダーゼとダルコアミラ一ゼとを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、 H P L C法で環状四糖を定量した。それらの結果を表 1 5に示す, 表 1 5 ：

表 1 5の結果から明らかなように、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と α —イソマルトシル転移酵素とによる環状四糖の生成は、澱粉の液化の程度で影響を受け、液化の程度が低いほど、即ち、 D Eが低値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率は高く、逆に、液化の程度が高いほど、即ち、 D Eが高値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率が低いことが判明した。具体的には、澱粉の部分分解の程度は約 2 0以下、望ましくは、 D E約 1 2以下、更に望ましくは、 D E 5約以下が適していることが判明した。実験例 1 2 ：澱粉部分分解物濃度の影響

澱粉部分分解物『パインデックス # 1 0 0』（D E約 2乃至約 5 ) の最終濃度 0 . 5乃至 4 0 %の水溶液を調製し、それぞれに、実験例 4 一 1 で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製ひ —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり 1単位と、実験例 4 一 4 で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマルトシル転移酵素を固形物グラム当り 1 0単位加え、両酵素を併用して 3 0 °C p H 6 . 0で 4 8時間作用させた後、 1 0 0 °Cで 1 5分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験例 1 と同様にひ—ダルコシダーゼとダルコアミラーゼを用いて、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、 H P L C法で環状四糖を定量した。それらの結果を表 1 6 に示す。

表 1 6 ：

表 1 6 の結果から明らかなように、澱粉部分分解物の濃度が 0 . 5 % の低濃度では、環状四糖の生成量は約 6 4 %であるのに対し、濃.度 4 0 % の高濃度では、環状四糖の生成量は約 4 0 %と、基質である澱粉部分分解物の濃度に依存して環状四糖の生成量が変化することが判明した。この結果から、環状四糖の生成量は、澱粉部分分解物の濃度により変化することが判明した。実験例 1 3 ：シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ添加効果澱粉部分分解物『パインデックス # 1 0 0』水溶液（濃度 1 5 % ) を調製し、実験例 4 一 1 で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり 1単位と、実験例 4 — 4で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマルトシル転移酵素を固形物グラム当り 1 0単位と、バチルス · ステア口サ一モフィルス由来の C G T a s e を固形物グラム当り 0 乃至 0 . 5単位加え、両酵素を併用して 3 0 °C、 p H 6 . 0で 4 8時間作用させた後、 1 0 0 で 1 5分間熱処理して酵素を失活させた。次いで、酵素反応液を α—ダルコシダーゼ（商品名『トランスダルコシダ一ゼ L 「ァマノ」』、天野製薬株式会社製）とダルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）を用いて、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、 H P L C法で環状四糖を定量した。それらの結果を表 1 7に示す, 表 1 7 ：

表 1 7の結果から明らかなように、 C GT a s eを添加することによつて、環状四糖の生成量が増加することが判明した。実験例 1 5 ：イソマルトース遊離酵素の調製

デキストラン 3. 0 w/v %、ペプトン 0. 7 w/v %、リン酸二力リウム 0. 2 w/ V %、硫酸マグネシゥム . 7水塩 0. 0 5 w/ V %及び水からなる液体培地を、 5 0 0 m l容三角フラスコに 1 0 0 m lずつ入れ、ォ一トクレ一ブで 1 2 1 °C、 2 0分間滅菌し、冷却して、ァルスロバク夕一グロビホルミス（ I AM 1 2 1 0 3 ) を接種し、 2 7 ° (：、 2 3 0 r p mで 4 8時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量 3 0 Lのフアーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約 2 0 L入れて, 加熱滅菌、冷却して温度 2 7 °Cとした後、種培養液 l v/v %を接種し，温度 2 7 t：、 p H 6. 0乃至 8. 0に保ちつつ、 7 2時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中のイソマルト一ス遊離酵素としてのイソマルトデキストラナ一ゼ活性は約 1 6. 5単位/ m I であり、遠心分離（ 1 0 , 0 0 0 r p m、 3 0分間）して回収した上清約 1 8 Lの酵素活性を測定したところ、本酵素は約 1 6単位/ m 1 の活性（総活性約 2 8 8、 0 0 0単位）であった。尚、イソマルトデキス卜ラナ一ゼ活性の測定は、濃度 0. 1 M酢酸緩衝液（ p H 5. 5 ) を含む濃度 1. 2 5 wZv %デキストラン水溶液 4m I を基質液とし、その基質液に酵素液 l m l加えて. 4 0 °Cで 2 0分間酵素反応し、その反応液から 1 m 1 を採り、それをソモギー銅液 2 m l に加えて反応を停止させた後、生成したイソマルト一スの還元カをソモギ一 · ネルソン法で定量することにより行った。イソマルトデキストラナーゼの活性 1単位は、上記の条件下で 1分間に 1 μ モルのイソマルトースに相当する還元力を生成する酵素量と定義した。培養上清約 1 8 Lを U F膜で約 2 Lに濃縮した後、 8 0 %飽和硫安液で塩祈して 4° (：、 2 4時間放置した。その塩析沈殿物を遠心分離（ 1 0、 0 0 0 r pm、 3 0分間）して回収し 5 mMリン酸緩衝液（： p H 6. 8 ) に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約 4 0 0 m 1 を得た。この粗酵素液を『 S e p a b e a d s F P— D A I 3』ゲルを用いたィオン交換クロマトグラフィー（ゲル量 2 L) に供した。イソマルトデキストラナーゼ活性は、『セパビーズ（ S e p a b e a d s ) F P - D A 1 3』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この活性画分を回収し、 8 0 %飽和硫安液で塩祈して 4で、 2 4時間放置した。その塩析沈殿物を遠心分離（ 1 0， 0 0 0 r p m、 3 0分間）して回収し 5 mMリン酸緩衝液（ P H 6. 8 ) に溶解後、同緩衝液に対して透析して、イソマルトデキストラナ一ゼ活性として 1 6 1 , 0 0 0単位を含む部分精製酵素液約 5 0 0 m 1 を得た。実験例 1 6 ： α—イソマルトシルダルコ糖質及び環状四糖からのイソマルトースの調製

最終固形物濃度 0. 2 %のパノース、 α—イソマルトシルマルトース. α—イソマルトシルトリオース、一イソマルトシルテトラオース、又は環状四糖水溶液に、実験例 1 5の方法で得たィソマルトデキストラナーゼを、固形物グラム当たり 1 0 0単位（環状四糖の場合、 1 0 0単位又は 3 0 0 0単位）を加えて、 4 0 °C、 p H 5. 5で 2 4時間作用させ. 1 0 0 °Cで 2 0分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を HP L C法を用いて測定した。 H P L Cは、『MC I G E L C K 0 4 S S』カラム（三菱化学株式会社製）を用い、カラム内温度 8 0 °C、溶離液としての水の流速 0. 5 m 1 /m i nの条件で行い、検出は示差屈折計『 R I — 8 0 1 2』（東ソ一株式会社製）を用いて行なった。その結果を表 1 8に示す。

表 1 8 ：

表中、 IMG 1、 IMG 2、 IMG 3、 IMG4は、それぞれ、ノゝソース、 α:—イソマルトシノレマルトース、 α—イソマルトグルコトリオース、イソマルトグルコテトラオースを、 G 1、 I M、 G 2、 G 3、 G 4は、それそれ、グルコース、イソマルトース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースを、 Αは、環状四糖からイソマルトースを生成する過程での中間体を意味する。表 1 8の結果から明らかなように、 α—イソマルトシルダルコ糖質にイソマルトデキストラナ一ゼを作用させた結果、基質としてのパノースからは、グルコースとイソマルトースのみが生成し、基質としての α— イソマルトシルマルト一スからは、イソマルト一スとマルトースとのみが生成し、基質としての α—イソマルトシルトリオースからは、イソマルトースとマルトトリオースのみが生成し、基質としての α—イソマルトシルテトラオースからは、イソマルトースとマルトテトラオースのみが生成することが判明した。一方、基質としての環状四糖からは、生成物 Αを中間体として、ィソマルト一スのみが生成することが判明した。次いで、基質としての環状四糖からの中間体である生成物 Aの精製と単離を行った。即ち、分取用 H P L Cカラム『YM C— P a c k 〇 D S - A R 3 5 5 — 1 5 S — 1 5 1 2 A』（株式会社ヮイエムシィ社製）を用いて生成物 Aを精製し単離することにより、上記の環状四糖からの反応物から、純度 9 8 . 2 %以上の生成物 Aを固形物収率約 7. 2 % で単離した。

生成物 Aについて、常法に従ってメチル化分析と N M R分析とを行なつた。メチル化分析結果は表 1 9 にまとめた。 NMR分析結果につていては、 — NM Rスペクトルを第 2 1 図に示した。又、 ^{1 3} C— NM R スぺクトルを第 2 2図に示し、それらの帰属を表 2 0 にまとめた。表 1 9 ：分析メチルイヒ物の種

組成比

2, 3, 4一トリメチル化物 2. 0 0

2, 4, 6— トリメチル化物 0. 9 2

2， 3, 4， 6—テトラメチル化物 0. 8 8 表 2 0 ：

これらの結果から、イソマルトデキストラナーゼによる環状四糖からイソマルト一スを生成する際の中間体である生成物 Αは、環状四糖の a 一 1 , 3結合のいずれか一つが加水分解して開環化した四糖類で、構造式 3で表わされる一ダルコシルー（ 1— 6 ) 一 α —ダルコシルー ( 1 → 3 ) 一 a —ダルコシル— （ 1→ 6 ) — a —グルコース（開環四糖）であることが判明した。

構造式 3 ：

a D - G 1 c p ( 1→ 6 ) a D - G 1 c p ( 1→ 3 ) a D— G l c p — ( 1→ 6 ) a D - G 1 c p

以上のことから、イソマルトデキストラナーゼの a;—イソマルトシルダルコ糖質に対する作用は以下のように判断される。

イソマルトデキストラナ一ゼは、基質として、非還元末端に 6 — 0— a —ダルコシル基を有するひ一イソマルトシルダルコ糖質に作用し、その非還元性末端のイソマルトシル残基とグルコース（マルトオリゴ糖）残基間の a— 1 , 4結合を特異的に加水分解して、イソマルト一スとグルコース (マルトオリゴ糖) とを生成する。又、イソマルトデキストラナ一ゼは、基質として、環状四糖にも作用し、その a— 1， 3結合を加水分解して、開環して、中間体として開環四糖を生成し、さらに、開環四糖にも作用し、その a— 1 , 3結合を加水分解して、イソマルトースを生成する。実験例 1 7 ：各種基質からのイソマルトースの生成

各種糖質を用いて、 a —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素及びイソマルトデキストラナーゼの作用によるイソマルト一スの生成について試験した。即ち、マルト一ス、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペン夕オース、マルトへキサオース、マルトへプタオ一ス、アミロース、又は澱粉部分分解物（商品名『パインデックス # 1 0 0』、松谷化学株式会社製）と塩化カルシウムを用いて、それぞれ水溶液の糖質最終濃度が 5 %、塩化カルシウム最終濃度が 1 m Mとなるように調製した。次いで、実験例 4 一 1で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり 0 . 2単位と、実験例 1 5 の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを固形物グラム当り 1 0 0単位とを加え、これらを 4 0 C p H 5 . 5で反応させた。反応条件は、下記 2つの系で行った。

( 1 ) —ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素を糖質に 6 5時間作用させた後、酵素を熱失活し、続いて、イソマルトデキストラナ一ゼを 6 5 時間作用させた後、酵素を熱失活させた。

( 2 ) a —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素とィソマルトデキストラナーゼとを併用で糖質に 6 5時間作用させた後、両酵素を加熱失活させた。次いで、加熱処理した酵素反応液中のイソマルト一ス生成量を H P L C法で定量した。それらの結果を表 2 1 に示す。

表 2 1 ：

表 2 1 の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質からも、 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼの作用によってイソマルト一スが生成した。その生成量は、 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を作用させた後にィソマルトデキストラナ一ゼを作用させた場合には、約 1 5 %以下と比較的に低いのに対して、 α 一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素とイソマルトデキス卜ラナーゼとを共に作用させると、いずれの糖質に於いても、イソマルトースの生成量は向上し、特に、マルトへプタオ一ス、アミロース、澱粉部分分解物では 6 0 %以上にまで増加することが判明した。このひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼとの併用におけるイソマルト一スの生成メカニズムは、両酵素の反応特性から以下のように推定される。

( 1 ) ひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素は、アミロースや澱粉部分分解物などの Q! — 1 ， 4グルカン鎖の非還元末端グルコース基に作用し、そのグルコース基を他の α— 1 ， 4グルカン鎖の非還元末端ダルコース基の 6位水酸基に分子間転移させ、非還元末端に 0；—ィソマルトシル基を有するひ一 1 ， 4グルカン鎖が生成する。

( 2 ) イソマルトデキストラナ一ゼは、非還元末端にイソマルトシル基を有する — 1 , 4 グルカン鎖に作用し、そのイソマルトシル基と α— 1 ， 4グルカン鎖間 α _ 1 ， 4結合を加水分解して、イソマルトースとグルコース重合度が 2減じたグルカン鎖とを生成する。

( 3 ) 切り離された一 1 , 4グルカン鎖は、再度、（ 1 ) 乃至（ 2 ) の反応を受けることによって、新たにイソマルト一スが生成する。 α— イソマルトシルダルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼとの併用で、上記したように、両酵素が繰り返し作用してイソマルトースの生成量が増加すると推定される。実験例 1 8 ：イソアミラーゼの添加効果

澱粉部分分解物『パインデックス # 1 0 0』水溶液（最終濃度 5 % 、 1 m M塩化カルシウム含有）を調製し、実験例 4 一 1で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製ひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり 0 . 2単位と、実験例 1 5で得たイソマルトデキストラナ一ゼを澱粉グラム当り 1 0 0単位と、シュ一ドモナスアミロデラモサス由来イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当り 0乃至 2 5 0単位加え、 4 0 ° (：、 p H 5 . 5で併用で 6 5時間作用させた後、 1 0 0 °Cで 1 5分間熱処理して酵素を失活させた, 生成したイソマルトースを H P L C法で定量した。それらの結果を表 2 2 に示す。

表 2 2 ：

表 2 2 の結果から明らかなように、イソアミラーゼを添加することよって、ィソマルトースの生成量が増加することが判明した。実験例 1 9 ：澱粉部分分解物濃度の影響

濃度の異なる 8種類の澱粉部分分解物『パインデックス # 1 0 0 』（D E約 2乃至約 5 ) 水溶液（（最終濃度 1 乃至 4 0 %の水溶液、 I m M塩化カルシウム含有）を調製し、それぞれに、実験例 4 一 1 で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり 0 . 2単位と、実験例 1 5 の方法で得たィソマルトデキストラナ一ゼを固形物グラム当り 1 0 0単位と、シユードモナスアミロデラモサス由来イソアミラーゼ (株式会社林原生物化学研究所製）を固形物グラム当たり 2 5 0単位加え、 4 0 °C、 p H 5 . 5 で併用で 6 5時間作用させた後、 1 0 0 °Cで 1 5分間熱処理して酵素を失活させた。生成したイソマルトースを H P L C法で定量した。それらの結果を表 2 3 に示す。

表 2 3 ：

表 2 3 の結果から明らかなように、澱粉部分分解物の濃度が 1 %の低濃度では、イソマルト一スの生成量は約 7 3 %であるのに対し、濃度 4 0 %の高濃度では、イソマルト一スの生成量は約 5 1 %と、基質である澱粉部分分解物の濃度に依存してイソマルトースの生成量が変化することが判明した。実験例 2 0 ：澱粉液化程度の影響とうもろこし澱粉を濃度 1 5 %澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを 0. 1 %加えて p H 6. 0に調整し、 α—アミラーゼ（商品名『ターマミール 6 0 L』、ノポ社製）を澱粉グラム当り 0. 2乃至 2. 0 %を加え、 9 5 °Cで 1 0分間反応させ、次いで、 1 2 Ο ΐ:にオートクレーブし約 4 0 °Cに急冷して、 D E 3. 2乃至 2 0. 5の液化溶液を得、これに最終澱粉濃度 5 %、 p H 5. 5に調整した後、実験例 4一 1で得たバチルスグロビスポルス C 1 1由来の精製ひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素標品を固形物グラム当たり 0. 2単位と、実験例 1 5の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを固形物グラム当り 1 0 0単位と、シユードモナス · アミロデラモサス由来イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物グラム当たり 2 5 0単位を加え、 4 0 °Cで 6 5時間反応させた。 1 0 0 °Cで 1 5分間熱処理して酵素を失活させた。生成したイソマルトースを H P L C法で定量した。それらの結果を表 2 4に示す。

表 2 4 ：

表 2 4の結果から明らかなように、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素とィソマルトデキストラナーゼとによるイソマルトース生成率は澱粉の液化度の影響を受け、液化の程度が低いほど、即ち、 D Eが低値であるほど、澱粉からのイソマルト一スの生成率は高く、逆に、液化の程度が高い、即ち、 D Eが高値であるほど、澱粉からのイソマルト一スの生成率が低いことが判明した。具体的には、澱粉の部分分解の程度は D E約 2 0以下、望ましくは、 D E約 1 2以下、更に望ましくは、 D E 約 5以下が適していることが判明した。実験例 2 3 ：シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼとダルコアミラーゼの添加効果

澱粉部分分解物『パインデックス # 1 0 0』水溶液（最終濃度 2 0 %. 1 mM塩化カルシウム含有）を調製し、実験例 4 — 1 で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 a—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり 0. 2単位と、実験例 1 5 の方法で得たイソマル 1、デキストラナーゼを固形物グラム当り 1 0 0単位と、シユードモナスアミロデラモサ由来イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当り 2 5 0単位と、バチルスステア口サ一モフィルス由来 C G T a s e (株式会社林原生物化学研究所）を 0乃至 0 . 5単位加え、これら酵素を併用して、 4 0 °C、 p H 5. 5で 6 5時間作用させた後、 1 0 0 °Cで 1 5分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、ダルコアミラーゼ（商品名『X L— 4』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当り 2 0単位加え、 5 0 °Cで 2 4時間作用させた後、 1 0 0 °C で 2 0分間熱処理して酵素を失活させた。生成したイソマルトースを H P L C法で定量した。それらの結果を表 2 5 に示す。表 2 5

表 2 5の結果から明らかなように、一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナ一ゼの酵素反応系に、 C G T a s e を添加することにより、ィソマルトースの生成量が増加することが判明した。尚、前記ダルコアミラーゼは、 C G T a s e存在下で生成した、ィソマルトースに 1個以上の D—グルコース残基を結合した糖質から、 D —グルコース残基を遊離させてイソマルト一スを更に生成させる目的で用いたものである。

以下、実施例 Aで及び実施例 Bに於いて、本発明のイソマルト一ス又はイソマルトース高含有物の製造方法とその用途について詳細に説明する。実施例 A— 1

トウモロコシ由来フイトグリコーゲン（キューピー株式会社製）の水溶液（約 1 0 0 L) を濃度 4 w/ v % p H 6 . 0、温度 3 0 ^に調整した後、実験例 4— 1 の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 Q!—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり 1単位と、実験例 4一 4の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の精製 α—イソマルトシル転移酵素を澱粉グラム当り 1 0単位加えて 4 8時間反応させた後、 1 0 0 で 1 0分間熱処理して酵素を失活させた < この酵素反応液の一部をとり、 H P L C法により環状四糖の生成量を調ベたところ、糖組成で約 8 4 %であった。尚、 H P L C法は、『ショウデックス（ 3 1 0 €1 6 5 1^ 3 — 8 0 1 カラム』（昭和電工株式会社製）を用い力ラム温度 6 0 C、流速 0 . 5 m l m i n水の条件で行い、検出は示唆屈折計『； I - 8 0 1 2』（東ソ一株式会社製）を用いて行なつた。この酵素反応液を p H 5. 0、温度 4 5 °Cに調整した後、 α—グルコシダーゼ（商品名『トランスダルコシダーゼ · ァマノ』、天野ェンザィム株式会社製）を澱粉グラム当たり 1 5 0 0単位と、ダルコアミラーゼ（商品名『X L— 4』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉ダラム当たり 7 5単位とを加えて 2 4時間反応させて残存する還元性オリゴ糖等を加水分解し、更に、水酸化ナトリウムで p Hを 5. 8 に調整し、温度 9 0 °Cで 1時間保持して酵素を失活させ、次いで、不溶物を濾別した。この濾液を逆浸透膜（商品名『ホロセップ H R 5 1 5 5 P I 』、東洋紡績株式会社製）を用いて固形分濃度約 1 6 %まで濃縮した後、常法に従って、脱色、脱塩、濾過、濃縮することにより、固形分約 3 , 7 0 0 gを含む糖液約 6 . 2 k gを得た。本糖液を、イオン交換樹脂（商品名『アンバーライト C R— 1 3 1 0 (N a +形）型』、オルガノ社製）を充填したカラム（ゲル量約 2 2 5 L ) に供し、カラム温度 6 0 で流速約 4 5 L / hの条件でクロマト分離を行った。溶出液の糖組成を前記 H P L C法でモニターして、環状四糖の純度が 9 8 %以上の画分を回収し. これを常法に従って、脱塩、脱色、濾過、濃縮して、固形分約 2， 5 0 0 gを含む糖液約 7. 5 k gを得た。本糖液の糖組成を H P L C法で測定したところ、環状四糖の純度は約 9 9. 5 %であった。得られた環状四糖含有糖液をエバポレーターで濃度約 5 0 %にまで濃縮した後、この濃縮液約 5 k gを円筒状プラスチック容器に入れ、緩やかに回転させながら約 2 0時間で温度を 6 5 から 2 0 °Cまで降下させて環状四糖を晶析させた。続いて、遠心濾過器を用いて分蜜し、環状四糖結晶を湿重量として 1 , 3 6 O g回収し、更に、 6 0 °Cで 3時間乾燥して、環状四糖結晶粉末を 1 , 1 7 0 g得た。本結晶粉末の糖組成を H P L C法で測定したところ、環状四糖結晶粉末の純度は 9 9 . 9 %以上と極めて高純度であった。

次いで、前記環状四糖結晶粉末を脱イオン水に溶解し、濃度 1 %、 p H 5 . 5、温度 5 0 °Cに調整した後、実験例 1 5 の方法で調製したイソマルトデキストラナーゼを固形物グラム当り 5 0 0単位加え、 p H 5 . 5 、 5 0 °Cで 7 0時間反応させた。 9 5 °Cに加熱し 1 0分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、 H 型及び O H型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に、濃度約 7 5 % に濃縮して、シラップ状イソマルト一ス高含有物を固形物当たり約 9 5 %の収率で得た。

本品は、固形物当たり、イソマルト一ス 9 6 . 1 %、開環四糖 2 . 8 % . 及びその他の糖質を 1 . 1 %含有していた。本品は、難結晶性で優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性糖質晶出防止性、難醌酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから . 各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。実施例 A— 2

実施例 A— 1 の方法で得られたシラップ状イソマルト一ス高含有物を強酸性カチオン交換樹脂（商品名『ァンバーライト C R— 1 3 1 0』、 N a +形、オルガノ株式会社製) を用いてカラムクロマトグラフィーを行なった。即ち、前記樹脂を内径 1 2. 5 c mのジャケット付きステンレス製カラム 1 0本に充填し、これらカラムを直列接続して樹脂層全長を 1 6 mとした。カラム内温度を 4 0 °Cに維持しつつ、前記シラップを樹脂量に対して 1 . 5 v / v %加え、これに 4 0 °Cの温水を S V 0. 2 で流して分画し、溶出液の糖組成を H P L C法でモニタ一しながら、ィソマルト一ス高含有画分を採取し、これを精製し、イソマルトース高含有液を得た。イソマルト一スの固形物当たりの収率は約 8 0 %であった, 本液を、常法に従って、脱色、脱塩、濃縮して、濃度約 7 5 %のシラップ状イソマルトース高含有物を得た。

本品は、固形物当たり約 9 9 . 9 %以上の極めて高純度のイソマルトースを含有していた。本品は、難結晶性で優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醱酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。実施例 A— 3

夕ピオ力澱粉を濃度約 2 0 %の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム 0. 1 %加え、 p H 6. 5 に調整し、 α—アミラーゼ（商品名『タ一マミ一ル 6 0 L』、ノポ社製）を澱粉グラム当たり 0. 3 %加え、 9 5 °Cで 1 5分間反応させ、次いで 1 2 0 °Cに 2 0分間オートクレープし、更に約 4 0 °Cに急冷して D E約 4の液化溶液を得、これに実験例 2 ― 1 の方法で得た α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当り 0. 2 単位と、実験例 1 5 の方法で得たィソマルトデキストラナ一ゼを澱粉グラム当り 1 0 0単位と、イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当り 2 5 0単位と、 C G T a s e (株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当り 0. 5単位になるように加え、 p H 5 , 5、温度 4 0で 6 4時間反応させた。その反応液を 9 5 °Cで 3 0分間保つた後、温度 5 0 °Cに調整した後、ダルコアミラーゼ剤（商品名『ダルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製) を固形物グラム当たり 1 0 単位加え、 2 4時間反応させ、その反応液を 9 5 °Cに加熱し 3 0分間保つた後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、 H型及び O H型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮し、乾燥し、粉末化し、造粒して顆粒状イソマルトース高含有物を固形物当たり約 9 5 %の収率で得た。

本品は、グルコース 1 1 . 0 %、イソマルト一ス 6 6 . 5 %、その他の 2糖類を 2. 4 %、 3糖類以上を 2 0. 1 %含有していた。本品は、優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性 . 粘性、糖質晶出防止性、難醱酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。実施例 A— 4

バチルスグロビスポルス C 9 ( F E RM B P— 7 1 4 3 ) を実験例 1 の方法に準じて、フアーメンターで 4 8時間培養した。培養後、 S F膜を用いて除菌濾過し、約 1 8 Lの培養濾液を回収し、更に、その濾液を U F膜濃縮し、 a;—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を 8. 8単位/ m 1 と α—イソマルトシル転移酵素を 2 6 . 7単位 Zm 1 とを含む濃縮酵素液約 1 Lを回収した。とうもろこし澱粉を濃度約 2 7 %の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム 0. 1 %加え、 p H 6 . 5 に調整し、 α —アミラーゼ（商品名『ターマミール 6 0 L』、ノポ社製）を澱粉ダラム当たり 0 . 3 %加え、 9 5 °Cで 1 5分間反応させ、次いで 1 2 0 °Cに 2 0分間オートクレープし、更に約 4 0 °Cに急冷して D E約 4の液化溶液を得、これに上記 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と α —イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉グラム当り 0 . 2 5 m l の割合になるように加え、更に実験例 1 5の方法で得たィソマルトデキストラナ一ゼを澱粉グラム当り 1 0 0単位と、イソアミラ一ゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当り 2 5 0単位と、 C G T a s e (株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当り 0 . 5単位となるように加え、 p H 5 . 5、温度 4 0 °Cで 7 0時間反応させた。その反応液を 9 5 °Cに加熱し 1 0分間保った後、温度 5 0 °Cに調整した後、グルコアミラーゼ剤（商品名『ダルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり 2 0単位加え、 2 4時間反応させ、その反応液を 9 5 °Cに加熱し 3 0分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、 H型及び O H型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度 7 5 %のシラップ状ィソマルトース高含有物を固形物当たり約 9 5 %の収率で得た。

本品は、固形物当り、グルコース 3 2 . 6 %、イソマルト一ス 5 9 . 4 %、その他の 2糖類を 1 . 2 % 、 3糖類以上を 6 . 8 %含有していた, 本品は、難結晶性で優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、陚形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醱酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。実施例 A— 5

実施例 A— 4の方法で得られたィソマルトース含有シラップを原糖液とし、イソマルトースの含量を高めるため、実施例 A— 2 の方法に準じて塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行なった後、イソマルトース高含有画分を採取し、これを精製し、濃縮して、イソマルト一ス髙含有シラップを固形物当たり約 6 0 %の収率で得た。

本品は、固形物当たり、グルコース 4 . 8 %、イソマルト一ス 8 5 . 3 %、その他の 2糖類を 3 . 9 %、 3糖類以上を 6 . 0 %含有していた _c 本品は、難結晶性で優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醌酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。実施例 B— 1 ：甘味料

実施例 A— 1 の方法により得た粉末状イソマルトース高含有物 0 . 8 重量部に、トレ八ロース含水結晶（登録商標『トレ八』、株式会社林原商事販売） 0 . 2重量部、 a—グリコシルステビオシド（商品名『 a G スイート』、東洋精糖株式会社販売） 0 . 0 1 重量部、及び L—ァスパルチル一 L—フエ二ルァラニンメチルエステル (商品名『ァスパルテ一ム』） 0 . 0 1重量部を均一に混合し、顆粒成形機にかけて顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約 2倍の甘味度を有している。本品は、難結晶性で優れた保湿性、低甘味性を有するイソマルト一スを含有する低甘味料組成物である。又、本品は、室温保存下、変質劣化の懸念が無く、安定である。実施例 B— 2 ：ハードキャンディー

濃度 5 5 %蔗糖溶液 1 0 0重量部に実施例 A一 2の方法で得たシラップ状イソマルトース高含有物 5 0重量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分 2 %未満になるまで加熱濃縮し、これにクェン酸 0 . 6重量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成形し、製品を得た。本品は歯切れ、呈味、風味とも良好で、蔗糖の晶出も起きず、吸湿性少ない安定で高品質のハードキャンディ一である。実施例 B— 3 ：チューインガム

ガムベース 3重量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに無水結晶マルチトール 2重量部、キシリトール 2重量部、実施例 A— 5 の方法で得たシラップ状イソマルト一ス高含有物 2重量部、及びトレハロース含水結晶 1重量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、呈味、風味良好で、低う蝕性、低カロリーのチュ一インガムとして好適である。実施例 B— 4 ：粉末べプチド

4 0 %食品用大豆ペプチド溶液（商品名『ハイ二ユート S』、不二製油株式会社販売） 1重量部に、実施例 A— 4の方法で得たシラップ状ィソマルト一ス高含有物 2重量部を混合し、プラスチック製バットに入れ. 5 0 °Cで減圧乾燥し、粉枠して粉末ペプチドを得た。本品は風味良好で. プレミックス、冷菓などの低力口リ一製菓材料として有用であるのみならず、経口流動食、経管流動食のための難消化性の食物繊維、整腸材料. 健康食品材料としても有用である。実施例 B - 5 ：浴用剤

ュズの皮ジュース 1重量部に対して、実施例 A— 3 の方法で得た顆粒状ィソマルト一ス高含有物 1 0重量部及び環状四糖 1重量部の割合で混合し、粉末化して、ュズの皮エキス含有イソマルトース含有粉末を得た本粉末 5重量部に、焼塩 9 0重量部、トレハロース含水結晶 2重量部, 無水ケィ酸 1重量部及び —ダルコシルヘスペリジン（商品名『 a G ヘスペリジン』、株式会社林原販売） 0 . 5重量部を混合して浴用剤を製造した。

本品は、ュズの香りも豊かで、入浴用の湯に 1 0 0乃至 1 0 ， 0 0 0 倍に希釈して利用すればよく、入浴後は、肌がしっとりしなめらかで、湯冷めしない高品質の浴用剤である。実施例 Β— 6 ：化粧用クリーム

モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール 2重量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン 5重量部、実施例 Α— 2の方法で得たシラップ状ィソマルトース高含有物 2重量部、 α —ダルコシルルチン（商品名『ひ Gルチン』、株式会社林原販売） 1重量部、流動パラフィン 1 重量部、トリオクタン酸グリセリン 1 0重量部および防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これに L—乳酸 2重量部、 1 ， 3 —ブチレングリコール 5重量部および精製水 6 6重量部を加え、ホモゲナイザ一にかけ乳化し、更に香料の適量を加えて撹拌混合し、化粧用クリームを製造した。本品は、抗酸化性を有し、安定性が高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。実施例 Β— 7 ：練歯磨

第二リン酸カルシウム 4 5重量部、ラウリル硫酸ナトリウム 1 . 5重量部、グリセリン 2 5重量部、ポオキシエチレンソルビタンラウレート 0 . 5重量部、実施例 Α— 5 の方法で得たシラップ状イソマルトース高含有物 1 5重量部、サッカリン 0 . 0 2重量部および防腐剤 0 . 0 5重量部を水 1 3重量部と混合して練歯磨を得た。本品は、界面活性剤の洗浄カを落とすことなく、嫌味を改良し、使用後感も良好である。実施例 B— 8 ：流動食用固体製剤

実施例 A— 1 の方法で得た粉末状イソマルトース高含有物 1 0 0重量部、トレハロース含水結晶 2 0 0重量部、マルトテトラオース高含有粉末 2 0 0重量部、粉末卵黄 2 7 0重量部、脱脂粉乳 2 0 9重量部、塩化ナトリウム 4 . 4重量部、塩化カリウム 1 . 8重量部、硫酸マグネシゥム 4重量部、チアミン 0 . 0 1重量部、ァスコルビン酸ナトリウム 0 . 1重量部、ビタミン Eアセテート 0 . 6重量部及びニコチン酸アミド 0 0 4重量部からなる配合物を調製し、この配合物 2 5 グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。

本品は、整腸作用に優れた流動食である。 1袋分を約 1 5 0乃至 3 0 0 m 1 の水に溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる。実施例 B— 9 ：錠剤

アスピリン 5 0重量部に実施例 A— 2の方法で得たシラップ状ィソマルト一ス高含有物 1 4重量部、コーンスターチ 4重量部を充分に混合した後、常法に従って打錠機により打錠して厚さ 5 . 2 5 m m , 1錠 6 8 0 m gの錠剤を製造した。

本品は、イソマルトースの賦形性を利用したもので、吸湿性がなく、物理的強度も充分にあり、しかも水中での崩壊はきわめて良好である。実施例 B - 1 0 ：糖衣錠

重量 1 5 0 m gの素錠を芯剤とし、これに実施例 A— 1 の方法で得た粉末状イソマルトース髙含有物 4 0重量部、プルラン（平均分子量 2 0 万） 2重量部、水 3 0重量部、タルク 2 5重量部および酸化チタン 3重量部からなる下掛け液を用いて、錠剤重量が約 2 3 0 m g になるまで糖衣し、次いで、環状四糖結晶粉末 6 5重量部、プルラン 1重量部および水 3 4重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更に、ロウ液で艷出しして光沢のある外観の優れた糖衣錠を得た。本品は、耐衝擊性にも優れており、高品質を長期間維持する。実施例 B— 1 1 ：外傷治療用膏薬

実施例 A— 5 の方法で得たシラップ状イソマルトース高含有物 1 0 0 重量部およびマルトース 3 0 0重量部に、ヨウ素 3重量部を溶解したメ夕ノール 5 0重量部を加え混合し、更に 1 0 w / v %プルラン水溶液 2 0 0重量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、イソマルトースにより、ヨウ素、メタノールの揮散が防止され、経時変化の少ない商品価値の高い膏薬である。

又、本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから治癒期間が短縮され. 創面もきれいに治る。産業上の利用可能性

以上説明したように、本発明は、イソマルトースの新規な製造方法とその用途に関し、より詳細には、非還元末端の結合様式として α— 1 , 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度 2以上の糖質に、 —イソマルトシル転移酵素の非存在下又は存在下で、一イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元性末端の結合様式として α— 1 ， 6 ダルコシル結合を有し、この非還元性末端以外の結合様式として α— 1， 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度 3以上の a —イソマノレトシルダルコ糖質、及び/又は、サイクロ {→ 6 ) — a — D—ダルコピラノシルー ( 1 → 3 ) — ひ一 D —ダルコビラノシルー ( 1→ 6 ) - a - D _ダルコピラノシルー ( 1 → 3 ) 一 α — D —ダルコピラノシルー ( 1 →} を生成させ、次いで、イソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルト一スを生成させ、この生成したイソマルトースを採取することを特徴とするイソマルト一スの製造方法とその用途に関する発明である。斯かる本発明によれば、斯界に於いて有用なイソマルト一ス及ぴイソマルトース高含有物を工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得ることなつた。斯かる本発明によるイソマルトース及びイソマルトース高含有物は難結晶性で優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醌酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。

本発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義ある発明である。

Claims

請求の範囲

1 . 非還元末端の結合様式として Q! — 1 ， 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度 2以上の糖質に、 α —イソマルトシル転移酵素の非存在下又は存在下で、 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元性末端の結合様式としてひ一 1 , 6 ダルコシル結合を有し、この非還元性末端以外の結合様式として — 1 , 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度 3以上のひ一イソマルトシルダルコ糖質、及び/ 又は、サイクロ {→ 6 ) 一 α — D —ダルコビラノシルー ( 1 -> 3 ) - — D—ダルコビラノシル一（ 1 → 6 ) — 一 D—ダルコピラノシル一（ 1 → 3 ) 一ひ一 D—ダルコピラノシル— ( 1 → } を生成させ、この生成物にイソマルト一ス遊離酵素を作用させてイソマルト一スを生成させ、この生成したイソマルト一スを採取することを特徴とするイソマルト一スの製造方法。

2 . α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を作用させるに際し、ひ一イソマルトシル転移酵素、シクロマルトデキストリングルカノトランスフエラーゼ、 α—ダルコシダ一ゼ、グルコアミラーゼ及び澱粉枝切酵素から選ばれる 1種又は 2種以上の酵素を作用させることを特徴とする請求の範囲第 1項記載のイソマルトースの製造方法。

3 . α;—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を作用させた後に、 α — イソマルトシル転移酵素、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラ一ゼ、 α—ダルコシダーゼ、ダルコアミラーゼ及びイソアミラ一ゼから選ばれる 1種又は 2種以上の酵素を作用させることを特徴とする請求の範囲第 1項記載のイソマルト一スの製造方法。

4 . 非還元末端の結合様式として一 1 , 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度 2以上の糖質が、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミ口べクチン、可溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及びダリコ一ゲンから選ばれる 1種又は 2種以上の糖質である請求の範囲第 1項、第 2項又は第 3項記載のイソマルトースの製造方法。

5 . サイクロ {→ 6 ) 一 α — D _ダルコピラノシルー ( 1 → 3 ) 一 a 一 D—ダルコピラノシル _ ( 1 → 6 ) — α — D—ダルコピラノシル一（ 1 → 3 ) 一 α — D —ダルコピラノシルー ( 1 → } 、 α—ダルコシル一 ( 1 → 6 ) 一 α _ダルコシルー ( 1 → 3 ) 一 α —ダルコシル— ( 1 -> 6 ) - α—グルコース及ぴパノースから選ばれる 2種以上の混合糖質に、イソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、この生成したイソマルト一スを採取することを特徴とするイソマルトースの製造方法。

6 . サイクロ {— 6 ) — α — D—ダルコピラノシル一（ 1 → 3 ) - a 一 D—ダルコピラノシル一（ 1 → 6 ) — ひ一 D —ダルコピラノシルー（ 1 → 3 ) 一《— D —ダルコピラノシルー（ 1 → } 、 α —ダルコシルー（ 1 → 6 ) -- α—ダルコシルー ( 1 → 3 ) - α —ダルコシルー ( 1 — 6 ) - a—グルコース及びパノースが、非還元末端の結合様式として一 1 ， 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度 2以上の糖質に酵素を作用させて得られたものであることを特徴とする請求の範囲第 5項記載のィソマルトースの製造方法。

7 . —イソマルトシル転移酵素が、下記の理化学的性質を有する酵素である請求の範囲第 1項乃至第 6項記載のイソマルト一スの製造方法,

( 1 ) 作用

非還元性末端の結合様式として α — 1 , 6 ダルコシル結合を有し、この非還元性末端以外の結合様式として α — 1 ， 4 ダルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質から、ひ一イソマルトシル転移することによって、サイクロ {→ 6 ) 一 α — D—ダルコピラノシルー ( 1 → 3 ) 一 α _ D—ダルコピラノシル一 ( 1 → 6 ) 一 α — D—ダルコビラノシル一（ 1 — 3 ) 一ひ一 D—ダルコピラノシルー ( 1 →} の構造を有する環状四糖を生成する

( 2 ) 分子量

S D S —ゲル電気泳動法により、約 8 2 ， 0 0 0乃至 1 3 2 , 0 0 0 ダル卜ン

( 3 ) 等電点

アンフォライン含有電気泳動法により、 p i 約 5 . 0乃至 6 . 1 ( 4 ) 至適温度

p H 6 . 0 、 3 0分間反応で、約 4 5乃至 5 0 °C

( 5 ) 至適 p H

3 5 ° ( 、 3 0分間反応で、 p H約 5 . 5乃至 6 . 0

( 6 ) 温度安定性

p H 6 . 0 、 6 0分間保持で、約 4 0 °Cまで安定

( 7 ) p H安定性

4 °C, 2 4時間保持で、 p H約 4 . 0乃至 9 . 0

8 . α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素が、下記の理化学的性質を有する酵素である請求の範囲第 1項乃至第 6項記載のイソマルトースの製造方法。

( 1 ) 作用

非還元性末端の結合様式として α — 1 , 4ダルコシル結合を有するダルコース重合度が 2以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなく -ダルコシル転移することによって、非還元性末端の結合.として α — 1 , 6 ダルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式として α — 1 , 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質を生成する

( 2 ) 分子量

S D S -ゲル電気泳動法により、約 1 1 7 ， 0 0 0乃至 1 6 0， 0 0 0 ダル卜ン

( 3 ) 等電点 .

アンフォライン含有電気泳動法により、 p i 約 4 . 7乃至 5 . 7 ( 4 ) 至適温度

p H 6 . 0 、 6 0分間反応で、約 4 0乃至 4 5 °C

I mM C a ^{2 +}存在下では、約 4 5乃至 5 0 °C

( 5 ) 至適 p H

3 5 °C、 6 0分間反応で、 p H約 6 . 0乃至 6 . 5

( 6 ) 温度安定性

p H 6 . 0 、 6 0分間保持で、約 3 5乃至 4 0 °Cまで安定

I mM C a ^{2 +}存在下では、約 4 0乃至 4 5 °Cまで安定

( 7 ) p H安定性

4で、 2 4時間保持で、 p H約 4. 5乃至 1 0 . 0

9 . イソマルト一スを採取する工程に於いて、アルカリ金属形及び/ 又はアルカリ土類金属形強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィ一を用いることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 8項記載のイソマルトースの製造方法。

1 0 . 得られるイソマルトースが、固形物当たりイソマルト一スを 4 0 % (w/w) 以上含有するイソマルト一ス高含有物である請求の範囲第 1項乃至第 9項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法。

1 1 . 請求の範囲第 1項乃至第 1 0項のいずれかに記載のイソマルト —スの製造方法により得ることのできる、固形物当たりイソマルトースを 4 0乃至 9 9 % (w/w) 含有すると共に、グルコース、マルトースマルトトリオ一ス、マルトテトラオース、澱粉部分加水分解物、 α _ィソマルトシルダルコ糖質、及び Q! —ダルコシルー（ 1→ 6 ) — α —ダルコシルー ( 1→ 3 ) 一 α —ダルコシルー ( 1→ 6 ) — 一グルコースから選ばれる 1種又は 2種以上の糖質を 1 乃至 6 0 % ( w / w ) 含有することを特徵とするイソマルトース高含有物。

1 2 . 請求の範囲第 1項乃至第 1 0項のいずれかに記載のイソマルト —スの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第 1 1項記載のイソマルト一ス高含有物を含む飲食物又は健康食品。

1 3 . 請求の範囲第 1項乃至第 1 0項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法により得ることのできるイソマルト一ス又は請求の範囲第 1 1項記載のイソマルトース高含有物を含む飼料又は餌料。

1 4 . 請求の範囲第 1項乃至第 1 0項のいずれかに記載のイソマルト —スの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第 1 1項記載のイソマルト一ス高含有物を含む化粧品。

1 5 . 請求の範囲第 1項乃至第 1 0項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第 1 1項記載のイソマルトース高含有物を含む医薬品。

1 6 . 請求の範囲第 1項乃至第 1 0項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第 1 1項記載のイソマルトース高含有物を用いることを特徴とする飲食物又は健康食品の製造方法。

1 7 . 請求の範囲第 1項乃至第 1 0項のいずれかに記載のイソマルトースの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第 1 1項記載のイソマルトース高含有物を用いることを特徴とする飼料又は餌料の製造方法。

1 8 . '請求の範囲第 1項乃至第 1 0項のいずれかに記載のィソマルト —スの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第 1 1項記載のイソマルトース高含有物を用いることを特徴とする化粧品の製造方法。

1 9 . 請求の範囲第 1項乃至第 1 0項のいずれかに記載のイソマルト —スの製造方法により得られるイソマルトース又は請求の範囲第 1 1項記載のイソマルトース高含有物を用いることを特徴とする医薬品の製造方法。