WO2002088175A1 - Peptide de liaison a des anticorps de la maladie de crohn et methode d'examen de ladite maladie - Google Patents

Peptide de liaison a des anticorps de la maladie de crohn et methode d'examen de ladite maladie Download PDF

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amino acid
crohn
disease
antibody
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Hiroshi Saito
Kiyonori Katsuragi
Tetsuya Tachikawa
Michinori Tanaka
Koichi Ogino
Takao Taki
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Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens

Definitions

  • the present invention relates to a test reagent useful for diagnosing Crohn's disease and an active ingredient thereof.
  • the present invention also relates to a method for testing Crohn's disease, which can be easily performed using a biological sample such as blood as a test sample.
  • Crohn's disease is understood as a local inflammatory injury based on abnormal states of the immunological response.
  • diagnosis of such Crohn's disease has been made comprehensively by clinical symptoms, X-ray contrast, endoscopy or pathological examination.
  • these methods require experience and skill in the discrimination, and have the disadvantage of causing physical or mental distress to the patient. Therefore, there is a need for a method for easily and accurately diagnosing Crohn's disease.
  • anti-butamylase antibody (Tatsuo Tozawa et al., "Blood anti-porcine amylase antibody in patients with Crohn's disease-ELISA study") Intractable inflammation Research group for genital intestinal disorders, 1999 report, Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-190734), a protein antibody derived from anti-M et al. Dig Dis Sci., 1999, Jun, 44 (6), 1202,7; Kreuzpaintner G, et al., Gut. 1995 Sep, 37 (3), 361-6; Oudkerk Pool M, et al., J.
  • rice allergen protein has been isolated as a major antigen of IgE in rice allergic patients, and is known to be an alpha-amylase / trypsin inhibitor from its gene and amino acid sequence (Izumi H, et al. FEBS Lett. 1992 May, 181302 (3), 213-6; Nakamura R, et al. Biosci Biotechnol Biochem. 1996 Aug, 60 (8), 1215-21)) o As described above, Although a connection with a dietary antigen such as baker's yeast / porcine amylase has been pointed out as an autoantigen, no connection with the rice allergen protein has been reported.
  • a dietary antigen such as baker's yeast / porcine amylase
  • Vacuolar H + -transporting AT Pase is an H + pump that exists in organelles belonging to the central vacuolar system and regulates the interior of the organelles to acidity. Is known to be closely associated with many life phenomena including dynamic processes of membranes, such as concentration of neurotransmitters and ions, and proteolysis (Biochemistry, Vol. 65, No. 6, 1993 June pp. 413-436). However, its detailed functions in vivo have not been fully elucidated. Furthermore, the human nuclear protein (Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300 (ZNF300)) is predicted to be involved in the regulation of gene expression in the nucleus due to having a zinc finger domain, but it is still not It is a protein whose function is unknown. There is no report on the human nuclear protein, only its amino acid sequence and its gene sequence are registered in the database (Gou D.-MET et al., Submitted (28-JUN-2001) to the EMBL / GenBank / DDBJ databases).
  • ZNF300
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and found that a specific peptide has a property of specifically recognizing and binding to an antibody specifically present in a patient with Crohn's disease. However, it was confirmed that the use of one or preferably two or more of these peptides in combination can easily and accurately detect the presence or absence of Crohn's disease in a subject.
  • vacuolar H + transporting ATPase particularly its subunit E
  • rice allergen protein or human nuclear protein
  • ZNF300 human nuclear protein
  • the present invention provides Crohn's disease antibody-binding peptides listed in the following (1) to (9) which can be effectively used for the examination of Crohn's disease:
  • a Crohn's disease antibody-binding peptide which is either (a) or (b) below:
  • a peptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are modified by substitution, deletion or addition in the amino acid sequence shown in the above (a), and having a binding property to a Crohn's disease antibody.
  • the peptide described in (b) above is a peptide partially containing any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 or SEQ ID NO: 7; Sex Beptide.
  • the Crohn's disease antibody-binding peptide according to (1) which has any of the 7-amino acid sequences shown in 5 to 14.
  • a peptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 have been modified by substitution, deletion or addition, and having a binding property to a Crohn's disease antibody;
  • the Crohn's disease antibody-binding peptide according to (1) which has any one of the amino acid sequences shown in 15 to 19.
  • (6) a peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are modified by substitution, deletion or addition in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having a binding property to a Crohn's disease antibody;
  • the Crohn's disease antibody-binding peptide according to (1) which has any one of the amino acid sequences shown in Nos. 20 to 32.
  • a peptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been modified by substitution, deletion or addition in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and having at least a peptide having a binding property to Crohn's disease antibody;
  • the Crohn's disease antibody binding peptide according to (1) which is a peptide having an amino acid sequence represented by No. 51 and having 7 to 604 amino acids.
  • a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are modified by substitution, deletion or addition in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and which has a binding property to the Crohn's disease antibody;
  • the Crohn's disease antibody-binding peptide according to (1) which is a peptide having 8 to 165 amino acids and comprising an amino acid sequence of GGIYXD (E) L (X is an arbitrary amino acid residue).
  • the Crohn's disease antibody-binding peptide of the present invention contains the above-mentioned (1) to
  • the present invention provides, as such a peptide, branched polyantigenic peptides listed in the following (10) to (11):
  • a branched polyantigenic peptide having a plurality of amino acid sequences of the same or different in one molecule having a plurality of amino acid sequences of the same or different in one molecule.
  • the “same substance” means an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids have been modified by substitution, deletion or addition in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4, respectively. Means a peptide that binds to disease antibodies (The same applies to (13) below).
  • the present invention provides the following reagents (12) to (15) for Crohn's disease, which can be effectively used for diagnosis of Crohn's disease, and a reagent kit containing the reagents:
  • Subunit E and at least one selected from the group consisting of other subunit A, subunit B, subunit C, subunit D, 115 kDa subunit, 39 kDa subunit, 20 kDa subunit, and 16 kDa subunit
  • test reagent for Crohn's disease comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of a complex with one subunit.
  • the above-mentioned Crohn's disease antibody-binding peptide comprises (i) a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an equivalent thereof, (ii) a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 And (iii) a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and the same, and (iv) a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and the same.
  • At least two different Crohn's disease antibody-binding peptides selected from at least two groups, wherein the branched polyantigenic peptide is the peptide described in (11), described in (12). Testing for Crohn's Disease III.
  • test reagent kit for Crohn's disease comprising the test reagent according to (12) or (13) as an antigenic substance for binding to a Crohn's disease antibody.
  • the present invention is a method for testing for Crohn's disease as described in the following (A) to (C): (A) the presence of an antibody that recognizes human vacuolar H + transportable A TPase in a biological sample of a subject; A method for testing Crohn's disease, comprising the step of detecting absence.
  • the method for testing for Crohn's disease includes the following aspects:
  • the antibody is an antibody you recognize human vacuolar H + transporting AT P ase of Sabuyunitto E (A) test method for Crohn's disease according.
  • (A-2) the antibody is a subunit E of human vacuolar H + transporting AT P ase, the other Sabuyunitto A, Sabuyunitto B, Sabuyunitto C, Sabuyuni' D, 115 kDa subunit, 39 kDa subunit, 20 kDa sub
  • (A) The method for testing for Crohn's disease according to (A), which is an antibody that recognizes a complex with at least one unit selected from the group consisting of a unit and a 16 kDa subnet.
  • the antibody is a human vacuolar H + transportable AT Pase subunit E 199-
  • (A-4) LI AQQM peptide consisting of an amino acid sequence or an equivalent thereof, or a branched polyantigen having a plurality of identical or different amino acid sequences of these peptides or an equivalent thereof in one molecule The method according to any of (A) to (A-3), wherein the peptide is used as an antigen substance, and the method comprises a step of detecting a complex produced by an antigen-antibody reaction with an antibody recognizing human vacuolar H + transportable AT Pase. Test method for Crohn's disease as described.
  • LI AQQM is a peptide having the same amino acid sequence as selected from the group consisting of peptides having the respective amino acid sequences described in SEQ ID NOS: 1 and 5 to L4. An inspection method for Crohn's disease according to (A-4).
  • A-7) Subunit E of human vacuolar H + transportable AT Pase and other subunits A, B, C, D, 115 kDa subunit, 39 kDa subunit, 20 kDa subunit, And (c) detecting a complex formed by a complex with at least one subunit selected from the group consisting of 16 kDa subunits and (A) to (A-3). How to test for disease.
  • (B) A method for detecting Crohn's disease, comprising the step of detecting the presence or absence of an antibody that recognizes a human nuclear protein (Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300) in a biological sample of a subject.
  • a human nuclear protein Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300
  • the method for testing for Crohn's disease includes the following aspects:
  • (B-1) The method for testing for Crohn's disease according to (B), wherein the antibody is an antibody that recognizes the amino acid region 126 to 138 of human nuclear protein (Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300).
  • (B-2) a branched polyantigen having the peptide of SEQ ID NO: 51 or an equivalent thereof, or a peptide having the same or different amino acid sequence in the same or different plural number in one molecule (B) or (B) comprising the step of using a peptide as an antigen to detect a complex formed by an in situ f-geometry reaction with an in-body that recognizes a human nuclear protein (Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300). The method for testing Crohn's disease according to -1).
  • the peptide described in SEQ ID NO: 51 or an equivalent thereof is a peptide comprising at least 7 to 604 amino acids including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 51 (B The method for testing Crohn's disease according to -2).
  • an equivalent of the peptide described in SEQ ID NO: 51 is a peptide having any amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 and 21 to 32 (B-2) Inspection method for Crohn's disease according to 1.
  • (C) A method for examining Crohn's disease, comprising the step of detecting the presence or absence of an antibody recognizing rice allergen protein in a biological sample of a subject.
  • (C-2) Rice allergen protein power ⁇ Rice aUergen, Rice seed allergen RA5, Rice allergen RA5B precursor Rice seed allergen RA14, Rice allergen RA14B
  • the antibody that recognizes the rice allergen protein is an antibody that recognizes an amino acid region having an amino acid sequence of L (V) GGIYREL of the gene family of alpha-amylase / trypsin inhibitor.
  • L (V) GGI YXD (E) A peptide comprising the amino acid sequence of L (X is the same or different and any amino acid residue) or an equivalent thereof is at least L (V) GGI YXD (E) L (X is the same or different and any amino acid residue) It is a peptide consisting of 8 to 16 amino acids including the amino acid sequence (C-5) The method for testing for Crohn's disease according to the above.
  • Crohn's disease antibody is an antibody specific to Crohn's disease that is produced in vivo by the onset of Crohn's disease.
  • an antibody specific to a Crohn's disease patient that is specifically recognized in a Crohn's disease patient regardless of the cause of the antigenic substance and regardless of its recognition is broadly meant. More specifically, antibodies specific to Crohn's disease, at least when comparing healthy patients, ulcerative colitis patients, other autoimmune disease patients, duodenal ulcer patients, and gastric ulcer patients to Crohn's disease patients Means
  • the Crohn's disease antibody is usually contained in various biological samples such as blood (serum, plasma), urine, sweat, saliva, semen, and cerebrospinal fluid of Crohn's disease patients.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of Example 1 (2). Specifically, for each of the five clones (CD_1, CD-2, CD-3, CD-4, and CD-5) selected for their specificity for Crohn's disease sera, each serum sample (Crohn's disease sera, The results obtained by examining the reactivity to enteritis patient serum and healthy subject serum) by ELISA.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structure of each MAP peptide of CDP-1, CDP-2, CDP-3, and CDP-4.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of Example 2 (1). Specifically, various serum tests for each MAP peptide (MAPP of CDP-1, CDP-2, CDP-3 and CDP-4) The result of having examined the reactivity of the body (serum of a patient with Crohn's disease, serum of a patient with ulcerative colitis, and serum of a healthy subject) by ELISA was shown.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of Example 2 (2). Specifically, using a mixed antigen plate, 550 serum samples from patients with Crohn's disease (CD), 20 serum samples from ulcerative colitis (UC), 120 serum samples from healthy subjects, and 25 serum samples from duodenal ulcer patients
  • FIG. 9 shows the results obtained by examining the reactivity of mixed serum MAP peptide by ELISA for 15 sera of patients with gastric ulcer and gastric ulcer.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of Example 2 (3).
  • FIG. A is a diagram showing the reactivity of various serum samples (serum of a patient with Crohn's disease (CD), serum of a patient with ulcerative colitis (UC), and serum of a healthy subject) to a mixed MAP peptide.
  • Figures B and C show the results of various serum samples (serum from Crohn's disease (CD), serum from ulcerative colitis (UC) and serum from healthy subjects) against baker's yeast using baker's yeast as an antigen instead of the mixed MAP peptide. Shows anti-reactivity " ⁇ (Use commercially available Anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA) detection kit.)
  • Figure B uses ASCAIgG
  • Figure C uses ASCAIgA.
  • Fig. 6 shows a peptide (CDX, pig pancreatic) that has been reported to be associated with Crohn's disease specific peptides (antibody binding to Crohn's disease antibodies: CD1, Peptide, CD2, CD3, and CD4).
  • alpha amylase porcine porcine ⁇ -amylase
  • M. paratuberculosis HSP65 M. paratuberculosis HSP65
  • human HSP60 human HSP60
  • M. paratuberculosis p36 OVL It is a figure which shows homology. Note that in the figure: indicates that the amino acids are identical, and ⁇ indicates that the amino acids are similar.
  • Fig. 7 shows various homologous amino acid sequences of Crohn's disease patient-specific peptides (CD1 peptide, CD3 peptide, CD4 peptide) obtained by homology search from the protein database. It is a figure which shows the protein derived from living organisms (bacteria, fungi, animals, arthropods, plants, algae).
  • Figure 8 shows the amino acid sequence of subunit E of human vacuolar H + -transporting AT Pase and the amino acids of CD1 peptide (CDP-1 peptide, CDP-5 peptide).
  • FIG. 3 is a diagram showing homology with a sequence.
  • II indicates that the amino acid sequence of V-ATPase subunit E matches the amino acid sequence of CDP-1 and / or CDP-5 peptide
  • I indicates that V-ATPase subunit E
  • the amino acid sequences of both CDP-1 and CDP-5 peptides are similar.
  • : indicates that the amino acids of CDP-1 and CDP-5 peptides are identical
  • ⁇ indicates that the amino acids of CDP-1 and CDP-5 peptides are similar.
  • the underlined portion shows the amino acid sequence derived from the phage PVIII-protein.
  • FIG. 9 is a diagram showing the structure of each MAP peptide of VATE-201, CDP-la and CDP-5a.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Example 4. Specifically, for each of the CDP-la peptide, CDP-5a peptide, and the peptide derived from human vacuolar H + transportable ATPase subunit E (VATE-201 peptide), serum samples (sera from patients with Crohn's disease, FIG. 3 shows the results of ELISA for the reactivity to ulcerative colitis patient serum and healthy subject serum.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of Example 5. Specifically, the reactivity of CDP-la Nos. 8, 9, and 14 to MAP plates from serum samples from patients with Crohn's disease was determined using the MAP peptide antigen of CDP-1a (Fig. A) or VATE-201. The result of the test inhibited by using the MA P peptide antigen (FIG. B) is shown. In the figure, -Kuniichi shows the results of sera of Crohn's disease patient No. 8,, shows the results of sera of Crohn's disease patient ninth, and-shows the results of sera of Crohn's disease patient.
  • FIG. 12 is a diagram showing the amino acid sequence of white matter (Homo sapiens kruppel-like zinc nnger protein 300) in human nucleus and the positional relationship of Z300 peptide having the amino acid sequence of the amino acid region at positions 126 to 138 thereof. It is.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of Example 6 (4). Specifically, the reactivity of CDP3 peptide (top) and Z300 peptide (bottom) to serum samples (serum from patients with Crohn's disease, serum from patients with ulcerative colitis, and serum from healthy subjects) was measured by ELISA. The results are shown below.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of Example 6 (5). Specifically, Crohn's disease Test in which the reactivity of CDP3 of No. 2, 7, and 8 to the MAP plate was inhibited using the MAP peptide antigen of CDP 3 ( Figure A) or the MAP peptide antigen of Z300 ( Figure B) The result is shown.
  • -Kuniichi shows the results of Crohn's disease patient serum No. 2,-# ⁇ shows the results of Crohn's disease patient serum No. 7, and I-_ shows the results of Crohn's disease patient serum No. 8.
  • FIG. 4 is a diagram comparing the homology of the amino acid regions at positions 95 to 110 with respect to.
  • FIG. 16 is a diagram showing the amino acid sequence of rice allergen protein (Rice seed allergen RA14) and the positional relationship of T03965 peptide having the amino acid sequence of the amino acid region at position 99 to L11 thereof.
  • FIG. 17 is a diagram showing the results of Example 7 (4). Specifically, the reactivity of CDP4 peptide (upper) and T03965 peptide (lower) with serum samples (sera from patients with Crohn's disease, sera from patients with ulcerative colitis, and sera from healthy subjects) was examined by ELISA. Show.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of Example 7 (5). Specifically, the reactivity of the serum samples of patients with Crohn's disease with the MAP plate of CDP4 at positions 3, 6, 15, 17, and 20 was determined using the MAP peptide antigen of CDP4 ( Figure A) or MAP peptide antigen of TO3965 (Figure shows the results of the inhibition test.
  • 1-11 is the serum of a patient with Crohn's disease
  • 1.1 is the serum of a patient with Crohn's disease
  • 6 is 1
  • 1 is the patient with Crohn's disease.
  • Serum No. 15 and 1 ⁇ show the results of Crohn's disease patient serum No. 17 and bite shows the results of Crohn's disease patient serum No. 20.
  • Crohn's disease antibody binding peptide The “Crohn's disease antibody-binding peptide” (hereinafter, also simply referred to as “CD-binding peptide”) targeted by the present invention refers to Crohn's disease antibody, that is, an antibody specific to Crohn's disease that is specifically observed in Crohn's disease patients. On the other hand, it means a peptide that specifically binds.
  • CD-binding peptide of the present invention include a peptide having any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 (SEQ ID NO: 1: CD1 peptide, SEQ ID NO: 2: CD) 2 peptide, SEQ ID NO: 3: CD3 peptide, SEQ ID NO: 4: CD4 peptide). These are all characterized by having specific binding to Crohn's disease antibodies.
  • the peptide of the present invention includes, in addition to the peptide having any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4, one or more amino acids in each of these amino acid sequences are substituted or deleted. Peptides comprising an amino acid sequence modified by loss or addition and having a binding property to Crohn's disease antibody are included. In the present invention, these peptides may also be referred to as “equivalents” of peptides having any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • the degree of “substitution, deletion, or addition” of amino acids and their positions are determined by the modified peptide being a peptide consisting of any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 (CD1 peptide, CD1 peptide). 2 peptide, CD3 peptide, and CD4 peptide) are not particularly limited as long as they have the same characteristic of having specific binding to Crohn's disease antibody.
  • the alteration (mutation) of the amino acid sequence may be caused by, for example, mutation or post-translational modification, but can also be artificially altered.
  • the present invention encompasses all modified peptides having specific binding properties to Crohn's disease antibody, regardless of the cause and means of such modifications and mutations.
  • Such an effective substance can be obtained by a screening technique using a library of display phages (phage display library 1), preferably a library of random peptide display phages. Screening using the phage display library is called a phage display method, and conventionally, a ligand that specifically binds to various cell surface receptors ⁇ a peptide that recognizes various antibodies ⁇ It is a known method used for identification.
  • a ligand that specifically binds to various cell surface receptors ⁇ a peptide that recognizes various antibodies ⁇ It is a known method used for identification.
  • the random peptide display phage in the library expresses a large number of peptides (oligopeptides or polypeptides) to be screened in vitro in order to select and identify peptides that specifically bind to Crohn's disease antibody.
  • Used for The phage library used may be any of the known phage libraries usually used in this method.
  • a phage library is prepared by inserting random DNA into the coat protein pIII gene of a phage.
  • a random peptide display phage (filamentous phage) constructed so that a peptide having a random amino acid sequence of 15 amino acids can be expressed on the outer surface of the shell can be suitably exemplified (Japanese Patent Laid-Open Publication No. 10-237098, JP-A-10-237099 and Ishikawa University, Takao Taki, Cell Engineering, 16 (12) 1821-1828 (1997), JP-A-2000-253900).
  • each of the above CD1 peptide (SEQ ID NO: 1), CD2 peptide (SEQ ID NO: 2), CD3 peptide (SEQ ID NO: 3), and CD4 peptide (SEQ ID NO: 4) has the same effect.
  • the following methods can be used to acquire goods. Can be:
  • a random DNA sequence is inserted into a phagemid vector, and a random peptide display phage is constructed so that a peptide having a random amino acid sequence corresponding to the DNA sequence can be expressed on the outer surface of the phage.
  • the phage that specifically binds to is recovered (biobanning).
  • the random DNA sequence to be inserted into the phagemid vector lacks at least one amino acid in the amino acid sequence of the peptide (CD1, CD2, CD3 or CD4 peptide) to be obtained for the same drug.
  • a DNA sequence encoding an amino acid sequence modified by loss, substitution or addition can be selected.
  • the serum antibody (IgG) of a Crohn's disease patient to be immobilized on a microplate or the like is not particularly limited as long as it has at least an antigen-binding ability.For example, it was collected from a patient suffering from Crohn's disease
  • the serum may be the serum itself, a purified antibody obtained by purifying the serum using protein A, or a purified antibody obtained by performing a precipitation treatment with a magnesium sulfate solution.
  • the phage that specifically binds to the Crohn's disease antibody can be recovered by allowing a substance capable of inhibiting the binding between the Crohn's disease antibody and the phage to act on the immobilized antibody. That is, the phage specifically bound to the Crohn's disease antibody immobilized on the microplate via the anti-human IgG antibody is desorbed and eluted from the Crohn's disease antibody by adding the above substance and recovered. be able to. By repeating such screening several times, preferably about 2 to 3 times, phage capable of expressing a peptide that specifically binds to Crohn's disease antibody can be selected.
  • the substance having the ability to inhibit the binding between the Crohn's disease antibody and the phage is not particularly limited, and examples thereof include an alkaline solution, an alkaline solution, a high-concentration salt, urine, and thiocyan.
  • Escherichia coli is infected with the phage obtained by the above method, and mass culture is performed. Then, separation and purification are performed to obtain a peptide-expressing phage that specifically binds to the Crohn's disease antibody.
  • the phage thus obtained is immobilized on a support (solid phase) via an anti-phage antibody and subjected to an operation of screening for a phage that specifically binds to the Crohn's disease antibody. Specifically, such screening is carried out by reacting the phage obtained by the above method with an anti-phage antibody immobilized on an arbitrary support and immobilizing the phage.
  • a control serum serum from healthy subjects and serum from patients suffering from ulcerative colitis, other autoimmune diseases, stomach ulcer, or duodenal ulcer are reacted, and from the reactivity, specifically react with serum from Crohn's disease patients. This is done by selecting phages to be made. Next, DNA is extracted and isolated from the selected phage, its nucleotide sequence is determined, and the amino acid sequence is determined based on the DNA.
  • the CD 1 peptide, CD 2 peptide, CD 3 peptide, or CD 4 peptide, which specifically binds, can be identified and obtained with the same drug (CD binding peptide).
  • sequence of DNA extracted and isolated by the above method can be easily determined by a method known in the art. For example, the dideoxy method CProc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463-5467 (1977) )] And the Maxam-Gilbert method [Method in Enzymology, 65, 499 (1980)].
  • the determination of such a nucleotide sequence can be easily carried out using a commercially available sequence kit or the like.
  • CD 1 peptide (SEQ ID NO: 1) obtained by the above method include CDP-la peptide (SEQ ID NO: 5), CDP-1 peptide (SEQ ID NO: 6) and CD5 peptide (SEQ ID NO: 7), CDP-5a peptide (SEQ ID NO: 8), CDP-5 peptide (SEQ ID NO: 9), VATE-201C peptide (SEQ ID NO: 10), VATE-201 peptide (SEQ ID NO: 10) No. 11), CDls peptide (SEQ ID NO: 12), and CDP-ls peptide (SEQ ID NO: 13) can be exemplified.
  • CDP-1 AEGEL GLLAQQMDY! ADPA 6
  • CDP-ls AEGEL GDPA 13
  • CD 2 peptide SEQ ID NO: 2
  • CDP-2 peptide SEQ ID NO: 15
  • CD2 s peptide SEQ ID NO: 16
  • CDP_2 S peptide SEQ ID NO: 17
  • CD2s1 peptide SEQ ID NO: 18
  • CDP-2s1 peptide SEQ ID NO: 19
  • CDP-2s AEGEL D @ Y JPlEGDG GDPA 17
  • CD3 peptide (SEQ ID NO: 3) 13 peptides (SEQ ID NO: 20), CDP 3 peptide (SEQ ID NO: 21), CDP 3-1 peptide (SEQ ID NO: 22), CDP 3-2 peptide (SEQ ID NO: 23), CDP 3 _ 3 peptide (SEQ ID NO: 24) ), CDP 3-4 peptide (SEQ ID NO: 25), CDP 3-5 peptide (SEQ ID NO: 26), CDP 3-6 peptide (SEQ ID NO: 27), CDP 3-8 peptide (SEQ ID NO: 28), CDP 3 — 12 peptide (SEQ ID NO: 29), CDP3-14 peptide (SEQ ID NO: 30), and Z300 peptide (SEQ ID NO: 31) can be exemplified.
  • CDP3-1 SEGEL RQSDGQYQM 22
  • CDP3-4 AEGAL RQSDGQYQM 25
  • CDP3-14 AEGEL RQSDGQYQJA 30
  • CD 4 peptide (SEQ ID NO: 33), CDP4 peptide (SEQ ID NO: 33) shown in Table 4 are also equivalent to CD4 peptide (SEQ ID NO: 4).
  • SEQ ID NO: 34 CDP4-1 peptide (SEQ ID NO: 35), CDP4-2 peptide (SEQ ID NO: 36), CDP4-3 peptide (SEQ ID NO: 37), CDP4-4 peptide (SEQ ID NO: 38), C Examples include the DP4-10 peptide (SEQ ID NO: 39), the CDP4-13 peptide (SEQ ID NO: 40), the CDP4-14 peptide (SEQ ID NO: 41), and the TO3965 peptide (SEQ ID NO: 42).
  • CDP-4 AEGEL GGIYQDLVS GDPA 33
  • CDP4 AEGEL GGIYQDLVS 34
  • CDP4-1 SEGEL GGIYQDLVS 35
  • CDP4-2 AAGEL GGIYQDLVS 36
  • CDP4-3 AEAEL GGIYQDLVS 37
  • CDP4-4 AEGAL GGIYQDLVS 38
  • CDP4-10 AEGEL GGIYQDLVS 39
  • CDP4-13 AEGEL GGIYQDIJAS 40
  • CDP4-14 AEGEL ⁇ GIYQDL A 41
  • CD-binding peptides can be produced by a general chemical synthesis method according to their amino acid sequences.
  • the method includes a conventional liquid phase method and a solid phase method for peptide synthesis. More specifically, such a peptide synthesis method is based on the amino acid sequence information provided by the present invention, in which a stepwise erosion method in which each amino acid is successively linked one by one to extend the chain, and a method comprising several amino acids.
  • a fragment condensation method in which fragments are synthesized in advance, and then each fragment is subjected to a coupling reaction.
  • the peptide of the present invention can be synthesized by any of them.
  • the condensation method adopted for the peptide synthesis can also be in accordance with various known methods. Specific examples include azide method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester Method, redox method, DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, DCC + additive (1-hydroxybenzotriazol, N-hydroxysuccinamide, N-hydroxy 5 _norpoleneene 2,3-dicarboxy) Imide), the Woodward method and the like.
  • the solvent that can be used in each of these methods can also be appropriately selected from general solvents that are well known to be used in this kind of peptide condensation reaction. Examples include dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide
  • DMSO methyl methyl sulfoxide
  • THF tetrahydrofuran
  • ethyl acetate a mixed solvent thereof.
  • carboxyl groups in amino acids and peptides not involved in the reaction are generally converted into lower alkyl esters such as methyl ester, ethyl ester and tertiary butyl ester by esterification, for example, benzyl ester, p- It can be protected as methoxybenzyl ester, p-nitrobenzyl ester, aralkyl ester and the like.
  • the amino acid having a functional group in the side chain for example, the hydroxyl group of TVr may be protected with an acetyl group, a benzyl group, a benzyloxycarbonyl group, a tertiary butyl group, etc., but such protection is not necessarily required.
  • the guanidino group of Arg includes a nitro group, a tosyl group, a 2-methoxybenzenesulfonyl group, a methylene-2-sulfonyl group, a benzyloxycarponyl group, an isopolnyloxycarponyl group, an adamantyloxycarbonyl group and the like.
  • the deprotection reaction of these protecting groups in the amino acid having the above-mentioned protecting group, the peptide and the finally obtained peptide of the present invention can also be carried out by a conventional method, for example, a catalytic reduction method, liquid ammonia nonadium, or fluoride. It can be carried out according to a method using hydrogen, hydrogen bromide, hydrogen chloride, trifluoroacetic acid, acetic acid, formic acid, methanesulfonic acid and the like.
  • the thus obtained CD-binding peptide of the present invention can be obtained by a conventional method, for example, ion exchange resin, partition chromatography, gel chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), countercurrent distribution method. Purification can be performed as appropriate according to methods widely used in the field of peptide chemistry, such as.
  • the CD-binding peptide according to the present invention includes not only the above-mentioned various peptides but also an amino acid sequence of a part of these peptides as long as they have specific binding to Crohn's disease antibody. Peptides-polypeptides are also included.
  • polypeptides include, for example, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 18 And a polypeptide having a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 42 as a part thereof.
  • an amino acid sequence in which one or more amino acids have been replaced, deleted or modified by caroylase, and an amino acid having a binding property to a Crohn's disease antibody It may be a polypeptide partially having a sequence.
  • the minimum number of amino acids required for an antibody to recognize in an antigen-antibody reaction is
  • the number of amino acids is not particularly limited as long as the peptide is composed of four or more amino acids. Although there is no limitation, the number of amino acids of usually 4 to 700 amino acids can be exemplified. In addition, as described later, when preparing a branched polyantigenic peptide having a plurality of amino acid sequences of the CD-binding peptide as a branched chain in one molecule, the number of amino acids in the branched chain may be determined. The range of 9 to 14 can be suitably exemplified.
  • a polypeptide containing at least the amino acid sequence of LI AQQM in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 can be exemplified.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of VATE-201C peptide, which is the same compound as CD 1 peptide, and the polypeptide partially including the amino acid sequence (LI AQQM) is as follows. Examples thereof include a VATE-201 peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, a vacuolar H + transportable AT Pase (hereinafter, also referred to as “V-AT Pase”), or a subunit E thereof.
  • V-AT Pase vacuolar H + transportable AT Pase
  • the amino acid sequence of the subunit E of the amino acid sequence of V-ATPase is shown in SEQ ID NO: 14.
  • V-AT Pase maintains the acidity of organelles (Golgi, lysosomes, secretory granules, synaptic vesicles, yeast vacuoles, etc.) belonging to the eukaryotic cell's central vacuolar system. An H + pump that is working for.
  • organelles Golgi, lysosomes, secretory granules, synaptic vesicles, yeast vacuoles, etc.
  • An H + pump that is working for.
  • the relevant V—AT P It is known that ase is composed of subunits A, B, C, D and E, and nine subunits of 115 kDa subunit, 39 kDa subunit, 20 kDa subunit, and 16 kDa subunit. The primary structure of each of these subunits is already known, and the structure of V-AT Pase composed of these subunits has also been estimated (Biochemistry, Vol. 65, No.
  • the CD-binding peptide of the present invention includes a polypeptide (protein) having the entire sequence of V-ATPase composed of these subunits, and a V-ATPase of V-ATPase as long as it has binding ability to Crohn's disease antibody. Fragments (including fragments of each subunit and each subunit) are included.
  • the CD-binding peptide of the present invention includes a human vacuolar H + transporting AT Pase subunit E and other subunits 8, subunit B, subunit C, subunit D, 115 kDa subunit, and 39 kDa subunit. , A 20 kDa subunit, and a complex with at least one subunit selected from the group consisting of a 16 kDa subunit.
  • V-AT Pase examples include subunit E (33 kDa polypeptide, 226 amino acids), a polypeptide containing the relevant subunit E region (including a complex of various subunits including subunit E), A polypeptide having 7 to 226 amino acids including the 202 to 208 region of the amino acid sequence of Unit E, or a polypeptide having 14 to 226 amino acids including the 199 to 212 region of the amino acid sequence of Subunit E Peptides can be mentioned.
  • these V-AT Pases and fragments thereof for example, a complex of various subunits including subunit E, subunit E or a part thereof
  • one or more amino acids in the amino acid sequence are substituted, deleted or modified by addition of amino acids.
  • modified proteins can be defined as equivalents of V-AT Pase and fragments thereof (eg, subunit E).
  • Examples of the CD-binding polypeptide include a polypeptide containing at least the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 51.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 51 also corresponds to the amino acid sequence of the Z300 peptide (SEQ ID NO: 31) which is the same as the CD3 peptide.
  • Examples of the human nuclear protein include human nuclear protein (Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300; hereinafter, also referred to as “human nuclear protein (HZF300)”).
  • HZF300 human nuclear protein
  • the amino acid sequence of human nuclear protein (HZF300) is shown in SEQ ID NO: 32.
  • the CD-binding peptide of the present invention may have one or more amino acids in the amino acid sequence of human nuclear protein (HZF300) shown in SEQ ID NO: 32 as long as it has specific binding to Crohn's disease antibody.
  • Amino acids may be modified by substitution, deletion or addition.
  • modified products include a polypeptide having 7 to 604 amino acids containing the 129-135 region of the amino acid sequence of human nuclear protein (HZF300), or a human nuclear protein.
  • (HZF300) polypeptides containing 14 to 604 amino acids containing the 126-139 region of the amino acid sequence of (HZF300). These variants are human nuclear proteins
  • examples of the CD-binding polypeptide include polypeptides containing at least the amino acid sequence of L (V) GGIYXE (D) L (X is an arbitrary amino acid residue).
  • Polypeptides partially containing the amino acid sequence include all of the CD4 peptides shown in SEQ ID NOs: 4, 33 to 42 and their equivalents.
  • rice seed allergen RA14 (Rice seed allergen RA14), which is also included in the ene family of alpha-amylase / trypsin inhibitor of rice allergen protein H ).
  • the amino acid sequence of Rice seed allergen RA14 is shown in SEQ ID NO: 46.
  • the CD-binding peptide of the present invention contains one or more amino acids in the amino acid sequence of Rice seed allergen RA14 (SEQ ID NO: 46) as long as it has specific binding to Crohn's disease antibody. It may be modified by substitution, deletion or addition. Examples of such modifications include a polypeptide having 8 to 16 amino acids including the 101-108 region of the amino acid sequence of Rice seed allergen RA14 (SEQ ID NO: 46), or 99-111 of the amino acid sequence of Rice seed allergen RA14. A polypeptide having 13 to 165 amino acids including the region can be mentioned. These modifications can be defined as equivalents of Rice seed allergen RA1.
  • the CD-binding peptide of the present invention has specific binding to Crohn's disease antibody.
  • polypeptides partially containing a modified amino acid sequence in which one or more amino acids may be modified by substitution, deletion or addition in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42 are also included.
  • Such polypeptides include the same as rice seed allergen RA14, such as alpha-amylase / trypsm lnhioitor ene iamily (rice allergen (Rice allergen) (SEQ ID NO: 43), rice seed allergen RA5 (Rice seed allergen RA5).
  • Rice allergen RA5 (SEQ ID NO: 4 4), Rice allergen ⁇ 5 ⁇ Precursor (Rice allergen RA5B precursor) (SEQ ID NO: 45), Rice allergen RA14B Precursor (Rice allergen RA14B recursor) (SEQ ID NO: 4 7) ), And Rice seed allergen RAG2 (SEQ ID NO: 48), provided that these rice allergen proteins also have specific binding properties to Crohn's disease antibodies.
  • one or more amino acids may be modified by substitution, deletion or addition. Examples of the same drug include proteins having at least the amino acid sequence of L (V) GGIYREL (SEQ ID NO: 49, 50) located in the amino acid region at positions 95 to 110 of each rice allergen protein.
  • a polypeptide having an amino acid number of 8 to 157 containing the 99-106 region of the amino acid sequence of Rice allergen, and an amino acid number of 8 containing the 99-106 region of the amino acid sequence of Rice seed allergen RA5 ⁇ 157 polypeptides including the amino acid sequence 102-109 region of the Rice allergen RA5B precursor Polypeptide with 8-160 amino acids, amino acid sequence 102-109 region of the Rice allergen RA14B precursor
  • the modified protein include a polypeptide having 8 to 16 amino acids and a polypeptide having 8 to 16 amino acids including the 102 to 109 region of the amino acid sequence of Rice seed allergen RAG2.
  • Each Rice allergen Rice seed allergen RA5> It can be defined as the equivalent of Rice allergen RA5B precursor, Rice allergen RA14B precursor, and Rice seed allergen RAG2.
  • V-AT Pase As described above, V-AT Pase, its subunit E (SEQ ID NO: 14) and its equivalents are equivalent to the CD1 peptide and are equivalent to human nuclear protein (HZF300) (SEQ ID NO: 32). And its equivalents are the same as CD3 peptides, and various rice allergen proteins belonging to the gene family of alpha-amylase / trypsin inhibitor (SEQ ID NOs: 43 to 48) All of the four peptides are included in the CD-binding peptides of the present invention as equivalents.
  • the CD-binding peptide of the present invention may be in the form of a multiple antigen peptide (hereinafter also referred to as “MAP peptide” or “branched multi-antigenic peptide”).
  • This MAP peptide is a basic molecule, for example, a peptide (CD1 peptide to CD4 peptide) shown in the sequence number 1 to 4 or the amino acid sequence of the same compound as a branched chain. It is characterized as a form that is joined in a shape.
  • the number of branched chains having the amino acid sequence of the CD-binding peptide is not particularly limited, but is preferably 2 to 16, more preferably 4 to 16, and even more preferably 8. Can be.
  • CD-binding peptide (branched polyantigenic peptide) of the present invention having the MAP form include, for example, those having a dendrimer structure as a basic molecule (backbone).
  • the dendrimer is generally known as a molecule having a spherical or other structure having a dendritic to star configuration.
  • the molecule is also characterized by having a branch (repeating unit) having a plurality of functional groups (for example, JP-A-60-500295; JP-A-63-99233; JP-A-3-263431). Gazette; U.S. Pat. No. 4,507,466; 4,568,737; Polymer Journal, 17, p. 117 (1985); Angewandte Chem. Int. Engl., 29, 138-175 (1990); Macromolecures, 25, p.3247 (1992)).
  • the dendrimer which can be used in the present invention comprises a core structure serving as a starting portion, an inner layer (generation) composed of a repeating unit (branch) bonded to the starting nucleus, and an outer layer comprising a functional group bonded to each branch.
  • generation composed of a repeating unit (branch) bonded to the starting nucleus
  • outer layer comprising a functional group bonded to each branch.
  • the size, morphology, reactivity and the like of the dendrimer can be adjusted by appropriately selecting the initiation nucleus, the number of generations and the repeating units used for each generation, and these are not particularly limited.
  • the production of dendrimers having appropriate size etc. is carried out by the usual method described later. Dendrimers of different sizes can easily be obtained by increasing the number of generations used (see, eg, US Pat. No. 4,6940,644).
  • the CD-binding peptide (branched polyantigenic peptide) of the present invention having a dendrimer structure for example, a nitrogen atom is used as an initiation nucleus part, and -CH 2 CH 2 CONHCH 2 A dendrimer having a repeating unit (branch) having a CH 2 -structure in which a plurality of specific amino acid sequences of a CD-binding peptide are bonded to the outermost end of each branch.
  • any one of amino acids such as Lys, Arg, Glu, and Asp is used as a starting nucleus part, and each similar amino acid is used as a repeating unit directly bonded to the nucleus part. Examples thereof include those in which the amino acid sequence of a CD-binding peptide is bound to the terminal.
  • the dendrimer having a nitrogen atom as an initiation nucleus can be produced according to a conventional method.
  • the structure (dendrimer raw material) is also commercially available (Polysciences, Inc., 400 VaUy Road, Warrington, PA, 18976 U.S.A.).
  • a dendrimer having the other amino acid as an initiation nucleus can be produced, for example, according to the peptide synthesis method described above. Further, it can also be produced by using a commercially available dendrimer raw material such as Fmoc8-Lys4-Lys2-Lys- / 3Ala-Alko resin (manufactured by Watanabe Chemical Industry Co., Ltd.).
  • the dendrimer raw material can be produced as follows. That is, the ⁇ , ⁇ -diamino acid, in which two amino groups are protected by the same or different protecting groups, is condensed with a resin for solid phase peptide synthesis with or without a spacer, and then protected. The group is removed, and the same condensation reaction and deprotection reaction of the protected ⁇ , ⁇ -diamino acid are repeated.
  • any resin commonly used for ordinary peptide synthesis can be used.
  • examples thereof include a chloromethyl group, a 4- (hydroxymethyl) phenoxy group, and a 4-(( ⁇ -2 ′, 4′-dimethoxyphenyl)-at the terminal such as polystyrene resin, polyacrylamide resin, and polystyrene polyethylene glycol resin.
  • Those having a 9-fluorenylmethoxycarbonylaminomethyl) phenoxy group and the like can be mentioned.
  • One or more keys may be used as spacers. Mino acids can be mentioned.
  • Examples of the ⁇ -diamino acid include lysine, ordinine, 1,4-diaminobutyric acid, and 1,3-diaminopropionic acid.
  • Examples of the protecting group include a Boc group, an Fmoc group and a Z group.
  • Examples of the functional group include an amino group, a carboxyl group, and a hydroxyl group.
  • the reaction for removing the protecting group can be performed according to the peptide synthesis method described above.
  • the number of branches becomes 2 ⁇ by repeating the condensation of the repeating unit and the removal of the protecting group n times. Specifically, the number of branches can be preferably in a range of 2 to 16.
  • the desired MAP form of the peptide of the present invention (branched polyantigenic peptide) can be obtained. Can be profitable. This binding reaction can follow the peptide synthesis method described above.
  • the MAP form of the peptide of the present invention is purified by a conventional method using a suitable matrix, for example, chromatography using a resin such as Sephacryl S-300 (Pharmacia). can do.
  • the amino acid sequences constituting the terminal ends of the branches need not be the same, and may be arbitrarily combinations of amino acid sequences of different CD-binding peptides. it can.
  • combinations of amino acid sequences of different CD-binding peptides include (i) CD1 peptide and its equivalent, (ii) CD2 ⁇ peptide and its equivalent, (ii) OCD3 peptide and its equivalent. And (iv) at least 2 groups, preferably 3 groups, more preferably 4 groups out of 4 groups consisting of CD4 peptide and the same, and preferably 4 or more different groups. Examples of combinations of the amino acid sequences of three or more, more preferably four or more peptides, etc. According to such a complex-type branched polyantigenic peptide, individual subjects suffer from Crohn's disease. Can be detected with higher accuracy.
  • the CD-binding peptide of the present invention has a property of selectively recognizing and binding to an antibody specific to Crohn's disease (Crohn's disease antibody) which is specifically recognized in Crohn's disease patients. Therefore, the CD-binding peptide of the present invention and the branched polyantigenic peptide containing the amino acid sequence thereof are used for the presence or absence of Crohn's disease, ie, for Crohn's disease. It can be effectively used for inspection and diagnosis.
  • the present invention provides a reagent for testing Crohn's disease comprising the above-mentioned CD-binding peptide or a branched polyantigenic peptide containing the amino acid sequence thereof as an active ingredient.
  • the reagent for testing Crohn's disease comprises, as an active ingredient, (i) CD 1 peptide or an equivalent thereof, (ii) CD 2 peptide or an equivalent thereof, (iii) A CD3-peptide or an equivalent thereof, and (iv) at least one peptide selected from various CD-binding peptides consisting of the CD4-peptide or an equivalent thereof, or (i) (Ii) CD2 peptide or its equivalent, (iii) CD3 peptide or its equivalent, and (iv) CD4 peptide or its equivalent It includes a branched polyantigenic peptide having the same or different amino acid sequence of at least one peptide selected from the group in one molecule in a branched manner.
  • the above-mentioned CD 1 peptide has the same efficacy as subunit E of human vacuolar H + transportable AT Pase and other subunits 8, subunit B, subunit II, subunit D, 115 kDa subunit and 39 kDa subunit. And a complex with at least one subunit selected from the group consisting of a unit, a 20 kDa subunit, and a 16 kDa subunit.
  • CD-binding peptides or branched polyantigenic peptides used here as active ingredients bind to Crohn's disease antibodies that may be present in a subject's biological sample by utilizing their specific binding to Crohn's disease antibodies. It captures or labels it and acts as an antigenic substance.
  • the above-mentioned CD-binding peptide may be used alone, or two or more of them may be used in any combination. From the viewpoint of improving accuracy (reliability of judgment), it is preferable to use a combination of two or more types.
  • CD 1 peptide Or its equivalents eg, CDP-la peptide, CDP-1 peptide, CD5 peptide, CDP-5a peptide, CDP-5 peptide, VATE-201c peptide, VATE.201 peptide, CDls peptide, CDP-ls Peptide, V-ATPase, subunit E or their equivalent
  • CD2 peptide or its equivalent for example, CDP-2 peptide, CD2s peptide, CDP-2s peptide, CD2sl peptide, CDP-2sl peptide or an equivalent thereof, CD3 peptide or an equivalent thereof (eg, CDP-3 ⁇ peptide, CDP3 peptide, CDP3-1 peptide, CDP3-2 peptide, CDP3-3 ⁇ peptide, CDP3 -4 peptide, CDP3.5 peptide, CDP3-6 peptide, CDP3-8 peptide
  • each CD-binding peptide may be mixed at an equal ratio, or when a peptide having a low reactivity (binding property) to Crohn's disease antibody is included, the reactivity is considered low. It is also possible to mix such that the mixing ratio of peptides and the like increases.
  • CD-binding peptide belonging to each of the above-mentioned groups (i), (ii), (iii) and (iv), (i) CDl peptide, (ii) When using (2) CD2 peptide, (iii) CD3 peptide, and (iv) CD4 peptide, they can be used in a ratio of 1: 2: 2: 1.
  • the above-mentioned branched polyantigenic peptide is used as an active ingredient of the test reagent for Crohn's disease.
  • the amino acid sequence constituting the branch of the polyantigenic peptide may be composed of the amino acid sequence of the same type of CD-binding peptide, but may be composed of two or more different types of CD-binding. It may contain an amino acid sequence of a sex peptide.
  • the mode of the combination of the amino acid sequences of the CD-binding peptides used as the branch is not particularly limited, but at least two groups, preferably three groups, of the above groups (i) to (iv) are used.
  • test reagent for Crohn's disease of the present invention can be used as an antigen substance that specifically binds to a Crohn's disease antibody for capturing or labeling a Crohn's disease antibody. Therefore, unless deviating from this purpose, the test reagent may be composed of only one or more CD-binding peptides or branched polyantigenic peptides as an active ingredient. May be contained.
  • CD-binding peptides or branched polyantigenic peptides are labeled with an arbitrary labeling substance.
  • a general labeling substance used in the art can be widely used, and it is not particularly limited.
  • radioactive isotopes such as 3 H and 14 C; Phosphatase, peroxidase (P ⁇ X), microperoxidase, chymotriprinogen, procarboxypeptidase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydratase, amylase, phosphorylase, D-nase, and P-nase Enzymes such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC); and other IN- (2,2,6,6-tetramethyl-1-oxyl- 4-piperidyl) -5N- (aspartate) 1,2,4-dinitrobenzene (T ⁇ PA), dye sol, metal sol, latex particles, etc.
  • Phosphatase peroxidase
  • P ⁇ X peroxidase
  • microperoxidase chymotriprinogen
  • procarboxypeptidase glycer
  • the above-mentioned CD-binding peptide or branched polyantigenic peptide according to the present invention includes these labeled CD-binding peptides.
  • a reagent kit containing the above-mentioned test reagent containing a CD-binding peptide or a branched polyantigenic peptide as an active ingredient it is convenient to use a reagent kit that can be effectively used for the examination (diagnosis) of Crohn's disease.
  • the Crohn's disease test reagent kit of the present invention may include the Crohn's disease antibody as long as it contains the test reagent described above for the purpose of binding to the Crohn's disease antibody. May be included as a labeling agent.
  • the above-mentioned test reagent is used as a capturing agent for Crohn's disease antibody, it can be used as an immobilized product which has been previously immobilized on an arbitrary support (solid phase).
  • a labeling agent for Crohn's disease antibody it is preferable to use a CD-binding peptide or a polyantigenic peptide labeled with an arbitrary labeling substance as described above.
  • test reagent kit of the present invention contains a secondary component for detecting human IgG as a component other than the above-mentioned detection reagent containing a CD-binding peptide or a polyantigenic peptide as an effective component.
  • a secondary antibody eg, an anti-human IgG antibody
  • the anti-human IgG antibody may be labeled with the above-described labeling substance, or may be previously immobilized on an arbitrary support (solid phase).
  • the test reagent kit may include a substrate corresponding to the labeling substance, or a detection reagent for detecting a reaction between the labeling substance and the substrate, and a suitable reagent for the convenience of performing the measurement. It may contain a test sample diluent, a secondary antibody diluent (for example, anti-human IgG antibody diluent), a standard antibody, a buffer, a washing solution, an enzyme substrate solution, a reaction stop solution, and the like.
  • a test sample diluent for example, anti-human IgG antibody diluent
  • a secondary antibody diluent for example, anti-human IgG antibody diluent
  • test reagent or anti-human IgG antibody that is not labeled or immobilized in addition to the test reagent kit, a support (solid phase) or a labeling substance may be used as a component. Can also be included.
  • the test reagent kit for Crohn's disease of the present invention comprises a detection reagent containing the above-mentioned CD-binding peptide or branched polyantigenic peptide as an active ingredient (which may be immobilized or Z-labeled).
  • a detection reagent containing the above-mentioned CD-binding peptide or branched polyantigenic peptide as an active ingredient (which may be immobilized or Z-labeled).
  • Fixed human or Z and optionally labeled anti-human It can be arbitrarily selected from IgG antibody, substrate according to labeling substance, antibody diluent, standard antibody, buffer, washing solution, substrate lysis solution, reaction stop solution, support (solid phase), and labeling substance
  • the reagent kit for testing Crohn's disease of the present invention comprises a detection reagent containing the above-mentioned CD-binding peptide or branched polyantigenic peptide as an active ingredient (which may be immobilized or enzyme-labeled).
  • a detection reagent containing the above-mentioned CD-binding peptide or branched polyantigenic peptide as an active ingredient (which may be immobilized or enzyme-labeled).
  • anti-human IgG antibody, enzyme substrate, antibody diluent, standard antibody, buffer, washing solution, enzyme substrate lysis solution, enzyme reaction stop solution, support which may be immobilized or Z- and enzyme-labeled It can be a reagent set for testing Crohn's disease, combining at least one arbitrarily selected from a body (solid phase) and an enzyme-labeled substance.
  • enzyme-labeling substances for enzyme labeling include, in addition to the above, micro-poxidase, chymotrypsinogen, proloxypeptidase, dariceroaldehyde-3-phosphate dehydratase, amila , Phosphorylase, D-nase, and P-nase.
  • the present invention provides a method for testing Crohn's disease.
  • This test method uses a biological sample of a subject as a test sample for the test and detects whether or not each subject has Crohn's disease. More specifically, the method for testing for Crohn's disease according to the present invention detects the presence or absence of Crohn's disease in an individual subject using, as an index, the presence of a specific antibody specifically present in a biological sample of a patient with Crohn's disease. It is.
  • test sample various biological samples such as blood (serum, plasma), urine, sweat, saliva, semen or cerebrospinal fluid of a subject (human), preferably serum can be used.
  • blood serum, plasma
  • urine urine
  • sweat saliva
  • semen saliva
  • cerebrospinal fluid of a subject human
  • the following three (3 :!) to (3-3) methods can be used to test for Kuguchi disease.
  • the method for testing for Crohn's disease according to the present invention includes a method including a step of detecting an antibody that recognizes human vacuolar H + transportable AT Pase (V-AT Pase) in a biological sample of a subject.
  • the antibody to be detected is preferably an antibody recognizing V-AT Pase subunit E, and more preferably an antibody recognizing the amino acid region at positions 199 to 212 of V-AT Pase subunit E. Detection of these antibodies can be performed using a conventionally known immunological measurement method utilizing an antigen-antibody reaction.
  • the above various biological samples preferably serum
  • the biological sample is reacted with an antigenic substance having a binding property to the above-mentioned antibody recognizing V-AT Pase. Then, it can be carried out by detecting a complex generated by the antigen-antibody reaction.
  • the antigenic substance having a binding property to the antibody recognizing V-AT Pase is not particularly limited as long as it specifically binds to the antibody recognizing V-AT Pase.
  • it has the property of specifically binding to an antibody that recognizes subunit E of V-AT Pase, and more preferably an antibody that recognizes the amino acid region at positions 199 to 212 of subunit E of V-AT Pase. It has the property of specifically binding to.
  • Specific examples of those having such properties include a peptide comprising the amino acid sequence of LI AQQM and its equivalent.
  • the same compound is a peptide in which one or more amino acids in the above amino acid sequence (LI AQQM) are modified by deletion, substitution or addition, and a V-ATPase subunit.
  • Such peptides include, for example, peptides having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 and 5 to 15 (CD1 peptide, CDP-la peptide, CDP.1 peptide, CD5 peptide, CDP-peptide). 5a peptide, CDP-5 peptide, VATE-201 c peptide, VATE-201 peptide, CDls peptide, CDP-ls peptide, V-ATPase, V-ATPase subunit E). .
  • a polypeptide having the amino acid sequence LIAQQM
  • having 6 to 22 amino acids preferably 6 to 14 amino acids can also be used.
  • V-ATP is used as an antigenic substance that binds to an antibody that recognizes V-ATPase.
  • subunit E and at least one other selected from the group consisting of other subunits A, subunit B, subunit C, subunit D, 115 kDa subunit, 39 kDa subunit, 20 kDa subunit, and 16 kDa subunit Complexes with subunits can also be used.
  • a method for testing for Crohn's disease of the present invention a method including a step of detecting an antibody that recognizes a human nuclear protein (HZF300) in a biological sample of a subject can be mentioned.
  • the antibody to be detected is preferably an antibody that recognizes the amino acid region at positions 126 to 138 of human nuclear protein (HZF300).
  • Detection of these antibodies can be performed using a conventionally known immunological measurement method utilizing an antigen-antibody reaction.
  • the above various biological samples preferably serum, are collected from a subject suspected of suffering from Crohn's disease, and an antigen that binds to the biological sample and an antibody that recognizes the human nuclear protein (HZF300). This can be done by reacting the substances and detecting the complex formed by the antigen-antibody reaction.
  • HZF300 human nuclear protein
  • the antigenic substance having a binding property to the antibody recognizing the human nuclear protein is not particularly limited as long as it specifically binds to the antibody recognizing the human nuclear protein (HZF300).
  • it has the property of specifically binding to an antibody that recognizes the amino acid region at positions 126 to 138 of human nuclear protein (HZF300).
  • Specific examples of those having such properties include a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 or an equivalent thereof.
  • the same active substance includes a peptide or protein obtained by adding one or more amino acids in SEQ ID NO: 51. Includes those that are white matter and have the property of specifically binding to an antibody that recognizes human nuclear protein (HZF300).
  • Such peptides include, for example, peptides having an amino acid sequence described in each of the sequence numbers 3 and 20 to 32 (CD3 peptide, CDP-3 peptide, CDP3-1 peptide, CDP3-2). Peptide, CDP3 3-peptide, CDP3-4 peptide, CDP3-5 peptide, CDP3.6 peptide, CDP3.8 peptide, CDP3-12 peptide, CDP3-14 peptide, Z300 peptide, human nuclear protein (HZF300)) be able to.
  • the polypeptide is not limited thereto, and for example, a polypeptide having 7 to 604 amino acids partially having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 51 can be used.
  • an antigenic substance having an ability to bind to an antibody recognizing human human nuclear protein HZF300
  • a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 51 or an equivalent thereof in the same or different molecule can be used. It is also possible to use a branched multi-antigenic peptide containing a plurality of peptides. (3-3) As shown in Example 7 described later, an antibody that recognizes rice allergen protein is specifically present in patients with Crohn's disease.
  • the rice allergen protein includes those belonging to the gene family of a-amylase / trypsin inhibitor.
  • Rice allergen 158aa
  • Rice seed allergen RA6 157aa
  • Rice allergen RA5B precursor 160aa
  • Rice seed allergen RA14 165aa
  • Rice allergen RA14B precursor 166aa
  • Rice seed allergen RAG2 166aa
  • the above antibody to be detected is preferably an antibody that recognizes at least the amino acid sequence of L (or V) GGIYREL located in the amino acid region at positions 95 to L10 of these various rice allergen proteins.
  • Detection of these antibodies can be performed using a conventionally known immunological measurement method utilizing an antigen-antibody reaction. Specifically, are subjects suspected of having Crohn's disease? The above various biological samples, preferably serum, are collected, and the biological sample is reacted with an antigen substance having a binding property with an antibody recognizing the rice allergen protein to detect a complex formed by an antigen-antibody reaction. Can be implemented.
  • the antigenic substance having a binding property to the antibody recognizing the human nuclear protein includes a substance which specifically binds to an antibody recognizing a protein belonging to the gene famil of the rice allergen protein (-amylase / trypsin inhibitor). If it is, there is no particular limitation.
  • it has a property of specifically binding to an antibody that recognizes at least the L (or V) GGIYREL amino acid sequence (SEQ ID NO: 49, 50) located in the amino acid region at positions 95 to 110 of various rice allergen proteins It is.
  • peptide consisting of an amino acid sequence of L (V) GGIYXD (E) L (X is an arbitrary amino acid residue) or an equivalent thereof.
  • the same compound is a peptide obtained by adding one or more amino acids in the amino acid sequence of L (V) GGIY XD (E) L (X is an arbitrary amino acid residue), and Includes those that have the property of specifically binding to an antibody that recognizes an allergen protein.
  • Such peptides include, for example, peptides having an amino acid sequence described in each of the sequence numbers 4 and 33 to 48 (CD4 peptide, CDP-4 peptide, CDP4-1 peptide, CDP4-2 peptide, CDP4-3 ⁇ Peptide, CDP4-4 peptide, CDP4-10 peptide, CDP4-13 peptide, CDP4-14 peptide, T03965 peptide, Rice allergen, Rice seed allergen RA5, Rice allergen RA5B precursor.Rice seed allergen RA14, Rice allergen RA14B precurso and Rice seed allergen RAG2).
  • the number of amino acids having an amino acid sequence of L (V) GGIYXD (E) L (X is an arbitrary amino acid residue) is 8 to 166, preferably 8 to 16 amino acids. 14 polypeptides can also be used.
  • a peptide comprising an amino acid sequence of L (V) GGIY XD (E) L (X is an arbitrary amino acid residue) or an equivalent thereof May be used in the form of a branched multi-antigenic peptide containing the same or different two or more in one molecule.
  • the method for detecting the antigen-antibody complex generated by the reaction between such an antigenic substance and an antibody specific to a Crohn's disease patient is not particularly limited, and a widely used conventional method can be used. Can be.
  • various immunoassays utilizing the above-mentioned various CD-binding peptides or branched polyantigenic peptides containing the same as the antigenic substance can be suitably exemplified.
  • the target antibody taking the solid-phase sandwich method using human serum as a test sample, the target antibody can be measured, for example, by the following method.
  • the peptide to be used as an antigen substance is immobilized (hereinafter referred to as “immobilized peptide” for convenience), and a biological sample (for example, a serum sample) as a test sample is added thereto.
  • a biological sample for example, a serum sample
  • an antigen-antibody reaction occurs between the immobilized peptide and an antibody specific to a Crohn's disease patient in the test sample, and the target antibody present in the test sample binds to the immobilized peptide.
  • the presence or absence of the bound target antibody and the amount (potency) of the antibody are detected using a human antibody (IgG) detection reagent, so that the test sample, that is, the biological sample (serum, etc.) of the subject is detected. Can be detected and quantified.
  • IgG human antibody
  • a human antibody (IgG) detection reagent is immobilized in advance, a test sample is added thereto to capture a target antibody in a biological sample, and then the above antigen substance is added thereto.
  • an antibody specific to the target Crohn's disease patient present in the test sample can be detected, and the amount (potency) of the antibody can be measured.
  • an antibody specific to a Crohn's disease patient can be detected using the antibody as an index, and the amount (potency) of the antibody can be measured. it can.
  • the selection of various means in these measurement methods and their modification are all well known to those skilled in the art, and in the present invention, any of these methods can be adopted (“Proposal of clinical test method”, Kinbara Publishing, 1995, etc.).
  • a human antibody (IgG) detection reagent for detecting Crohn's disease antibody various reagents generally used can be used without particular limitation.
  • an anti-human IgG antibody that specifically binds to human IgG is preferably used. Wear. These can be obtained as commercial products, but can also be prepared according to a conventional method.
  • the human antibody (IgG) detection reagent is preferably labeled.
  • radioactive isotopes such as C
  • enzymes such as alkaline phosphatase Ya Paokishidaze (P OX), full O receptacle in Isothiocarbazate Xia (FITC) ⁇ ⁇
  • Fluorescent substance such as tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC), and other IN— (2,2,6,6-tetramethyl-1-oxyl-4-piperidyl) -5N- (aspartate) —2,4-Dinitrobenzene (TO PA;), dye sol, metal sol, latex particles, etc.
  • IN— (2,2,6,6-tetramethyl-1-oxyl-4-piperidyl) -5N- (aspartate) —2,4-Dinitrobenzene (TO PA;) dye sol, metal sol, latex particles, etc.
  • the immunoassays using the detection reagents labeled with these labeling substances are described in Radioimnoassay, Enzymimnoassay, Fluoromnoassay, Spinimnoassay, FlowthroughAssy and It is called Muno Chromato Atsy.
  • enzyme labeling substances for enzyme labeling include, in addition to the above, microperoxidase, chymotrypsinogen, proloxypeptidase, glyceraldehyde-3_phosphate dehydratase, amylase, phosphorylase, D —Nase and P-nase.
  • the labeling method using these labeling substances can be performed according to a method known per se (“Monoclonal Antibody” by Tatsuo Iwasaki et al., Kodansha Scientifick, 1998; Enzyme Immunoassay). 2nd edition, Eiji Ishikawa et al., Medical School, 1982, etc.).
  • the target antibody is detected and measured using an antigenic substance (a CD-binding peptide or a branched polyantigenic peptide containing the amino acid sequence thereof) as an index
  • an antigenic substance a CD-binding peptide or a branched polyantigenic peptide containing the amino acid sequence thereof
  • a labeled peptide as the antigenic substance.
  • the labeling of such an antigenic substance can be carried out in the same manner as the labeling of the above-mentioned anti-human IgG antibody, using any labeling substance according to a conventional method.
  • an antigenic substance or an anti-human IgG antibody may be immobilized on a support (solid phase) before use.
  • the support is not particularly limited as long as it is an insoluble or inert carrier, and commonly used supports are widely used.
  • the method for immobilizing the antigenic substance or the anti-human IgG antibody on the solid phase is not particularly limited, and any of physical binding and chemical binding can be used.
  • the diazo method, the peptide method (acid amide derivative, carboxychloride resin method, the carpoimide resin method, the maleic anhydride derivative method, the isocyanate derivative method, the cyanide bromide-activated polysaccharide) are used as the covalent bond method.
  • a chemical reaction such as a carrier binding method by the Ugi reaction: or an ion binding method using a carrier such as an ion exchange resin: a physical adsorption method using porous glass such as glass beads as a carrier.
  • any of the commonly used solvents can be used as long as they do not adversely affect the reaction.
  • Specific examples include buffers having a pH of about 5 to 9, such as citrate buffer, phosphate buffer, tris-hydrochloride buffer, and acetate buffer.
  • the conditions of the immune reaction are not particularly limited, and ordinary conditions generally used in this type of assay are employed.
  • the reaction can be carried out under a temperature condition of 45 or less, preferably about 4 to 40, and about 1 to 40 hours.
  • the measurement of the antigen-antibody complex generated by the antigen-antibody reaction can be performed according to a conventional method depending on the type of the labeling substance to be used.
  • the activity of the enzyme should be measured.
  • Enzyme activity can be measured according to known methods depending on the type of enzyme used.
  • peroxidase used as a labeling enzyme
  • ABTSJ 2,2'-azinobi 3'ethyl
  • Benzthiazoline sulfonate or p-nitrophenyl phosphate as a substrate when alkaline phosphatase is used, incubate each, and measure the decomposition of each substrate using a spectrophotometer.
  • Enzyme immunoassay 2nd edition, Eiji Ishikawa et al., Medical Shoin, 1982, etc.
  • the measurement can be performed according to a method known per se.
  • the phage display library comprises a DNA containing a sequence in which NNK (N indicates any one of A, C, G, and T, and K indicates G or T) is repeated nine times. Is a filamentous phage that has been inserted randomly, and a DNA encoding a peptide consisting of 9 random amino acids has been inserted into the N-terminal portion of the main coat protein PVIII gene, and has been randomized on the phage coat surface. It is constructed so that a peptide having an amino acid sequence of 9 residues can be expressed.
  • Serum antibody was used as the antibody.
  • serum 20 serum samples from patients with Crohn's disease were used, and 20 serum samples from ulcerative colitis patients and 20 serum samples from healthy subjects were used as control serum samples.
  • the antibody (IgG) in the serum was immobilized on magnetic beads as follows. First, to a magnetic bead (DynabeadsM-450Tosyl-activated), an anti-human IgG (Fc) -specific antibody (Biodesign) adjusted to a concentration of 200 g / ml with 0.1 M borate buffer was added, followed by 4T. ⁇ Reacted.
  • Fc anti-human IgG
  • the magnetic beads were washed with (D) _PBS (Dulbecco's phosphate buffer) containing 0.1% serum albumin (BSA), and then washed with 0.2M Tris (2-%) containing 0.1% BSA. Blocking with amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) (Tris-HCl), followed by blocking with (D) -PBS containing 0.1% BSA, followed by anti-human IgG (Fc) Specific antibody-immobilized magnetic beads were prepared.
  • D _PBS
  • BSA serum albumin
  • coli on the grown medium was removed, infected with helper phage (M13K07), and IPTG (isopropyl-1-D (-)-thiogalactopyranoside) and kanamycin were removed. After the addition, the cells were cultured with shaking at 37 overnight. The culture solution was centrifuged to remove insolubles, a sodium salt solution containing polyethylene dalicol was added thereto, and the mixture was stirred several times, followed by centrifugation again to collect the pellet, and 0.02% sodium azide was added. Containing (D) —dissolved in PBS to obtain a concentrated phage solution.
  • the phage solution obtained by the third biopanning was infected into Escherichia coli J Ml09, which was spread on an LB agar medium containing 150 / g / ml ampicillin and 1% glucose, and cultured overnight at 37 t. A single colony of E. coli formed on the medium was picked up, shake-cultured at 371: 3 for 3 hours in LB liquid medium containing 150 g / ml ampicillin, and then infected with helper phage (M13K07). After adding I, PTG and kanamycin, the cells were cultured at 37 ° C with shaking.
  • the CD-binding peptide display phage was cloned.
  • the CD-binding peptide display phage cloned as described above was subjected to phage ELISA using the serum pool of a healthy subject and the serum pool of a patient with Crohn's disease (see (i)) used in the above-mentioned biobanning.
  • an anti-phage antibody (Pharmacia) was first immobilized on a 96-well microplate. Specifically, immobilization was performed by adding (D) —an anti-phage antibody (Pharmacia) solution 100 1 prepared in PBS at a concentration of 1 g / ml to each well, and allowed to stand at 4 ° C. After washing, 300 1 of a blocking solution ((D) -PBS containing 1% BSA and 5% sorbitol) was added, and the mixture was allowed to stand still in step 4.
  • D an anti-phage antibody
  • a blocking solution ((D) -PBS containing 1% BSA and 5% sorbitol) was added, and the mixture was allowed to stand still in step 4.
  • the primary reaction was performed by adding 10 ⁇ 1 of the phage culture solution prepared in (ii) above to 901 phage ELISA buffer ((D) -PBS containing 1% BSA, 0.05% Tween20 and 10% normal goat serum). After adding the above anti-phage antibody to each of the immobilized wells, the reaction was carried out at 37 for 1 hour. After the completion of the primary reaction, the resultant was washed four times and a secondary reaction was performed. The secondary reaction is performed by adding serum 11 (normal serum or serum from a patient with Crohn's disease) to 100 1 of phage ELISA buffer, adding to each well, and then adding Reaction for one hour.
  • serum 11 normal serum or serum from a patient with Crohn's disease
  • the third reaction was an anti-human IgG (FC) -specific antibody labeled with HRP (horseradish peroxidase) diluted 40,000-fold with phage ELISA buffer.
  • FC anti-human IgG
  • phage clones that did not react with the serum antibodies of healthy subjects but were reactive only with the serum antibodies of Crohn's disease patients were selected.
  • ELISA was performed on the selected phage clones for each of 20 sera of patients with Crohn's disease, 20 sera of patients with ulcerative colitis, and 20 sera of healthy subjects in the same manner as above, and based on the reactivity, Five clones (CD-1, CD-2, CD-3, CD-4, CD-5) with high specificity for Crohn's disease patient serum were selected.
  • Fig. 1 shows the results of the reactivity (ELISA) of each of the five selected clones with each serum sample (serum of a patient with Crohn's disease, serum of a patient with ulcerative colitis, and serum of a healthy subject).
  • the amino acid sequences of the five clones (CD-1, CD_2, CD-3, CD_4, CD-5) selected by each of the phages ELISA were determined.
  • DNA was extracted from the phage clones selected above. Specifically, the phage clone was infected into E. coli J Ml09, applied to LB agar medium containing ampicillin, cultured overnight, and the colonies formed on the medium were picked out and contained 2 ml of ampicillin. After culturing with shaking overnight in LB liquid medium, plasmid DNA was extracted using Qiaprep DNA extraction kit (Qiagen).
  • the nucleotide sequence of phage DNA was determined by the dideoxy method (Proc. Na. Acad. Sci., USA., 74, 5463-5467 (1977)) using the Amersham pharmacia biotech, code. ; 2438) It was performed according to the protocol.
  • the DNA sequence was sequenced using a DNA sequencer manufactured by Pharmacia (ALF DNA Sequencer).
  • AEGEL and ADPA or GDPA located at the N-terminal and C-terminal regions of each peptide are derived from the amino acid sequences located at both ends of the random peptide of the phage vector. Is what you do.
  • CD-1, CD_2, CD_3 and CD-4 clones excluding the CD-5 clone 18 amino acids including the amino acid sequence derived from the above phage vector were substituted with the branched antigen antigen peptide (Multiple Antigen Peptide) (MAP peptide).
  • MAP peptide Multiple Antigen Peptide
  • Fmoc8-Lys4-Lys-2-3 Ala-Alko manufactured by Watanabe Chemical Industry Co., Ltd.
  • a peptide having the following amino acid sequence is converted into a peptide ATC-357 peptide synthesizer (manufactured by Advanced ChemTech) was synthesized.
  • CDP-1 AEGELGLLAQQMDYADPA (SEQ ID NO: 6)
  • CDP-2 AEGELYRWLP PSS AGDPA (SEQ ID NO: 15)
  • CDP-3 AEGELRQSDGQYQMGDPA (SEQ ID NO: 20)
  • CDP-4 AEGELGG I YQDLVSGDPA (SEQ ID NO: 33)
  • the branched polyantigenic peptide has eight CD-binding peptide amino acid sequences in one molecule in a branched manner (Fig. 2).
  • Example 2 Reactivity of CD binding peptide to serum samples.
  • Each MAP peptide obtained in Example 1 was used as an antigen peptide, and each serum sample was analyzed by ELISA. (Sera of patients with Crohn's disease, sera of patients with ulcerative colitis, and sera of healthy subjects) were examined.
  • each MAP peptide was immobilized on a 96-well microplate. Specifically, for immobilization, each MAP peptide was prepared at a concentration of 1 g / ml in bicarbonate buffer (50 mM, pH 9.6) to prepare a MAP solution, and 100 1 was added to each well of the plate. 4t: Let stand still, then wash, add 300 1 casein solution ((D) _PBS containing 0.1% casein and 1% TritonX-100), and repeat at 4 ° C. I went by letting it stand.
  • casein solution 1001 plus serum antibody 11 was added to each well of a MAP plate, and the mixture was reacted at 37: for 1 hour.
  • wash 4 times add HRP-labeled anti-human IgG (Fc) -specific antibody diluted 20,000-fold with casein solution to this well, and allow it to react briefly at 37 for secondary reaction. Went.
  • the plate was washed four times to perform a color reaction. For detection, add 1001 TMB solution, react at room temperature for 10 minutes, stop the reaction by adding 1001 TMB stop solution (1N sulfuric acid), and absorb at OD450nm with a pre-loader.
  • CDP-11 peptide As shown in Table 6, when the mean ⁇ D value of 48 SDs from healthy subjects was taken as the cut-off value of 15 SD, the positive rate for CDP-11 peptide was 31.3% for CDP-11 peptide and CDP- Two peptides accounted for 27.1%, CDP-3 peptide for 51.0%, and CDP-4 peptide for 31.3%. In addition, the false-positive rate for serum in healthy subjects and patients with ulcerative colitis was 5% or less for all peptides. Therefore, each of these peptides (CDP-1 peptide, CDP-2 peptide, CDP-3 peptide and CDP-4 peptide) specifically binds to a unique antibody (Crohn disease antibody) possessed by Crohn's disease patients. However, it was thought that this could be used to accurately diagnose the presence or absence of Crohn's disease.
  • Example 2 (2) ELISA using mixed MAP peptide as antigen
  • the MAP peptides prepared in Example 1 (CDP-1, CDP-2, CDP-3 and CDP-4 MAP peptides) were mixed to prepare a mixed MAP peptide, which was used as an antigen.
  • the reactivity to various serum samples was examined by ELISA.
  • the antigen plate used for detection was 1.5 g / mL of CDP_1 MAP peptide and 1.5 g / mL of CDP-4 and MAP peptide, and 3 g / mL of MAP peptide of CDP-2 and MAP peptide and CDP-3.
  • the mixture was prepared by immobilizing the mixture on a 96-well micro tie plate in the same manner as in the preparation of the MAP plate described in (1).
  • each of the Crohn's disease antibody-binding peptides (CDP-1 peptide, CDP-2 peptide, CDP-3 peptide and CDP-4 peptide) was used alone. It was thought that the use of these in combination would improve the specificity for Crohn's disease-specific antibodies rather than using them, and this would enable the diagnosis of Crohn's disease to be diagnosed with high accuracy.
  • Example 1 the MAP peptide prepared in Example 1 (CDP-1, CDP-2, CDP-3 and CDP-4 MAP peptides) was mixed and used as an antigen.
  • the reactivity of each serum sample serum of a patient with Crohn's disease, serum of a patient with ulcerative colitis, and serum of a healthy subject
  • SA serum of a patient with Crohn's disease
  • serum of a patient with ulcerative colitis serum of a healthy subject
  • SA serum of a healthy subject
  • baker's yeast sacharomvces cerevisiae
  • the mixed MAP plate used as the antigen plate was composed of 1.5 g / mL CDP-1 MAP peptide and CDP-4 MAP peptide, and 1.5 g / mL CDP-2 MAP peptide and CDP-3 MAP peptide.
  • ASCAIgA detection kit antigen used: glycomannan of baker's yeast cell membrane, manufactured by Medizyme.
  • FIG. 5 shows the results.
  • the cut-off value was the average unit value + 48 SD of 48 healthy serum sera, and as shown in Figs. 5B and 5C.
  • a positive rate and a false positive rate were calculated according to the operation manual using a binding index of 1.0 as a cutoff value.
  • Table 8 shows the results of the positive rate and false positive rate.
  • MAP peptide (CDP- :! to CDP-4 MAP peptide)
  • CDX measles related antigen
  • porcine pancreatic alpha amylase Annual report of the research committee of inflammatory bowel disease.Japan: The ministry of health and welfare of Japan, 1999: 98-100>
  • M. paratuberculosis HSP65 honeyparatuberculosis HSP65 (horseradish peroxidase 65) (Clin Diagn Lab Immunol. 1995 Nov; 2 (6): 657-64), human HSP60 (Digestion.
  • Example 1 From the reactivity with various sera obtained by phage ELISA (FIG. 1) and the similarity of amino acid sequences (Table 2), each of the clones having the amino acid sequence of CD-1 and CD-5 clones was used.
  • the peptides (CDP-1 peptide (SEQ ID NO: 6) and CDP-5 peptide (SEQ ID NO: 9)) were considered to recognize the same antibody.
  • the CDP-1 peptide and the CDP-5 peptide are peptides (VATE-201 ⁇ ) located in the 199-212 region of subunit E of human vacuolar H + transportable ATase (V-ATPase).
  • Peptide A liquor having amino acid sequence homology with SEQ ID NO: 11).
  • CDP-la AEGELGLLAQQMDYADP (SEQ ID NO: 5)
  • CDP-5a AEGELRLVGQQVMQGDP (SEQ ID NO: 8).
  • VATE-210 RLDL I AQQMMPEVR (SEQ ID NO: 11) Twenty serum samples from patients with Crohn's disease were used as serum samples, and 20 serum samples from ulcerative colitis patients and 20 normal serum samples were used as comparative serum samples. The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 10, the CDP-la peptide, CDP-5a peptide and VATE-201 peptide showed the same ELISA reactivity as each other.
  • a MAP plate having CDP-la MAP peptide (Fig. 10) immobilized on the plate was used as an antigen plate (see Example 2 (1)), and the MAP peptide of VATE-201 (reaction inhibition) was used.
  • ELISA was similarly performed using the MAP peptide of CDP-la instead of the MAP peptide of VATE-201 as the above reaction inhibitor. The results are shown in FIG.
  • the results of Examples 4 and 5 indicate that the VATE-201 peptide, CDP-lapeptide and CDP-5a peptide all recognize antibodies that are specifically present in the sera of Crohn's disease patients. I understood.
  • the CD1 peptide of the present invention including the CDP-1a peptide and the CDP-5a peptide and the like, and their similarities, due to the similarity of the amino acid sequence with the VATE-201 peptide and the commonality of the reactivity with serum antibodies.
  • the drug is expected to mimic the subunit E of human vacuolar H + transport ATPase (V-ATPase).
  • Example 6 Search for a mimetic protein of the CD3 peptide and its equivalent, and its evaluation From the results of Example 5, CD1 peptide and its equivalent show that human vacuolar H + transporting ATPase (V-ATPase ) Was found to mimic subunit E. In the same manner, a mimetic protein was searched for the CD3 peptide and its equivalent, and its reactivity with the Crohn's disease antibody was evaluated.
  • CDP3 peptides 14 peptides were prepared in which each amino acid residue was substituted with alanine based on the amino acid sequence of the CDP3 peptide (SEQ ID NO: 21) (Table 9).
  • CDP 3-1 was substituted with serine because the first amino acid was alanine.
  • a MAP peptide having 8 peptides per molecule was prepared for each of these 15 peptides according to the method of Example 1 (3) (1 amino acid-substituted MAP peptide).
  • a three-step reaction was performed using a MAP plate (see Example 2 (1)) in which a MAP peptide of CDP3 was immobilized on the plate as an antigen plate.
  • the primary reaction was performed using a sample diluent (0.5 M salt, 1.5% casein, 2% normal goat serum, 0.2% Tween 20) containing the serum of a patient with Crohn's disease and a 1 amino acid-substituted MAP at a concentration of 100 Z / g / mL each. (0.1M Tris buffer) containing 100-fold dilution, and reacted at 25 for 1 hour.
  • the secondary reaction was performed by adding 100 L of the primary reaction solution to the wells of the MAP plate, reacting at 25: for 1 hour, and washing three times.
  • the tertiary reaction was performed using an HRP-labeled anti-human IgG diluted 5,000-fold with an enzyme-labeled antibody diluent (Tris buffer containing 0.14 M saline, 0.5% BSA, 5% normal goat serum, and 0.05% Tween 20).
  • Fc A specific antibody lOO ⁇ L was added, and the mixture was reacted at 25: 1 for 1 hour, followed by washing three times.
  • Detection was carried out according to Example 2 (1), and the reaction inhibition activity by 1-amino acid-substituted MAP peptide was measured. Table 9 shows the results. Table 9
  • CDP3-1 S EGE L RQ S DGQYQM +++ +++ +++
  • CDP3-2 AAGE L RQ S DGQYQM +++ +++ +++
  • CDP3-3 AEAE LRQ S DGQYQ +++ +++ +++
  • CDP3-4 AEGAL RQ S DGQYQM +++ +++ +++
  • CDP3-5 AEGEARQ S D GQ Y QM +++ +++ +++
  • CDP3-8 AEGE L RQADGQYQM +++ +++ +++
  • HZF300 human nuclear protein
  • Z300 peptide having the amino acid sequence of the amino acid region at positions 126 to 138 was converted to a MAP peptide.
  • a MAP antigen ELISA was performed using 20 sera of Crohn's disease patients, 20 sera of ulcerative colitis patients, and 20 sera of healthy subjects.
  • a MAP plate in which a MAP peptide of CDP3 was immobilized on a plate was used (see Example 2 (1)), and a MAP peptide (a reaction inhibitor) of Z300 was added thereto.
  • Sample diluent containing 100 ig / mL (described above) Serum sample (1 Hh) was added to 100 L, and the entire volume of the solution reacted for 1 hour at 25 was added.
  • EL was prepared in the same manner as in Example 6 (2). I performed SA.
  • ELISA was similarly performed using the MAP peptide of CDP3 instead of the MAP peptide of Z300 as the reaction inhibitor. The results are shown in FIG.
  • both the Z300 peptide and the CDP3 peptide recognized antibodies specifically present in the serum of patients with Crohn's disease. Also, due to the similarity of the amino acid sequence with the Z300 peptide and the similarity of the reactivity with serum antibodies, the CD3 peptide of the present invention and its equivalents were homologous to the human nuclear protein (Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein). It is thought to mimic 300). That is, the results of the above examples show that antibodies to human nuclear protein (Homo sapiens kruppeMike zinc finger protein 300) are specifically present in Crohn's disease patients.
  • human nuclear protein Homo sapiens kruppeMike zinc finger protein 300
  • Example 7 Search for a mimetic protein of CD4 peptide and its equivalent, and evaluation thereof The reactivity to Boehne's disease antibody was evaluated.
  • modified CDP4 peptides 15 types of peptides were prepared in which each amino acid residue was substituted with alanine based on the amino acid sequence of CDP4 peptide (SEQ ID NO: 33) (Table 10).
  • CDP4-1 was substituted with serine because the first amino acid was alanine.
  • a MAP peptide having eight peptides per molecule was prepared according to the method of Example 1 (3) (1-amino acid-substituted MAP peptide).
  • Example 6 In order to determine the sequence required for specific reactivity with the Crohn's disease antibody in the amino acid sequence of the CDP peptide, the above-prepared 1 amino acid-substituted MAP peptide was used as a reaction inhibitor in Example 6 ( A reaction inhibition test was performed in the same manner as in 2). Serum Nos. 3, 6, 15, 15, 17 and 20 from patients with Crohn's disease who showed strong reactivity with the CDP-4 peptide in Example 2 were used as the reactive serum antibody samples (see Figure 3). ). Table 10 shows the results.
  • CDP4-1 S E GE LGG I YQD LV S +++ +++ +++ +++ +++ +++
  • CDP4-2 AAGE LGG I YQD L V S +++ +++ +++ +++ +++ +++
  • CDP4-4 AEG ALGG I YQDL V S +++ +++ +++ +++ +++ +++
  • CDP4-6 AEG E LAG I YQDLV S ++
  • CDP4-7 A E G E L G A I Y Q D L V S
  • CDP4-8 AEG E LGGAYQD LV S
  • CDP4-10 A E G E L G G I Y AD L V S +++ +++ +++ +++ +++ +++
  • CDP4-14 A E G E L G G I YQD LVA +++ +++ +++ +++ +++ +++
  • Reaction inhibition activity is 30% or less
  • CDP 4-7, CDP4-8, CDP4-9 and CDP8-12 When the MAP peptide was used, the inhibitory activity on the reaction between the serum of a patient with Crohn's disease and the CDP4 peptide was 30% or less.
  • the MAP peptide of CDP4-6 was used as a reaction inhibitor in the sera of patients with Crohn's disease Nos. 6, 15, 17, and 20, the reaction between the sera of patients with Crohn's disease and the CDP3 peptide was inhibited. Inhibitory activity was 30% or less.
  • CDP4-5 and CDP4-11 MAP peptides were used as reaction inhibitors, inhibition of the reaction between the CDP4 peptide and the serum of patients with Crohn's disease in serum Nos. 6 and 15 of Crohn's disease patients, respectively.
  • the activity was less than 30%.
  • the amino acid sequence of CDP4 peptide was determined to be LGGI YXDL (X is an arbitrary amino acid residue) (SEQ ID NO: 49), which is a sequence required for reaction with Crohn's disease antibody (antibody recognition).
  • homology analysis with a protein database was performed using an amino acid sequence (LGGIYXDL (X is any amino acid)) that is considered important for the recognition of Crohn's disease antibody.
  • the rice allergen protein is a-amylase / trypsin inhibitor and forms a gene family.
  • These OL-amylase / trypsin inhibitors having high homology to each other are amino acid sequences L (or V) GG I YXD (or E) L which are considered to be important for the reaction (antibody recognition) with Crohn's disease antibody.
  • a peptide (T03965 peptide) having the amino acid sequence of the 99th to 111th amino acid region of Rice seed allergen RA14 (Fig. 16) was mapped to MAP.
  • the peptide was prepared in the form of a peptide, and MAP antigen ELISA was performed using serum from 20 patients with Crohn's disease, serum from 20 patients with ulcerative colitis, and serum from 20 healthy volunteers.
  • MAP antigen ELISA was performed in the same manner as in Example 6 (4), except that a MAP antigen plate prepared by immobilizing the MAP peptide of T03965 was used as the antigen plate.
  • the results are shown in FIG. As a result, sera 3, 6, 15, 17, and 20 of Crohn's disease patients showing strong reactivity to the CDP4 peptide showed similar reactivity to the T03965 peptide.
  • T03965 peptide like CDP4 peptide, did not show clear reactivity to serum of patients with ulcerative colitis and healthy subjects.
  • the peptide which specifically binds to the antibody which exists uniquely in Crohn's disease patient can be provided.
  • Such a peptide of the present invention is useful as a test reagent for Crohn's disease. According to such a peptide and a test reagent containing the same, the presence or absence of Crohn's disease can be accurately diagnosed.
  • the present invention also provides an antibody that recognizes human vacuolar H + transporting AT Pase, particularly subunit E of human vacuolar H + transporting AT Pase, a human nuclear protein (Homo sapiens).
  • kruppei-like zinc finger protein 300 Provides new knowledge that antibodies that recognize the 3 ⁇ 4r recognition, antagonist, and gene family of rice allergen proteins (a-amylase / trypsin inhibitor) are specifically present.
  • the present invention provides a method for testing for Crohn's disease, which comprises detecting the presence of the antibody in a biological sample of a subject using at least one of these antibodies as an index. According to such a method, the presence or absence of Crohn's disease can be diagnosed simply and accurately for each subject by using a biological sample (for example, serum or the like).
  • a biological sample for example, serum or the like.

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Description

明 細 書 クローン病抗体結合性べプチド及びクローン病の検査方法 技術分野
本発明は、 クローン病の診断に有用な検査試薬及びその有効成分に関する。 ま た、 本発明は血液などの生体試料を被験試料として用いて簡便に実施できるクロ —ン病の検査方法に関する。
背景技術
クロ一ン病は、 免疫学的応答の異常状態に基づく局所の炎症性傷害として理解 されている。 従来、 かかるクローン病の診断は、 臨床症状、 X線造影、 内視鏡検 査または病理学的検査等によって総合的に行われている。 しかしながら、 これら の方法は判別に経験と熟練した技術が必要であり、 また患者に肉体的または精神 的な苦痛を与えるといった欠点がある。 このためクローン病を簡単に精度良く診 断するための方法が求められている。
クローン病の病因は未だ不明であるが、食餌性抗原との関連も指摘されており、 事実、 抗パン酵母抗体や抗ブ夕アミラーゼ抗体等の特定の抗体がクローン病患者 の血清中に特異的に増加していることが報告されている。 このような知見から、 最近ではクローン病の診断として、 クローン病患者に特有に見られる抗体、 例え ば抗パン酵母抗体 (松本譽之他,「炎症性腸疾患における血清 anti Saccharomyces cerevisiae antibody 測定の意義」難治性炎症性腸管障害調査研究班,平成 1 0年 報告書； Main J, et al. BMJ, 1988 Oct 29, 297 (6656) 1105-6； Barnes RM, et al. Int Arch Allergy Appl Immunol. 1990， 92(1)： 9· 15； Giaffer MH, et al. Gut. 1992 Aug, 33 (8), 1071-5； Sendid B, et al. Clin Diagn Lab Immunol. 1996 Mar,3(2),219-26； Quinton JF, et al., Gut. 1998 Jun, 42(6) 788.91)、 抗ブタァミ ラーゼ抗体（戸澤辰雄他， 「クローン病患者血中抗ブタアミラーゼ抗体— E L I S Aによる研究」 難治性炎症性腸管障害調査研究班， 平成 1 0年報告書、 特開平 11-190734号公報)、抗 Mパラチュバキュ口一シス由来タンパク抗体 (Suenaga K, et al.Dig Dis Sci., 1999, Jun, 44(6), 1202,7； Kreuzpaintner G, et al., Gut. 1995 Sep, 37(3)， 361-6； Oudkerk Pool M, et al., J.Clin Pathol., 1995 Apr, 48(4), 346-50)、 抗好中球抗体 (Targan,S.,et al., Gastroenterology, 96, A505, 1989)、 抗小腸抗体 (Bagchi,S.,et al:Clin.Exp.Immunol, 55, 44-48, 1984) を検出するこ とによってクローン病を診断する方法が提案されている。
ところで、 コメアレルゲン蛋白質は、 コメアレルギー患者における I g Eの主 要抗原として単離され、 遺伝子およびァミノ酸配列より alpha-amylase/trypsin inhibitorであることが知られている （Izumi H, et al. FEBS Lett. 1992 May, 181302 (3), 213-6； Nakamura R, et al. Biosci Biotechnol Biochem. 1996 Aug, 60 (8), 1215-21) ) o 前述するように、 クローン病に特異的な自己抗原としてパン 酵母ゃブタアミラーゼなどの食餌性抗原との関連は指摘されているものの、 上記 コメアレルゲン蛋白質との関連性については報告されていない。
また、 液胞型 H+輸送性 AT Paseは、 細胞内膜系 （central vacuolar system) に属するオルガネラに存在してオルガネラの内部を酸性に調整している H+ボン プであり、 これが形成する酸性 p Hが神経伝達物質やイオンの濃縮、 タンパク質 分解など、 膜の動的な過程を含む多くの生命現象と密接に結びついていることが 知られている （生化学、 第 65巻、 第 6号、 1993年 6月、 第 413-436頁)。 しか し、 その生体内での詳細機能は十分に解明されてはいない。 さらに、 ヒト核内蛋 白質 (Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300 (ZNF300)) は、 Zinc fingerドメインを有することから核内で遺伝子の発現制御に関与していると予測 されているものの、 未だ機能が不明な蛋白質である。 当該ヒト核内蛋白質に関す る報告はなく、 唯一、 そのアミノ酸配列及びその遺伝子配列がデータベースに登 録されているに過ぎない （Gou D.-MET et al., Submitted (28-JUN-2001) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases)。
これらの蛋白質については、 生体内での機能が解明されることによって新たな 薬剤の開発や医療に応用できる可能性が期待されるものの、 未だそれを示唆する 報告はなく、 またいずれもクローン病との関連性について報告された例もない。 発明の開示
本発明は、 クローン病の罹患の有無を特異的に検出するのに有用な検査試薬、 及びその有効成分を提供することを目的とする。 また本発明は、 被験者の生体試 料を対象に簡便に実施できるクローン病の検査方法を提供することを目的とする。 本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねていたところ、 特定のぺ プチドがクローン病患者体内に特有に存在する抗体を特異的に認識して結合する 性質を有することを見出し、 これらのペプチドを 1種、 好ましくは 2種以上組み 合わせて用いることにより、 被験者についてクローン病の罹患の有無を簡単に且 つ精度よく検出することができることを確認した。 さらに本発明者らは、 上記研 究の過程で、 クローン病患者体内には、 液胞型 H+輸送性 AT P ase (特にそのサ ブユニット E)、 コメアレルゲン蛋白質、 またはヒト核内蛋白質 （Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300 (ZNF300)) を認識する抗体が特異的に存在 していることを見いだした。 そして、 これらの蛋白質がクローン病における特異 的な自己抗原となっている可能性を確信し、 被験者について上記抗体の有無を検 出することにより、 クローン病の罹患の有無を高い精度で調べることができるこ とを確信した。
本発明はかかる種々の知見に基づいて開発されたものである：
第 1に、 本発明はクローン病の検査に有効に利用できる下記 （1 ) 〜 （9 ) に 掲げるクローン病抗体結合性ペプチドである：
( 1 )下記（a )または（b ) のいずれかであるクローン病抗体結合性ペプチド：
( a ) 配列番号 1〜 4に示されるァミノ酸配列のレ ^ずれかから選ばれるァミノ酸 配列からなるペプチド、
( b ) 上記 （a ) に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロー ン病抗体に結合性を有するペプチド。
( 2 ) 上記 （b ) に記載されるペプチドが、 配列番号 1〜4または配列番号 7に 示されるアミノ酸配列のいずれかを一部に含むペプチドである （1 ) に記載のク ローン病抗体結合性べプチド。 ( 3 ) 配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロ一 ン病抗体に結合性を有するペプチドが、 配列番号 5〜1 4に示されるいずれかの 7ミノ酸配列を有するものである（ 1 )に記載のクローン病抗体結合性べプチド。 ( 4 ) 配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロー ン病抗体に結合性を有するぺプチドが、 少なくとも L I AQ QMのアミノ酸配列 を含むアミノ酸数 6〜2 2 6ペプチドである （1 ) に記載のクローン病抗体結合 性ペプチド。
( 5 ) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロ一 ン病抗体に結合性を有するペプチドが、 配列番号 1 5〜1 9に示されるいずれか のアミノ酸配列を有するものである （1 ) に記載のクローン病抗体結合性べプチ ド、。
( 6 ) 配列番号 3に示されるァミノ酸配列において 1若しくは複数個のァミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロー ン病抗体に結合性を有するペプチドが、 配列番号 2 0〜3 2に示されるいずれか のアミノ酸配列を有するものである （1 ) に記載のクローン病抗体結合性べプチ ド。
( 7 ) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロ一 ン病抗体に結合性を有するペプチドが、 少なくとも配列番号 5 1に示されるアミ ノ酸配列を含むアミノ酸数 7〜6 0 4のペプチドである （1 ) に記載のクローン 病抗体結合性ペプチド。
( 8 ) 配列番号 4に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロー ン病抗体に結合性を有するペプチドが、 配列番号 3 3〜4 8に示されるいずれか のアミノ酸配列を有するものである請求項 1に記載のクローン病抗体結合性ぺプ チド。
(9) 配列番号 4に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロー ン病抗体に結合性を有するペプチドが、少なくとも L(V)GGIYXD(E)L (X は任意のアミノ酸残基） のアミノ酸配列を含むアミノ酸数 8〜165のペプチド である （1) に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
また、 本発明のクローン病抗体結合性ペプチドは、 一分子中に、 上記 （1) 〜
(9) に掲げる各べプチドのアミノ酸配列を複数個有するものであってもよい。 本発明はこのような形態のペプチドとして、 下記 （10) 〜 （11) に掲げる分 岐状多抗原性べプチドを提供する：
(10) 分枝鎖のアミノ酸配列として、 下記：
(a) 配列番号 1〜 4に示されるアミノ酸配列のいずれかから選ばれるアミノ酸 配列からなるペプチド、 または
(b) 上記 （a) に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロー ン病抗体に結合性を有するぺプチド
のアミノ酸配列を、 同一または異なって、 一分子中に複数個有する分岐状多抗原 性ペプチド。
(11) (i) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効 物、 （ii) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、
(iii)配列番号 3で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、 及び
(iv)配列番号 4で示されるァミノ酸配列を有するぺプチド及びその同効物のうち、 少なくとも 2つの群の中から選択される 2種以上の異なるクローン病抗体結合性 ペプチドのアミノ酸配列を分枝鎖に有する （10) に記載の分岐状多抗原性ぺプ チド。
なお、 ここで 「同効物」 とは、 各々配列番号 1〜4に記載されるアミノ酸配列 において 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、 欠失若しくは付加により改変され たァミノ酸配列からなり、 且つクローン病抗体に結合性を有するぺプチドを意味 する （下記の （13) においても同じ）。 第 2に、 本発明はクローン病の診断に有効に利用できる下記（12)〜 （15) に掲げるクローン病の検査試薬及びそれを含む試薬キットである：
(12) 上記 （1) 〜 （9) のいずれかに記載するクローン病抗体結合性ぺプ チド；（10) に記載する分岐状多抗原性ペプチド；及びヒト液胞型 H+輸送性 A TPaseのサブユニット Eと、 その他のサブユニット A、 サブユニット B、 サブ ユニット C、 サブユニット D、 115kDaサブユニット、 39kDaサブユニット、 20 kDaサブュニット、 及び 16 kDaサブュニッ卜よりなる群から選択される少なく とも 1つのサブユニットとの複合体よりなる群から選択される少なくとも 1つを 有効成分として含有するクローン病の検査試薬。
(13)上記のクローン病抗体結合性ペプチドが、 (i)配列番号 1で示されるアミ ノ酸配列を有するぺプチド及びその同効物、 （ii)配列番号 2で示されるアミノ酸 配列を有するペプチド及びその同効物、 （iii)配列番号 3で示されるアミノ酸配列 を有するぺプチド及びその同効物、 及び (iv)配列番号 4で示されるアミノ酸配列 を有するペプチド及びその同効物のうち、 少なくとも 2つの群の中から選択され る 2種以上の異なるクローン病抗体結合性べプチドであり、 分岐状多抗原性ぺプ チドが（11) に記載されるペプチドである、 （12)に記載のクローン病の検査 ϋ。
(14) (12) または（13)に記載の検査試薬をクローン病抗体結合用の抗原 物質として含むクローン病の検査試薬キット。
(15) 抗ヒト I gG抗体、 及び （12) または （13) に記載の検査試薬、 並 びに必要に応じて、検体希釈液、 標識物質、 支持体（固相)、 抗ヒト I gG抗体希 釈液、 酵素基質液、 及び反応停止液よりなる群から選択される少なくとも 1つを 含有する （14) に記載のクローン病の検査試薬キット。 第 3に、 本発明は下記 （A) 〜 （C) に掲げるクローン病の検査方法である： (A)被験者の生体試料中のヒト液胞型 H+輸送性 A TPaseを認識する抗体の有 無を検出する工程を含むクローン病の検査方法。
上記クローン病の検査方法には、 下記の態様が包含される：
(A-1) 上記抗体がヒト液胞型 H+輸送性 AT Pase のサブュニット Eを認識す る抗体である （A) 記載のクローン病の検査方法。
(A-2) 上記抗体がヒト液胞型 H+輸送性 AT Pase のサブユニット Eと、 その 他のサブュニット A、サブュニット B、サブュニット C、サブュニッ D、 115kDa サブユニット、 39kDaサブユニット、 20 kDaサブユニット、 及び 16 kDaサブ ュニッ卜よりなる群から選択される少なくとも 1つのサブュニッ卜との複合体を 認識する抗体である （A) 記載のクローン病の検査方法。
(A-3) 上記抗体がヒト液胞型 H+輸送性 AT Pase のサブユニット Eの 199〜
212位のアミノ酸領域を認識する抗体である（A)記載のクローン病の検査方法。
(A-4) L I AQQMのアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物、ま たはこれらのペプチド若しくはその同効物のアミノ酸配列を同一または異なって 一分子中に複数個有する分岐状多抗原性ペプチドを抗原物質として用い、 ヒト液 胞型 H+輸送性 AT Pase を認識する抗体との抗原一抗体反応によって生じる複 合物を検出する工程を有する （A)〜(A-3)のいずれかに記載のクローン病の検査 方法。
(A-5) L I AQQMのアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物が、 L I AQQMのアミノ酸配列を含むアミノ酸数 6〜2 2 7個からなるペプチドで ある (A-4)に記載のクローン病の検査方法。
(A-6) L I AQQMのアミノ酸配列からなるぺプチドの同効物が、 配列番号 1及び 5〜： L 4に記載されるそれぞれのアミノ酸配列を有するぺプチドよりなる 群から選択されるものである (A-4)に記載のクローン病の検査方法。
(A-7) ヒト液胞型 H+輸送性 AT Paseのサブュニット Eと、 その他のサブュ ニット A、 サブユニット B、 サブユニット C、 サブユニット D、 115kDaサブュ ニット、 39kDaサブユニット、 20 kDaサブユニット、 及び 16 kDaサブュニッ 卜よりなる群から選択される少なくとも 1つのサブユニットとの複合体によって 生じる複合物を検出する工程を有する （A)〜(A-3)のいずれかに記載のクローン 病の検査方法。
( B) 被験者の生体試料中のヒト核内蛋白質 （Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)を認識する抗体の有無を検出する工程を含むクローン病の検 査方法。
上記クローン病の検査方法には、 下記の態様が包含される：
(B-1) 上記抗体がヒト核内蛋白質 (Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300) の 126〜： 138位のアミノ酸領域を認識する抗体である （B) 記載の クローン病の検査方法。
(B-2) 配列番号 5 1に記載するペプチド若しくはその同効物、またはこれらの ぺプチド若しくはその同効物のアミノ酸配列を同一または異なって一分子中に複 数個有する分岐状多抗原性ペプチドを抗原として用い、 ヒト核内蛋白質 （Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300) 識する in体との 原一 f几体汉 応によって生じる複合物を検出する工程を有する （B) または (B-1)に記載のクロ ーン病の検査方法。
(B-3) 配列番号 5 1に記載するペプチド若しくはその同効物が、少なくとも配 列番号 5 1に記載するアミノ酸配列を含むアミノ酸数 7〜 6 0 4個からなるぺプ チドである (B-2)に記載のクローン病の検査方法。
(B-4) 配列番号 5 1に記載するペプチドの同効物が、 配列番号 3、 2 1〜3 2 よりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである (B-2)に記載のクローン病の検査方法。
( C) 被験者の生体試料中のコメアレルゲン蛋白質を認識する抗体の有無を検出 する工程を含むクローン病の検査方法。
(C-1) 上記コメァレルゲン蛋白質が alpha-amylase/trypsin inhibitorの gene familyに属するものである （C) 記載のクローン病の検査方法。
(C-2) 上記コメァレルゲン蛋白質力^ Rice aUergen, Rice seed allergen RA5、 Rice allergen RA5B precursor Rice seed allergen RA14、 Rice allergen RA14B precursor及び Rice seed allergen RAG2よりなる群から選択される少なくとも 1種である （C) または （C-1) に記載のクローン病の検査方法。
(C-3) 上記コメァレルゲン蛋白質を認識する抗体が、 Rice seed allergen RA14 の 99〜： 111位のアミノ酸領域を認識する抗体である （C) 〜 （C-2) のいずれか に記載のクローン病の検査方法。
(C-4) 上記コメアレルゲン蛋白質を認識する抗体が、 alpha-amylase/trypsin inhibitorの gene familyの、 L (V) G G I Y R E Lのアミノ酸配列を有するァ ミノ酸領域を認識する抗体である （C) 〜 （C-3) のいずれかに記載のクローン 病の検査方法。
(C-5) L (V) GG I YXD (E) L (Xは、 同一または異なる、 任意のアミ ノ酸残基である） のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物、 または これらのペプチド若しくはその同効物のアミノ酸配列を同一または異なって一分 子中に複数個有する分岐状多抗原性ペプチドを抗原物質として用い、 コメアレル ゲン蛋白質を認識する抗体との抗原一抗体反応によって生じる複合物を検出する 工程を有する （C) 〜 （C-4) のいずれかに記載のクローン病の検査方法。
(C-6) L (V) G G I YXD (E) L (Xは、 同一または異なる、 任意のァ ミノ酸残基である） のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物が、 少 なくとも L(V)G G I YXD(E)L (Xは、 同一または異なる、 任意のアミノ酸残 基である） のアミノ酸配列を含むアミノ酸数 8〜1 6 6個からなるペプチドであ る （C-5) に記載のクローン病の検査方法。
(C-7) L (V) G G I YXD (E) L (Xは、 同一または異なる、 任意のァ ミノ酸残基である） のアミノ酸配列からなるペプチドの同効物が、 配列番号 4、 3 3〜4 8に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドよりなる群から選択され るものである （C-5) に記載のクロ一ン病の検査方法。 更に本発明には、 下記の発明が含まれる：
( a ) 上記 （1 ) 〜 （1 1 ) のいずれかに記載のペプチドの、 クローン病の検査 においてクローン病抗体と反応させる抗原物質としての使用。 (b) 上記 （1) 〜 （11) のいずれかに記載のペプチドの、 クローン病の検査 試薬の製造のための使用。 以下、 本明細書におけるアミノ酸、 ペプチド、 塩基配列、 核酸等の略号による 表示は、 IUPAC、 IUBの規定、 「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等 の作成のためのガイドライン」 （特許庁編)及び当該分野における慣用記号に従う ものとする。 また、 本発明でいうペプチドには、 アミノ酸数が 10個以下のオリ ゴペプチドおよびそれ以上のアミノ酸からなるポリペプチドがいずれも包含され る。
「クローン病抗体」 は、 クローン病の罹患によって生体内で生成されるクロー ン病特有の抗体である。 本発明では、 原因となる抗原物質の別を問わず、 またそ の認識如何に関わらず、 クローン病患者に特異的に認められるクローン病患者特 有の抗体を広く意味するものである。 より詳細には、 少なくとも健常者、 潰瘍性 大腸炎患者、 その他の自己免疫疾患患者、 十二指腸潰瘍患者及び胃潰瘍患者とク ローン病患者とを対比した場合に、 クローン病患者に特異的に認められる抗体を 意味する。 なお、 クローン病抗体は、 通常クローン病患者の血液 （血清、 血漿)、 尿、 汗、 唾液、 精液及び髄液等の各種の生体試料中に含まれる。
図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1 (2) の結果を示す図である。 具体的には、 クローン病患者 血清に対する特異性から選択した 5つのクローン （CD_1， CD- 2, CD— 3、 CD— 4、 CD— 5) について各血清検体 （クローン病患者血清、 潰瘍性大 腸炎患者血清及び健常者血清）に対する反応性を EL I S Aで調べた結果を示す。 図 2は、 CDP-1、 CDP-2、 CDP-3、 及び CD P-4の各 MAPペプチド の構造を示す図である。
図 3は、 実施例 2 (1) の結果を示す図である。 具体的には、 各 MAPぺプチ ド （CDP-1、 CDP-2、 CDP-3、 CDP-4の MAPペプチド） に対する各種血清検 体 （クローン病患者血清、 潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清） の反応性を E L I S Aで調べた結果を示す。
図 4は、 実施例 2 ( 2 ) の結果を示す図である。 具体的には、 混合抗原プレー トを用いて、 クローン病 （CD) 患者血清 550検体、 潰瘍性大腸炎 （UC) 患者血 清 2 0検体、 健常者血清 120検体、 十二指腸潰瘍患者血清 2 5例及び胃潰瘍患者 血清 1 5検体について混合 MA Pペプチドに対する反応性を E L I S Aで調べた 結果を示す。
図 5は、 実施例 2 ( 3 ) の結果を示す図である。 具体的には、 図 Aは、 混合 M A Pペプチドに対する各種血清検体 （クローン病 （CD) 患者血清、 潰瘍性大腸 炎 （UC) 患者血清、 及び健常者血清） の反応性を示す図である。 図 B及び Cは、 混合 MA Pペプチドに代えてパン酵母を抗原として、 パン酵母に対する各種血清 検体 （クローン病 （CD) 患者血清、 潰瘍性大腸炎 （UC) 患者血清及び健常者血 清) の反 '性を示"^ (巿販の Anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies(ASCA) 検出キットを使用）。 図 Bは ASCAIgG、 及び図 Cは ASCAIgAを使用。
図 6は、クローン病患者特異的べプチド（クローン病抗体結合性べプチド： CD1 ペプチド、 CD2ペプチド、 CD3ペプチド、 CD4ペプチド） と、 クローン病との 関連が報告されているタンパク （CDX、 pig pancreatic alpha amylase (ブタ滕 臓 α -アミラーゼ）， M.paratuberculosis HSP65 (M.パラチュバキュ口一シス HSP65) , human HSP60 (ヒト HSP60) , M.paratuberculosis p36 OVLパラチ ュバキュ口一シス p36) ) とのアミノ酸配列における相同性を示す図である。 な お、 図中：はアミノ酸が一致することを、 また ·はアミノ酸が類似していること を示す。
図 7は、 タンパクデータベースよりホモロジ一検索して得られた、 クローン病 患者特異的ペプチド （クローン病抗体結合性ペプチド： CD1ペプチド、 CD3ぺ プチド、 CD4ぺプチド）とアミノ酸配列において相同性を有する各種生物 (細菌、 菌類、 動物、 節足動物、 植物、 藻類） に由来するタンパクを示す図である。 図 8は、 ヒト液胞型 H+輸送性 AT Paseのサブユニット Eのアミノ酸配列と、 C D 1ペプチドの同効物 （C D P - 1ペプチド、 C D P - 5ペプチド） のアミノ酸 配列との相同性を示した図である。 なお、 図中、 IIは V-ATPaseサブユニット E のアミノ酸配列と CDP-1及び CDP-5ぺプチドの両方またはいずれか一方のアミ ノ酸配列を一致することを、 Iは V-ATPaseサブュニット Eのァミノ酸配列と CDP-1及び CDP-5ぺプチドの両方のアミノ酸配列とが類似することを示す。 ま た、 ：は CDP-1と CDP-5ペプチドとのアミノ酸が一致することを、 ·は CDP-1 と CDP-5ペプチドとのアミノ酸が類似することを示す。 また下線部は、 ファー ジ PVIII-蛋白質に由来するアミノ酸配列を示す。
図 9は、 VATE-201、 CDP-la及び CDP-5aの各 MA Pぺプチドの構造を示す 図である。
図 10は、実施例 4の結果を示す図である。具体的には、 CDP-laペプチド、 CD P- 5aペプチド、及びヒト液胞型 H+輸送性 ATPaseのサブュニット Eに由 来するペプチド （VATE-201ペプチド） について、 各血清検体 （クローン病患者 血清、 潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清に対する反応性を EL I SAで調べ た結果を示す。
図 11は、 実施例 5の結果を示す図である。 具体的には、 クローン病患者の血 清検体 8番、 9番、 14番の CDP-laの MAPプレートに対する反応性を CD P - 1 aの M A Pぺプチド抗原（図 A)または VATE-201の MA Pぺプチド抗原（図 B)用いて阻害した試験の結果を示す。図中、ー國一はクローン病患者血清 8番、 はクローン病患者血清 9番、 及び一▲ーはクローン病患者血清 14番の結 果を示す。
図 12は、 ヒ卜核内 ¾白質 (Homo sapiens kruppel-like zinc nnger protein 300) のアミノ酸配列、 並びにその 126〜： 138位のアミノ酸領域のアミノ酸配列 を有する Z300ぺプチドの位置関係を示した図である。
図 13は、 実施例 6 (4) の結果を示す図である。 具体的には、 CDP3ぺプ チド （上段） 及び Z300ペプチド （下段） について、 各血清検体 （クロ一ン病患 者血清、 潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清に対する反応性を EL I SAで調 ベた結果を示す。
図 14は、 実施例 6 (5) の結果を示す図である。 具体的には、 クローン病患 者の血清検体 2番、 7番、 8番の C D P 3の MA Pプレートに対する反応性を C D P 3の MA Pペプチド抗原 （図 A) または Z300の MA Pペプチド抗原（図 B ) 用いて阻害した試験の結果を示す。 図中、 ー國一はクローン病患者血清 2番、 ― #~はクローン病患者血清 7番、 及び一▲_はクローン病患者血清 8番の結果を 示す。
図 1 5は、 コメアレルゲン蛋白質 （ひ- amylase/trypsin inhibitor) の gene familyに厲 ^る Rice allergen、 Rice seed allergen RA5、 Rice allergen RA5B precursor, Rice seed allergen RA14 Rice allergen RA14B precursor,及び Rice seed allergen RAG2について、 95〜： 110位のアミノ酸領域の相同性を比較した図 である。
図 1 6は、コメァレルゲン蛋白質（Rice seed allergen RA14)のァミノ酸配列、 並びにその 99〜： L11位のアミノ酸領域のァミノ酸配列を有する T03965ぺプチド の位置関係を示した図である。
図 1 7は、 実施例 7 ( 4 ) の結果を示す図である。 具体的には、 C D P 4ぺプ チド （上段） 及び T03965ペプチド （下段） について、 各血清検体 （クローン病 患者血清、 潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清に対する反応性を E L I S Aで 調べた結果を示す。
図 1 8は、 実施例 7 ( 5 ) の結果を示す図である。 具体的には、 クローン病患 者の血清検体 3番、 6番、 15番、 17番、 20番の CDP4の MA Pプレートに対す る反応性を C D P 4の M A Pぺプチド抗原（図 A) または TO3965の M A Pぺプ チド抗原 （図 用いて阻害した試験の結果を示す。 図中、 一■一はクローン病 患者血清 3番、 一条一はクローン病患者血清 6番、 一▲一はクローン病患者血清 1 5番、 一♦ "はクローン病患者血清 1 7番、 及び一口一はクローン病患者血清 2 0番の結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
( 1 ) クローン病抗体結合性ペプチド 本発明が対象とする「クローン病抗体結合性ペプチド」 （以下、単に「C D結合 性ペプチド」 ともいう） とは、 クローン病抗体、 すなわちクローン病患者に特異 的に認められるクローン病特有の抗体に対して、 特異的に結合するペプチドを意 味する。
本発明の C D結合性ペプチドとして、 具体的には配列番号 1〜4に示されるい ずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる （配列番号 1 ： C D 1ペプチド、 配列番号 2 ： C D 2ペプチド、 配列番号 3 ： C D 3ペプチド、 配列番号 4： C D 4ペプチド）。これらはいずれもクローン病抗体に対して特異的 に結合性を有することによって特徴づけられる。
さらに本発明のペプチドには、 上記配列番号 1〜4に示されるいずれかのアミ ノ酸配列からなるペプチドの他に、 これらの各アミノ酸配列において、 1若しく は複数個のアミノ酸が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列か らなり、 且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが包含される。 本発明に おいては、 これらのぺプチドを配列番号 1から 4に示されるいずれかのアミノ酸 配列を有するペプチドの 「同効物」 ということもある。
ここで、 アミノ酸の 「置換、 欠失若しくは付加」 の程度及びそれらの位置など は、 改変されたペプチドが、 配列番号 1から 4で示されるアミノ酸配列のいずれ かからなるペプチド （C D 1ペプチド、 C D 2ペプチド、 C D 3ペプチド、 C D 4ペプチド） と同様に、 クローン病抗体に対して特異的結合性を有するといった 特徴を備えた同効物であれば特に制限されない。アミノ酸配列の改変（変異）は、 例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、 人為的に改変す ることもできる。 なお、 アミノ酸配列の改変 （変異） 方法は、 当業者において良 く知られたところである （例えば、 サイ トスべシフィ ック · ミュー夕ゲ ネシス C Methods in Enzymology, 154， 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)； Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座 1 「遺伝 子研究法 II」、 日本生化学会編，pl05 (1986)〕 などの遺伝子工学的手法、 またはリン酸トリエステル法ゃリン酸アミダイト法などの化学合成手段 〔J. Am. Chem. Soc, 89， 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)； Science, 150， 178 (1968)； Tetrahedron Lett., 22， 1859 (1981)； 同 24， 245 (1983)〕 等 が例示できる。）。
本発明は、 このような改変や変異の原因及び手段などを問わず、 クローン病抗 体に対して特異的結合性を有する全ての改変ペプチドを包含するものである。 かかる同効物はディスプレイファージのライブラリ一 （ファージディスプレイ ライブラリ一）、好ましくはランダムべプチドディスプレイファージのライブラリ ―を利用したスクリ一二ング手法を用いて取得することができる。 該ファージデ ィスプレイライブラリーを用いるスクリ一二ングは、 ファージディスプレイ法と 呼ばれ、 従来から種々の細胞表面レセプ夕一と特異的に結合するリガンドゃ種々 の抗体の認識するェピ 1 ^一プを同定するために使用されている公知の方法である。 これらファージディスプレイライブラリ一の作成方法及びィンビトロスクリー二 ング法については、 スコット及びスミスらの方法を参照することができる
(Scott'J.M. and Smith, G.P.,Science, 249, 386.390 (1990)； Smith, G.P. and Scott, J.K., Methods in Enzymology, 217, 228-257 (1993》。
当該ライブラリ一中のランダムペプチドディスプレイファージは、 クローン病 抗体に特異的に結合するペプチドを選別し同定するために、 スクリーニング対象 とする多数のペプチド （オリゴペプチドまたはポリペプチド） をインビトロで発 現するのに利用される。 また、 用いられるファージライブラリ一は、 通常この方 法に用いられる公知のファージライブラリ一のいずれであってもよく、 例えばフ ァ一ジのコートタンパク質 p III遺伝子にランダムな D N Aが挿入されて、ファー ジ外殻表面にランダムな 1 5個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するぺプチ ドが発現し得るように構築されたランダムべプチドディスプレイファージ （繊維 状ファージ） を好適に例示することができる （特開平 10-237098号公報、 特開平 10-237099号公報および石川大、 瀧孝雄、 細胞工学， 16 (12) 1821-1828 (1997)、 特開 2000-253900号公報）。
当該スクリーニング方法を利用して、 上記 C D 1ペプチド （配列番号 1 )、 C D 2ペプチド （配列番号 2 )、 C D 3ペプチド （配列番号 3 )、 及び C D 4ペプチド (配列番号 4 ) の各々の同効物を取得する方法として、 具体的には次の方法を挙 げることができる：
まず、 ファージミドベクターに、 ランダムな DNA配列を挿入し、 ファージの 外殻表面に上記 DN A配列に対応してランダムなアミノ酸配列を有するペプチド を発現し得るようにランダムべプチドディスブレイファージを構築する。これを、 予めマイクロプレート等の固相表面上に抗ヒト I g G抗体を介して固定ィ匕したク ローン病患者の血清抗体 ( I g G) と反応させて、 該クローン病患者の血清抗体 と特異的に結合するファージを回収する （バイオバニング)。 なお、 ファージミド ベクターに挿入するランダムな D N A配列は、 同効物取得の対象となるぺプチド (C D 1ペプチド、 C D 2ペプチド、 C D 3ペプチドまたは C D 4ペプチド） の アミノ酸配列の少なくとも 1つのアミノ酸を欠失、 置換または付加することによ つて改変したァミノ酸配列をコードする D N A配列を選択することができる。 ここで、 マイクロプレート等に固定化させるクローン病患者の血清抗体 ( I g G) としては、 少なくとも抗原結合能を有するものであれば特に制限されず、 例 えばクローン病に罹患した患者から採取した血清そのものであってもよいし、 ま た該血清をプロテイン Aを用いて精製した精製抗体や、 硫酸マグネシウム溶液で 沈降処理することによって得られる精製抗体であってもよい。
またクローン病抗体と特異的に結合するファージの回収は、 クローン病抗体と ファージとの結合を阻害する能力を有する物質を、 上記固定化抗体に対して作用 させることによって行うことができる。 すなわち、 マイクロプレート上に抗ヒト I g G抗体を介して固定化されたクローン病抗体に特異的に結合しているファー ジは上記物質を加えることによりクローン病抗体から脱離溶出し、 回収すること ができる。 このようなスクリーニングを数回、 好ましくは 2〜3回程度繰り返す ことによりクローン病抗体と特異的に結合するペプチドを発現し得るファージが 選別できる。
ここで、 クローン病抗体とファージとの結合を阻害する能力を有する物質とし ては、 特に制限されないが、 例えば 性溶液やアルカリ性溶液、 高濃度の塩、 尿 素、 チォシアン等を挙げることができる。
次いで、 上記の方法によって得られたファージを大腸菌に感染させて大量培養 し、 分離、 精製して、 クローン病抗体と特異的に結合するペプチド発現ファージ を得る。 かくして得られたファージは、 抗ファージ抗体を介して支持体 （固相） に固定ィ匕され、 クローン病抗体と特異的に結合するファージをスクリーニングす る操作に供される。 かかるスクリーニングは、 具体的には、 上記方法で得られた ファージを、 任意の支持体に固定化した抗ファージ抗体と反応させて固定化し、 該固定化ファ一ジに対してクローン病患者の血清並びに対照血清として健常者の 血清や潰瘍性大腸炎やその他の自己免疫疾患、 胃潰瘍または十二指腸潰瘍などに 罹患した患者の血清を反応させて、 その反応性からクローン病患者の血清に特異 的に反応するファージを選択することによって実施される。 次いで、 選択された ファージから D N Aを抽出単離し、 その塩基配列を決定し、 それに基づいてアミ ノ酸配列を決定することにより、 選択されたファージが発現するペプチド、 すな わちクローン病抗体と特異的に結合する C D 1ペプチド、 C D 2ペプチド、 C D 3ペプチド、 または C D 4ペプチドの各々の同効物 （C D結合性ペプチド） を同 定し、 取得することができる。
なお、 上記方法により抽出単離した D N Aの配列決定は、 当業界で公知の方法 により容易に行うことができ、例えばジデォキシ法 CProc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463-5467 (1977)〕 やマキサム—ギルバート法 [Method in Enzymology, 65, 499 (1980)〕 等を挙げることができる。 かかる塩基配列の決定は、 市販のシ ークエンスキット等を用いても容易に行うことができる。
例えば、 上記の方法で得られる C D 1ぺプチド （配列番号 1 ) の同効物として は、表 1に示す CDP-laぺプチド（配列番号 5 )、 CDP- 1ぺプチド（配列番号 6 )、 CD5ペプチド （配列番号 7 )、 CDP-5aペプチド （配列番号 8 )、 CDP-5ぺプチ ド（配列番号 9 )、 VATE-201Cぺプチド（配列番号 1 0 )、 VATE-201ぺプチド（配 列番号 1 1 )、 CDlsペプチド （配列番号 1 2 )、 及び CDP-lsペプチド （配列番 号 1 3 ) を例示することができる。 なお、 表 1に示す各ペプチドについて、 C D 1ペプチドのアミノ酸配列と共通する部分を四角で囲み、 また類似するアミノ酸 残基を下線で示す （以下、 表 2〜4においても同様)。 ぺプチド アミノ酸配列 配列番号
CD1 GLLAQQMDY 1
CDP-la AEGEL GLLAQQMDY ADP 5
CDP-1 AEGEL GLLAQQMDY! ADPA 6
Figure imgf000020_0001
CDP-5a EGEL REVG|QQ1VMQ GDP 8
CDP-5 AEGEL RBVGJQ0]VMQ GDPA 9
VATE-201C glAQQMIM 10
Figure imgf000020_0002
CDls R[AQQ[VVEFS 12
CDP-ls AEGEL
Figure imgf000020_0003
GDPA 13 また、 CD 2ペプチド （配列番号 2) の同効物としては、 表 2に示す CD P— 2ペプチド （配列番号 15)、 CD2 sペプチド （配列番号 16)、 CDP_2S ペプチド （配列番号 17)、 CD 2s 1ペプチド （配列番号 18)、及び CD P— 2 s 1ペプチド （配列番号 19) を例示することができる。
表 2
ペプチド アミノ酸配列 配列番号
CD2 YRWLPPSSA 2
CDP-2 AEGELlYRWLPPSSA GDPA 15
Figure imgf000020_0004
CDP-2s AEGEL D@Y JPlEGDG GDPA 17
CD2sl HE|WLPLYD@ 18
CDP-2sl AEGEL HEWLPLYD囚 GDPA 19 さらに、 CD3ペプチド （配列番号 3) の同効物としては、 表 3に示す CDP 一 3ペプチド （配列番号 20)、 CDP 3ペプチド （配列番号 2 1)、 CDP 3— 1ペプチド （配列番号 22)、 CDP 3— 2ペプチド （配列番号 23)、 CDP 3 _ 3ペプチド （配列番号 24)、 CDP 3 - 4ペプチド （配列番号 25)、 CDP 3— 5ペプチド （配列番号 26)、 CDP 3— 6ペプチド （配列番号 2 7)、 CD P 3— 8ペプチド （配列番号 28)、 CDP 3— 1 2ペプチド （配列番号 29)、 CDP 3- 14ぺプチド（配列番号 30 )、及び Z 3 00ぺプチド（配列番号 3 1 ) を例示することができる。
表 3
ぺプチド アミノ酸配列 配列番号
CD3 ROSDGOYQM 3
CDP-3 AEGEL RQSDGQYQM GDPA 20
CDP3 AEGEL RQSDGQYQM 21
CDP3-1 SEGEL RQSDGQYQM 22
CDP3-2 AAGEL RQSDGQYQM 23
CDP3-3 AEAEL RQSDGQYQM 24
CDP3-4 AEGAL RQSDGQYQM 25
CDP3-5 AEGEA RQSDGQYQM 26
CDP3-6 AEGEL A QSDGQYQM 27
CDP3-8 AEGEL
Figure imgf000021_0001
28
CDP3-12 AEGEL IRQSDG6|A|QM 29
CDP3-14 AEGEL RQSDGQYQJA 30
Z300 KVC|Q|G| GO]L|QJR FL 31 さらにまた、 CD 4ペプチド （配列番号 4) の同効物としては、 表 4に示す C DP— 4ペプチド （配列番号 33)、 CDP4ペプチド （配列番号 34)、 CDP 4一 1ペプチド （配列番号 3 5)、 CDP4— 2ペプチド （配列番号 36)、 CD P 4— 3ペプチド （配列番号 37)、 CDP4— 4ペプチド （配列番号 38)、 C DP4— 10ペプチド（配列番号 39)、 CDP4—13ペプチド（配列番号 40)、 CDP4-14ぺプチド （配列番号 41)、 及び T O 3965ペプチド （配列番号 42) を例示することができる。
表 4
ペプチド アミノ酸配列 配列番号
CD4 GGIYODLVS 4
CDP-4 AEGEL GGIYQDLVS GDPA 33
CDP4 AEGEL GGIYQDLVS 34
CDP4-1 SEGEL GGIYQDLVS 35
CDP4-2 AAGEL GGIYQDLVS 36
CDP4-3 AEAEL GGIYQDLVS 37
CDP4-4 AEGAL GGIYQDLVS 38
CDP4-10 AEGEL GGIYQDLVS 39
CDP4-13 AEGEL GGIYQDIJAS 40
CDP4-14 AEGEL ^GIYQDL A 41
T03965 HMV|GGIYIREgGAT 42 これらの CD結合性ペプチドは、 そのアミノ酸配列に従って、 一般的な化学合 成法により製造することができる。 該方法には、 通常の液相法及び固相法による ペプチド合成法が包含される。 かかるペプチド合成法は、 より詳しくは、 本発明 で提供するアミノ酸配列情報に基づいて、 各アミノ酸を 1個ずつ逐次結合させ鎖 を延長させていくステップワイズエロゲーシヨン法と、 アミノ酸数個からなるフ ラグメントを予め合成し、 次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラ グメント ·コンデンセ一シヨン法とを包含する。 本発明のペプチドの合成は、 そ のいずれによることもできる。
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。 その具体例としては、 例えばアジド法、 混合酸無水物法、 DCC法、 活性エステ ル法、酸化還元法、 D P P A (ジフヱニルホスホリルアジド)法、 D C C +添加物（1 —ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル、 N—ヒドロキシサクシンアミド、 N—ヒドロ キシー 5 _ノルポルネンー 2 , 3—ジカルボキシイミド等)、 ウッドワード法等を 例示できる。 これらの各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用 されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。 そ の例としては、 例えば ジメチルホルムアミド （DM F)、 ジメチルスルホキシド
(DM S O)、へキサホスホロアミド、ジォキサン、テトラヒドロフラン（TH F)、 酢酸ェチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
尚、 上記ペプチド合成反応に際して、 反応に関与しないアミノ酸及至ペプチド におけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、 ェチルエステル、 第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、 例えばベン ジルエステル、 p—メトキシベンジルエステル、 p—二トロべンジルエステルァ ラルキルエステル等として保護することができる。 また、 側鎖に官能基を有する アミノ酸、 例えば TVrの水酸基は、 ァセチル基、 ベンジル基、 ベンジルォキシカ ルポニル基、 第三級ブチル基等で保護されてもよいが、 必ずしもかかる保護を行 う必要はない。 更に例えば Argのグァニジノ基は、 ニトロ基、 トシル基、 2—メ トキシベンゼンスルホニル基、 メチレン— 2—スルホニル基、 ベンジルォキシカ ルポニル基、 イソポルニルォキシカルポニル基、 ァダマンチルォキシカルボニル 基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、 ぺプチド及び最終的に得られる本発明のぺプチドにおけるこれら保護基の脱保護 反応もまた、 慣用される方法、 例えば接触還元法や、 液体アンモニアノナトリウ ム、 フッ化水素、 臭化水素、 塩化水素、 トリフルォロ酢酸、 酢酸、 蟻酸、 メタン スルホン酸等を用いる方法等に従って、 実施することができる。
かくして得られる本発明の C D結合性ペプチドは、 通常の方法に従って、 例え ばイオン交換樹脂、 分配クロマトグラフィー、 ゲルクロマトグラフィー、 ァフィ 二ティークロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィー (H P L C)、 向流分 配法等のぺプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、 適宜その精製を行 うことができる。 また、 本発明でいう C D結合性ペプチドには、 クローン病抗体に対して特異的 結合性を有する限り、 上記各種のぺプチドだけでなくこれらのぺプチドのァミノ 酸配列を一部に含むォリゴぺプチドゃポリぺプチドも包含される。
このようなポリペプチドとしては、 例えば、 配列番号 1， 配列番号 2 , 配列番 号 3 , 配列番号 4 , 配列番号 7， 配列番号 1 0， 配列番号 1 2， 配列番号 1 6 , 配列番号 1 8 , 配列番号 3 1 , または配列番号 4 2のレ ^ずれかに示されるァミノ 酸配列を一部に有するポリペプチドを挙げることができる。 また、 上記配列番号 のいずれかに示されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が置 換、 欠失若しくは付カロにより改変されたアミノ酸配列であって、 且つクローン病 抗体に結合性を有するアミノ酸配列を一部に有するポリペプチドであってもよい。 一般に抗原一抗体反応において抗体が認識するのに必要な最小のアミノ酸数は
4個であると考えられている。 従って、 抗原性の観点からは、 4以上のアミノ酸 からなるペプチドである限り、 そのアミノ酸数は特に制限されない。 制限はされ ないが、 通常 4〜7 0 0個のアミノ酸数を例示することができる。 また、 後述す るように一分子中に当該 C D結合性ペプチドのアミノ酸配列を分枝鎖として複数 個有する分岐状多抗原性べプチドとして調製する場合には、 当該分枝鎖のアミノ 酸数として 9〜1 4の範囲を好適に例示することができる。
より具体的には、 少なくとも配列番号 1 0に示されるアミノ酸配列のうち L I AQQMのァミノ酸配列を含むポリぺプチドを例示することができる。 配列番号 1 0に示されるアミノ酸配列は、 C D 1ぺプチドの同効物である VATE-201Cぺ プチドのアミノ酸配列であり、 当該アミノ酸配列 （L I AQQM) を一部に含む ポリぺプチドとしては、配列番号 1 1のァミノ酸配列を有する VATE-201ぺプチ ド、 液胞型 H+輸送性 AT Pase (以下、 「V-AT Pase」 ともいう）、 またはその サブユニット Eを挙げることができる。 なお、 V-AT P aseのアミノ酸配列のサ ブユニット Eのァミノ酸配列を配列番号 1 4に示す。
V- AT Paseは、 真核細胞の細胞内膜系 (central vacuolar system) に属する オルガネラ （ゴルジ体、 リソソ一ム、 分泌顆粒、 シナプス小胞、酵母の液胞など） の内部を酸性に維持するために機能している H+ポンプである。 当該 V— AT P aseは、サブュニット A、 B、 C、 D及び E、並びに 115kDaサブュニット、 39kDa サブュニット、 20kDaサブュニット、 及び 16kDaサブュニットの 9つのサブュ ニッ卜から構成されることが知られている。 これらの各サブュニッ卜の一次構造 は既に公知であり、 またこれらのサブユニットから構成される V— AT Paseの 構造も推定されている（生化学、第 65巻、第 6号、 1993年 6月、第 413-436頁)。 本発明の C D結合性ペプチドには、 これらのサブュニッ卜から構成される V— AT Paseの全配列を有するポリペプチド （蛋白質）、並びにクローン病抗体との 結合性を備える限り、 V— AT Paseの断片 （各サブユニット及び各サブュニッ 卜の断片を含む） が含まれる。 また、 本発明の C D結合性ペプチドには、 ヒト液 胞型 H+輸送性 AT Paseのサブュニット Eと、その他のサブュニット八、サブュ ニット B、 サブユニット C、 サブユニット D、 115kDaサブユニット、 39kDaサ ブュニット、 20 kDaサブュニット、及び 16 kDaサブュニッ卜よりなる群から選 択される少なくとも 1つのサブユニットとの複合体も包含される。
V— AT Paseの断片としては、 サブユニット E (33kDaポリペプチド、 ァミノ 酸数 226個)、 当該サブュニット E領域を含むポリぺプチド （サブュニット Eを 含む各種サブュニッ卜の複合体を含む）、 当該サブユニット Eのアミノ酸配列の 202-208領域を含むアミノ酸数 7〜 2 2 6個のポリペプチド、 またはサブュニッ ト Eのアミノ酸配列の 199-212領域を含むアミノ酸数 1 4〜2 2 6個のポリぺプ チドを挙げることができる。さらに、 これらの V-AT Pase、並びにその断片（例 えば、 サブユニット Eを含む各種サブユニットの複合体、 サブユニット Eまたは その一部） は、 クローン病抗体に対して特異的結合性を有する限り、 そのアミノ 酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、 欠失若しくは付カ卩により 改変されていてもよい。 これらの改変蛋白質は、 それぞれ V- AT Pase並びにそ の断片 （例えばサブユニット E) の同効物として定義することができる。
また、 C D結合性のポリぺプチドとして、 少なくとも配列番号 5 1に示される アミノ酸配列を含むポリペプチドを例示することができる。 配列番号 5 1に示さ れるアミノ酸配列は、 C D 3ペプチドの同効物である Z300ペプチドのアミノ酸 配列 （配列番号 3 1 ) にも該当する。 当該アミノ酸配列を一部に含むポリべプチ ドとしては、 ヒ卜核内蛋白質 (Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300 ;以下、 「ヒト核内蛋白質（HZF300)」 ともいう） を挙げることができる。 な お、 ヒト核内蛋白質 （HZF300) のアミノ酸配列を配列番号 3 2に示す。 本発明 の C D結合性べプチドには、クローン病抗体に対して特異的結合性を有する限り、 配列番号 3 2に示すヒト核内蛋白質 （HZF300) のアミノ酸配列において 1若し くは複数個のアミノ酸が置換、 欠失若しくは付加により改変されていてもよい。 かかる改変物としては、 ヒト核内蛋白質 （HZF300) のアミノ酸配列の 129-135 領域を含むアミノ酸数 7〜6 0 4個のポリペプチド、 またはヒト核内蛋白質
(HZF300) のァミノ酸配列の 126-139領域を含むァミノ酸数 1 4〜 6 0 4個の ポリペプチドを挙げることができる。 これらの改変物は、 ヒト核内蛋白質
(HZF300) の同効物として定義することができる。
さらに、 C D結合性のポリペプチドとして、 少なくとも L (V)G G I YX E(D) L (Xは任意のアミノ酸残基） のアミノ酸配列を含むポリペプチドを例示するこ とができる。 当該アミノ酸配列を一部に含むポリペプチドには、 配列番号 4、 3 3〜 4 2にそれぞれ示される C D 4ぺプチド及びその同効物が全て含まれる。 ま た、 当該アミノ酸配列を一部に含むポリペプチドとして、 他にコメアレルゲン蛋 H質の alpha-amylase/trypsin inhibitorの ene familyに厲 るフっス ·ン一 ド ·ァレルゲン RA14 (Rice seed allergen RA14)を挙げることができる。なお、 Rice seed allergen RA14のアミノ酸配列を配列番号 4 6に示す。
本発明の C D結合性ペプチドは、 クローン病抗体に対して特異的結合性を有す る限り、 Rice seed allergen RA14 (配列番号 4 6 ) のァミノ酸配列において 1若 しくは複数個のァミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されていてもよい。 かかる改変物としては、 Rice seed allergen RA14のアミノ酸配列 (配列番号 4 6 ) の 101-108領域を含むアミノ酸数 8〜1 6 5個のポリペプチド、または Rice seed allergen RA14のアミノ酸配列の 99-111領域を含むアミノ酸数 1 3〜1 6 5個の ポリぺプチドを挙げることができる。 これらの改変物は、 Rice seed allergen RA1 の同効物として定義することができる。
さらに本発明の C D結合性べプチドには、 クローン病抗体に対して特異的結合 性を有する限り、 配列番号 4 2に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数 個のアミノ酸が置換、 欠失若しくは付加により改変されていてもよい改変アミノ 酸配列を一部に含むポリぺプチドも含まれる。かかるポリぺプチドとしては、 Rice seed allergen RA14と同 こ alpha-amylase/trypsm lnhioitorの ene iamily (こ 属するライス ·ァレルゲン （Rice allergen) (配列番号 4 3 )、 ライス ·シード · ァレルゲン RA5 (Rice seed allergen RA5) (配列番号 4 4)、 ライス ·ァレルゲ ン ΙΙΑ5Β ·プレカーサ一 （Rice allergen RA5B precursor) (配列番号 4 5 )、 ラ イス ·ァレルゲン RA14B ·プレカーサ一 （Rice allergen RA14B recursor) (配 列番号 4 7 )、及びライス ·シード ·ァレルゲン RAG2 (Rice seed allergen RAG2) (配列番号 4 8 ) を挙げることができる。 なお、 これらのコメアレルゲン蛋白質 もまた、 クローン病抗体に対して特異的結合性を有する限り、 そのアミノ酸配列 において、 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、 欠失若しくは付加により改変さ れていてもよい。 このようなコメアレルゲン蛋白質の同効物としては、 例えば、 各コメアレルゲン蛋白質の 95〜： 110位のアミノ酸領域に位置する少なくとも L (V) G G I Y R E Lのアミノ酸配列 （配列番号 4 9、 5 0 ) を保有する蛋白質 を挙げることができる。具体的には Rice allergenのアミノ酸配列の 99-106領域 を含むァミノ酸数 8〜 1 5 7個のポリペプチド、 Rice seed allergen RA5のアミ ノ酸配列の 99-106領域を含むアミノ酸数 8〜 1 5 7個のポリペプチド、 Rice allergen RA5B precursorのァミノ酸配列の 102-109領域を含むァミノ酸数 8〜 1 6 0個のポリペプチド、 Rice allergen RA14B precursor のアミノ酸配列の 102-109領域を含むアミノ酸数 8 ~ 1 6 6個のポリペプチド、 及び Rice seed allergen RAG2のアミノ酸配列の 102- 109領域を含むアミノ酸数 8〜1 6 6個の ポリペプチドを挙げることができる。 これらの改変蛋白質は、 それぞれ Rice allergen. Rice seed allergen RA5> Rice allergen RA5B precursor、 Rice allergen RA14B precursor, 及び Rice seed allergen RAG2の同効物として定義すること ができる。
以上、 V-AT Pase, そのサブユニット E (配列番号 1 4 ) 及びこれらの同効 物は C D 1ぺプチドの同効物として、ヒト核内蛋白質（HZF300) (配列番号 3 2 ) 及びその同効物は C D 3ぺプチドの同効物として、並びに alpha-amylase/trypsin inhibitorの gene familyに属する各種のコメアレルゲン蛋白質（配列番号 4 3〜 4 8 ) 及びこれらの同効物は C D 4ペプチドの同効物として、 いずれも本発明の C D結合性べプチドに包含される。
さらに本発明の C D結合性べプチドは、 多抗原性べプチド （multiple antigen peptide:以下 「MA Pペプチド」 または 「分岐状多抗原性ペプチド」 もいう） 形 態であることもできる。 この MA Pペプチドは、 基本分子に、 例えは己列番号 1 〜4に示されるペプチド （C D 1ペプチド〜 C D 4ペプチド） またはこれらの同 効物のアミノ酸配列が分枝鎖として、 複数個、 分岐状に結合した形態として特徴 付けられる。 上記 C D結合性ペプチドのアミノ酸配列を有する分枝鎖の数として は特に制限されないが、 好ましくは 2〜1 6個、 より好ましくは 4〜1 6個、 さ らに好ましくは 8個を例示することができる。
MA P形態を有する本発明の C D結合性ペプチド （分岐状多抗原性ペプチド） の好適な一例としては、 例えば基本分子 （骨格） としてデンドリマ一構造を有す るものを挙げることができる。
デンドリマーとは、 一般に樹枝状形状から星形の立体配置を有する球状乃至そ の他の構造の分子として知られている。 該分子はまた複数個の機能基を有する枝 (繰返し単位） を有することにより特徴付けられる （例えば、 特表昭 60-500295 号公報；特開昭 63-99233号公報；特開平 3-263431号公報；米国特許第 4507466 号明細書； 同第 4568737 号明細書； Polymer Journal, 17, p.117 (1985); Angewandte Chem. Int. Engl., 29, 138-175 (1990); Macromolecures, 25, p.3247 (1992)など参照）。
本発明に利用できるデンドリマーは、 開始部分となる核構造、 該開始核に結合 した繰返し単位 （枝） で構成される内部層 （世代） および各枝に結合して存在す る機能基よりなる外表面を有するものであれば、 特に制限されない。 該デンドリ マーの大きさ、 形態、 反応性などは、 開始核部分、 世代数および各世代に用いら れる繰返し単位を適宜選択することによって調節することができ、 これらにも特 に制限はない。 適当な大きさなどを有するデンドリマーの製造は、 後記する常法 に従うことができ、 また異なる大きさのデンドリマ一は、 利用される世代数を増 やすことによって容易に得ることができる（例えば米国特許第 4694064号明細書 など参照)。
デンドリマー構造を有する本発明の C D結合性べプチド （分岐状多抗原性ぺプ チド））の一例としては、例えば窒素原子を開始核部分とし、該核部分に結合する -CH2CH2CONHCH2CH2-構造からなる繰返し単位 （枝） を有するデンドリマー の各枝の最外側末端に CD結合性べプチドの特定アミノ酸配列を、 複数個結合さ せたものを挙げることができる。 他の一例としては、 例えば Lys、 Arg、 Glu、 Aspなどのアミノ酸のいずれかを開始核部分とし、 該核部分に直接結合する繰返 し単位として同様の各アミノ酸を利用し、 同様に各枝末端に C D結合性ペプチド のァミノ酸配列を結合させたものを挙げることができる。
上記窒素原子を開始核部分とするデンドリマーは、 常法に従い製造できる。 ま たその構造物（デンドリマー原料）は、市販品としても入手できる（Polysciences, Inc., 400 VaUy Road, Warrington, PA, 18976 U.S.A.)。 他方のアミノ酸を開始核 部分とするデンドリマ一は、 例えば前記したぺプチド合成法に従い製造すること ができる。 また、 例えば Fmoc8-Lys4-Lys2-Lys- /3Ala-Alko樹脂 （渡辺化学工業 社製） などとして市販のデンドリマー原料を利用して製造することもできる。 より具体的には、 上記デンドリマー原料は、 次の如くして製造することができ る。 即ち、 固相ペプチド合成用の樹脂に、 スぺーサーを介してまたは介さずに、 2つのアミノ基を同一のまたは同一でない保護基で保護した α ,ω-ジアミノ酸を 縮合反応させ、 ついで保護基を除去し、 更に同様の保護 α，ω -ジアミノ酸の縮合 反応及び脱保護基反応を繰返す。
固相ペプチド合成用の樹脂としては、 通常のペプチド合成に汎用されているも のをいずれも使用することができる。その例としては、例えばポリスチレン樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 ポリスチレンポリエチレングリコール樹脂などの末端 にクロロメチル基、 4- (ヒドロキシメチル)フエノキシ基、 4-(( α -2'，4'-ジメトキシ フェニル) -9-フルォレニルメトキシカルポニルァミノメチル)フエノキシ基などを 有するものを挙げることができる。 スぺーサ一としては、 1個または複数個のァ ミノ酸を挙げることができる。 また、 ひ， ω-ジアミノ酸としては、 リジン、 オル 二チン、 1,4-ジァミノ酪酸、 1,3-ジアミノプロピオン酸などを挙げることができる。 保護基としては、 Boc基、 Fmoc基、 Z基などを挙げることができる。 機能基 としては、 アミノ基、 カルボキシル基および水酸基を挙げることがきる。 保護基 の除去反応は、 前述したペプチド合成法に従うことができる。 枝の数は、 繰返し 単位の縮合と保護基の除去とを n回繰り返すことにより 2ηとなる。この枝数は、 具体的には 2から 16の範囲を好ましいものとして挙げることができる。
得られるデンドリマ一原料の各枝末端の機能基に、 C D結合性べプチドの特定 ァミノ酸配列を結合させることにより、所望の M A P形態の本発明のぺプチド（分 岐状多抗原性ペプチド） を収得することができる。 この結合反応は、 前記したぺ プチド合成法に従うことができる。
MA P形態の本発明ペプチド （分岐状多抗原性ペプチド） は、 常法に従い、 適 当なマトリックス、 例えばセファクリール S-300 (フアルマシア社製） などの樹 脂を用いたクロマトグラフィー操作などにより精製することができる。
本発明の分岐状多抗原性べプチドにおいて、 各枝末端を構成するアミノ酸配列 は、 同一のものである必要はなく任意に異なる CD結合性べプチドのアミノ酸配 列を組合せたものであることもできる。 異なる C D結合性ペプチドのアミノ酸配 列の組合せ例としては、 例えば、 （i)C D 1ペプチド及びその同効物、 （ii)C D 2ぺ プチド及びその同効物、 （iiOC D 3ペプチド及びその同効物、 及び（iv) C D 4ぺ プチド及びその同効物よりなる 4群のうち、 少なくとも 2群、 好ましくは 3群、 より好ましくは 4群の中から選択される異なる 2種以上、 好ましくは 3種以上、 より好ましくは 4種以上のぺプチドのアミノ酸配列の組合せを例示することがで きる。 このような複合型分岐状多抗原性ペプチドによれば、 個々の被験者につい てクローン病の罹患の有無をより高い精度で検出することができる。
本発明の C D結合性ペプチドは、 クローン病患者に特異的に認められるクロー ン病特有の抗体 （クローン病抗体） を選択的に認識してそれと結合する性質を有 するものである。 よって、 本発明の C D結合性ペプチド及びそのアミノ酸配列を 含む分岐状多抗原性ペプチドは、 クローン病の罹患の有無、 すなわちクローン病 の検査及び診断に有効に利用することができる。
( 2 ) クローン病の検査試薬及び試薬キット
以上のこと力ら、 本発明は上記の C D結合性べプチドまたは及びそのアミノ酸 配列を含む分岐状多抗原性べプチドを有効成分とするクローン病の検査試薬を提 供する。
具体的には、 本発明のクローン病の検査試薬は、 有効成分として、 前述する (i) C D 1ぺプチドまたはその同効物、 （ii) C D 2ぺプチドまたはその同効物、 （iii) C D 3ぺプチドまたはその同効物、及び (iv) C D 4ぺプチドまたはその同効物からな る各種の C D結合性ペプチドの中から選択される少なくとも 1つのべプチド、 ま たは (i) C D 1ぺプチドまたはその同効物、 （ii)C D 2ぺプチドまたはその同効物、 (iii)C D 3ぺプチドまたはその同効物、 及び (iv) C D 4ペプチドまたはその同効物 からなる群から選択される少なくとも 1つのペプチドのアミノ酸配列を、 同一ま たは異なって一分子中に、 分岐状に複数個有する分岐状多抗原性ペプチドを含む ものである。
なお、上記の C D 1ぺプチドの同効物には、 ヒト液胞型 H+輸送性 AT Paseの サブュニット Eと、その他のサブュニット八、サブュニッ B、サブュニット〇、 サブユニット D、 115kDaサブユニット、 39kDaサブユニット、 20 kDaサブュ ニット、 及び 16 kDaサブュニッ卜よりなる群から選択される少なくとも 1つの サブユニットとの複合体が包含される。
ここで有効成分として用いるこれらの C D結合性べプチドまたは分岐状多抗原 性ペプチドは、 クローン病抗体に対するその特異的結合性を利用して、 被験者の 生体試料中に存在し得るクローン病抗体と結合してそれを捕捉または標識化する 抗原物質としての役目を担うものである。
クローン病の検査試薬の有効成分として、 上記の C D結合性ペプチドは 1種単 独で使用されてもよいが、 2種以上を任意に組み合わせて用いることもできる。 精度 （判定の信頼性） 向上の点からは 2種以上を組み合わせて使用することが好 ましい。 かかる組合せの態様は特に制限されないが、 好ましくは (i)C D 1ぺプチ ドまたはその同効物 （例えば、 CDP-laペプチド， CDP-1ペプチド， CD5ぺプ チド， CDP-5aペプチド， CDP-5ペプチド， VATE-201cペプチド， VATE.201 ペプチド， CDlsペプチド， CDP-lsペプチド、 V-ATPase, サブユニット Eまた はこれらの同効物）、 （ii)C D 2ペプチドまたはその同効物 （例えば、 CDP-2ぺプ チド， CD2sペプチド， CDP-2sペプチド， CD2slペプチド， CDP-2slペプチド またはこれらの同効物)、 C D 3ペプチドまたはその同効物 （例えば、 CDP-3ぺ プチド， CDP3ペプチド， CDP3-1ペプチド， CDP3-2ペプチド， CDP3-3ぺプ チド， CDP3-4ペプチド， CDP3.5ペプチド， CDP3-6ペプチド， CDP3-8ぺプ チド， CDP3-12ペプチド， CDP3-14ペプチド， Z300ペプチド， ヒト核内蛋白質 (HZF300) またはこれらの同効物）、 及び (iv) C D 4ペプチドまたはその同効物 (例えば、 CDP-4ペプチド， CDP4ペプチド， CDP4-1ペプチド， CDP4-2ぺプ チド， CDP4-3ペプチド， CDP4-4ペプチド， CDP4-10ペプチド， CDP4-13ぺ プチド， CDP4-14ぺプチド， T03965ぺプチド， Rice allergen, Rice seed allergen RA5, Rice allergen RA5B precursor, Rice seed allergen RA14, Rice allergen RA14B precursor, Rice seed allergen RAG2またはこれらの同効物） の各群 (i) 〜(iv)のうち、少なくとも 2群、好ましくは 3群、 より好ましくは 4群から任意に 選択される 2種以上、 好ましくは 3種以上、 より好ましくは 4種以上のペプチド を組み合せて使用する態様である。
本発明のクローン病の検査試薬が、 上記のように C D結合性べプチドを 2種以 上含有する組成物の態様である場合、 各 C D結合性べプチドの配合割合は特に制 限されない。 例えば、 各 C D結合性ペプチドを互いに等しい割合で配合してもよ いし、 またクローン病抗体に対する反応性 （結合性） の弱いペプチド等を含む場 合はそれを考慮して、 該反応性の弱いぺプチド等の配合割合力多くなるように配 合することもできる。 例えば、 制限されないが、 有効成分として、 上記 (i)群、 （ii) 群、 （iii)群及び (iv)群のそれぞれに属する C D結合性ペプチドとして、 （i) C D lぺ プチド、（ii) C D 2ペプチド、 （iii) C D 3ペプチド、 及び (iv) C D 4ペプチドを用い る場合、 これらは 1： 2： 2： 1の割合で用いることができる。
また、 クローン病の検査試薬の有効成分として、 上記の分岐状多抗原性べプチ ドを用いる場合、 当該多抗原性ペプチドは分枝を構成するアミノ酸配列は、 同一 種の C D結合性べプチドのァミノ酸配列からなるものであってもよいが、 2種以 上の異なる C D結合性べプチドのァミノ酸配列を含むものであってもよい。 後者 の場合、 かかる分枝として用いる C D結合性べプチドのアミノ酸配列の組合せの 態様も特に制限されないが、 上記各群 (i)〜(iv)のうち、 少なくとも 2群、 好ましく は 3群、 より好ましくは 4群から任意に選択される 2種以上、 好ましくは 3種以 上、 より好ましくは 4種以上の C D結合性べプチドのァミノ酸配列を組み合せて 分岐鎖として使用する態様である。 本発明のクローン病の検査試薬は、 クローン病抗体と特異的に結合する抗原物 質として、 クローン病抗体の捕捉や標識ィヒに用いることができる。 よってこの目 的を逸脱しない限り、 当該検査試薬は、 有効成分として 1種または 2種以上の C D結合性べプチドまたは分岐状多抗原性べプチドだけからなるものであってもよ いし、 また他の成分を含有するものであってもよい。 また、 クローン病抗体の標 識に用いるためには、 これらの C D結合性ペプチドまたは分岐状多抗原性べプチ ドは、 任意の標識物質で標識されていることが好ましい。 かかる標識に用いられ る標識物質としては、 当業界で用いられる通常の標識物質を広く用いることがで き、 特に制限されないが、 具体的には3 Hや1 4 C等の放射性同位元素；アルカリ ホスファターゼ、 パーォキシダーゼ（P〇X)、 マイクロパーォキシダーゼ、 キモ トリプリノーゲン、 プロカルボキシぺプチダーゼ、 グリセ口アルデヒド— 3—リ ン酸脱水酵素、 アミラーゼ、 ホスホリラーゼ、 D-ナーゼ、 及び P -ナーゼなどの 酵素；フルォレセインイソチオシァネート （F I T C) ゃテトラメチルローダミ ンイソチオシァネ一ト （R I T C)等の蛍光物質；並びに、その他 I N— (2,2,6,6 ーテトラメチル -1-ォキシル -4-ピペリジル） - 5 N - (ァスパルテート） 一 2， 4 —ジニトロベンゼン （T〇P A)、 染料ゾル、 金属ゾル、 ラテックス粒子等を例示 することができる。 なお、 前述する本発明にかかる C D結合性ペプチドまたは分 岐状多抗原性べプチドには、 これらの標識化 C D結合性べプチドも包含される。 一般に、 被験者の生体試料を被験試料として、 クローン病の検査を行うには、 C D結合性べプチドまたは分岐状多抗原性べプチドを有効成分とする上記の検査 試薬を含む試薬キットを利用することが簡便である。 ゆえに、 また本発明はクロ ーン病の検査 （診断） に有効に利用できる試薬キットを提供する。
本発明のクロ一ン病の検査試薬キットは、 前述する検査試薬を、 クローン病抗 体と結合させる目的で含むものであれば、 クローン病抗体の捕捉剤として含んで いても、 またクローン病抗体の標識剤として含んでいてもよい。 なお、 上記の検 査試薬をクローン病抗体の捕捉剤として利用する場合には、予め任意の支持体 (固 相） に固定化させた固定化物として用いることもできる。 またクローン病抗体の 標識剤として利用する場合には、 前述するように任意の標識物質で標識された C D結合性べプチドまたは多抗原性べプチドを用いることが好ましい。
本発明の検査試薬キットに上記の検査試薬と組み合わせて用いられる他の成分 は、 クローン病の検査に利用される免疫学的測定方法の種類や採用される検出手 段に応じて、 常法に従って適宜選択して用いることができる。 好ましくは、 本発 明の検査試薬キッ卜には、 C D結合性ペプチドまたは多抗原性ペプチドを有効成 分とする上記の検出試薬以外の他の成分として、 ヒト I g Gを検出するための二 次抗体 （例えば抗ヒト I g G抗体） を含めることができる。 なお、 当該抗ヒト I g G抗体は、 前述する標識物質で標識化されていてもよいし、 また予め任意の支 持体 （固相） に固定化されていてもよい。
また、 検査試薬キットには、 標識物質に応じた基質、 または標識物質と基質と の反応を検出するための検出試薬が含まれていてもよく、 さらに測定の実施の便 益のために適当な被験試料希釈液、 二次抗体希釈液 （例えば抗ヒト I g G抗体希 釈液)、 標準抗体、 緩衝液、 洗净液、 酵素基質液、 反応停止液などが含まれていて もよい。 さらに、 上記の検査試薬または抗ヒト I g G抗体として、 標識または固 定ィ匕されていないものを使用する場合は、 検査試薬キットの他に成分として、 支 持体 （固相） や標識物質を含めることもできる。
すなわち、 本発明のクローン病の検査試薬キットは、 上記の C D結合性べプチ ドまたは分岐状多抗原性べプチドを有効成分とする検出試薬 （固定化または Z及 び標識されていてもよい） に、 固定ィ匕または Z及び標識されていてもよい抗ヒト I g G抗体、 標識物質に応じた基質、 抗体希釈液、 標準抗体、 緩衝液、 洗浄液、 基質溶解液、 反応停止液、 支持体（固相)、 及び標識物質の中から任意に選択され る少なくとも一つを組み合わせたクローン病の検査用の試薬セッ卜である。 簡便 性、 安全性、 感度等の観点から、 好ましくは酵素を標識物質として用いることが 好ましい。 この点から、 本発明のクローン病の検査試薬キットは、 上記の C D結 合性べプチドまたは分岐状多抗原性べプチドを有効成分とする検出試薬 （固定化 または 及び酵素標識されていてもよい） に、 固定化または Z及び酵素標識され ていてもよい抗ヒト I g G抗体、 酵素基質、 抗体希釈液、 標準抗体、 緩衝液、 洗 浄液、 酵素基質溶解液、 酵素反応停止液、 支持体（固相)、 及び酵素標識物質の中 から任意に選択される少なくとも一つを組み合わせたクローン病の検査用の試薬 セットであることができる。 なお、 酵素標識のための酵素標識物質としては、 例 えば、 上記に加えて、 マイクロパ一ォキシダ一ゼ、 キモトリプシノーゲン、 プロ 力ルポキシぺプチダ一ゼ、 ダリセロアルデヒド— 3—リン酸脱水酵素、 ァミラ一 ゼ、 ホスホリラーゼ、 D—ナ一ゼ、 及び P—ナーゼなどを例示することができる
( 3 ) クローン病の検査方法
さらに本発明はクローン病の検査方法を提供する。 当該検査方法は、 検査のた めの被験試料として被験者の生体試料を用いて、 個々の被験者についてクローン 病の罹患の有無を検出するものである。 より具体的には、 本発明のクローン病の 検査方法は、 クローン病患者の生体試料に特異的に存在する特定の抗体の存在を 指標として、 個々の被験者についてクローン病の罹患の有無を検出するものであ る。
ここで被験試料としては、被験者（ヒト） の血液（血清、血漿)、尿、汗、唾液、 精液または髄液等の各種の生体試料、 好ましくは血清を用いることができる。 ク口一ン病の検査方法として、下記 (3·：！)〜 (3-3)の 3つの方法を挙げることがで さる。
(3-1) 後述する実施例に示すように、 クローン病患者にはヒト液胞型 H+輸送 性 AT Paseを認識する抗体が特異的に存在している。 従って、 本発明のクローン病の検査方法として、 被験者の生体試料を対象とし て、 ヒト液胞型 H+輸送性 AT Pase (V-AT Pase) を認識する抗体を検出する 工程を含む方法を挙げることができる。 上記の検出対象とする抗体は、 好ましく は V-AT Paseのサブュニット Eを認識する抗体であり、より好ましくは V- AT Paseのサブュニット Eの 199〜212位のアミノ酸領域を認識する抗体である。 これらの抗体の検出は、 抗原—抗体反応を利用した従来公知の免疫学的測定方 法を用いて行うことができる。 具体的にはクローン病の罹患が疑われる被験者か ら、 上記各種の生体試料、 好ましくは血清を採取し、 その生体試料と上記 V-AT Pase を認識する抗体に結合性を有する抗原物質を反応させて、 抗原一抗体反応 によって生じる複合物を検出することによって実施することができる。
ここで V-AT Pase を認識する抗体に結合性を有する抗原物質としては、 V- AT Pase を認識する抗体に特異的に結合するものであれば特に制限されない。 好ましくは V- AT Paseのサブュニット Eを認識する抗体に特異的に結合する性 質を有するものであり、 より好ましくは V-AT Paseのサブユニット Eの 199〜 212位のアミノ酸領域を認識する抗体に特異的に結合する性質を有するものであ る。 かかる性質を有するものとして、 具体的には L I AQQMのアミノ酸配列か らなるペプチド及びその同効物を挙げることができる。 ここで同効物には、 上記 アミノ酸配列 （L I AQQM) において 1又は複数個のアミノ酸が欠失、 置換ま たは付加により改変されてなるペプチドであって、 且つ V - A T P aseのサブュニ ット Eを認識する抗体に特異的に結合する性質を有するものが含まれる。 かかる ペプチドとしては、 例えば配列番号 1、 5〜1 5の各々に記載されるアミノ酸配 列を有するぺプチド （CD1ぺプチド、 CDP-laぺプチド、 CDP.1ぺプチド、 CD5 ぺプチド、 CDP-5aぺプチド、 CDP-5ぺプチド、 VATE-201 cぺプチド、 VATE-201 ペプチド、 CDlsペプチド、 CDP-lsペプチド、 V— AT P ase、 V - AT Pase のサブユニット E)を挙げることができる。また、これらに限定されることなく、 例えば上記アミノ酸配列 （L I AQQM) を有するアミノ酸数 6〜2 2 6、 好ま しくは 6〜 1 4のポリペプチドを用いることもできる。
また V-AT Paseを認識する抗体に結合性を有する抗原物質として、 V-AT P aseのサブユニット Eと、 その他のサブユニット A、 サブユニット B、 サブュニ ット C、 サブュニッ D、 115kDaサブュニット、 39kDaサブュニット、 20 kDa サブュニット、 及び 16 kDaサブュニッ卜よりなる群から選択される少なくとも 1つのサブユニットとの複合体を用いることもできる。さらにまた、 V-AT Pase を認識する抗体に結合性を有する抗原物質として、 上記のアミノ酸配列 （L I A QQM) からなるペプチドまたはその同効物を、 同一または異なって、 一分子中 に複数個含む分岐状多抗原性べプチドを用いることもできる。
(3-2) また後述する実施例 6に示すように、 クローン病患者にはヒト核内蛋白 質（Homo sapiens kruppeHike zinc finger protein 300 (HZF300)) を認識する 抗体が特異的に存在している。
従って、 本発明のクローン病の検査方法として、 被験者の生体試料を対象とし て、 ヒト核内蛋白質 （HZF300) を認識する抗体を検出する工程を含む方法を挙 げることができる。 上記の検出対象とする抗体は、 好ましくはヒト核内蛋白質 (HZF300) の 126〜138位のアミノ酸領域を認識する抗体である。
これらの抗体の検出は、 抗原—抗体反応を利用した従来公知の免疫学的測定方 法を用いて行うことができる。 具体的にはクローン病の罹患が疑われる被験者か ら、 上記各種の生体試料、 好ましくは血清を採取し、 その生体試料と上記ヒト核 内蛋白質 （HZF300) を認識する抗体に結合性を有する抗原物質を反応させて、 抗原—抗体反応によって生じる複合物を検出することによって実施することがで さる。
ここで上記ヒト核内蛋白質を認識する抗体に結合性を有する抗原物質としては、 当該ヒト核内蛋白質 （HZF300) を認識する抗体に特異的に結合するものであれ ば特に制限されない。 好ましくはヒト核内蛋白質 （HZF300) の 126〜： 138位の アミノ酸領域を認識する抗体に特異的に結合する性質を有するものである。 かか る性質を有するものとして、 具体的には配列番号 5 1に記載するアミノ酸配列か らなるぺプチド若しくはその同効物を挙げることができる。 ここで同効物には、 配列番号 5 1において 1又は複数個のアミノ酸が付カ卩してなるぺプチドまたは蛋 白質であって、 且つヒト核内蛋白質 （HZF300) を認識する抗体に特異的に結合 する性質を有するものが含まれる。 かかるペプチドとしては、 例えば己列番号 3 及び 2 0〜 3 2の各々に記載されるアミノ酸配列を有するぺプチド（CD3ぺプチ ド、 CDP-3ぺプチド、 CDP3-1ぺプチド、 CDP3-2ぺプチド、 CDP3 3ぺプチド、 CDP3-4ペプチド、 CDP3-5ペプチド、 CDP3.6ペプチド、 CDP3.8ペプチド、 CDP3-12 ペプチド、 CDP3-14 ペプチド、 Z300 ペプチド、 ヒト核内蛋白質 (HZF300) ) を挙げることができる。 また、 これらに限定されることなく、 例え ば ¾己列番号 5 1に記載するアミノ酸配列を一部に有するアミノ酸数 7〜6 0 4の ポリペプチドを用いることもできる。
さらにヒトヒト核内蛋白質 （HZF300) を認識する抗体に結合性を有する抗原 物質として、 上記の配列番号 5 1に記載するアミノ酸配列からなるペプチドまた はその同効物を、 同一または異なって一分子中に複数個含む分岐状多抗原性ぺプ チドを用いることもできる。 (3-3) また後述する実施例 7に示すように、 クローン病患者にはコメアレルゲ ン蛋白質を認識する抗体が特異的に存在している。
従って、 本発明のクローン病の検査方法として、 被験者の生体試料を対象とし て、 コメァレルゲン蛋白質を認識する抗体を検出する工程を含む方法を挙げるこ とができる。 なお、 ここでコメアレルゲン蛋白質としては、 a -amylase/trypsin inhibitorの gene family に属するものを挙げることができ、 具体的には Rice allergen (158aa)、 Rice seed allergen RA6 (157aa)、 Rice allergen RA5B precursor (160aa)、 Rice seed allergen RA14 (165aa)、 Rice allergen RA14B precursor (166aa)、 及び Rice seed allergen RAG2 (166aa)を例示することがで きる。 上記の検出対象とする抗体は、 好ましくはこれらの各種のコメアレルゲン 蛋白質の 95〜： L10位のアミノ酸領域に位置する少なくとも L (又は V) G G I Y R E Lのアミノ酸配列を認識する抗体である。
これらの抗体の検出は、 抗原—抗体反応を利用した従来公知の免疫学的測定方 法を用いて行うことができる。 具体的にはクローン病の罹患が疑われる被験者か ら、 上記各種の生体試料、 好ましくは血清を採取し、 その生体試料と上記コメァ レルゲン蛋白質を認識する抗体に結合性を有する抗原物質を反応させて、 抗原一 抗体反応によって生じる複合物を検出することによって実施することができる。 ここで上記ヒト核内蛋白質を認識する抗体に結合性を有する抗原物質としては、 当該コメァレルゲン蛋白質 ( -amylase/trypsin inhibitor) の gene famil に属 する蛋白質を認識する抗体に特異的に結合するものであれば特に制限されない。 好ましくは各種のコメァレルゲン蛋白質の 95〜110位のアミノ酸領域に位置する 少なくとも L (又は V) G G I Y R E Lのアミノ酸配列 （配列番号 4 9、 5 0 ) を認識する抗体に特異的に結合する性質を有するものである。
かかる性質を有するものとして、具体的には L (V) G G I Y XD (E) L (X は任意のアミノ酸残基） のアミノ酸配列からなるぺプチドまたはその同効物を挙 げることができる。 ここで同効物には、 上記 L (V) G G I Y XD (E) L (X は任意のアミノ酸残基） のアミノ酸配列において 1又は複数個のアミノ酸が付加 してなるペプチドであって、 且つコメアレルゲン蛋白質を認識する抗体に特異的 に結合する性質を有するものが含まれる。 かかるペプチドとしては、 例えば ¾己列 番号 4及び 3 3〜4 8の各々に記載されるアミノ酸配列を有するペプチド （CD4 ペプチド、 CDP-4ペプチド、 CDP4-1ペプチド、 CDP4-2ペプチド、 CDP4-3ぺ プチド、 CDP4-4ペプチド、 CDP4-10ペプチド、 CDP4-13ペプチド、 CDP4-14 ペプチド、 T03965 ペプチド、 Rice allergen, Rice seed allergen RA5、 Rice allergen RA5B precursor. Rice seed allergen RA14、 Rice allergen RA14B precurso 及び Rice seed allergen RAG2) を挙げることができる。 また、 これ らに限定されることなく、 L (V) G G I YX D (E) L (Xは任意のアミノ酸 残基） のアミノ酸配列を有するアミノ酸数 8〜1 6 6、 好ましくはアミノ酸数 8 〜1 4のポリペプチドを用いることもできる。
さらにコメアレルゲン蛋白質を認識する抗体に結合性を有する抗原物質として、 上記の L (V) G G I Y XD (E) L (Xは任意のアミノ酸残基） のアミノ酸配 列からなるペプチドまたはその同効物を、 同一または異なって一分子中に複数個 含む分岐状多抗原性べプチドを用いることもできる。 このような抗原物質とクロ一ン病患者に特有の抗体との反応によつて生じる抗 原—抗体複合物の検出方法に関しては、 特に制限されることはなく、 慣用の方法 を広く採用することができる。 具体的には抗原物質として上記の各種の C D結合 性べプチドまたはそれを含む分岐状多抗原性べプチドを利用する各種の免疫測定 法が好適に例示できる。 例えば、 ヒト血清を被験試料とする固相化サンドイッチ 法を例にすると、 目的抗体は、 例えば以下の方法で測定することができる。
まず抗原物質として用いる上記ペプチドを固相化しておき （以下、 これを便宜 上「固相化ペプチド」 という）、 これに被験試料としての生体試料（例えば血清検 体） を加える。 その結果、 固相化ペプチドと被験試料中のクローン病患者特有の 抗体との間で抗原一抗体反応が起こり、 被験試料中に存在する目的抗体は固相化 ペプチドに結合する。 次に結合した目的抗体の有無及びその抗体量 （力量） を、 ヒト抗体 （I g G) 検出試薬を用いて検出することにより、 被験試料中、 すなわ ち被験者の生体試料 （血清など） 中に存在する目的抗体を検出し定量することが できる。
また、 上記において、 ヒト抗体 ( I g G) 検出試薬を予め固相化し、 これに被 験試料を添加して生体試料中の目的抗体を捕捉させ、 次いでこれに上記抗原物質 を加えて、 目的抗体に結合させることにより、 被験試料中に存在する目的のクロ ーン病患者特有の抗体を検出し、 その抗体量 （力量） を測定することもできる。 また、 目的抗体に結合した抗原物質にさらに該抗原物質の特異抗体を結合させる ことにより、 該抗体を指標としてクローン病患者特有の抗体が検出でき、 その抗 体量 （力量） を測定することもできる。 これら測定手法における各種手段の選択 やそれらの改変などはいずれも当業者のよく知るところであり、 本発明において はそれら各手法をいずれも採用することができる〔「臨床検査法提要」、金原出版、 1995年等参照〕。
ここで、 クローン病抗体を検出するためのヒト抗体 ( I g G) 検出試薬は、 特 に制限されることなく一般に使用されている各種の試薬を利用することができる。 例えば、 好適にはヒト I g Gに特異的に結合する抗ヒト I g G抗体などが使用で きる。 これらは市販品として入手できるが、 常法に従い調製することもできる。 また、 これらのヒト抗体 ( I g G) 検出試薬を指標として、 目的とする抗体を 検出する場合は、 当該ヒト抗体 （I g G) 検出試薬は標識されていることが好ま しい。 かかる標識に用いられる標識物質としては、 具体的には3 Hや1 4 C等の放 射性同位元素、 アルカリホスファターゼゃパーォキシダーゼ （P OX) などの酵 素、 フルォレセインイソチオシァネート （F I T C) ゃテトラメチルローダミン イソチオシァネート （R I T C) 等の蛍光物質、 並びに、 その他 I N— (2,2,6,6 ーテトラメチル -1-ォキシル -4-ピペリジル） - 5 N - (ァスパルテート） —2， 4 —ジニトロベンゼン（TO P A；)、染料ゾル、金属ゾル、 ラテックス粒子等が例示 される。 なお、 これらの標識物質で標識された検出試薬を用いた免疫測定法は、 それぞれラジオィムノアツセィ、 ェンザィムィムノアツセィ、 フルォロイムノア ッセィ、 スピンィムノアツセィ、 フロースルーアツセィ及びィムノクロマトアツ セィと称される。
本発明においては、 簡便性、 安全性、 感度等の観点から、 好ましくは酵素を標 識物質として用いるェンザィムィムノアツセィが採用される。 酵素標識のための 酵素標識物質としては、 例えば、 上記に加えて、 マイクロパ一ォキシダーゼ、 キ モ卜リプシノーゲン、 プロ力ルポキシぺプチダ一ゼ、 グリセロアルデヒドー 3 _ リン酸脱水酵素、 アミラーゼ、 ホスホリラーゼ、 D—ナ一ゼ、 及び P—ナーゼな どを例示することができる。 なお、 これらの標識物質による標識方法は、 自体公 知の方法に従って行うことができる（「単クローン抗体」岩崎辰夫 他著、講談社 サイェンティフイク、 1 9 8 4 ;「酵素免疫測定法」第 2版、 石川栄治 他著、 医 学書院、 1 9 8 2年など）。
また、 抗原物質 （C D結合性ペプチド又はそのアミノ酸配列を含む分岐状多抗 原性ペプチド） を指標として目的抗体を検出し測定する場合は、 抗原物質として 標識されたペプチドを用いることが好ましい。 かかる抗原物質の標識も、 上記抗 ヒト I g G抗体の標識と同様にして、 常法に従って任意の標識物質で用いて行う ことができる。
また、 上記測定方法において、 固相法を採用する場合、 目的抗体を捕捉する目 的で、 予め抗原物質或いは抗ヒト I g G抗体を支持体 （固相） に固定化して用い てもよい。 ここで支持体としては不溶性、 不活性担体であれば特に制限されず、 通常使用されるものが広く用いられる。 例えば、 ガラス、 セルロース粉末、 セフ アデックス、セファロース、ポリスチレン、濾紙、カルボキシメチルセルロース、 イオン交換樹脂、デキストラン、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、 ナイロン、 ガラスビーズ、 絹、 ポリアミン—メチルビ二ルェ一テル一マレイン酸 共重合体、 アミノ酸共重合体、 エチレン—マレイン酸共重合体などの種々の素材 からなるスティック、 ビーズ、 マイクロプレート、 試験管等が広く用いられる。 抗原物質或いは抗ヒト I g G抗体の固相への固定ィヒ方法についても特に制限は なく、 物理的結合及び化学的結合のいずれをも使用することができる。 具体的に は、 例えば共有結合法としてジァゾ法、 ペプチド法 （酸アミド誘導体、 カルボキ シクロライド樹脂法、 カルポジイミド樹脂法、 無水マレイン酸誘導体法、 イソシ アナ一ト誘導体法、 臭化シアン活性ィ匕多糖体法、 セルロースカルボナ一ト誘導体 法、 縮合試薬を使用する方法等)、 アルキル化法、 架橋試薬による担体結合法（架 橋試薬としてダル夕一ルアルデヒド、 へキサメチレンイソシアナ一トなどを用い る。）、 U g i反応による担体結合法などの化学的反応：或いはイオン交換樹脂の ような担体を用いるイオン結合法：ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として 用いる物理的吸着法等が例示できる。
上記の測定系において使用される溶媒としては、 反応に悪影響を与えないもの であれば一般的に使用されるもののいずれをも用いることができる。 具体的には クェン酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 卜リス塩酸緩衝液、 酢酸緩衝液などの p Hが約 5〜 9程度の緩衝液が例示される。
免疫反応 （抗原一抗体反応） 条件も特に制限はなく、 一般にこの種の測定法で 用いられる通常の条件が採用される。 一般には 4 5 以下、 好ましくは約 4〜4 0で程度の温度条件下に、 1〜4 0時間程度を要して反応を行うことができる。 抗原一抗体反応によって生じる抗原—抗体複合物の測定は、 使用する標識物質 の種類に応じて慣用方法に従って行うことができる。
例えば、 標識物質として酵素を利用する場合、 当該酵素の活性を測定すること によって行うことができる。 酵素活性の測定は、 使用する酵素の種類に応じて公 知の方法に従って行うことができ、 例えば標識酵素としてパーォキシダーゼを用 いる場合は基質として A B T S J 2，2'-アジノービ （3'ェチルベンツチアゾリンス ルホン酸） を用い、 またアルカリホスファターゼを用いる場合は基質として p— ニトロフエニルホスフェートを用いて、 それぞれインキュベートし、 各基質の分 解を分光光度計等を用いて測定する方法等が挙げられる（「酵素免疫測定法」第 2 版、 石川栄治 他著、 医学書院、 1 9 8 2年等参考)。 なお、 上記酵素標識の代わ りに、 放射性同位元素や蛍光物質による標識体を用いる場合も、 自体公知の方法 に従って測定することができる。
【実施例】
以下、 本発明を更に詳しく説明するため、 実施例を挙げる。 しかし、 本発明は これに限定されるものではない。
実施例 1 クローン病抗体結合性ペプチドの選別及びその同定
( 1 ) ファージディスプレイライブラリーの調製
フランコらの報告 （Franco FeHci., et al, J. Mol.Biol.,222,301-310 (1991)) に 若干の変更を加え、 ファージディスプレイライブラリーを作製した （1.0X 10E8 クローン）。 該ファージディスプレイライブラリ一は、 具体的には NNK (Nは A, C , G, Tのいずれかを示し、 Kは G又は Tを示す。） が 9回繰り返された 配列を含む D N Aが遺伝子工学的に挿入された繊維状ファージであって、 更に主 要外殻タンパク質 PVIII遺伝子の N端部分に 9残基のランダムなアミノ酸から なるペプチドをコードする D NAが挿入されてファージ外殻表面にランダムな 9 残基のアミノ酸配列を有するペプチドが発現できるように構築されている。
( 2 ) クローン病抗体結合性ペプチド （C D結合性ペプチド） の選択
( i ) 血清抗体の固定化
抗体として血清抗体を用いた。 血清としてクローン病患者の血清 2 0検体、 並 びに対照血清検体として潰瘍性大腸炎患者の血清 2 0検体及び健常者の血清 2 0 検体を用いた。 次のようにして血清中の抗体 (IgG) をマグネチックピーズに固定化した。 ま ず、 マグネチックビーズ (DynabeadsM-450Tosyl-activated)に、 0.1M ホウ酸 緩衝液で 200 g/ml濃度に調製した抗ヒ卜 I gG(Fc)特異的抗体 (Biodesign) を加え、 4Tでー晚反応させた。 反応後、 該マグネチックビーズを 0.1%のゥシ 血清アルブミン （BSA) を含有する (D)_PBS (ダルベッコ式リン酸緩衝液） で洗浄し、 0.1 %の BSAを含有する 0.2Mトリス （2-ァミノ- 2-ヒドロキシメ チル -1,3-プロパンジオール） （Tris-HCl) を用いたブロッキング、 次いで 0.1%の BS Aを含有する (D)— PBSを用いたブロッキングを行い、抗ヒト I gG(Fc) 特異抗体固相化マグネチックビーズを調製した。
次いで、 この抗ヒト I gG(Fc)特異抗体固相化マグネチックビーズに、 クロ ーン病患者の血清 20検体よりランダムに選んだ 3人分の血清プール 2種類 （C D G 1及び C D G 2 )、 及び健常者の血清 20検体よりランダムに選んだ 5人分 の血清プールをそれぞれ添加し、 一晩反応させて、 表面に抗ヒト I gG(F c)特 異抗体を介して各血清 I gG (健常者の血清 I gGまたはクローン病患者の血清 I gG) を固定化したマグネチックビーズを作製した。
(ii) CD結合性ペプチドディスプレイファージの選別 （バイオバニング） 健常者の血清 I gGを固定化したマグネチックビーズに、 約 1 X 1011のファ ージライブラリ一 （Ml 3ファージの pVIII領域にランダムな 9アミノ酸をディ スプレイするライブラリ一） を添加して 4 :でー晚反応させ、 次いで結合しなか つたファージをクローン病患者の血清 I g Gを固定化したマグネチックビーズに 添加して 4 °Cでー晚反応させた。 反応後、 ビーズを 0.1%BSAを含む (D)— PB Sを用いて洗净し、 その後、 溶出緩衝液 （lmg/mlの BSAを含有する 0.1M塩 酸をグリシンにて PH2.2に調整） を用いて、 ビーズに結合したファージを溶出 した。 得られた溶出ファージを 1Mトリスを用いて中和し、 中和後のファージを 大腸菌 JM109に感染させて、 これを 150 g/mlアンピシリン、 1 %ダルコ一 スを含む LB寒天培地に塗布し、 37°Cで一晩培養した。 培養後、 増殖した培地 上の大腸菌を全て搔き取り、 ヘルパーファージ （M13K07) を感染させて、 I P TG (イソプロピル一 一D (-)—チォガラクトピラノシド） 及びカナマイシンを 添加した後、 37でで一晩振盪培養した。培養液を遠心分離して不溶物を除去し、 この中にポリエチレンダリコールを含む塩ィ匕ナトリゥム溶液を加え、 数回撹拌し た後、 再度遠心してペレットを回収し、 0.02%アジ化ナトリウムを含む (D)— PBSに溶解し、 濃縮ファージ溶液を得た。
こうして得られたファージ溶液を用いて、 さらに上記のようなバイオバニング を 2回繰り返した。 3回目のバイオパニングで得られたファージ溶液を大腸菌 J Ml 09に感染させ、 これを 150 /g/mlアンピシリン、 1 %グルコースを含む L B寒天培地に塗布し、 37tにて一晩培養した。 培地上に形成された単コロニー の大腸菌を搔き取り、 150 g/mlのアンピシリンを含む LB液体培地を用いて 3 71:にて 3時間振盪培養した後、 ヘルパーファージ （M13K07) を感染させて、 I PTG及びカナマイシンを添加した後、 37 でー晚振盪培養した。
以上のようにして、 CD結合性べプチドディスプレイファージを単クローン化 した。
(iii) ファージ EL I S A
上記で単クローン化した C D結合性べプチドディスプレイファージについて、 上記のバイォバニングで用いた健常者血清プール及びクローン病患者血清プール ((i)参照） を用いてファージ EL I SAを行った。
EL I S Aにあたっては、 まず抗ファージ抗体 (Pharmacia)を 96穴マイクロ 夕イタ一プレートに固定ィ匕した。固定化は、具体的には (D)— PBSにて 1 g/ml 濃度に調製した抗ファージ抗体 (Pharmacia) 溶液 100 1を各ゥエルに添加し、 4°Cでー晚静置した後、 洗浄し、 300 1のブロッキング溶液（1%BSA、 5%ソ ルビトールを含む (D) -PBS)を加えて 4ででー晚静置することによつて行つた。 一次反応は、 ファージ EL I SA緩衝液 （1% BSA、 0.05% Tween20 10% 正常ャギ血清を含む (D)-PBS) 90 1 に上記 (ii)で調製したファージ培養液を 10^ 1加え、上記の抗ファージ抗体を固定化した各ゥエルに添加した後、 37 にて一時間反応させることによって行った。 一次反応終了後、 4回洗浄し、 二次 反応を行った。二次反応は、ファージ EL I SA緩衝液 100 1に血清 1 1 (健 常者血清またはクローン病患者血清） を加え、 各ゥエルに添加した後、 37 に て一時間反応させることによって行った。 次いで二次反応終了後、 4回洗浄し、 三次反応を行った。 三次反応は、 ファージ EL I SA緩衝液で 40,000倍に希釈 した HR P (horseradish peroxidase)標識抗ヒト I g G (F C ) 特異的抗体
(20ng/ml) 100 fi 1を各ゥエルに添カ卩した後、 37でにて一時間反応させること によって行った。 三次反応終了後、 洗浄し、 発色反応を行った。 発色は TMB
(3,3',5，5 '—テトラメチルベンジジン）溶液を加えて、室温で 1 0分間反応させた 後、 停止液 （1N 硫酸） を加えることによって反応を停止した。 反応を停止さ せたプレートはプレートリーダーで吸光度 (OD450nm) を測定し、 血清抗体と の反応性を調べた。
これ力ゝら、 健常者の血清抗体とは反応しないでクローン病患者の血清抗体だけ に反応性を示すファージクローンを選択した。 次いで選択したファージクローン について、 上記方法と同様にしてクローン病患者血清 20検体、 潰瘍性大腸炎患 者血清 20検体及び健常者血清 20検体のそれぞれに対して EL I SAを行い、 その反応性からクローン病患者血清に特異性の高い 5つのクローン （C D— 1、 CD— 2、 CD— 3、 CD— 4、 CD— 5) を選択した。 選択した 5つのクロ一 ンについて各血清検体 （クローン病患者血清、 潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者 血清） に対する反応性 （EL I SA) をみた結果を図 1に示す。
(3) CD結合性ペプチドのアミノ酸配列の決定
上記各ファージ EL I S Aによって選択した 5つのクロ一ン （CD— 1、 CD _ 2、 CD— 3、 CD_4、 CD— 5) のアミノ酸配列の決定を行った。 まず、 上記で選択されたファージクローンから D N Aを抽出した。 具体的にはファージ クローンを大腸菌 J Ml 09に感染させ、 アンピシリンを含む LB寒天培地に塗 布し、 一晩培養を行い、 培地上に形成されたコロニーを搔き取り、 2m lのアン ピシリン含む LB液体培地で一晩振盪培養し、キアプレップ DNA抽出キット（キ ァゲン） を用いてプラスミド DNAを抽出した。
ファージ DN Aの塩基配列の決定は、 ジデォキシ法 （Proc. Na . Acad. Sci.， USA., 74, 5463-5467 (1977)) により、 アマシャム社のサイクルシークェンスキ ット （Amersham pharmacia biotech, code; 2438) を用いて、 キットの使用説明 書に従い実施した。 DNA配列はフアルマシア社製の DNAシークェンサ一 （A LF DNAシークェンサ一） を用いてシークェンスを行った。
得られた塩基配列から決定した各クローン （CD— 1、 CD— 2、 CD— 3、 CD— 4、 CD— 5) のアミノ酸配列を 1文字表記として表 5に示す。
表 5 クローン No. アミノ酸配列 配列番号
CD- 1 AEGEL GLLAQQMDY ADPA 6
CD- 5 AEGEL RL VGQQVMQ GDPA 9
CD- 2 AEGEL YRWLPP S SA GDPA 15
CD- 3 AEGEL RQSDGQYQM GDPA 20
CD- 4 AEGEL GG I YQDL VS GDPA 33 なお、 表中、 各ペプチドの N末端及び C末端領域に位置するそれぞれ AEGE L及び ADPAまたは GDPAは、 ファージベクターのランダムペプチドの両端 に位置するアミノ酸配列に由来するものである。
CD— 5クローンを除く CD— 1、 CD_2、 CD _ 3及び CD— 4クローン について、 上記ファージベクター由来のアミノ酸配列を含む 18アミノ酸を分岐 状多抗原性ペプチド （Multiple Antigen Peptide) (MAPペプチド） の形態にて 合成し、以下の実験に使用した。具体的には市販の Fmoc8-Lys4-Lys-2-3 Ala-Alko (渡辺化学工業社製） を用いて下記のアミノ酸配列を有するぺプチドをぺプチド ATC-357 peptide synthesizer (Advanced ChemTech社製） にて合成した。
CDP- 1 ： AEGELGLLAQQMDYADPA (配列番号 6) CDP-2 ： AEGELYRWLP P S S AGDPA (配列番号 15) CDP-3 ： AEGELRQSDGQYQMGDPA (配列番号 20) CDP-4 ： AEGELGG I YQDLVSGDPA (配列番号 33) 本合成法により、各分岐状多抗原性ペプチド （MAPペプチド） は、 一分子中に CD結合性べプチドのァミノ酸配列を分岐状に 8つ有することになる （図 2 )。 実施例 2 CD結合性ペプチドの血清検体に対する反応性 .
(1) 個々の分岐状多抗原性ペプチド （MAPペプチド） を抗原とした EL I S A
実施例 1で得られた各 MAPペプチド （CDP-1、 CDP-2、 CD P- 3及び CDP-4の M A Pぺプチド：図 3参照） を抗原べプチドとして利用して、 E L I S Aにより各血清検体 （クローン病患者血清、 潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者 血清） に対する反応性を調べた。
まず、 各 MAPペプチドを 96穴マイクロ夕イタ一プレートに固定化した。 具 体的には、 固定化は、 各 MAPペプチドを bicarbonate buffer (50mM、 pH 9.6) にて 1 g/ml濃度に調製して MAP溶液を調製し、 プレートの各ゥエル に 100 1ずつ添加し、 4t:にてー晚静置し、 その後洗浄して 300 1のカゼィ ン溶液 （0.1%カゼイン及び 1 %TritonX-100を含む (D)_PBS) を加えて、 再 度 4 °Cにてー晚静置することによつて行つた。
(i) 各 MAPペプチドを固定ィ匕した MAPプレートを用いて、 クローン病患者 血清 20検体、 潰瘍性大腸炎患者血清 20検体及び健常者血清 48検体の各 M A Pペプチドに対する反応性を EL I S Aにより確認した。
具体的には、 まず一次反応として、 カゼイン溶液 100 1に血清抗体 1 1を 加えた全量を MAPプレートの各ゥエルに添加し、 それを 37 :で 1時間反応さ せた。 一次反応終了後、 4回洗浄し、 このゥエル中に、 カゼイン溶液で 20,000 倍に希釈した HRP標識抗ヒト I gG(F c)特異的抗体を添加し、 37 で一時 間反応させて二次反応を行つた。二次反応終了後、 4回洗浄し発色反応を行つた。 検出は 100 1の TMB溶液を加えて、 室温で 1 0分間反応させた後、 100 1 の TMB停止溶液（1N 硫酸） を加えることにより反応を停止し、 プレ一トリ一 ダ一で OD450nmの吸光度を測定して、各血清について各 M A Pプレートに対す る反応性を調べた。 結果を図 3に示す。 図 3からわかるように、 4種類の MAP ペプチド （CDP-1、 CDP-2、 CDP-3および CDP-4の MAPペプチド） は、 いずれも潰瘍性大腸炎患者の血清や健常者の血清とは殆ど反応せず、 クロー ン病患者の血清に対して 2〜 4割の割合で反応性を示した。 また図 3からわかる ように、 各 MAPぺプチドのクローン病患者の血清に対する反応性は各 MAPぺ プチド間でそれぞれ異なっており共通性は認められなかった。 このことから、 こ の 4種類のぺプチドはクローン病患者特異的に反応するそれぞれ異なるタイプの ペプチドであると判断された。
(ii) 次に多数の血清検体 （クローン病患者血清 96検体、 潰瘍性大腸炎患者 血清 20検体及び健常者血清 48検体） を用いて、 上記各 MAPペプチド （CD P-l、 CDP-2, CDP-3および CDP-4の MAPペプチド） の反応性を上記 (i) の方法と同様にして調べ、 クローン病患者血清に対する当該ペプチドの特異 性を評価した。 結果を表 6に示す。
'表 6
Figure imgf000049_0001
表 6に示すように、 健常者の血清 48検体の平均〇D値十 5 SDをカツトオフ 値とした場合、 クローン病患者血清 96検体に対する陽性率は C D P一 1ぺプチ ドが 31.3%、 CDP— 2ペプチドが 27.1%、 CDP— 3ペプチドが 51.0%、 及び CDP— 4ペプチドが 31.3%であった。 また、健常者及び潰瘍性大腸炎患 者の血清に対する偽陽性率はいずれのぺプチドも 5 %以下であった。 このことか ら、 これらの各ペプチド （CDP-1ペプチド、 CDP-2ペプチド、 CDP-3ペプチド および CDP-4ペプチド） はクローン病患者が有する特有の抗体 （クローン病抗 体） に特異的に結合し、 これを利用することによって、 クローン病の罹患の有無 を精度よく診断できると考えられた。
(2) 混合 MAPペプチドを抗原とした EL I SA 実施例 1で調製した MAPペプチド （CDP-1、 CDP-2、 CD P- 3および C DP- 4の MAPペプチド） を混合して混合 MAPペプチドを調製し、 これを抗 原として利用して、 EL I S Aにより多種類の血清検体 （クローン病患者血清、 潰瘍性大腸炎患者血清、十二指腸潰瘍患者血清、胃潰瘍患者血清及び健常者血清） に対する反応性を調べた。
なお、 検出に使用する抗原プレートは、 CDP_ 1の MAPペプチド及び CD P— 4び MA Pぺプチドがそれぞれ 1.5 g/mL CDP- 2び M A Pぺプチド 及び CDP— 3の MAPペプチドがそれぞれ 3 g/ml となるように調製し、 こ れらを等量混和したものを （1) に記載する MAPプレートの調製と同様にして 96穴マイクロタイ夕一プレートに固定化することによって調製した。
(i) この混合抗原プレートを用いて、 クローン病患者血清 550検体、 潰瘍 性大腸炎患者血清 20検体、 健常者血清 120検体、 十二指腸潰瘍患者血清 25 例及び胃潰瘍患者血清 15検体について混合 MAPぺプチドに対する反応性を E L I S Aにより確認した。 なお、 EL I S Aは二次反応に使用する HRP標識抗 ヒト I gG (Fc) 特異的抗体として、 カゼイン溶液 （0.1%カゼイン及び 1 % TritonX-lOOを含む (D)— PB S)で 10,000倍に希釈したものを使用する以外は、 上記の （1) (0 に記載する方法と同様にして行った。 結果を図 4及び表 7に示 す。
表 7 カツトオフ値.
健常者平均値 + 5SD 健常者平均値 + 3SD 陽性率 クローン病患者 61.3% (337/550) 67.1% (369/550) 偽陽性率 潰瘍性大腸炎患者 5.0% (1/20) 5.0% (1/20)
健常者 0.8% (1/120) 1.7% (2/120) 十二指腸潰瘍患者 0 % (0/25) 0 % (0/25)
0 % (0/15) 0 % (0/15) 図 4及び表 7からわかるように、 健常者の血清 120検体の平均 unit値十 3 S Dを力ットオフ値とした場合、 クローン病患者血清に対する陽性率は 67.1% (369/550) であり、 偽陽性率は潰瘍性大腸炎患者の血清について 5% (1/20)、 健常者血清について 1.7% (2/120)、十二指腸潰瘍患者血清並びに胃潰瘍患者血 清については 0% (0/25、 0/15) であった。
この結果と （1) の結果とを比較することにより、 各クローン病抗体結合性べ プチド （CDP-1ぺプチド、 CDP-2ぺプチド、 CDP-3ぺプチドおよび CDP-4ぺ プチド） を単独で使用するよりも、 これらを組み合わせて用いることによりクロ —ン病特有の抗体に対する特異性が向上し、 これによつてクローン病の罹患の有 無が高い精度で診断できると考えられた。
(3) 混合 MAPペプチドとパン酵母を抗原とした EL I S Aとの比較
(2) と同様にして、 実施例 1で調製した MAPペプチド （CDP-1、 CDP -2、 CDP-3および CDP-4の MAPペプチド） を混合してこれを抗原として 利用して、 EL I SAにより各血清検体 （クローン病患者血清、 潰瘍性大腸炎患 者血清及び健常者血清） に対する反応性を調べた。 また、 クローン病との関連が 指摘されているパン酵母 ( saccharomvces cerevisiae ) (Gut 1998, 42, pp.788-791. Gastroenterology 1999, 116， ρρ·1001·1003、 Am J Gastroenterol 2001， 96 pp.730-734)についても同様に、 上記各血清検体に対する反応性を調べ、 両者のクローン病診断における有用性を比較した。 なお、 抗原プレートとして使 用する混合 M A Pプレートは、 C D P - 1の M A Pぺプチド及び C DP-4の M A Pぺプチドがそれぞれ 1.5 g/mL CDP-2の MA Pぺプチド及び C D P - 3の M A Pぺプチドがそれぞれ 3 g/mlとなるように調製し、 これらを等量混和したも のを （1) に記載する MAPプレートの調製と同様にして 96穴マイクロタイ夕 —プレートに固定ィ匕することによって調製した。またパン酵母に対する反応性は、 市販の測定キットであ Anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies検出キット
(ASCAIgG検出キット及び ASCAIgA検出キット、使用抗原：パン酵母細胞膜 のグリコマンナン、 Medizyme製） を用いて測定した。
(i)混合 MAPプレートを用いてクローン病患者血清 96例、潰瘍性大腸炎患者 血清 20例、 及び健常者血清 48例について混合 MAPに対する反応性を EL I SAにより確認した。 なお、 EL I SAは上記 （2) (i)に記載する方法と同様に xつた。
(ϋ) また、パン酵母に対する反応性は測定キットの操作説明書に従って行った。 結果を図 5に示す。 図 5 Αに示すように、 抗原として混合 MAPペプチドを用い た EL I S Aでは健常者の血清 48検体の平均 unit値 + 3 SDをカツ卜オフ値 とし、 図 5 B及び図 5 Cに示すように、 抗原として ASCA IgG及び ASCA IgA の測定キットを用いた EL I S Aでは操作説明書に従って binding index (結合 インデックス） =1.0 をカットオフ値として陽性率と偽陽性率を算出した。 陽性 率と偽陽性率の結果を表 8に示す。
表 8
陽性率 _ 偽陽性率
抗原 クローン病患者 潰瘍性大腸炎患者 健常者 混合 MAP 66.7% (64/96) 5.0% (1/20) 2.1% (1/48) ASCA IgG 30.2% (29/96) 10.0% (2/20) 10.4% (5/48) ASCA IgA 13.5% (13/96) 5.0% (1/20) 0% (0/48) これらの結果から、 個々の M A Pぺプチドを組合せて混合 M A Pペプチドとし て用いることによって、 クローン病抗体の認識抗原として指摘されているパン酵 母よりも、 クローン病抗体が特異的に認識でき、 高い精度でクローン病の罹患の 有無が検出できると考えられた。 実施例 3 C D結合性べプチドのホモ口ジー解析
得られた MAPペプチド（CDP-：!〜 CDP-4の MAPペプチド）について、 クローン病との関連が報告されているタンパク〔CDX (measles related antigen) (Gut 2000 Feb;46(2):163'9〉、 porcine pancreatic alpha amylase (Annual report of the research committee of inflammatory bowel disease. Japan: The ministry of health and welfare of Japan, 1999:98-100〉、 M.paratuberculosis HSP65 (horseradish peroxidase 65) ( Clin Diagn Lab Immunol. 1995 Nov;2(6) :657-64 ) 、 human HSP60 ( Digestion. 1997;58(5):469·75 ) 、 M.paratuberculosis p36 (Curr Microbiol.1999 Aug;39(2):115-9〉〕とのアミノ酸 配列における相同性を DNAS I Sソフト （日立製作所） を用いて解析した。 結 果を図 6に示す。 この結果からわかるように、 それぞれのタンパクにおいて弱い 相同性が認められたものの、 余り高い相同性は認められなかった。
次いでこれらのアミノ酸配列について、 FASTAプログラム （Genome Net サイト使用） を用いて、 クローン病抗体結合性ペプチドとアミノ酸配列において 相同性を有するタンパクをタンパクデータベースより検索した。検索は、 Z-score が 130以上である相同性の高いタンパクだけが抽出されるように行った。結果を 図 7に示す。 図 7からわかるように、 CD 1ペプチド、 CD 3ペプチド及び CD 4ペプチドに関しては、 クローン病との関与が報告されている yeast や mycobacteriumの夕ンパクだけでなく、クローン病との関連性が認められていな い病原性微生物や食物 （Zea myze等） のタンパク等、 細菌、 動物及び植物など の多くの種にわたって相同性を有するタンパクがみられた。 実施例 4
実施例 1において、ファージ EL I S Aで得られた各種血清に対する反応性 (図 1) 並びにアミノ酸配列の類似性 （表 2) から、 CD— 1及び CD— 5クローン のァミノ酸配列を有するそれぞれのぺプチド（ C D P -1ぺプチド（配列番号 6 )、 及び C D P - 5ペプチド（配列番号 9 ) )は同一抗体を認識するものと考えられた。 また当該 CD P - 1ぺプチドと CD P - 5ぺプチドは、 ヒト液胞型 H+輸送性 AT P ase (V-ATPase) のサブユニット Eの 199-212 領域に位置するペプチド (VATE-201ぺプチド：配列番号 1 1) とアミノ酸配列上の相同性を有している 酒 8)。
そこで、 下記に示すペプチド （CDP-laペプチド、 CDP-5aペプチド、 VATE-201ペプチド） を、 上記実施例 1 (3) に記載する方法と同様にして MA P (Multiple antigenic peptides) の形態にて合成し （図 9)、 実施例 2 (1) の 方法に従って、 各 MAPペプチドの各血清検体 （クローン病患者血清、 潰瘍性大 腸炎患者血清及び健常者血清） に対する反応性を EL I S Aによって調べた。
CDP-la ： AEGELGLLAQQMDYADP (配列番号 5) CDP-5a ： AEGELRLVGQQVMQGDP (配列番号 8)。
VATE-210 ： RLDL I AQQMMPEVR (配列番号 11 ) 血清検体としてクローン病患者の血清 20検体、 並びに比較血清検体として潰 瘍性大腸炎患者の血清 20検体及び健常者の血清 20検体を用いた。 結果を図 1 0に示す。 図 10からわかるように、 CDP-laペプチド、 CDP-5aペプチド 及び VATE-201ペプチドは互いに同様の EL I S A反応性を示した。 実施例 5 VATE-201ぺプチドによる抗原—抗体反応の阻害試験
実施例 4で得られた VATE-201の反応性を確認するために、 VATE-201ぺプチ ドを用いて CD P - 1 aぺプチドとクローン病抗体との抗原—抗体反応の阻害試 験を行った。血清抗体試料として、各 MAPぺプチド（CDP-laぺプチド、 CDP-5a ぺプチド、 VATE-201ぺプチド） に強い反応性を示したクローン病患者の血清 8 番、 9番、 及び 14番 （図 11参照） を用いた。
具体的には、 抗原プレートとして、 CDP-laの MAPペプチド （図 10) を プレートに固定化した MAPプレートを用い （実施例 2(1)参照）、 これに VATE-201の MAPペプチド （反応阻害物質） を lOO ig/mLの濃度で含むカゼ ィン溶液（0.1%カゼィン及び 1 % ritonX-lOOを含む (D)_ P BS) 100 に血 清検体 1 を加えて 37でで 1時間反応させた溶液の全量を添加し、 実施例 2 (1) と同様にして EL I SAを行った。 一方、 比較実験として、 上記反応阻害 物質として、 VATE-201の MAPペプチドに代えて CDP-laの MAPペプチド を用いて同様に EL I S Aを行った。 結果を図 11に示す。
図 11の Bに示すように、反応系に VATE-201の MAPペプチドを添加するこ とによって、 CDP-laの MA Pプレートに対するクローン病患者の各血清検体 ( 8番、 9番、 14番） の反応性がすべて阻害された。 また、 上記 C D P— 1 aの MAPペプチドに代えて CD P— 5aの MAPペプチドを用いて同様に行った試 験においても同様の結果が得られた （結果示さず)。
以上、 実施例 4及び 5の結果から、 VATE-201ペプチド、 並びに CD P- laぺ プチド及び CD P- 5aぺプチドはいずれもクローン病患者の血清中に特異的に 存在する抗体を認識することがわかった。また VATE-201ペプチドとのアミノ酸 配列の類似性並びに血清抗体との反応性の共通性から、 C D P - 1 aペプチドおよ び CD P- 5aペプチドを始めとする本発明の CD 1ペプチド及びその同効物は、 ヒト液胞型 H+輸送性 ATPase (V-ATPase) のサブユニット Eを模倣するもの であると考えられる。
すなわち、 上記実施例の結果は、 クローン病患者にはヒト液胞型 H+輸送性 ATPaseサブュニット Eに対する抗体が特異的に存在していることを示すもので ある。 このことから、 ヒト液胞型 H+輸送性 ATPase、 特にそのサブユニット E を認識する抗体を指標とすることによって個々の被験者についてクローン病の罹 患の有無を診断することができるものと考えられる。 実施例 6 CD 3ペプチド及びその同効物の模倣蛋白質の探索、並びにその評価 実施例 5の結果から、 C D 1ぺプチド及びその同効物は、 ヒト液胞型 H+輸送 性 ATPase (V-ATPase) のサブユニット Eを模倣していることが分かった。 そ こで同様にして CD 3ペプチド及びその同効物について模倣蛋白質を探索し、 そ のクローン病抗体への反応性について評価した。
(1) MAPペプチドの調製
CD P 3ペプチドの改変物として、 CD P 3ペプチド （配列番号 21) のアミ ノ酸配列を基本にそれぞれ 1アミノ酸残基をァラニンに置換した 14種類のぺプ チドを調製した （表 9)。 なお、 CDP 3-1については 1番目のアミノ酸がァラ ニンであるためセリンに置換した。 次いで、 これらの 15種類のペプチドについ て、 実施例 1 (3) の方法に従って、 それぞれ 1分子あたり 8個のペプチドを有 する MAPペプチドを調製した （1アミノ酸置換 MAPペプチド）。 (2) CD P 3ェピトープ配列の決定
C D Pペプチドのァミノ酸配列において、 クロ一ン病抗体との特異的反応性に 必要な配列を決定するため、 上記で調製した 1アミノ酸置換 MAPぺプチドを反 応阻害物質として用いて、 下記の反応阻害試験を行った。 反応血清抗体試料とし て、実施例 2において CD P - 3ぺプチドに強い反応性を示したクローン病患者の 血清 2番、 7番及び 8番を用いた （図 3参照)。
具体的には、 抗原プレートとして、 CD P 3の MAPペプチドをプレートに固 定化した MAPプレート （実施例 2 (1) 参照） を用いて 3段階の反応により行 つた。 1次反応は、クローン病患者血清を、 1アミノ酸置換 MAPをそれぞれ 100 Z/g/mL濃度で含む検体希釈液（0.5M食塩、 1.5%カゼイン、 2 %正常ャギ血清、 0.2% Tween 20を含む 0.1Mトリス緩衝液）にて 100倍希釈した後、 25 で 1時 間反応することにより行った。 2次反応は、 1次反応液 100 Lを MAPプレー トのゥエルに添加した後、 25 :にて 1時間反応した後、 3回洗浄することにより 行った。 3次反応は、 酵素標識抗体希釈溶液 （0.14M食塩、 0.5% BSA、 5 %正 常ャギ血清、 0.05% Tween 20を含むトリス緩衝液） で 5,000倍に希釈した HR P標識抗ヒト I gG (Fc) 特異的抗体 lOO^Lを添加し、 25 :にて 1時間反応 した後、 3回洗浄することにより行った。 検出は、 実施例 2 (1) に従い、 1ァ ミノ酸置換 MAPぺプチドによる反応阻害活性を測定した。 結果を表 9に示す。 表 9
1アミノ酸置換 MAP 患者血清検体
名育 U アミノ酸配列 2 7 8
CDP3 AEGE L RQ S DGQYQM +++ +++ +++
CDP3-1 S EGE L RQ S DGQYQM +++ +++ +++
CDP3-2 AAGE L RQ S DGQYQM +++ +++ +++
CDP3-3 AEAE LRQ S DGQYQ +++ +++ +++
CDP3-4 AEGAL RQ S DGQYQM +++ +++ +++
CDP3-5 AEGEARQ S D GQ Y QM +++ +++ +++
CDP3-6 AEGE LAQ S D GQ YQM +++ +++ +++
CDP3-7 AEGE L RA S DGQYQM
CDP3-8 AEGE L RQADGQYQM +++ +++ +++
CDP3-9 AEGE L RQ S AGQYQM +
CDP3-10 AEGE L RQ S DAQYQM + +++ +++
CDP3-11 AEGE L RQ S D GAYQM +
CDP3-12 AEGE L RQ S D GQAQM +++ +++ +++
CDP3-13 AEGE L RQ S D G Q Y AM + +++ ++
CDP3-14 AEGE LRQ S DGQYQA +++ +++ +++
+++：反応阻害活性が 70%以上
++：反応阻害活性が 50%~70%の間 +：反応阻害活性が 30%~50%の間 一：反応阻害活性が 30%以下 この結果、 クローン病患者血清 2番において、 反応阻害物質として CDP 3- 7、 CDP 3-9, CDP3-10、 C D P 3 - 11及び CD P 3 - 13の各 MAPぺ プチドを用いた場合、 クローン病患者血清と CD P 3ペプチドと反応に対する阻 害活性が 50 %以下であった。また、クローン病患者血清 7番及び 8番において、 反応阻害物質として CD P 3-7、 CDP 3-9、 及び CDP 3-11の各 MAPぺ プチドを用いた場合、 クローン病患者血清と CD P 3ペプチドと反応に対する阻 害活性が 50%以下であった。 以上の結果より、 CD P 3のアミノ酸配列におい てクローン病抗体との反応 （抗体認識） に必要な配列な QXDGQXQ (Xは、 同一または異なって、任意のアミノ酸残基） （配列番号 51)であると判断された。 (3) CD P 3ペプチド模倣蛋白質の探索
上記のことから、 クローン病抗体の認識に重要と思われるアミノ酸配列 （QX DGQXQ は、 同一または異なって、任意のアミノ酸)） を用いて蛋白質デー 夕べ一スとの相同性解析を行った。 その結果、 ヒト核内蛋白質 （Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300 (HZF300) )の 129〜135位のアミノ酸領域 と相同性があることが確認された （図 12)。
そこで、 ヒト核内蛋白質 （HZF300) が CD P 3ペプチドの模倣蛋白質である ことを確認するために、 その 126〜： 138位のアミノ酸領域のアミノ酸配列を有す るペプチド （Z300ペプチド） を MAPペプチドの形態に調製し、 クローン病患 者血清 20例、 潰瘍性大腸炎患者血清 20例、 及び健常者血清 20例を用いて M AP抗原 EL I S Aを行った。
(4) MAP抗原 EL I S A
まず、 ヒト血清を検体希釈液 （前述） にて 101倍に希釈し、 その 100 Lを M APプレートのゥエルに添加した後、 実施例 6 (2) の 2次反応以降の操作に準 じて測定し、 MAPペプチドと各種の血清抗体との反応性を調べた。 結果を図 1 3に示す。 その結果、 CD P 3ペプチドに強い反応性を示すクローン病患者血清 2、 7及び 8番は、 Z300ペプチドに対して同様の反応性を示した。 一方、 潰瘍 性大腸炎患者血清及び健常者血清に対して、 Z300ペプチドは明確な反応性を示 さなかった。 (5) 抗原一抗体反応の阻害試験
Z300ぺプチドのク口一ン病抗体への反応性を確認するために、 Z300ぺプチド を用いて CD P 3ぺプチドとクローン病抗体との抗原—抗体反応の阻害試験を行 つた。 血清抗体試料として、 CD P 3ペプチドに強い反応性を示したクローン病 患者の血清 2番、 7番、 及び 8番を用いた。
具体的には、 抗原プレートとして、 CD P 3の MAPペプチドをプレートに固 定化した MAPプレートを用い （実施例 2(1)参照）、 これに Z300の MAPぺプ チド （反応阻害物質） を 100 ig/mLの濃度で含む検体希釈液 （前述） 100 Lに 血清検体 1 Hhを加えて 25でで 1時間反応させた溶液の全量を添加し、 実施例 6 (2) と同様にして EL I SAを行った。 一方、 比較実験として、 上記反応阻 害物質として、 Z300の MAPペプチドに代えて CD P 3の MAPペプチドを用 いて同様に EL I S Aを行った。 結果を図 14に示す。
図 14の Bに示すように、 反応系に Z300の MAPペプチドを添加することに よって、 C D P 3の M A Pプレートに対するクローン病患者の各血清検体（ 2番、 7番、 8番） の反応性がすべて阻害された。
上記の結果から、 Z300ペプチド及び CD P 3ペプチドはいずれもクローン病 患者の血清中に特異的に存在する抗体を認識することがわかった。 また Z300ぺ プチドとのアミノ酸配列の類似性並びに血清抗体との反応性の共通性から、 本発 明の CD 3ペプチド及びその同効物は、 ヒト核内蛋白質 （Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)を模倣するものであると考えられる。 すなわち、 上記実施例の結果は、 クローン病患者にはヒト核内蛋白質 （Homo sapiens kruppeMike zinc finger protein 300) に対する抗体が特異的に存在して いることを示すものである。 このことから、 ヒト核内蛋白質（Zinc finger protein 300)を認識する抗体を指標とすることによって個々の被験者についてクローン 病の罹患の有無を診断することができるものと考えられる。 実施例 7 CD 4ぺプチド及びその同効物の模倣蛋白質の探索、並びにその評価 次いで CD 4ぺプチド及びその同効物について模倣蛋白質を探索し、 そのク口 ーン病抗体への反応性について評価した。
(1) MAPペプチドの調製
CD P 4ペプチドの改変物として、 CD P 4ペプチド （配列番号 33) のアミ ノ酸配列を基本にそれぞれ 1アミノ酸残基をァラニンに置換した 15種類のぺプ チドを調製した （表 10)。 なお、 CDP4-1については 1番目のアミノ酸がァ ラニンであるためセリンに置換した。 次いで、 これらの 14種類のペプチドにつ いて、 実施例 1 (3) の方法に従って、 それぞれ 1分子あたり 8個のペプチドを 有する M A Pぺプチドを調製した （ 1ァミノ酸置換 M A Pぺプチド）。
(2) CD P 4ェピトープ配列の決定
CD Pぺプチドのアミノ酸配列において、 クローン病抗体との特異的反応性に 必要な配列を決定するため、 上記で調製した 1アミノ酸置換 MAPぺプチドを反 応阻害物質として用いて、 実施例 6 (2) と同様にして反応阻害試験を行った。 なお、反応血清抗体試料として、実施例 2において CD P- 4ペプチドに強い反応 性を示したクローン病患者の血清 3番、 6番、 15番、 17番及び 20番を用い た （図 3参照)。 結果を表 10に示す。
表 10
1アミノ酸置換 MAP 崽者血清検体
名前 アミノ酸配列 3 6 15 17 20
CDP4 A E G E L G G I Y Q D L V S +++ +++ +++ +++ +++
CDP4-1 S E GE LGG I YQD LV S +++ +++ +++ +++ +++
CDP4-2 AAGE LGG I YQD L V S +++ +++ +++ +++ +++
CDP4-3 AE AE LGG I YQD L V S +++ +++ +++ +++ +++.
CDP4-4 AEG ALGG I YQDL V S +++ +++ +++ +++ +++
CDP4-5 AE GEAGG I Y Q D L V S +++ + ++
CDP4-6 AEG E LAG I YQDLV S ++
CDP4-7 A E G E L G A I Y Q D L V S
CDP4-8 AEG E LGGAYQD LV S
CDP4-9 AEGE LGG I AQDLV S
CDP4-10 A E G E L G G I Y AD L V S +++ +++ +++ +++ +++
CDP4-11 A E G E L G G I Y Q A L V S +++ +++ +++ +++
CDP4-12 AEGE LGG I YQDAV S
CDP4-13 AEGE LGG I YQD LAS +++ +++ +++ +++ +++
CDP4-14 A E G E L G G I YQD LVA +++ +++ +++ +++ +++
+++：反応阻害活性が 70%以上
++：反応阻害活性が 50% 70%の間
+：反応阻害活性が 30%~50%の間
反応阻害活性が 30%以下 この結果、 クローン病患者血清 3番、 6番、 15番、 17番及び 20番におい て、 反応阻害物質として CD P 4-7、 CDP4-8、 CD P 4 - 9及び C D P 8 - 12の各 MAPペプチドを用いた場合、 クローン病患者血清と CD P 4ペプチド との反応に対する阻害活性が 30%以下であった。 また、 クローン病患者血清 6 番、 15番、 17番及び 20番において、 反応阻害物質として CD P 4-6の MA Pペプチドを用いた場合、 クローン病患者血清と CDP 3ペプチドとの反応に対 する阻害活性が 30 %以下であつた。 さらに反応阻害物質として CDP4— 5及 び CDP4— 11の各 MAPペプチドを用いた場合、 それぞれクローン病患者血 清 6番及び 15番において、 クローン病患者血清と CD P 4ペプチドとの反応に 対する阻害活性が 30 %以下であった。
以上の結果より、 CD P 4ぺプチドのアミノ酸配列においてクローン病抗体と の反応（抗体認識） に必要な配列な LGGI YXDL (Xは任意のアミノ酸残基） (配列番号 49) であると判断された。
(3) CD P 4ペプチド模倣蛋白質の探索
上記のことから、 クローン病抗体の認識に重要と思われるアミノ酸配列 （LG G I YXDL (Xは任意のアミノ酸)）を用いて蛋白質データベースとの相同性解 析を行った。 その結果、 コメアレルゲン蛋白質と相同性があることが確認された (図 15)。 図 15に示すように、 コメアレルゲン蛋白質は a -amylase/trypsin inhibitorであり、 gene familyを形成している。 これらの相互に高い相同性を持 つ OL -amylase/trypsin inhibitorは、いずれもクローン病抗体との反応（抗体認識） に重要と考えられるアミノ酸配列 L (又は V) GG I YXD (又は E) L領域（配 列番号 49、 50) を有していた。 なお、 Lと Vは脂肪族アミノ酸、 Dと Eは酸 性アミノ酸として互いに類似するアミノ酸である。
そこで、 コメァレルゲン蛋白質が C DP4ぺプチドの模倣蛋白質であることを 確認するために、 Rice seed allergen RA14 (図 16) の 99〜： 111番目のアミノ酸 領域のアミノ酸配列を有するペプチド （T03965ペプチド） を MAPペプチドの 形態に調製し、 クローン病患者血清 20例、 潰瘍性大腸炎患者血清 20例、 及び 健常者血清 20例を用いて MAP抗原 EL I S Aを行った。 (4) MAP抗原 EL I SA
抗原プレートとして、 T03965の MAPペプチドを固定ィ匕して調製した MAP 抗原プレートを用いる以外は、 実施例 6 (4) と同様にして MAP抗原 EL I S Aを行った。 結果を図 17に示す。 その結果、 CD P 4ペプチドに強い反応性を 示すクローン病患者血清 3、 6、 15、 17及び 20番は、 T03965ぺプチドに 対しても同様の反応性を示した。 一方、 T03965ぺプチドは、 CDP4ぺプチド と同様に、 潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清に対して、 明確な反応性を示さ なかった。
(5) 抗原一抗体反応の阻害試験
T03965ペプチドのクローン病抗体への反応性を確認するために、 実施例 6 (5) と同様にして、 T03965ペプチドを用いて CD P 4ペプチドとクローン病 抗体との抗原—抗体反応の阻害試験を行った。 血清抗体試料として、 CDP4ぺ プチドに強い反応性を示したクローン病患者の血清 3、 6、 15、 17及び 20 番を用いた。 結果を図 18に示す。
図 18に示すように、反応系に T03965の MAPペプチドを添加することによ つて、 CD P 4の MAPプレートに対するクローン病患者の各血清検体（3、 6、
15、 17及び 20番） の反応性がすべて阻害された。
上記の結果から、 TO3965ぺプチド及び CD P 4ぺプチドはいずれもクローン 病患者の血清中に特異的に存在する抗体を認識することがわかった。 また T03965ペプチドとのァミノ酸配列の類似性並びに血清抗体との反応性の共通性 から、 本発明の CD 4ペプチド及びその同効物は、 コメアレルゲン蛋白質 （α
-amylase/trypsin inhibitor gene family)を模倣するわのでめると考えられる。 すなわち、上記実施例の結果は、クローン病患者にはコメアレルゲン蛋白質（ひ
-amylase/trypsin inhibitor)に対する抗体が特異的に存在していることを示すも のである。 このことから、 コメアレルゲン蛋白質（α-amylase/trypsin inhibitor) の gene familyを認識する抗体を指標とすることによって個々の被験者について クローン病の罹患の有無を診断することができるものと考えられる。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 クローン病患者に特有に存在する抗体に特異的に結合するべ プチドを提供することができる。 かかる本発明のぺプチドはクローン病の検査試 薬として有用であり、 かかるペプチド及びそれを含む検査試薬によれば、 クロー ン病の罹患の有無を精度よく診断することができる。
また、本発明は、クローン病患者の体内には、ヒト液胞型 H+輸送性 AT Pase、 特にヒト液胞型 H+輸送性 AT Paseのサブユニット Eを認識する抗体、ヒト核内 蛋白質 (Homo sapiens kruppei-like zinc finger protein 300) ¾r認識， 仇体、 コメアレルゲン蛋白質 （ a -amylase/trypsin inhibitor) の gene familyを認識 る抗体が、 特異的に存在しているという新たな知見を提供する。 そして、 この知 見に基づいて、 本発明はこれらの少なくとも 1つの抗体を指標として、 被験者の 生体試料中にその存在を検出することからなるクローン病の検査方法を提供する ものである。 かかる方法によれば、 個々の被験者について、 生体試料 （例えば血 清等） を対象にすることにより、 簡便にかつ精度よく、 クローン病の罹患の有無 を診断することができる。

Claims

請求の範囲
1 . 下記（a ) または（b) のいずれかであるクローン病抗体結合性ペプチド： ( a) 配列番号 1〜4に示されるアミノ酸配列のいずれかから選ばれるアミノ酸 配列からなるペプチド、
( b) 上記 （a) に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロ一 ン病抗体に結合性を有するぺプチド。
2. 上記 （b) に記載されるペプチドが、 配列番号 1〜4または配列番号 7に 示されるアミノ酸配列のいずれかを一部に含むぺプチドである請求項 1に記載の クローン病抗体結合性べプチド。
3. 配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロー ン病抗体に結合性を有するペプチドが、 配列番号 5〜1 4に示されるいずれかの アミノ酸配列を有するものである請求項 1に記載のクローン病抗体結合性べプチ ド。
4. 配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロ一 ン病抗体に結合性を有するペプチドが、 配列番号 1 0に示されるアミノ酸配列の うち少なくともし I AQ QMのアミノ酸配列を含むアミノ酸数 6〜2 2 6ぺプチ ドである請求項 1に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
5 . 配列番号 2に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロー ン病抗体に結合性を有するペプチドが、 配列番号 1 5〜1 9に示されるいずれか のアミノ酸配列を有するものである請求項 1に記載のクローン病抗体結合性ぺプ チド。
6 . 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロ一 ン病抗体に結合性を有するペプチドが、 配列番号 2 0〜3 2に示されるいずれか のアミノ酸配列を有するものである請求項 1に記載のクローン病抗体結合性ぺプ チド。
7 . 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付カ卩により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロー ン病抗体に結合性を有するペプチドが、 少なくとも配列番号 5 1に示されるアミ ノ酸配列を含むアミノ酸数？〜 6 0 4のべプチドである請求項 1に記載のクロー ン病抗体結合性ペプチド。
8 . 配列番号 4に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付カ卩により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロー ン病抗体に結合性を有するぺプチドが、 配列番号 3 3〜 4 8に示されるいずれか のアミノ酸配列を有するものである請求項 1に記載のクローン病抗体結合性ぺプ チド。
9. 配列番号 4に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロ一 ン病抗体に結合性を有するペプチドが、 少なくとも L(V)G G I YXD(E)L (X は任意のアミノ酸残基） のアミノ酸配列を含むアミノ酸数 8〜1 6 5のペプチド である請求項 1に記載のクローン病抗体結合性べプチド。
1 0 . 分枝鎖のアミノ酸配列として、 下記：
( a) 配列番号 1〜 4に示されるアミノ酸配列のいずれかから選ばれるアミノ酸 配列からなるペプチド、 または
( b) 上記 （a ) に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が置換、 欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、 且つクロ一 ン病抗体に結合性を有するぺプチド
のアミノ酸配列を、 同一または異なって、 一分子中に複数個有する分岐状多抗原 性ペプチド。
1 1 . (i)配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有するぺプチド及びその同効物、 (ϋ)配列番号 2で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、 （iii) 配列番号 3で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、 及び (iv) 配列番号 4で示されるァミノ酸配列を有するぺプチド及びその同効物のうち、 少 なくとも 2つの群の中から選択される 2種以上の異なるクローン病抗体結合性べ プチドのアミノ酸配列を分枝鎖に有する、 請求項 1 0に記載の分岐状多抗原性べ プチド。
1 2. 請求項 1に記載するクローン病抗体結合性べプチド；請求項 1 0に記載 する分岐状多抗原性べプチド；及びヒト液胞型 H+輸送性 AT Paseのサブュニッ ト Eと、 その他のサブユニット A、 サブユニット B、 サブユニット C、 サブュニ ット D、 115kDaサブュニット、 39kDaサブュニット、 20 kDaサブュニット、 及び 16 kDaサブュニッ卜よりなる群から選択される少なくとも 1つのサブュニ ッ卜との複合体よりなる群から選択される少なくとも 1つを有効成分として含有 するクローン病の検査試薬。
1 3. 上記のクローン病抗体結合性べプチドが、 (i)配列番号 1で示されるアミ ノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、 （ii)配列番号 2で示されるアミノ酸 配列を有するペプチド及びその同効物、 （iii)配列番号 3で示されるアミノ酸配列 を有するペプチド及びその同効物、 及び (iv)配列番号 4で示されるアミノ酸配列 を有するぺプチド及びその同効物のうち、 少なくとも 2つの群の中から選択され る 2種以上のクローン病抗体結合性ペプチドであり、 上記の分岐状多抗原性ぺプ チドが請求項 1 1に記載されるペプチドである、 請求項 1 2に記載のクローン病 の検査試薬。
1 4. 請求項 1 2に記載の検査試薬をクローン病抗体結合用の抗原物質として 含むクローン病の検査試薬キット。
1 5. 抗ヒト I g G抗体、 及び請求項 1 2に記載の検査試薬、 並びに必要に応 じて、 検体希釈液、 標識物質、 支持体 （固相)、 抗ヒト I g G抗体希釈液、 酵素基 質液、 及び反応停止液よりなる群から選択される少なくとも 1つを含有する請求 項 1 4に記載のクローン病の検査試薬キット。
1 6. 被験者の生体試料中の、 ヒト液胞型 H+輸送性 AT Paseを認識する抗体 を検出する工程を含むクローン病の検査方法。
1 7 . 上記抗体がヒト液胞型 H+輸送性 AT Paseのサブュニット Eを認識する 抗体である請求項 1 6に記載のクローン病の検査方法。
1 8. 上記抗体が、 ヒト液胞型 H+輸送性 AT Paseのサブュニット Eと、 その 他のサブュニット A、サブュニッ卜 B、サブュニット C、サブュニッ卜 D、 115kDa サブユニット、 39kDaサブユニット、 20 kDaサブユニット、 及び 16 kDaサブ ュニットよりなる群から選択される少なくとも 1つのサブュニッ卜との複合体を 認識する抗体である請求項 1 6に記載のクローン病の検査方法。
1 9 . 上記抗体がヒト液胞型 H+輸送性 AT Pase のサブュニット Eの 199〜 212位のアミノ酸領域を認識する抗体である請求項 1 6に記載のクローン病の検 査方法。
2 0. L I AQQMのアミノ酸酉己列からなるペプチド若しくはその同効物、 ま たはこれらのペプチド若しくはその同効物のアミノ酸配列を同一または異なって 一分子中に分岐状に複数個有する分岐状多抗原性ペプチドを抗原物質として用い、 ヒト液胞型 H+輸送性 AT Pase を認識する抗体との抗原一抗体反応によって生 じる複合物を検出する工程を有する請求項 1 6に記載のクローン病の検査方法。
2 1 . L I AQQMのアミノ酸配列からなるぺプチドまたはその同効物が、 L I AQQMのアミノ酸配列を含むアミノ酸数 6〜2 2 7個からなるペプチドであ る請求項 2 0に記載のクローン病の検査方法。
2 2. L I AQQMのアミノ酸配列からなるペプチドの同効物が、配列番号 1、 5〜 1 4に記載されるそれぞれのアミノ酸配列を有するぺプチドよりなる群から 選択されるものである請求項 2 0に記載のクローン病の検査方法。
2 3. ヒト液胞型 H+輸送性 AT Paseのサブュニット Eと、その他のサブュニ ット A、 サブユニット B、 サブユニット C、 サブユニット D、 115kDaサブュニ ット、 39kDaサブユニット、 20 kDaサブユニット、 及び 16 kDaサブユニット よりなる群から選択される少なくとも 1つのサブュニットとの複合体を抗原物質 として用い、ヒト液胞型 H+輸送性 AT Paseを認識する抗体との抗原一抗体反応 によって生じる複合物を検出する工程を有する請求項 1 6に記載のクローン病の 検査方法。
2 4. 被験者の生体試料中の、 ヒト核内蛋白質 （Homo sapiens kruppeHike zinc finger protein 300)を認識する抗体を検出する工程を含むクローン病の検査 方法。
2 5 . 上記抗体がヒト核内蛋白質 (Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300) の 126〜： 138位のアミノ酸領域を認識する抗体である請求項 2 4に 記載のクローン病の検査方法。
2 6 . 配列番号 5 1に記載するアミノ酸配列を有するペプチド若しくはその同 効物、 またはこれらのペプチド若しくはその同効物のアミノ酸配列を、 同一また は異なって一分子中に分岐状に複数個有する分岐状多抗原性ペプチドを抗原物質 として用い、 ヒト核内 白質 (Homo sapiens kruppel-like zinc nnger protein 300) を認識する抗体との抗原—抗体反応によって生じる複合物を検出する工程 を有する請求項 2 4に記載のクローン病の検査方法。
2 7 . 配列番号 5 1に記載するアミノ酸配列を有するペプチド若しくはその同 効物が、 配列番号 5 1に記載するアミノ酸配列を含むアミノ酸数 7〜6 0 4個か らなるぺプチドである請求項 2 6に記載のクローン病の検査方法。
2 8 . 配列番号 5 1に記載するアミノ酸配列を有するペプチドの同効物が、 配 列番号 3、 2 1〜 3 2に記載されるそれぞれのアミノ酸配列を有するぺプチドょ りなる群から選択されるものである請求項 2 6に記載のクローン病の検査方法。
2 9 . 被験者の生体試料中の、 コメアレルゲン蛋白質を認識する抗体を検出す る工程を含むクローン病の検査方法。
3 0 . 上記コメァレルゲン蛋白質が alpha-amylase/trypsin inhibitorの gene familyに属するものである請求項 2 9に記載のクローン病の検査方法。
3 1 . 上記コメァレルゲン蛋白質が、 Rice allergen, Rice seed allergen RA5、 Rice allergen RA5B precursor. Rice seed allergen RA14、 Rice allergen RA14B precursor及び Rice seed allergen RAG2よりなる群から選択される少なくとも 1種である請求項 2 9に記載のクローン病の検査方法。
3 2. 上記コメァレルゲン蛋白質を認識する抗体が、 Rice seed allergen RA14 の 99〜： L11位のアミノ酸領域を認識する抗体である請求項 2 9に記載のクローン 病の検査方法。
3 3 . 上記コメァレルゲン蛋白質を認識する抗体が、 alpha-amylase/trypsin inhibitorの gene familyの、 L (V) G G I Y R E Lのアミノ酸配列を有するァ ミノ酸領域を認識する抗体である請求項 2 9に記載のクローン病の検査方法。
3 4. L (V) G G I YXD (E) L (Xは、 同一または異なる、 任意のアミ ノ酸残基である） のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物、 または これらのペプチド若しくはその同効物のアミノ酸配列を、 同一または異なって一 分子中に分岐状に複数個有する分岐状多抗原性ペプチドを抗原物質として用い、 コメアレルゲン蛋白質を認識する抗体との抗原—抗体反応によって生じる複合物 を検出する工程を有する請求項 2 9に記載のクローン病の検査方法。
3 5. L (V) G G I YXD (E) L (Xは、 同一または異なる、 任意のアミ ノ酸残基である） のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物が、 アミ ノ酸配列： L (V) GG I Y XD (E) L (Xは、 同一または異なる、 任意のァ ミノ酸残基である） を含むアミノ酸数 8〜1 6 6個からなるペプチドである請求 項 3 4に記載のクローン病の検査方法。
3 6. L (V) G G I YXD (E) L (Xは、 同一または異なる、 任意のアミ ノ酸残基である） のアミノ酸配列からなるペプチドの同効物が、 配列番号 4、 3 3〜4 8に記載されるアミノ酸配列を有するぺプチドよりなる群から選択される ものである請求項 3 4に記載のクローン病の検査方法。
3 7 . 請求項 1〜1 1のいずれかに記載のペプチドの、 クローン病の検査におい てクローン病抗体と反応させる抗原物質としての使用。
3 8. 請求項 1〜1 1のいずれかに記載のペプチドの、 クローン病の検査試薬の 製造のための使用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2006013661A1 (ja) * 2004-08-05 2006-02-09 Toagosei Co., Ltd. クローン病抗体エピトープペプチド及びクローン病の検査試薬
JP2006308494A (ja) * 2005-04-28 2006-11-09 Ajinomoto Co Inc クローン病の診断方法
WO2010101255A1 (ja) * 2009-03-05 2010-09-10 味の素株式会社 クローン病診断試薬

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1869692A (zh) * 2005-05-23 2006-11-29 武汉大学 三功能纳米球
EP1890152A1 (en) * 2006-08-14 2008-02-20 Charite Universitätsmedizin-Berlin Determination of renin/prorenin receptor activity
CN110073217A (zh) * 2016-10-04 2019-07-30 豪夫迈·罗氏有限公司 用于鉴定合成分类器的系统和方法
CN110256541A (zh) * 2019-05-15 2019-09-20 山西瑞豪生物科技有限公司 一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11190734A (ja) * 1997-12-26 1999-07-13 Wakamoto Pharmaceut Co Ltd クローン病の検査方法および検査用キット

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999061909A2 (en) * 1998-05-26 1999-12-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and compositions for the detection of human herpesvirus
WO2000069896A2 (en) * 1999-05-14 2000-11-23 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in haematopoietic cells
WO2001055321A2 (en) * 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
JP2004520803A (ja) * 2000-04-21 2004-07-15 コリクサ コーポレイション 尋常性挫瘡の治療および診断のための組成物および方法
CA2416544A1 (en) * 2000-07-21 2002-01-31 University Of Utah Research Foundation Mu-conopeptides
AU2002222108A1 (en) * 2000-12-08 2002-06-18 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. Diagnosis and treatment of alzheimer's disease

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11190734A (ja) * 1997-12-26 1999-07-13 Wakamoto Pharmaceut Co Ltd クローン病の検査方法および検査用キット

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALVAREZ ANGELINA M. ET AL.: "Classification of rice allergenic protein cDNAs belonging to the alpha-amylase/trypsin inhibitor gene family", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1251, no. 2, 1995, pages 201 - 204, XP002955656 *
BARNES R.M.R. ET AL.: "Serum antibodies reactive with saccharomyces cerevisiae in inflammatory bowel disease: is IgA antibody a marker for Crohn's disease?", INT. ARCH. ALLERGY APL. IMMUNOL., vol. 92, 1990, pages 9 - 15, XP000979650 *
LAWRANCE IAN C. ET AL.: "Ulcerative colitis and Crohn's disease: distinctive gene expression profiles and novel susceptibility", HUMAN MOLECULAR GENETICS, vol. 10, no. 5, 2001, pages 445 - 456, XP002955653 *
REUMAUX DOMINIQUE ET AL.: "Distinct production of autoantibodies to nuclear components in ulcerative colitis and in Crohn's disease", CLINICAL IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY, vol. 77, no. 3, 1995, pages 349 - 357, XP002955655 *
See also references of EP1391462A4 *
VAN HILLE BENOIT ET AL.: "Cloning and tissue distribution of subunits C, D and E of the human vacuolar H+-ATPhase1", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 197, no. 1, 1993, pages 15 - 21, XP002955654 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006013661A1 (ja) * 2004-08-05 2006-02-09 Toagosei Co., Ltd. クローン病抗体エピトープペプチド及びクローン病の検査試薬
US7985831B2 (en) 2004-08-05 2011-07-26 Toagosei Co., Ltd. Crohn's disease antibody epitope peptide and reagent for testing Crohn's disease
JP2006308494A (ja) * 2005-04-28 2006-11-09 Ajinomoto Co Inc クローン病の診断方法
JP4577083B2 (ja) * 2005-04-28 2010-11-10 味の素株式会社 クローン病の診断方法
WO2010101255A1 (ja) * 2009-03-05 2010-09-10 味の素株式会社 クローン病診断試薬
JP5660027B2 (ja) * 2009-03-05 2015-01-28 味の素株式会社 クローン病診断試薬

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