WO2002070726A1

WO2002070726A1 - Procede de preparation de derives de propoxyaniline optiquement actifs

Info

Publication number: WO2002070726A1
Application number: PCT/JP2002/002054
Authority: WO
Inventors: Kouji Sato; Tsutomu Yagi; Kazuo Kubota; Akihiro Imura
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2001-03-07
Filing date: 2002-03-06
Publication date: 2002-09-12
Also published as: US7217560B2; KR100868619B1; KR20040007459A; US20040077060A1; CN100465286C; ATE439333T1; EP1367132A4; NO20033880L; CN1496409A; CA2440411A1; DE60233307D1; HK1063819A1; EP1367132B1; TWI311589B; NO20033880D0; ES2329554T3; EP1367132A1; JPWO2002070726A1; JP4169332B2

Description

明細書光学活性なプロポキシァニリン誘導体の製造方法技術分野

本発明は、抗菌性化合物の製造に有用な光学活性なプロポキシァニリン誘導体の製造方法とそのための中間体の製造方法に関する。背景技術

S一 (-) — 9一フルオロー 3—メチル _ 10— (4—メチル— 1—ピペラジニル) — 7—ォキソ一 2， 3—ジヒドロ一 7 H—ピリド [1， 2, 3 - - d e ] [1, 4] ベンゾォキサジン— 6—カルボン酸 (レポフロキサシン、 L VFX；特開昭 62- 252790号公報）は優れた合成抗菌剤として知られている。この合成抗菌剤の製造中藺体として式（V)

(式中、 X¹および X²は、各々独立してハロゲン原子を意味する。）で表される化合物（以下、化合物（V) と表し、他の番号で表される化合物も同様に表す。）は有用であり、下記の製法にて製造可能なことが知られている（特開平 1 - 250369号および特開平 2— 723号公報）。 OH ΟΊΉΡ

Me C0₂Me Me C0₂Me Me

(A) (B)

すなわち、化合物（V) は、市販の乳酸エステルの水酸基をテトラヒドロビラニル基で保護して得た化合物（A) を水素化リチウムアルミニウムにより還元して化合物（B) を得、この化合物（B) と化合物（C) とを水素化ナトリウムで処理して化合物（D) を得、その後、テトラヒドロピラエル基を除去し、ニトロ基を還元することにより、合成できる。

しかし、化合物（A) の原料である乳酸エステルのうち安価に入手容易なものでは光学純度が 97 %ee 程度であり、 99 ee 以上という高い光学純度を要求されるレボフロキサシンの原料としては不適当である。

そのため、乳酸エステルを用いない化合物（B) の別途製造方法も開発されている（特開平 2— 265701) 。また、還元に用いる水素化リチウムアルミ二ゥムは安全面より大量に取り扱うことは困難であった。さらに、上記の製造方法は比較的工程数が多かった。さらにまた、テトラヒドロピラエル基を除去する際にはラセミ化を伴なうことが報告されている（S. Ch l ade k, Ch em. I n d. (London), 1719 (1964))。

そのため、化合物（A) のテトラヒドロビラニル基をべンジル基とした化合物

((R) — 2—べンジロキシプロピオン酸エステル）の使用を検討した。しかし、従来は（R) — 2—べンジロキシプロピオン酸エステルとしては 9 7 % ee程度の光学純度のものしか入手できなかった。医薬としてのレポフロキサシンは 9 9 % ee 以上というさらに高い光学純度を要求されるのに対し、中間工程で光学純度を向上することが困難なため、 9 7 % ee 程度の（R ) — 2—べンジロキシプロピオン酸ェチルはレポフロキサシンの原料としては使用できなかった。

そこで、これらの課題を解決すべき方法の開発が望まれていた。

本発明の目的は、光学活性なプロポキシァニリン誘導体及び抗菌剤として有用なレポフロキサシンの安価で効率的な製造方法とそのための中間体の製造方法を提供することである。

さらに本発明は、エステル不斉加水分解能を有する微生物の菌体を、高圧下に破砕し、陰イオンクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、次いで陰ィォンクロマトグラフィ一で精製することにより得られるエステル不斉加水分解能を有する酵素を提供するものである。

発明の開示

本発明者らは鋭意検討した結果、ラセミ体である乳酸エステル誘導体をエステル不斉加水分解能を有する酵素等で処理することにより、一方の光学異性体のェステル部分を特異的に加水分解する方法を見出し、また、この加水分解により得られた化合物を中間体として用いることにより従来より安価かつ短工程で光学活性なプロボキシァ二リン誘導体が製造できることを見出した。また、エステル不斉加水分解反応により生じた不要な光学異性体をラセミ化によって基質に戻すリサイクル法も見出した。これらの知見により光学純度の高いレポフロキサシンが効率的に製造できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、式（I )

(式中、； ¹は炭素数 1から 6のアルキル基を意味し、； R²は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物を、エステル不斉加水分解能を有する酵素、またはエステル不斉加水分解能を有する微生物の培養液、該微生物菌体、もしくは該微生物菌体処理物で処理した後の反応液から単離採取することを特徵とする式（ I -a) （^I_^a)

(式中、 R¹はおよび R²は前記と同じ。）で表される光学活性な化合物の製造方法に係るものである。

また、本発明は、式（I)

(式中、 R^lおよび R²は前記と同じ。）で表される化合物を、エステル不斉加水分解能を有する酵素、またはエステル不斉加水分解能を有する微生物の培養液、該微生物菌体、もしくは該微生物菌体処理物で処理した後の反応液から単離採取して式（ I— a)

OR²

(I-a)

M& CO 'で R¹

(式中、 R¹および R²は前記と同じ。）で表される光学活性な化合物を得、この化合物 (I -a) を非アルコール系溶媒中、一級アルコール類存在下で、水素化ホウ素金属化合物で処理して式（I I)

(式中、 R²は前記と同じ。)

で表される光学活性な化合物を得、この化合物（I I) と式（I I I)

(式中、 X¹、 X²および X³は、各々独立してハロゲン原子を意味する。）で表される化合物を塩基で処理して、式（IV)

(式中、 R²、 X¹および X²は、前記と同じ。）で表される光学活性な化合物を得、二の化合物（I V) のニトロ基のアミノ基への変換と R²の脱離とを同時に行う二とを特徴とする式 (V)

(式中、 X¹および X²は、前記と同じ。）で表される化合物の製造方法に係るものである。

さらに本発明は、式（I)

(式中、 R¹は炭素数 1から 6のアルキル基を意味し、： ²は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物を、エステル不斉加水分解能を有する酵素、またはエステル不斉加水分解能を有する微生物の培養液、該微生物菌体、もしくは該微生物菌体処理物で処理した後の混合液から単離採取して式（ I— a)

(式中、 R¹及び R²は前記と同じ。）で表される光学活性な化合物を得、この化合物（I一 a) を非アルコール系溶媒中、一級アルコール類存在下で、水素化ホゥ素金属化合物で処理して式（I I)

(式中、 R²は前記と同じ。）

で表される化合物を得、この化合物 (I I) と、式（I I I)

(式中、 X¹、 X²および X³は、各々独立してハロゲン原子を意味する。）で表される化合物を塩基で処理して、式（I V)

(IV)

(式中、 R²、 X¹および X²は、前記と同じ。）で表される光学活性な化合物を得、この化合物（I V) のニトロ基のアミノ基への変換と R²の脱離とを同時に行つて、式（V)

(式中、 X¹および X²は、前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物 (V) に式（V I )

,COOR^J

γ一 CH=C、 (VI)

、COOR⁴

(式中、 Yは炭素数 1〜6のアルコキシ基、ハロゲン原子又はジ（一 C ₆アルキル）アミノ基を意味し、 R³および R⁴は各々独立して炭素数 1〜 6のアルキル基を意味する。）で表される化合物を反応させて、式（VI I)

(式中、 X¹、 X²、 R³および R⁴は前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（V I I) にスルホニル化合物を反応させて式（V I I I)

(式中、 R⁵は置換基を有していてもよいアルキルスルホニル基または置換基を有していてもよいァリールスルホニル基を意味し、 X¹、 X²、 R³および R⁴は前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（V I I I) を塩基条件下に閉環して式（I X)

(式中、 X¹、 X²、 R³および R⁴は前記と同じ。）で表される化合物を得、 .の化合物 (I X) をホウ素化合物の存在下又は非存在下に加熱して式 (X)

(式中、 R⁶は炭素数 1〜6のアルキル基、又は BZ₂ (ここで Zは、ハロゲン原子、 C,-C₆アルコキシ基、又は C₂— C₇アルキル力ルポ二ルォキシ基を示す）を示し、 X¹および X²は前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物

(X) に 4ーメチルピペラジンを反応させて式 (X I)

(式中、 X¹および R⁶は前記と同じ。）で表される化合物を得、次いで加水分解することを特徴とする、式（X I I)

(式中、 X¹は前記と同じ。）で表される化合物の製造方法に係るものである。さらに本発明は、エステル不斉加水分解能を有する微生物の菌体を、高圧下に破碎し、陰イオンクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、次いで陰ィォンクロマトグラフィーで精製することにより得られるエステル不斉加水分解能を有する酵素を提供するものである。発明を実施するための最良の形態

本発明は、化合物（I) をエステル不斉加水分解能を有する酵素、またはエステル不斉加水分解能を有する微生物の培養液、該微生物菌体、もしくは該微生物菌体処理物で処理した後の混合液から単離採取して得られた化合物（I一 a) を水素化ホウ素金属化合物で処理し、得られた化合物（I I) と化合物（I I I) とを塩基存在下で処理して得た化合物（I V) を還元反応により一工程で光学活性プロボキシァ二リン誘導体（V) に導き、当該化合物（V) から抗菌剤として有用な化合物（X I I) を製造するものである。

本発明による化合物（I) から化合物（X I I) への反応工程図を下記に示す。

(I) (I-a) (Π)

反応工程中の置換基について説明する。

X ¹、 X²および X³は、各々独立してハロゲン原子を意味するが、ハロゲン原子としてはフッ素原子が好ましい。

R R ³および; ⁴は、直鎖状、分岐状、環状のいずれをも含むアルキル基を意味するが、炭素数は 1から 6が好ましく、特にメチル基、ェチル基、イソブチル基が好ましい。

R ²は、水酸基の保護基を意味する。この保護基は、通常使用されるものであればよい。例えば、（置換）アルコキシカルボニル基類、（置換）ァラルキルォキシカルボニル基類、（置換）ァシル基類、（置換）アルキル基類、（置換）ァルケニル基類、（置換）ァラルキル基類、アルキル基あるいはァラルキル基（これらは、同一でも異なっていてもよい）によって置換された置換シリル基類である

〔本明細書において「（置換）」とは、「置換基を有していてもよい」との意味である。〕。具体的には、第三級ブトキシカルポニル基、 2 , 2 , 2—トリクロロェトキシカルポニル基等の（置換）アルコキシ力ルポニル基類；ベンジルォキシカルポニル基、パラメトキシベンジルォキシカルポニル基、パラニトロベンジルォキシカルポニル基等の（置換）ァラルキルォキシ力ルポニル基類；ァセチル基、メトキシァセチル基、トリフルォロアセチル基、クロロアセチル基、ビバロイル基、ホルミル基、ベンゾィル基等の（置換）ァシル基類；第三級ブチル基、ァリル基（プロぺニル基）、ベンジル基、パラニトロべンジル基、パラメトキシベンジル基、トリフエニルメチル基、フエネチル基等の（置換）アルキル基類、（置換）アルケニル基、または（置換）ァラルキル基類；メトキシメチル基、第三級ブトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、 2， 2 , 2—トリクロ口エトキシメチル基等のエーテル類；トリメチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、第三級プチルジメチルシリル基、トリベンジルシリル基、第三級プチルジフエ二ルシリル基等の置換シリル基類である。以上の保護基のうち、 R ²としては、還元条件で除去できるものが好ましく、具体的には（置換）ァラルキル基が好まし' く、さらにべンジル構造を有する（置換）ァラルキル基、特にべンジル基が好ましい。

R ⁵は、（置換）アルキルスルホニル基または（置換）ァリールスルホニル基を意味するが、炭素数 1〜6のアルキルスルホニル基または（置換）ベンゼンスルホニル基が好ましい。このうち、特にメタンスルホニル基、 p—トルエンスルホニル基が好ましい。

R ⁶は一 C ₆アルキル基、又は B Z ₂ (ここで Zはハロゲン原子、 C L— (：₆ァルコキシ基又は C ₂—C ₇アルキル力ルポニルォキシ基を示す）を意味する。炭素数 1〜 6のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、 t e r t一ブトキシ基等が挙げられる。ハロゲン原子としては、前記 X¹、 X²及び X ³と同じものが挙げられる。 C ₂—C ₇アルキルカルボニルォキシ基としては、ァセチルォキシ基、プロピオニルォキシ基、プチリルォキシ基等が挙げられる。このうち、 R ⁶としては B F ₂が特に好ましい。

Yは炭素数 1〜 6のアルコキシ基、ハロゲン原子又はジ（ーァルキル）アミノ基を意味するが、炭素数 1〜6のアルキコキシ基が好ましく、特にメトキシ基、エトキシ基が好ましい。

なお、上記工程図では片方の異性体のみの製法を示したが、化合物（I一 a) の立体配置が逆のものを使用すれば、もう一方の異性体も同様に合成することができる。また、化合物（I) を利用すれば、化合物（V) のラセミ体も得ることができる。

以下に、本願発明を各工程毎に詳細に述べる。

工程（a)

工程（a) は、化合物（I) を、エステル不斉加水分解能を有する酵素、またはエステル不斉加水分解能を有する微生物の培養液、該微生物菌体、もしくは該微生物菌体処理物にて処理することにより化合物（I _a) を得る工程である。まず、化合物（I) を適当な緩衝液に懸濁し、次いで酵素、微生物の培養液、該微生物菌体または該微生物菌体処理物を加え攙拌して処理する。反応に使用する酵素はエステル不斉加水分解能を有していれば特に限定されないが、酵素としては微生物、動物および植物由来の市販酵素製剤が挙げられる。

本発明に用いられる酵素としては、リパーゼが好ましい。リパーゼは固定化されたものでもよい。

また、微生物としては、クラドスポリゥム（Cladosporium)属、アブシディア

(Absidia)属、ナンニジァ（Nannizzia)属、ァスペルギルス（Aspergillus)属、リゾパス（Rhizopus)属、ムコール（Mucor)属等のカビ；ジゴァスカス（Zygoascus)属、キャンディダ（Candida)属、サッカロマイセス属（Saccharomyces)等の酵母；またはバチルス（Bacillus)属、マイクロパクテリゥム（Microbacteri画)属、マイクロコッカス（Micrococcus)属、シユードモナス（Pseudomonas)属、コリネバクテリウム（Corynebacterium)属、ストレプトマイセス（Streptomyces)属等の細菌が挙げられる。これらの微生物のうちでも細菌が好ましく、さらにバチルス（Bacillus) 属またはマイクロパクテリゥム（Microbacter ium)属が好ましく、さらにバチルスセレウス（Bacillus cereus)、またはマイクロバクテリゥムラエヴァニフォルマス（Microbacterium laevaniformas)が好ましく、特にバチルスセレウス DSC0007 (Bacillus cereus DSC0007)、バチルスセレウス ATCC14579 (Baci 1 lus cereus ATCC14579), またはマイクロパクテリゥムラエヴァニフォルマス IF0 14471 (Microbacterium laevaniformasIF0 471)が好ましい。

さらにこれらの微生物菌体処理物としては、微生物菌体破碎物及びそれらの精製品が挙げられる。

本発明においては、これらの微生物、特に細菌類の菌体から精製した酵素を用いるのが反応効率の点からより好ましい。このような精製酵素としては、菌体を、高圧下に破碎し、陰イオンクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、次いで陰イオンクロマトグラフィーで精製することにより得られるものが特に好ましい。なお、酵素の精製の程度は、所望の活性を示す程度でよい。

また、これらの精製酵素は、上記の如く菌体を処理して得られるものでもよく、さらに組換え D N A技術により大腸菌等の他の宿主で生産させたものでもよい。組換え DNA技術により酵素を得るには、例えば次の手順が挙げられる。まず、前記の精製酵素を逆相クロマトグラフィーでさらに精製して蛋白質のアミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸配列を基にプローブを作成し、菌体の DNA断片から不斉加水分解酵素の活性本体をコードする DNAをクローニングする。次いでこれを PCRで増幅し、組換えプラスミド調製し、大腸菌等への導入、当該大腸菌等を培養して目的酵素を得ることができる。

この処理によって、下記の化合物（I)

(式中、 R¹および R²は前記と同じ。）

のうちの一方の光学異性体のエステル部分が選択的に加水分解されて、化合物 (I一 b)

OR

Me' 、C0₂H

(式中、 R²は前記と同じ。）

が生成し、未反応の化合物 ( I一 a)

(式中、 R¹および R²は前記と同じ。）

が混合液から単離できる。すなわち、この混合液に酢酸ェチル、クロ口ホルム等の有機溶媒を加えて攪拌 ·分液等の処理をすることにより、化合物（I _a) を単離採取することができる。なお、処理に用いた酵素および菌体等は、化合物

(I -a) の抽出前に、濾過等により除いておくのがよい。

これらの加水分解及び単離の処理温度は、通常 5°Cから 6 Otの範囲であればよいが、好ましくは 20°Cから 40°Cの範囲である。また、処理液の pHは、 4 から 9の範囲であればよいが、好ましくは 6から 8の範囲である。処理時間は、 1時間から 7日間の範囲であればよいが、好ましくは 1時間から 30時間の範囲である。処理液中の化合物（I) の濃度は、通常は重量割合で 0. 1 %から 1 0%の範囲で行なうが、好ましくは 0. 5 %から 5 %の範囲である。酵素および微生物の培養液、該微生物菌体または該微生物菌体処理物の使用量は特に限定されないが、乾燥重量に基づいて、化合物（I) に対し重量比で 0. 05倍から0. 5倍が適当である。

また、反応混合物から分離された化合物 (I一 b) は、エステル化後ラセミ化反応に供し、さらにエステル不斉加水分解反応に付すことにより再利用できる。工程（b) 工程（b) は、化合物（I一 a) を非アルコール溶媒中、一級アルコール類存在下で、水素化ホウ素金属化合物で処理することにより化合物（I I) を得るェ程である。

水素化ホウ素金属化合物としては、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カルシウム、水素化ホウ素カリウム、水素化ホウ素亜鉛、水素化ホウ素マグネシウム、シァノ水素化ホウ素ナトリゥム等を挙げることができる。これらのうち、水素化ホウ素ナトリウムが好ましい。水素化ホウ素金属化合物の使用量は、化合物（I— a) に対して 1から 5倍モルの範囲でよく、好ましくは 1. 1から 2倍モル程度である。

溶媒としては、 n一へキサン、 n—ペンタン、シクロへキサン、シクロペン夕ン等の炭化水素系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒；ジェチルエーテル、ジイソプロピルエーテル ( I PE)、メチル第三級プチルェ一テル（MTBE)、テトラヒドロフラン（THF)、ジメトキシェタン、 1， 4—ジォキサン等のエーテル系溶媒；クロ口ホルム、塩化メチレン、 1， 2—ジクロロェタン（EDC) 等のハロゲン化炭化水素系溶媒が挙げられる。この他に、水、酢酸エステル類等を挙げることができる。これらの溶媒は単独でもよいが複数種を組み合わせてもよい。これらの溶媒のうち、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒が好ましい。

一級アルコール類は、特に限定されないが、メタノールが好ましい。一級アルコール類の使用量は、化合物（I一 a) に対して 3から 15倍モルの範囲でよく、好ましくは 4から 8倍モル程度である。

反応温度は使用する溶媒により異なるが、 — 78°Cから溶媒の沸点で、好ましくは 10 °Cから溶媒の沸点である。反応時間は 1から 24時間の範囲でよく、好ましくは 2から 16時間の範囲である。

工程（c)

工程（c) は、化合物（I I) を溶媒中、塩基存在下にて処理することにより化合物（I I I) を得る工程である。

溶媒は各種溶媒を使用することができ、例えば、 n—へキサン、 n—ペンタン等の炭化水素系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール（I PA)、 n ーブタノール、第三級ブ夕ノールのアルコール系溶媒；ジェチルエーテル、ジィソプロピルエーテル（I PE)、メチル第三級ブチルエーテル（MTBE：)、テトラヒドロフラン（THF；)、ジメトキシェタン、 1， 4一ジォキサン等のェ一テル系溶媒；ジメチルホルムアミド (DMF)、ジメチルァセトアミド (DMA c) 等のアミド系溶媒；クロ口ホルム、塩化メチレン、 1， 2—ジクロロェタン

(EDO 等のハロゲン化炭化水素系溶媒を挙げることができる。この他に、水、ァセトニトリル、酢酸エステル類、アセトン等を挙げることができる。これらの溶媒は単独でもよいが複数種を組み合わせてもよい。これら溶媒のうち、トルェン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒が好ましい。

反応温度は塩基の種類や使用する溶媒により異なるが、一 78°Cから溶媒の沸点で、好ましくは一 10°Cから溶媒の沸点である。

塩基としては、有機または無機のいずれであってもよく、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム等の水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびアルコキサイド等、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化リチウム等の金属水素化物、 n—プチルリチウム、メチルリチウム、リチウムジィソプロピルアミド等のアルキルリチウム試薬、トリェチルァミン、 N, N—ジィソプロピルェチルァミン等の三級ァミン類、その他、 1, 8—ジァザビシクロ [5. 4. 0] ゥンデセ一 7—ェン（DB

U)、 1， 8—ジァザビシクロ [4. 3. 0] ノン一 5—ェン（DBN)、ジメチルァニリン、 N—メチルモルフオリン等の複素環化合物を用いることができる。これらの塩基のうち、炭酸力リゥム等のアル力リ金属またはアル力リ土類金属の炭酸塩、または水酸化力リウム等のアル力リ金属またはアル力リ土類金属の水酸化物、または第三級ブトキシナトリウム、第三級ブトキシカリウム等のアルカリ金属アルコキサイドが好ましい。また、炭酸カリウム等のアルカリ金属またはァルカリ土類金属の炭酸塩および水酸化力リゥム等のアル力リ金属またはアル力リ土類金属の水酸化物を組み合わせて使用することもできる。塩基の使用量は通常、化合物（I I I) のモル数に対して 0. 1から 15倍モルの範囲でよく、好ましくは 1から 5倍モル程度である。

また、反応を促進させるためにテトラプチルアンモニゥムブロミド、ベンジルトリェチルアンモニゥムクロリド等の四級アンモニゥム塩ゃヨウ化カリウム、ョゥ化ナトリゥム等のアル力リ金属またはアル力リ土類金属のヨウ化物およびクラゥンエーテル等の存在下で行うこともある。

工程 (d)

工程（d) は、化合物（I V) のニトロ基のアミノ基への変換と R²の脱保護とを還元反応によって同時に行うことにより化合物（V) を得る工程である。

還元反応は、通常の水素添加法等により行うことができる。例えば、触媒存在下の接触水添法が挙げられるが、この方法に用いることのできる触媒としては、通常使用される金属触媒でよい。これらのうちで好ましくは、パラジウム—炭素、ラネーニッケル、ラネ一コバルトである。

溶媒は反応を阻害しないものであれば特に制限されないが、炭化水素系としては、 n—へキサン、 n—ペンタン、ベンゼン、トルエン、キシレン等が挙げられる。アルコール系としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール (I PA)、 n—ブタノ一ル、第三級ブタノ一ルが挙げられる。エーテル系としては、ジェチルエーテル、ジイソプロピルエーテル（I PE)、メチル第三級ブチルエーテル（MTBE)、テトラヒドロフラン（THF)、ジメトキシェタン、 1、 4一ジォキサン等が挙げられる。アミド系としてはジメチルホルムアミド（DMF)、ジメチルァセトアミド (DMA c) 等が挙げられる。ハロゲン化炭化水素系としては、クロ口ホルム、塩化メチレン、 1、 2—ジクロロエタン（E D C) 等が挙げられる。この他に、水、ァセトニトリル、酢酸エステル類、ァセトン等を挙げることができる。これらの溶媒は単独でもよいが複数種を組み合わせてもよい。これら溶媒のうち、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール（I P A) 等のアルコール系溶媒、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、またはこれらと水の混合溶媒が好ましい。

水素源としては、水素ガスのほかにギ酸アンモニゥムを使用することができる。ギ酸アンモニゥム量は、化合物（I V) のモル数に対して 1から 1 5倍モルの範囲でよく、好ましくは 2から 5倍モル程度である。

反応温度は塩基の種類や使用する溶媒により異なるが、一 7 8 °Cから溶媒の沸点で、好ましくは室温から 8 0 °Cである。反応時間は 1から 2 4時間の範囲でよく、好ましくは 2から 1 6時間の範囲である。

工程（e )

工程 ( e ) は、化合物 (V) に式 (V I ) のメチレンマロネート化合物を反応せさて化合物（V I I ) を得る工程である。

用いるメチレンマロネート化合物 (V I ) としては、ジェチルエトキシメチレンマ口ネート、ジメチルメトキシメチレンマロネート等が挙げられる。

この反応は、例えば化合物 (V) に対して好ましくは等モル以上のメチレンマロネ一ト化合物（V I ) を用い、無溶媒で両者を 1 0 0〜1 8 0 °C程度に加熱攪拌するか、適当な溶媒中で加熱還流することによつて実施できる。

この際の溶媒としては、反応に対して悪影響を与えないものならば特に限定されず、例えばベンゼン、トルエン、キシレン、 n—へキサン、サイクロへキサン、 n _ペンタン等の炭化水素類；メタノール、エタノール、プロパノール類；ブタノール類等の低級アルコール類；ジェチルエーテル、テトラハイドロフラン、ジォキサン、 1， 2—ジメトキシェタン等のエーテル類； N， N—ジメチルホルムアミド、 N, N—ジメチルァセトアミド、 N—メチルー 2—ピロリドン等のアミド類；ジメチルスルホキサイド、スルホラン等の非プロトン性極性溶媒等を挙げることができる。溶媒を使用する場合には、反応は溶媒の沸点以下の温度で実施すればよい。

工程（ f )

工程（ί) は、化合物（V I I) にスルホニル化合物を反応させて化合物（V I I I) を得る工程である。

用いるスルホニル化合物としては ρ—トルエンスルホニルクロリド、メタンスルホニルクロリド、クロロメタンスルホニルクロリド等が挙げられる。

反応は塩基の存在下に行うのが好ましく、当該塩基としては、トリェチルアミン、卜リブチルァミン、 Ν, Ν—ジィソプロピルェチルァミン等の三級アルキルアミン類； Ν， Ν—ジメチルァニリン、 Ν, Ν—ジェチルァニリン等のジアルキルァニリン類；ピリジン、 Ν, Ν -ジメチルァミノピリジン、 Ν—メチルモルホリン等の複素環ァミン類； 1, 8—ジァザビシクロ [5， 4, 0] ゥンデセン等を例示することができる。

溶媒を使用する場合は、非プロトン系の溶媒が望ましく、ジェチルエーテル、テトラハイドロフラン、ジォキサン、 1， 2—ジメトキシェタン等のエーテル類； Ν， Ν—ジメチルホルムアミド、 Ν, Ν—ジメチルァセトアミド、 Ν—メチルー 2—ピロリドン等のアミド類；ジクロロメタン、クロ口ホルム、 1 , 2—ジクロ口エタン等を例示することができる。反応温度は 0〜100°C程度が好ましい。

工程（g)

工程（g) は、化合物（V I I I) を塩基条件下に閉環させて化合物（I X) を得る工程である。

用いる塩基としては無機塩基、有機塩基の何れでもよく、無機塩基としては水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の金属水酸化物、炭酸リチゥム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の金属炭酸塩類；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の金属炭酸水素塩類を挙げることができる。有機塩基としてはトリエチルァミン、トリプチルァミン、 N, N—ジィソプロピルェチルァミン等の三級アルキルアミン類； N， N—ジメチルァニリン、 N, N—ジェチルァニリン等のジアルキルァニリン等、ピリジン、 N, N—ジメチルァミノピリジン、 N—メチルモルホリン等の複素環ァミン類；ナトリウムメトキサイド、ナトリウムェトキサイド、ナトリウムイソプロポキサイド、カリウム第三級プトキサイド等の金属アルコキサイド等、この他 1， 8—ジァザビシクロ [ 5， 4 , 0 ] ゥンデセン、 N—ベンジルトリメチルアンモニゥム八ィドロキサイド等を例示することができる。

反応溶媒としてはメタノール、エタノール、プロパノール類；ブタノール類等の低級アルコール類；ジェチルエーテル、テトラ八ィドロフラン、ジォキサン、 1 , 2—ジメトキシェタン、 2—メトキシェチルエーテル、エチレングリコール ·ジェチルエーテル等のエーテル類； N, N—ジメチルホルムアミド、 N, N ージメチルァセトアミド、 N, N—メチル一 2—ピロリドン等のアミド類；ジメチルスルホキサイド、スルホラン等の非プロトン性極性溶媒等を挙げることができる。

反応温度は室温から 1 5 O tの範囲で実施すればよい。

また、この閉環反応では反応促進剤としてヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、クラウンエーテル等をプロポキシベンゼン化合物に対して 1 / 2 0当量またはそれ以上を加えるのが有効なことである。

工程 ( h )

工程 ( h ) は、化合物 ( I X) をホウ素化合物の存在下又は非存在下に加熱して化合物（X) を得る工程である。

反応をホウ素化合物の非存在下に行えば、式（X) 中、 R⁶が C ₆ァルキル基である化合物が得られる。一方、反応をホウ素化合物の存在下に行えば、式

(X) 中、 R⁶が B Z ₂である化合物が得られる。ホウ素化合物としては、具体的には、三フッ化ホウ素 'テトラヒドロフラン錯体、三フッ化ホウ素 .ジェチルェ一テル錯体等が挙げられる。

ホウ素化合物の非存在下の反応は、ポリリン酸等の溶媒中で 1 0 0 〜 2 0 0 °Cに加熱して行うのが好ましい。ホウ素化合物の存在下の反応は、無水酢酸、無水プロピオン酸等の溶媒中で、三フッ化ホウ素 ·テトラヒドロフラン錯体、三フッ化ホウ素 ·ジェチルェ一テル錯体等を加えて 1 5 0 °C〜2 0 O tに加熱して行うのが好ましい。

工程（ i )

工程 ( i ) は、化合物 (X) に 4ーメチルピペラジンを反応させて化合物 (X I ) を得る工程である。なお、式（X) 中の R⁶が C _t一 C ₆アルキル基である場合は、塩基性または酸性条件下で加水分解してカルボン酸にしてから 4—メチルピぺラジンを反応させるのが好ましい。

反応は塩基の存在下に行うのが好ましい。この塩基は無機塩基でも、有機塩基でもよく、無機塩基としては、アルカリ金属、もしくはアルカリ土類金属の炭酸塩、炭酸水素塩等を挙げることができる。有機塩基としてはトリアルキルアミンや含窒素複素環化合物を挙げることができる。具体的には、トリェチルァミン、トリプチルァミン、ェチルジィソプロピルァミン等、また、 4一メチルモルホリン、ジメチルァミノピリジン等、さらには 4ーメチルピペラジンを過剰量使用して塩基と兼用させてもよい。この反応は、溶媒、例えばジメチルスルホキシドを使用することができる。

工程（ j )

工程（j ) は、化合物（X I ) を加水分解して化合物（X I I ) を得る工程である。

この加水分解反応は、例えば、塩基存在下でプロトン性溶媒中加熱することにより行うことができる。例えば、アルコール溶媒中、トリアルキルアミン存在下に加熱する条件を例示することができるが、具体的にはエタノール中、トリェチルァミンの存在下に加熱攪拌すればよい。式（X I I) 中、 X¹がフッ素原子である化合物がレポフロキサシンである。実施例

以下、実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

なお、得られた化合物の光学純度（％e e) は、 HPLCまたは GCに付して測定した。

得られた化合物の絶対配置は、別途合成した絶対配置が既知のサンプルと比較して決定されたものである。

実施例 1 ： (R) 一 2—ベンジロキシプロピオン酸ェチル

2—ベンジロキシプロピオン酸ェチル（30 Omg) を 0. 1Mリン酸緩衝液 (ρΗ6. 5) (30m l ) に懸濁し、リパーゼ F i n e G r a d e (生化学工業社製、リゾパスデレマー； 6mg) を加え 30°Cにて 24時間攪拌した。反応液に酢酸ェチルを加え、セライトろ過により変性蛋白質を除去し、更に 1N 水酸化ナトリウム水溶液にて PH 7. 0に調整後、分液抽出した。有機層を 5% 炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒留去することにより、油状の標題化合物（102 mg、 98. 8 % e e) を得た。 Ή-NMR (CDC 1₃) δ ： 1. 30 (3 Η, t , J = 6. 8Hz), 1. 4 4 (3H, d， J = 6. 8Hz), 4. 05 ( 1 H, q, J = 6. 8Hz), 4. 2 2 (1H, q, J = 6. 8Hz)， 4. 23 ( 1 H, q, J = 6. 8 H z), 4. 45 ( 1H, d， J = 1 1. 7 Hz)， 4. 67 ( 1 H, d， J = 1 1. 7 H z) 7. 23 - 7. 42 (5H， m)

実施例 2 ： (R) 一 2—ベンジロキシ一 1—プロパノール

40°Cにて、水素化ホウ素ナトリウム（21. 8mg) をトルエン 0. 8m l に懸濁し、その溶液に実施例 1で得た（R) — 2—ベンジロキシプロピオン酸ェチル（100mg、 98. 8 % e e) のトルエン溶液（0. 8m l ) を加えた。反応液に MeOH (0. 15ml) を加え、そのままの温度にて 3時間攪拌した。反応液に水を加え、トルエンにて抽出した。有機層を水、飽和塩化アンモニゥム水溶液にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。溶媒留去後、得られた残渣をシリカゲル力ラムクロマトグラフィーに付し、油状物質として標題化合物

(79mg、 99%e e) を得た。

Ή-NMR (CDC 1₃) δ ： 1. 1 7 (3Η, d, J = 6. 3Hz), 2. 2 0 (1H, b s)， 3. 43— 3. 72 (3H, m)， 4. 48 ( 1 H, d， J = 11. 7Hz), 4. 64 (1H, d, J = 11. 7Hz)， 7. 22— 7. 44

(5H， m)

参考例 1 , マイクロバクテリゥムラエヴァニフォルマス (Microbacterium laevaniformas)IFO 14471 の種菌を普通ブイヨン培地 100 ml (坂口フラスコ）に接種し、 30°Cで一晩振とう培養した。遠心分離により集菌後、凍結乾燥し IF0 14471の凍結乾燥菌体を得た。

実施例 3 ： (R) — 2 _ベンジロキシプロピオン酸ェチル

2—べンジロキシプロピオン酸ェチル 2. 0 g (9. 6 mm o 1 ) を 0. 1M リン酸塩緩衝液（PH7. 0) 100mlに懸濁し、参考例 1にしたがつて調製した I F O 14471の凍結乾燥菌体 100 mgを加え 30 °Cで攪拌した。反応の進行に伴い（カルボン酸の生成により） pHが低下するので、 1N水酸化ナトリウムを加え系内の pHを 6. 8から 7. 2の間に保った。 14時間反応後、酢酸ェチル 100mlを加え暫く攪拌した後、セライト濾過により菌体を除いた。分液後、更に酢酸ェチル 100mlで抽出を行った後、酢酸ェチル層を集め 5 % 重曹水で 2回洗浄して完全にカルボン酸を除去した。有機層を乾燥後、溶媒を溜去することにより標題化合物を 0. 93 g (46. 5%、 99. 9%e e) 得た。

— NMRは実施例 1と一致した。

実施例 4 ： (R) 一 2一べンジロキシプロピオン酸ェチル 2—べンジロキシプロピオン酸ェチル 2. 0 g (9. 6mmo 1 ) を 0. 1M リン酸塩緩衝液（pH7. 0) 100mlに懸濁し、参考例 1と同様の方法で調製した ATCC 14579の凍結乾燥菌体 10 Omgを加え 30°Cで攪拌した。反応の進行に伴い（カルボン酸の生成により） pHが低下するので、 1N水酸化ナトリゥムを加え系内の p Hを 6. 8から 7. 2の間に保った。 16時間反応後、酢酸ェチル 10 Omlを加え暫く攪拌した後、セライト濾過により菌体を除いた。分液後、更に酢酸ェチル 100mlで抽出を行った後、酢酸ェチル層を集め 5 % 重曹水で 2回洗浄して完全にカルボン酸を除去した。有機層を乾燥後、溶媒を溜去することにより標題化合物を 0. 88 g (44. 0 %, 99. 9 % e e ) 得た。

— NMRは実施例 1と一致した。

実施例 5 ： 2一べンジロキシプロピオン酸ェチル（ラセミ化工程）

実施例 3で酢酸ェチルによる抽出操作の際のすべての水層を集め 10%塩酸により PH2に調整した後、酢酸ェチル 10 Omlで 2回抽出した。有機層を乾燥後、溶媒を溜去して（S) —べンジロキシプロピオン酸を 0. 83 g (48.

0 %, 96 % e e) 得た。そのうちの 0. 8 g (4. 4mmo 1 ) をエタノール

10mlに溶解し、濃硫酸 0 lml加えて加熱還流した。 8時間後、溶媒を溜去により除き残渣を酢酸ェチル 2 Om 1で抽出した。 5%重曹水（10m l) 及び水（10ml) で洗浄した後、有機層を乾燥後溶媒を溜去して（S) —ベンジロキシプロピオン酸ェチルを得た。これをトルエン 10mlに溶解し氷冷攪拌下、ナトリウムエトキシド 0. 33 g (1. 1 e q) を加え室温で 14時間攪拌し、光学活性カラムを用いたガスクロマトグラフィーを用いてラセミ化反応終了を確認した。その後、反応液を 10%クェン酸水溶液（10ml) 中に滴下した。有機層を水 1 Omlで洗浄し乾燥後、溶媒を溜去することにより、標題化合物を

0. 74 g得た。 — NMRは実施例 1と一致した。このラセミ体は、実施例

1〜 4のようなエステル不斉加水分解の原料として用いることができる。

比較例 1 ： (R) 一 2一べンジロキシプロピオン酸メチル _ 30°Cにて、ベンジルブロマイド（9. 86 g) および 60%水素化ナトリゥム（2. 1 1 g) のジメチルホルムアミド（DMF) およびテトラヒドロフラン（THF) の混合溶液（50m l、 3 ： 2容積比）に溶解した。その溶液に (R) 一乳酸メチル（5. 0 g、 99%e e) を加えた。そのままの温度にて、 30分間攪拌した。次いで、室温にて 30分間攪拌し、さらに 50°Cにて 30分間攪拌した。反応液に水、ジィソプロピルェ一テルを加え、有機層を水にて洗、净後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。溶媒留去後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、黄色油状物質として標題化合物（8. 87 g, 92. 1 % e e) を得た。

Ή-NMR (CDC 1₃) δ ： 1. 44 (3H， d， J = 6. 8Hz), 3. 7 5 (3H, s)， 4. 0 7 (1H， q, J = 6. 9Hz), 4. 45 ( 1 H, d， J = 1 1. 7Hz), 4. 69 (1H, d， J = 1 1. 7Hz), 7. 22-7. 37 (5H， m)

実施例 6 ： (R) 一 3, 4—ジフルオロー 2— (2—べンジロキシプロボキシ) ニトロベンゼン

氷冷下、水酸化カリウム（5. 40 g) および炭酸カリウム（3. 33 g) をトルエン 1 8 0m lに懸濁した。その溶液に、実施例 2と同様にして得られた

(R) _ 2 _ベンジロキシ— 1一プロパノール（4. 0 g) および 2, 3, 4一トリフルォロニトロベンゼン（4. 1 3 g) のトルエン溶液（40m 1 ) を加え、そのままの温度にて 1時間攪拌した。反応液に水を加え、トルエンにて抽出した。有機層を水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。溶媒留去後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、黄色油状物質として標題化合物（7. 55 g) を得た。

Ή一 NMR (CDC 1₃) 6 : 1. 2 9 (3H, d, J = 6. 4Hz)， 3. 9

3-4. 03 (2H, m), 4. 53 -4. 65 (2H, m), 6. 9 0 - 6. 9

9 (1H, m)， 7. 23 - 7. 35 ( 5 H, m) , 7. 60 - 7. 6 6 ( 1 H, m)

実施例 7 ： (R) 一 3,—4—ジフルオロー 2— (2—べンジロキシプロボキシ) 氷冷下、ターシャルブトキシナトリウム (63. 6mg) をトルエン (0. 5 ml) に懸濁した。その溶液に、実施例 2と同様にして得られた（R) — 2_ベンジロキシー 1一プロパノール（l O Omg) 加えた。次いで、氷冷下、その溶液を 2, 3, 4 _トリフルォロニトロベンゼン（103. 5mg) のトルエン溶液（0. 5m l) へ加え、 1時間攪拌した。反応液に水を加え、トルエンにて抽出した。有機層を水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。溶媒留去後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、黄色油状物質として標題化合物（161. 2mg) を得た。なお、スペクトルデータは実施例 6で得たものと一致した。

実施例 8 ： (R) -3, 4—ジフルオロー 2 - (2—ヒドロキシプロボキシ）ァ二リン

室温にて、実施例 6で得られた（R) — 3， 4ージフルオロー 2— （2—ベンジロキシプロポキシ）ニトロベンゼン (1. 0 g) をエタノール (10m l) に溶解し、 7. 5%Pd-C (1. 0 g) を加え、水素雰囲気下、 6時間攪拌した _c Pd_Cを濾去後、得られた濾液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲル力ラムクロマトグラフィーに付し、油状物質として標題化合物（600mg、 99. 0%e e) を得た。

Ή-NMR (CDC 1₃) 23 ( 3 H, d, J = 6. 3Hz), 3. 8

1-4. 89 (1H, m)， 4. 06-4. 17 (2H, m)， 6. 37— 6. 4 4 (1H， m)， 6. 77 - 6. 87 (1 H， m)

実施例 9 ： (R) 一 3， 4ージフルオロー 2— （2—ヒドロキシプロボキシ）ァニリン

室温にて、実施例 6で得られた（R) — 3， 4—ジフルオロー 2— (2—ベンジロキシプロポキシ）ニトロベンゼン（0. 3 g) をトルエン（3ml) に溶解し、 10%Pd— C (9 Omg) を加え、 80°Cにて水素雰囲気下、 4時間攪拌した。 Pd— Cを濾去後、得られた濾液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、油状物質として標題化合物（181. 0 mg、 99. 0%e e) を得た。スペクトルデータは実施例 8で得たものと一致した。

実施例 10 ： 2, 3—ジフルオロー 6— (2, 2—ジエトキシカルボ二ルェテ二ル）アミノー [(R) — 2—ヒドロキシプロボキシ] ベンゼン

100°Cにて、実施例 8と同様にして得られた（R) — 3， 4ージフルオロー 2- (2—ヒドロキシプロボキシ）ァニリン（1. 02 g) およびジェチルエトキシメチレンマロネート（1. 14g) を無溶媒にて 1時間攪拌した。さらに微減圧にて発生するエタノールを除去しながら 30分間攪拌した。反応混合物を放冷後、減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、標題化合物（1. 83 g， 99. 0%e e) を白色結晶として得た。

融点： 52— 55 °C

一 NMR (270 MHz, CDC 1₃) δ ： 1. 22— 1. 46 (m， 9H),

3. 55 (d, 1H, J = 4. 5Hz)、 3. 88— 4. 43 (m, 7H), 6.

75 - 7. 08 (m, 2H), 8. 48 (d, 1 H, J = 14. 5Hz)

実施例 1 1 ： 2, 3—ジフルオロー 6— （2， 2—ジエトキシカルポ二ルェテ二ル）ァミノ— [(R) — 2— (メタンスルホニルォキシプロピル) ォキシ] ベンゼン

実施例 10と同様にして得られた 2， 3ージフルオロー 6 - (2， 2 -ジエトキシカルポ二ルェテニル) アミノー [(R) — 2— (ヒドロキシプロピル) ォキシ] ベンゼン 3. 008を1， 2—ジクロロェタン 3 Om 1に溶解し、氷冷撹拌下にトリェチルァミン 0. 98 gを加え、さらに同温度でメタンスルホニルクロライド 1. O l gを撹拌下に加えた。室温で 2時間撹拌して不溶物を濾去した。濾液を 1， 2—ジクロロェタンにて希釈し水洗後無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥した有機層にシリカゲル 1. 5 gをカロえ、 30分間撹拌した後、不溶物を濾去した。溶媒を減圧留去し、残渣をジイソプロピルエーテルより結晶化後濾取した。標記の化合物 3. 27 gを得た。

一 NMR (CDC 1₃) δ ： 1. 22- 1. 47 (6H， m), 1. 58 (3 H, d， J = 7 H z ), 1. 50 (3H, d, J = 7Hz), 3. 13 (3 H, s)， 3. 98 -4. 60 (6H， m), 4. 95 - 5. 35 ( 1 H, m)， 6. 79-7. 14 (2H, m), 8. 41 ( 1 H， d, J = 13. 5Hz)

実施例 12 ： (S) ージェチル（7， 8—ジフルオロー 3—メチル— 3, 4—ジヒドロ— 2H— [1， 4] ベンゾォキサジン— 4 _ィル) メチレンマロネート実施例 1 1で得られた 2， 3—ジフルオロー 6— (2, 2 _ジェトキシカルボ二ルェテニル) アミノー [(R) - 2- (メタンスルホニルォキシプロピル) ォキシ] ベンゼン 3. 00 gを無水 DMF、 15m 1に溶解し、炭酸カリウム 0. 92 gを加え、 80°Cで 2時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残'渣を酢酸ェチルで抽出し、抽出液を水洗して無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、標記の化合物 2. 14 gを得た。

^XH-NMR (CDC 1₃) δ ： 1. 22— 1. 42 (9H, m)， 3. 90-4.

44 (7H, m), 6. 74- 6. 88 (2H, m), 7. 78 ( 1 H, s) 実施例 13 ： (3 S) -9, 10—ジフルオロー 3—メチル一 7—ォキソ一 2，

3—ジヒドロー 7 H—ピリド [1, 2, 3— d e] [1, 4] ベンゾォキサジン

- 6一力ルボン酸ポロンジフルオリドキレート錯体

実施例 12で得られた（ S ) —ジェチル (7, 8—ジフルオロー 3—メチル

—3， 4—ジヒドロ一 2 H— [1, 4] ベンゾォキサジン _ 4一ィル）メチレンマロネート（2 g) および無水酢酸（2ml) を混合して 140°Cにて 47 %三フッ化ホウ素 'テトラヒドロフラン錯体（0. 8m l ) を加え、そのままの温度で 1時間加熱攪拌した。生成する低沸点物を留去した後に反応液を室温までに冷却する。反応混合物にアセトン（10ml) を加えてそのままの温度で 30分攪拌した。析出した結晶を集めてアセトンで洗浄し、標記の化合物 1. 55 gを得た。

実施例 14 ： (3 S) - (一） — 9—フルオロー 3—メチルー 10— (4—メチルー 1ーピペラジニル) 一 7—ォキソ _2， 3—ジヒドロ一 7H—ピリド [1, 2, 3 - d e ] [1， 4] ベンゾォキサジン一 6—力ルボン酸（レポフロキサシン）

実施例 13で得られた (3 S) -9, 10—ジフルオロー 3—メチルー 7—才キソー 2, 3—ジヒドロ一 7H—ピリド [1， 2, 3 - d e] [1， 4] ベンゾォキサジン一 6—力ルボン酸ボロンジフルオリドキレート錯体 (31 Omg) をジメチルスルホキシド (6m l ) に溶解し、トリェチルァミン (0. 32ml) および N—メチルピペラジン (0. 13ml) を加え、室温で 17時間攪拌した後減圧乾固した。残留物をジェチルエーテルで洗浄した後、トリェチルァミン

(0. 5ml ) を含む 95 %エタノール（20m 1 ) に溶解して 8時間加熱還流した。冷後減圧乾固して得た残留物を、希塩酸（5%) に溶解してクロ口ホルムと振り分け、水層を水酸化ナトリウム（Imo lZ l) で pHl lとし、次いで塩酸（lmo l/l) で pH7. 4に調整した。これをクロ口ホルム（ 50 m 1 X 3) で抽出して芒硝乾燥後クロ口ホルムを留去し、得た粉末をエタノールージェチルエーテルより再結晶し、透明微針晶の標記の化合物 12 Omgを得た。融点： 225〜 227 °C (分解）

元素分析： C₁₈H₂。FN₃〇₄ · 1/2H₂〇として；

計算値： C, 58. 37 ； H, 5. 72 ； N, 11. 35 分析値： C， 58. 17 ； H, 5. 58 ； N, 1 1. 27 実施例 15

(1) 菌体破砕（フレンチプレス） ATCC 14579の坂口培養菌体（培地量 1200m l) を 20mMリン酸緩衝液 8 Om l (pH 7. 0，含 1 mM EDTA, DTT) に懸濁し、フレンチプレスにて 15000 p s iの圧力をかけて菌体を破碎した。

破碎した菌体を遠心分離機（10, 000 G， 30m i n) にて遠心分離することにより、菌体抽出液 85. 0ml (総活性 123 u n i t, 比活性 0. 03 2 u n i t/mg) を得た。菌体抽出液を下記の陰イオンクロマト精製条件にて分画した。各画分につき 2 一べンジロキシプロピオン酸ェチルの加水分解活性を測定し、活性画分 206m 1 (総活性 88 u n i t , 比活性 0. 058un i tZmg，活性収率 72%) を得た。

陰イオンクロマトグラフィ一精製条件

担体； S ou r c e Q (ファルマシアバイォテク) 400ml

カラム； 5 Ommx 20 OmmH

移動相； A液： 2 OmMリン酸緩衝液 pH7. 0 (含 1 mM EDTA, DT

T) 900ml

Β液： Α液 +1. OM NaC 1 90 Oml

A→B l i ne r g r ad i en t

検出； 280 nm, 温度； 4°C

15分毎に画分分取、 2一べンジロキシプロピオン酸ェチルの加水分解反応

(3) 疎水クロマトグラフィー

陰イオン交換カラム活性画分 206mlに硫酸アンモニゥム 54. 4g (2.

0M相当）を少量ずつ添加し、 30分攪拌後、生じた沈殿物を遠心分離（10，

000 G, 3 Om i n) にて除去した。得られた上清を下記の疎水クロマトダラフィ一精製条件にて分画した。各画分につき 2—べンジロキシプロピオン酸ェチルの加水分解活性を測定し、活性画分（251— 308m i n) を見出した。分取した活性画分を限外ろ過にて脱塩濃縮し、活性本体画分 1. 0ml (総活性 1 6. 8 un i t，比活性 3. 23 un i t/mg, 活性収率 19%) を得た。疎水クロマトグラフィ一精製条件

担体； Re s ou r c e ETH (フアルマシアバイオテク) 100ml カラム； 45mmX 6 OmmH

移動相； A液： 2 OmMリン酸緩衝液 pH 7. 0 (含 1 mM EDTA, DT

T) 600ml

B液： A液 +2. 0M硫安 600ml

B→A l i ne r g r ad i en t

検出'； 280 nm, 温度； 4°C

7分毎に画分を分取、 2—べンジロキシプロピオン酸ェチルの加水分解反応実施 (4) 陰イオンクロマトグラフィー（Mono Q)

疎水クロマトグラフィー活性画分 1. 0m lを陰イオンクロマトグラフィー (Mono Q) にて分画した。各画分につき 2—べンジロキシプロピオン酸ェチルの加水分解活性を測定し、活性画分（23— 25m i n) を見出した。分取した活性画分を限外ろ過にて脱塩濃縮し、活性本体画分 1. 0ml (総活性 5.

9 un i t, 比活性 4. 54un i t/mg, 活性収率 35 %) を得た。この活性本体の分子量は、約 38, 000 (SDS PAGE)、約 40， 000 (ゲル濾過）であった。

陰イオンクロマトグラフィー（Mono Q) 精製条件

カラム；陰イオン交換カラム Mo n o Q lm l

ク）

移動相； A液： 20 mMリン酸緩衝液（p H 7. 0 )

B液： A液 + 1. 0M NaC 1

A→B l i n e r g r ad i en t 流速； 1 . 0 m l /m i n .

検出； 2 8 0 nm, 温度； r t

1分毎に画分分取、 2 - オン酸ェチルの加水分解反応実施

表 ATCC14579単離精製結果

総活性比活性活性収率

(mg) (uni ) (unit/mg) (%)

抽出液 3893 123 0.032 100

陰イオンクロマ卜 1508 88 0.058 72 疎水クロマト 5.2 16.8 3.23 14

Mono Q 1.3 5.9 4.54 4.8 得られた微生物由来精製酵素を用いて実施例 1、 2、 3及び 4と同様にエステル不斉加水分解反応を行ったところ、光学純度 9 9 % ee 以上の（R) — 2—べ：ォン酸ェチルが効率良く得られた。

産業上の利用可能性

本発明方法によれば、安価でかつ短工程で光学純度の高い、光学活性プロポキシァニリン誘導体（V) が得られ、これにより抗菌剤として有用な光学純度の高いレポフロキサシンが工業的に有利に得られる。

Claims

請求の範囲式（I )

(り

(式中、 R¹は炭素数 1から 6のアルキル基を意味し、 R²は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物を、エステル不斉加水分解能を有する酵素、またはエステル不斉加水分解能を有する微生物の培養液、該微生物菌体、もしくは該微生物菌体処理物で処理した後の混合物から単離採取することを特徴とする式（ I 一 a )

(式中、 R¹及び R²は前記と同じ。）で表される光学活性な化合物の製造方法。

2 . R²が置換基を有していてもよいァラルキル基である請求項 1記載の製造方法。

3 . R²がべンジル基である請求項 1または 2記載の製造方法。

4. R¹がェチル基である請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の製造方法。

5 . 酵素がリバ一ゼである請求項 1〜4のいずれか 1項記載の製造方法。

6 . 微生物が細菌である請求項 1〜4のいずれか 1項記載の製造方法。

7 . 細菌が、バチルス（Baci l lus)属、マイクロパクテリゥム（Microbacter i霞）属、マイクロコッカス属、シユードモナス（Pseudomonas)属、コリネバクテリウム（Corynebac teriumu)属、およびストレブトマイセス（S treptomyces)属からなる群から選ばれるものである請求項 6記載の製造方法。

8 . 細菌が、ノチルス（Bac i 1 lus)属またはマイクロバクテリゥム (Microbacteri腿)属であるものである請求項 6記載の製造方法。

9. 細菌が、バチルスセレウス（Bacillus cereus)、またはマイクロバクテリウムラエヴァニフォルマス（Microbacterium laevaniformas)である請求項 6 記載の製造方法。

10. 細菌が、バチルスセレウス DSC0007 (Bacillus cereus DSC0007)、バチルスセレウス ATCC14579 (Bacillus cereus ATCC14579), またはマイクロバクテリウムラエヴァニフォルマス IF014471 (Microbacterium laevani formasIF0144 71)である請求項 6記載の製造方法。

11. 酵素が、エステル不斉加水分解能を有する微生物の菌体を、高圧下に破砕し、陰イオンクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、次いで陰イオンク口マトグラフィ一で精製することにより得られるエステル不斉加水分解能を有する酵素である請求項 1〜 4のいずれか 1項記載の製造方法。

12. 式（I) . (り

(式中、 R¹は炭素数 1から 6のアルキル基を意味し、 R²は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物を、エステル不斉加水分解能を有する酵素、またはエステル不斉加水分解能を有する微生物の培養液、該微生物菌体、もしくは該微生物菌体処理物で処理した後の混合液から単離採取して式（ I一 a) ( ）

(式中、 R²は前記と同じ。)

で表される化合物を得、この化合物（I I ) と、式（I I I )

(式中、 X¹、 X²および X³は、各々独立してハロゲン原子を意味する。）で表される化合物とを塩基存在下で処理して、式（I V)

(式中、 R²、 X¹および X²は、前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（I V) のニトロ基のアミノ基への変換と R²の脱離とを同時に行うことを特徴とする式（V)

(式中、 X¹および X²は、前記と同じ。）で表される化合物の製造方法。

13. 式（ I V) (IV)

(式中、 X¹および X²は、各々独立してハロゲン原子を意味する。 R²は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物のニト口基のアミノ基への変換と R²の脱離とを同時に還元条件下で行い、式（V)

(_v)

(式中、 X¹および X²は、前記と同じ。）で表される化合物を得ることを特徴とする請求項 1 2記載の製造方法。

14. 非アルコール系溶媒が芳香族炭化水素である請求項 1 2または 1 3記載の製造方法。

15. 一級アルコール類がメタノールである請求項 1 2〜1 4のいずれか 1項記載の製造方法。

16. 水素化ホウ素金属化合物が水素化ホウ素ナトリウムである請求項 1 2〜1 5のいずれか 1項記載の製造方法。

17. R²が置換基を有していてもよいァラルキル基である請求項 1 2〜1 6のいずれか 1項記載の製造方法。

18. R²がべンジル基である請求項 1 2〜 1 7のいずれか 1項記載の製造方法

19. 式（I )

(式中、は炭素数 1から 6のアルキル基を意味し、 R² は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物を、エステル不斉加水分解能を有する酵素、またはエステル不斉加水分解能を有する微生物の培養液、該微生物菌体、もしくは該微生物菌体処理物で処理した後の混合物から単離採取することを特徴とする式

( I一 a )

(式中、 R¹及び R²は前記と同じ。）で表される光学活性な化合物を得、この化合物を非アルコール系溶媒中、一級アルコール類存在下で、水素化ホウ素金属化合物で処理して式（I I )

(式中、 R²は前記と同じ。）

で表される光学活性な化合物を得、この化合物（I I ) と式（I I I )

(式中、 R²、 X¹および X²は、前記と同じ。）で表される光学活性な化合物を得、この化合物（I V) のニトロ基のアミノ基への変換と R²の脱離とを同時に行つて、式 (V)

(式中、 X¹および X²は、前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物 (V) に式（V I)

-COOR^J

Y— CH=C、 (VI)

、COOR⁴

(式中、 Yは炭素数 1〜6のアルコキシ基、ハロゲン原子又はジ（Ct一 C₆アルキル）アミノ基を意味し、 R³および R⁴は各々独立して炭素数 1〜6のアルキル基を意味する。）で表される化合物を反応させて、式（V I I)

(式中、 X¹、 X²、 R³および R⁴は前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物 (I X) をホウ素化合物の存在下又は非存在下に加熱して式 (X)

(式中、 R⁶は炭素数 1~6のアルキル基、又は BZ₂ (ここで Zはハロゲン原子、

C,-C_f,アルコキシ基、又は C₂— C₇アルキルカルボ二ルォキシ基を示す）を示し、 X¹および X²は前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（X) に 4—メチルピペラジンを反応させて式 (X I )

(式中、 X¹および R⁶は前記と同じ。）で表される化合物を得、次いで加水分解することを特徴とする、式（X I I )

(式中、 X¹は前記と同じ。）で表される化合物の製造方法。

20. 式（I V)

(式中、 X¹ および X² は、各々独立してハロゲン原子を意味する。 R² は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物の二ト口基のアミノ基への変換と R² の脱離とを同時に還元条件下で行い、式（V)

(式中、 X¹ および X²は、前記と同じ。）で表される化合物を得ることを特徴とする請求項 2 0記載の製造方法。

21. 非アルコール系溶媒が芳香族炭化水素である請求項 1 9または 2 0記載の製造方法。

22. 一級アルコール類がメタノールである請求項 1 9〜2 1のいずれか 1項記載の製造方法。

23. 水素化ホウ素金属化合物が水素化ホウ素ナトリウムである請求項 1 9〜2 2のいずれか 1項記載の製造方法。

24. R² が置換基を有していてもよいァラルキル基である請求項 1 9〜2 3のいずれか 1項記載の製造方法。

25. R² がべンジル基である請求項 1 9〜2 4のいずれか 1項記載の製造方法。

26. X¹がフッ素原子である請求項 1 9〜2 5のいずれか 1項記載の製造方法。

27. エステル不斉加水分解能を有する微生物の菌体を、高圧下に破碎し、陰ィオンクロマ卜グラフィ一、疎水クロマトグラフィー、次いで陰イオンクロマ卜グラフィ一で精製することにより得られるエステル不斉加水分解能を有する酵素。