KR20040007459A - 광학활성인 프로폭시아닐린 유도체의 제조방법 - Google Patents

광학활성인 프로폭시아닐린 유도체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

라세미체인 젖산에스테르 유도체를 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소 등으로 처리함으로써 한쪽의 광학이성체의 에스테르 부분을 특이적으로 가수분해할 수 있고, 이 가수분해에 의해 얻어진 화합물을 중간체로 사용함으로써 종래보다 짧은 공정으로 광학활성인 프로폭시아닐린 유도체를 제조할 수 있다.

Description

광학활성인 프로폭시아닐린 유도체의 제조방법{Process for preparation of optically active propoxyaniline derivatives}
S-(-)-9-플루오로-3-메틸-10-(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도[1,2,3-de][1,4]벤즈옥사진-6-카르복실산(레보플록사신, LVFX; 일본국 특허공개 제(소)62-252790호 공보)은 우수한 합성 항균제로서 알려져 있다.
이 합성 항균제의 제조 중간체로서 화학식 V
(식중, X1및 X2는 각각 독립적으로 할로겐원자를 의미한다.)로 표시되는 화합물(이하, 화합물 V로 나타내고, 다른 번호로 표시되는 화합물도 마찬가지로 나타낸다.)은 유용하고, 하기의 제법으로 제조 가능한 것이 알려져 있다(일본국 특허공개 제(평)1-250369호 및 일본국 특허공개 제(평)2-723호 공보).
즉, 화합물 V는 시판의 젖산에스테르의 수산기를 테트라히드로피라닐기로 보호하여 얻은 화합물 (A)를 수소화리튬알루미늄으로 환원하여 화합물 (B)를 얻고, 이 화합물 (B)와 화합물 (C)를 수소화나트륨으로 처리하여 화합물 (D)를 얻은 후, 테트라히드로피라닐기를 제거하고 니트로기를 환원함으로써 합성할 수 있다.
그러나, 화합물 (A)의 원료인 젖산에스테르 중 저렴하고 입수가 용이한 것은 광학순도가 97%ee 정도여서, 99%ee 이상의 높은 광학순도가 요구되는 레보플록사신의 원료로서는 부적당하다.
그 때문에, 젖산에스테르를 사용하지 않은 화합물 (B)의 별도 제조방법도 개발되고 있다(일본국 특허공개공보 제(평)2-265701). 또한, 환원에 사용하는 수소화리튬알루미늄은 안전면에서 대량으로 취급하는 것이 곤란하였다. 더욱이, 상기의제조방법은 비교적 공정수가 많았다. 더욱이 또한, 테트라히드로피라닐기를 제거할 때에는 라세미화를 수반하는 것이 보고되고 있다(S. Chladek, Chem. Ind. (London), 1719(1964)).
그 때문에, 화합물 (A)의 테트라히드로피라닐기를 벤질기로 한 화합물 ((R)-2-벤질옥시프로피온산 에스테르)의 사용을 검토하였다. 그러나, 종래에는 (R)-2-벤질옥시프로피온산 에스테르로서는 97%ee 정도의 광학순도인 것밖에 입수할 수 없었다. 의약으로서의 레보플록사신은 99%ee 이상의 더욱 높은 광학순도가 요구되는 것에 대해, 중간공정에서 광학순도를 향상하는 것이 곤란하여 97%ee 정도의 (R)-2-벤질옥시프로피온산 에틸은 레보플록사신의 원료로서는 사용할 수 없었다.
따라서, 이들 과제를 해결하기 위한 방법의 개발이 요구되고 있었다.
본 발명의 목적은 광학활성인 프로폭시아닐린 유도체 및 항균제로서 유용한 레보플록사신의 저렴하고 효율적인 제조방법과 그를 위한 중간체의 제조방법을 제공하는 것이다.
더욱이 본 발명은 에스테르 비대칭 가수분해능(asymmetric ester-hydrolyzing ability)을 갖는 미생물의 균체를 고압하에 파쇄하여, 음이온 크로마토그래피, 소수(疎水) 크로마토그래피, 이어서 음이온 크로마토그래피로 정제함으로써 얻어지는 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소를 제공하는 것이다.
본 발명은 항균성 화합물의 제조에 유용한 광학활성인 프로폭시아닐린 유도체의 제조방법과 그를 위한 중간체의 제조방법에 관한 것이다.
발명의 개시
본 발명자 등이 예의 검토한 결과, 라세미체인 젖산에스테르 유도체를 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소 등으로 처리함으로써 한쪽의 광학이성체의 에스테르 부분을 특이적으로 가수분해하는 방법을 발견하고, 또 이 가수분해에 의해 얻어진 화합물을 중간체로 사용함으로써 종래보다 저렴하고 짧은 공정으로 광학활성인 프로폭시아닐린 유도체를 제조할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 에스테르 비대칭 가수분해 반응에 의해 생성된 불필요한 광학이성체를 라세미화에 의해 기질에 되돌리는 리사이클법도 발견하였다. 이들 사실에 의해 광학순도가 높은 레보플록사신을 효율적으로 제조할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 화학식 I
(식중, R1은 탄소수 1~6의 알킬기를 의미하고, R2는 수산기의 보호기를 의미한다.)로 표시되는 화합물을 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소, 또는 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 미생물의 배양액, 상기 미생물 균체 또는 상기 미생물 균체 처리물로 처리한 후의 반응액으로부터 단리 채취하는 것을 특징으로 하는 화학식 I-a
(식중, R1및 R2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 광학활성인 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 화학식 I
화학식 I
(식중, R1및 R2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소, 또는 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 미생물의 배양액, 상기 미생물 균체 또는 상기 미생물 균체 처리물로 처리한 후의 반응액으로부터 단리 채취하여 화학식 I-a
화학식 I-a
(식중, R1및 R2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 광학활성인 화합물을 얻고, 이 화합물 I-a를 비알코올계 용매 중에서 1급 알코올류 존재하에 수소화붕소 금속 화합물로 처리하여 화학식 II
(식중, R2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 광학활성인 화합물을 얻고, 이 화합물 II와 화학식 III
(식중, X1, X2및 X3은 각각 독립적으로 할로겐원자를 의미한다.)으로 표시되는 화합물을 염기로 처리하여 화학식 IV
(식중, R2, X1및 X2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 광학활성인 화합물을 얻고, 이 화합물 IV의 니트로기의 아미노기로의 변환과 R2의 탈리를 동시에 행하는 것을특징으로 하는 화학식 V
화학식 V
(식중, X1및 X2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
더욱이 본 발명은 화학식 I
화학식 I
(식중, R1은 탄소수 1~6의 알킬기를 의미하고, R2는 수산기의 보호기를 의미한다.)로 표시되는 화합물을 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소, 또는 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 미생물의 배양액, 상기 미생물 균체 또는 상기 미생물 균체 처리물로 처리한 후의 혼합액으로부터 단리 채취하여 화학식 I-a
화학식 I-a
(식중, R1및 R2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 광학활성인 화합물을 얻고, 이 화합물 I-a를 비알코올계 용매 중에서 1급 알코올류 존재하에 수소화붕소 금속 화합물로 처리하여 화학식 II
화학식 II
(식중, R2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻고, 이 화합물 II와 화학식 III
화학식 III
(식중, X1, X2및 X3은 각각 독립적으로 할로겐원자를 의미한다.)으로 표시되는 화합물을 염기로 처리하여 화학식 IV
화학식 IV
(식중, R2, X1및 X2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 광학활성인 화합물을 얻고, 이 화합물 IV의 니트로기의 아미노기로의 변환과 R2의 탈리를 동시에 행하여 화학식 V
화학식 V
(식중, X1및 X2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻고, 이 화합물 V에 화학식 VI
(식중, Y는 탄소수 1~6의 알콕시기, 할로겐원자 또는 디(C1-C6알킬)아미노기를 의미하고, R3및 R4는 각각 독립적으로 탄소수 1~6의 알킬기를 의미한다.)로 표시되는 화합물을 반응시켜서 화학식 VII
(식중, X1, X2, R3및 R4는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻고, 이 화합물 VII에 설포닐 화합물을 반응시켜서 화학식 VIII
(식중, R5는 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬설포닐기 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴설포닐기를 의미하고, X1, X2, R3및 R4는 상기와 동일하다.)로 표시되는화합물을 얻고, 이 화합물 VIII을 염기 조건하에 폐환하여 화학식 IX
(식중, X1, X2, R3및 R4는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻고, 이 화합물 IX를 붕소 화합물의 존재하 또는 비존재하에 가열하여 화학식 X
(식중, R6은 탄소수 1~6의 알킬기 또는 BZ2(여기서 Z는 할로겐원자, C1-C6알콕시기 또는 C2-C7알킬카르보닐옥시기를 나타낸다)를 나타내고, X1및 X2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻고, 이 화합물 X에 4-메틸피페라진을 반응시켜서 화학식 XI
(식중, X1및 R6은 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻고, 이어서 가수분해하는 것을 특징으로 하는 화학식 XII
(식중, X1은 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
더욱이 본 발명은 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 미생물의 균체를 고압하에 파쇄하여, 음이온 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 이어서 음이온 크로마토그래피로 정제함으로써 얻어지는 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소를 제공하는 것이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명은 화합물 I을 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소, 또는 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 미생물의 배양액, 상기 미생물 균체 또는 상기 미생물 균체 처리물로 처리한 후의 혼합액으로부터 단리 채취하여 얻어진 화합물 I-a를 수소화붕소 금속 화합물로 처리하여 얻어진 화합물 II와 화합물 III을 염기 존재하에 처리하여 얻은 화합물 IV를 환원 반응에 의해 한 공정으로 광학활성 프로폭시아닐린 유도체 (V)로 유도하여, 해당 화합물 V로부터 항균제로서 유용한 화합물 XII을 제조하는 것이다.
본 발명에 의한 화합물 I~화합물 XII의 반응공정도를 아래에 나타낸다.
반응공정 중의 치환기에 대해서 설명한다.
X1, X2및 X3은 각각 독립적으로 할로겐원자를 의미하는데, 할로겐원자로서는 불소원자가 바람직하다.
R1, R3및 R4는 직쇄형상, 분지형상, 고리형상 중 어느 하나를 포함하는 알킬기를 의미하는데, 탄소수는 1~6이 바람직하고, 특히 메틸기, 에틸기, 이소부틸기가 바람직하다.
R2는 수산기의 보호기를 의미한다. 이 보호기는 보통 사용되는 것이면 된다. 예를 들면, (치환)알콕시카르보닐기류, (치환)아랄킬옥시카르보닐기류, (치환)아실기류, (치환)알킬기류, (치환)알케닐기류, (치환)아랄킬기류, 알킬기 또는 아랄킬기(이들은 동일해도 되고 상이해도 된다)에 의해 치환된 치환 실릴기류이다[본 명세서에 있어서 「(치환)」이란 「치환기를 갖고 있어도 된다」라는 의미이다.]. 구체적으로는, 제3급 부톡시카르보닐기, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐기 등의 (치환)알콕시카르보닐기류; 벤질옥시카르보닐기, 파라메톡시벤질옥시카르보닐기, 파라니트로벤질옥시카르보닐기 등의 (치환)아랄킬옥시카르보닐기류; 아세틸기, 메톡시아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 클로로아세틸기, 피발로일기, 포르밀기, 벤조일기 등의 (치환)아실기류; 제3급 부틸기, 알릴기(프로페닐기), 벤질기, 파라니트로벤질기, 파라메톡시벤질기, 트리페닐메틸기, 펜에틸기 등의 (치환)알킬기류, (치환)알케닐기 또는 (치환)아랄킬기류; 메톡시메틸기, 제3급 부톡시메틸기, 테트라히드로피라닐기, 2,2,2-트리클로로에톡시메틸기 등의 에테르류; 트리메틸실릴기, 이소프로필디메틸실릴기, 제3급 부틸디메틸실릴기, 트리벤질실릴기, 제3급 부틸디페닐실릴기 등의 치환 실릴기류이다. 이상의 보호기 중에서, R2로서는 환원 조건에서 제거할 수 있는 것이 바람직하고, 구체적으로는 (치환)아랄킬기가 바람직하며, 더욱이 벤질구조를 갖는 (치환)아랄킬기, 특히 벤질기가 바람직하다.
R5는 (치환)알킬설포닐기 또는 (치환)아릴설포닐기를 의미하지만, 탄소수 1~6의 알킬설포닐기 또는 (치환)벤젠설포닐기가 바람직하다. 이 중에서, 특히 메탄설포닐기, p-톨루엔설포닐기가 바람직하다.
R6은 C1-C6알킬기 또는 BZ2(여기서 Z는 할로겐원자, C1-C6알콕시기 또는 C2-C7알킬카르보닐옥시기를 나타낸다)를 의미한다. 탄소수 1~6의 알콕시기로서는 메톡시기, 에톡시기, 이소프로폭시기, 제3급 부톡시기 등을 들 수 있다. 할로겐원자로서는 상기 X1, X2및 X3과 동일한 것을 들 수 있다. C2-C7알킬카르보닐옥시기로서는 아세틸옥시기, 프로피오닐옥시기, 부틸일옥시기 등을 들 수 있다. 이 중에서, R6으로서는 BF2가 특히 바람직하다.
Y는 탄소수 1~6의 알콕시기, 할로겐원자 또는 디(C1-C6알킬)아미노기를 의미하지만, 탄소수 1~6의 알콕시기가 바람직하고, 특히 메톡시기, 에톡시기가 바람직하다.
또한, 상기 공정도에서는 한쪽의 이성체만의 제법을 나타냈지만, 화합물 I-a의 입체배치가 역인 것을 사용하면 또 다른 한쪽의 이성체도 마찬가지로 합성할 수 있다. 또한, 화합물 I을 이용하면 화합물 V의 라세미체도 얻을 수 있다.
이하에 본원 발명을 각 공정별로 상세하게 설명한다.
공정 (a)
공정 (a)는 화합물 I을 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소, 또는 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 미생물의 배양액, 상기 미생물 균체 또는 상기 미생물 균체 처리물로 처리함으로써 화합물 I-a를 얻는 공정이다.
먼저, 화합물 I을 적당한 완충액에 현탁하고, 이어서 효소, 미생물의 배양액, 상기 미생물 균체 또는 상기 미생물 균체 처리물을 가해 교반하여 처리한다.반응에 사용하는 효소는 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖고 있다면 특별히 한정되지 않지만, 효소로서는 미생물, 동물 및 식물 유래의 시판 효소제제를 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 효소로서는 리파제가 바람직하다. 리파제는 고정화된 것이어도 된다.
또한, 미생물로서는 클라도스포리움(Cladosporium)속, 아브시디아(Absidia)속, 난니지아(Nannizzia)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 리조푸스(Rhizopus)속, 무코르(Mucor)속 등의 곰팡이; 지고아스쿠스(Zygoascus)속, 칸디다(Candida)속, 사카로마이세스(Saccharomyces)속 등의 효모; 또는 바실루스(Bacillus)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 마이크로코카스(Micrococcus)속, 슈도모나스 (Pseudomonas)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 스트렙토마이세스(Strepto myces)속 등의 세균을 들 수 있다. 이들 미생물 중에서도 세균이 바람직하고, 더욱이 바실루스(Bacillus)속 또는 마이크로박테리움(Microbacterium)속이 바람직하며, 더욱이 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 마이크로박테리움 라에바니포르마스(Microbacterium laevaniformas)가 바람직하고, 특히 바실루스 세레우스 DSC0007(Bacillus cereus DSC0007), 바실루스 세레우스 ATCC14579(Bacillus cereus ATCC14579) 또는 마이크로박테리움 라에바니포르마스 IFO14471 (Microbacterium laevaniformas IFO14471)이 바람직하다.
더욱이 이들 미생물 균체 처리물로서는 미생물 균체 파쇄물 및 그들의 정제품을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는 이들 미생물, 특히 세균류의 균체로부터 정제된 효소를사용하는 것이 반응 효율의 관점에서 보다 바람직하다. 이러한 정제 효소로서는 균체를 고압하에 파쇄하여, 음이온 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 이어서 음이온 크로마토그래피로 정제함으로써 얻어지는 것이 특히 바람직하다. 또한, 효소의 정제 정도는 목적으로 하는 활성을 나타내는 정도면 된다.
또한, 이들 정제 효소는 상기와 같이 균체를 처리하여 얻어지는 것이면 되고, 더욱이 재조합 DNA 기술에 의해 대장균 등의 다른 숙주에서 생산시킨 것이어도 된다. 재조합 DNA 기술에 의해 효소를 얻기 위해서는 예를 들면 다음의 절차를 들 수 있다. 먼저, 상기의 정제 효소를 역상 크로마토그래피로 추가로 정제하여 단백질의 아미노산서열을 결정하고, 그 아미노산서열을 토대로 프로브를 작성하여 균체의 DNA 단편으로부터 비대칭 가수분해 효소의 활성본체를 코드하는 DNA를 클로닝한다. 이어서 이것을 PCR로 증폭하여 재조합 플라스미드를 조제하고, 대장균 등으로의 도입, 해당 대장균 등을 배양하여 목적 효소를 얻을 수 있다.
이 처리에 의해 하기의 화합물 I
(식중, R1및 R2는 상기와 동일하다.) 중 한쪽의 광학이성체의 에스테르 부분이 선택적으로 가수분해되어 화합물 I-b
(식중, R2는 상기와 동일하다.)가 생성되고, 미반응의 화합물 I-a
(식중, R1및 R2는 상기와 동일하다.)를 혼합액으로부터 단리할 수 있다. 즉, 이 혼합액에 초산에틸, 클로로포름 등의 유기 용매를 가하여 교반·분액 등의 처리를 행함으로써 화합물 I-a를 단리 채취할 수 있다. 또한, 처리에 사용한 효소 및 균체 등은 화합물 I-a의 추출 전에 여과 등에 의해 제거해 두는 것이 좋다.
이들 가수분해 및 단리의 처리온도는 보통 5℃~60℃의 범위이면 되지만, 바람직하게는 20℃~40℃의 범위이다. 또한, 처리액의 pH는 4~9의 범위이면 되지만, 바람직하게는 6~8의 범위이다. 처리시간은 1시간~7일간의 범위이면 되지만, 바람직하게는 1시간~30시간의 범위이다. 처리액 중의 화합물 I의 농도는 보통은 중량비율 0.1%~10%의 범위로 행하지만, 바람직하게는 0.5%~5%의 범위이다. 효소 및 미생물의 배양액, 상기 미생물 균체 또는 상기 미생물 균체 처리물의 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 건조중량을 토대로 화합물 I에 대해 중량비 0.05배~0.5배가 적당하다.
또한, 반응혼합물로부터 분리된 화합물 I-b는 에스테르화 후 라세미화 반응시키고, 추가로 에스테르 비대칭 가수분해 반응시킴으로써 재이용할 수 있다.
공정 (b)
공정 (b)는 화합물 I-a를 비알코올 용매 중에서 1급 알코올류 존재하에 수소화붕소 금속 화합물로 처리함으로써 화합물 II를 얻는 공정이다.
수소화붕소 금속 화합물로서는 수소화붕소 나트륨, 수소화붕소 리튬, 수소화붕소 칼슘, 수소화붕소 칼륨, 수소화붕소 아연, 수소화붕소 마그네슘, 시아노수소화붕소 나트륨 등을 들 수 있다. 이들 중에서 수소화붕소 나트륨이 바람직하다. 수소화붕소 금속 화합물의 사용량은 화합물 I-a에 대해서 1~5배 몰의 범위이면 되고, 바람직하게는 1.1~2배 몰 정도이다.
용매로서는 n-헥산, n-펜탄, 시클로헥산, 시클로펜탄 등의 탄화수소계 용매; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소계 용매; 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르(IPE), 메틸 제3급부틸 에테르(MTBE), 테트라히드로푸란(THF), 디메톡시에탄, 1,4-디옥산 등의 에테르계 용매; 클로로포름, 염화메틸렌, 1,2-디클로로에탄 (EDC) 등의 할로겐화 탄화수소계 용매를 들 수 있다. 이 밖에 물, 초산에스테르류 등을 들 수 있다. 이들 용매는 단독이어도 되지만 여러 종류를 조합해도 된다. 이들 용매 중에서 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소계 용매가 바람직하다.
1급 알코올류는 특별히 한정되지 않지만 메탄올이 바람직하다. 1급 알코올류의 사용량은 화합물 I-a에 대해서 3~15배 몰의 범위이면 되고, 바람직하게는 4~8배 몰 정도이다.
반응온도는 사용하는 용매에 따라 다르지만 -78℃~용매의 비점이고, 바람직하게는 10℃~용매의 비점이다. 반응시간은 1~24시간의 범위이면 되고, 바람직하게는 2~16시간의 범위이다.
공정 (c)
공정 (c)는 화합물 II를 용매 중에서 염기 존재하에 처리함으로써 화합물 III을 얻는 공정이다.
용매는 각종 용매를 사용할 수 있으며, 예를 들면 n-헥산, n-펜탄 등의 탄화수소계 용매; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소계 용매; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올(IPA), n-부탄올, 제3급부탄올의 알코올계 용매; 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르(IPE), 메틸 제3급부틸 에테르(MTBE), 테트라히드로푸란(THF), 디메톡시에탄, 1,4-디옥산 등의 에테르계 용매; 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드(DMAc) 등의 아미드계 용매; 클로로포름, 염화메틸렌, 1,2-디클로로에탄(EDC) 등의 할로겐화 탄화수소계 용매를 들 수 있다. 이 밖에 물, 아세토니트릴, 초산에스테르류, 아세톤 등을 들 수 있다. 이들 용매는 단독이어도 되지만 여러 종류를 조합해도 된다. 이들 용매 중에서 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소계 용매가 바람직하다.
반응온도는 염기의 종류나 사용하는 용매에 따라 다르지만 -78℃~용매의 비점이고, 바람직하게는 -10℃~용매의 비점이다.
염기로서는 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 되고, 알칼리금속 또는 알칼리토류금속, 예를 들면 나트륨, 칼륨, 리튬, 마그네슘, 칼슘 등의 수산화물, 탄산염, 탄산수소염 및 알콕시드 등, 수소화나트륨, 수소화칼륨, 수소화리튬 등의 금속수소화물, n-부틸리튬, 메틸리튬, 리튬 디이소프로필아미드 등의 알킬리튬 시약, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 등의 3급 아민류, 그 밖에 1,8-디아자비시클로 [5.4.0]운데세-7-엔(DBU), 1,8-디아자비시클로[4.3.0]논-5-엔(DBN), 디메틸아닐린, N-메틸모르폴린 등의 복소환 화합물을 사용할 수 있다. 이들 염기 중에서, 탄산칼륨 등의 알칼리금속 또는 알칼리토류금속의 탄산염, 또는 수산화칼륨 등의 알칼리금속 또는 알칼리토류금속의 수산화물 또는 제3급부톡시 나트륨, 제3급부톡시 칼륨 등의 알칼리금속 알콕시드가 바람직하다. 또한, 탄산칼륨 등의 알칼리금속 또는 알칼리토류금속의 탄산염 및 수산화칼륨 등의 알칼리금속 또는 알칼리토류금속의 수산화물을 조합하여 사용하는 것도 가능하다. 염기의 사용량은 보통 화합물 III의 몰수에 대해서 0.1~15배 몰의 범위이면 되고, 바람직하게는 1~5배 몰 정도이다.
또한, 반응을 촉진시키기 위해서 테트라부틸암모늄 브로마이드, 벤질트리에틸암모늄 클로라이드 등의 4급 암모늄염이나 요오드화칼륨, 요오드화나트륨 등의 알칼리금속 또는 알칼리토류금속의 요오드화물 및 크라운에테르 등의 존재하에 행하는 경우도 있다.
공정 (d)
공정 (d)는 화합물 IV의 니트로기의 아미노기로의 변환과 R2의 탈보호를 환원 반응에 의해 동시에 행함으로써 화합물 V를 얻는 공정이다.
환원 반응은 보통의 수소첨가법 등에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 촉매 존재하의 접촉 수소첨가법을 들 수 있고, 이 방법에 사용할 수 있는 촉매로서는 보통 사용되는 금속 촉매이면 된다. 이들 중에서 바람직하게는 팔라듐-탄소, 레이니니켈, 레이니코발트이다.
용매는 반응을 저해하지 않는 것이라면 특별히 제한되지 않지만, 탄화수소계로서는 n-헥산, n-펜탄, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등을 들 수 있다. 알코올계로서는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올(IPA), n-부탄올, 제3급부탄올을 들 수 있다. 에테르계로서는 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르(IPE), 메틸 제3급부틸 에테르(MTBE), 테트라히드로푸란(THF), 디메톡시에탄, 1,4-디옥산 등을 들 수 있다. 아미드계로서는 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMAc) 등을 들 수 있다. 할로겐화 탄화수소계로서는 클로로포름, 염화메틸렌, 1,2-디클로로에탄(EDC) 등을 들 수 있다. 이 밖에 물, 아세토니트릴, 초산에스테르류, 아세톤 등을 들 수 있다. 이들 용매는 단독이어도 되지만 여러 종류를 조합해도 된다. 이들 용매 중에서 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올(IPA) 등의 알코올계 용매, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소계 용매 또는 이들과 물의 혼합 용매가 바람직하다.
수소원으로서는 수소가스 외에 포름산 암모늄을 사용할 수 있다. 포름산 암모늄의 양은 화합물 IV의 몰수에 대해서 1~15배 몰의 범위이면 되고, 바람직하게는 2~5배 몰 정도이다.
반응온도는 염기의 종류나 사용하는 용매에 따라 다르지만 -78℃~용매의 비점이고, 바람직하게는 실온~80℃이다. 반응시간은 1~24시간의 범위이면 되고, 바람직하게는 2~16시간의 범위이다.
공정 (e)
공정 (e)는 화합물 V에 화학식 VI의 메틸렌말로네이트 화합물을 반응시켜서 화합물 VII을 얻는 공정이다.
사용하는 메틸렌말로네이트 화합물 VI으로서는 디에틸 에톡시메틸렌말로네이트, 디메틸 메톡시메틸렌말로네이트 등을 들 수 있다.
이 반응은 예를 들면 화합물 V에 대해서 바람직하게는 등몰 이상의 메틸렌말로네이트 화합물 VI을 사용하고, 무용매에서 양자를 100~180℃ 정도로 가열 교반하거나, 적당한 용매 중에서 가열 환류함으로써 실시할 수 있다.
이 때의 용매로서는 반응에 대해서 악영향을 부여하지 않는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 벤젠, 톨루엔, 크실렌, n-헥산, 시클로헥산, n-펜탄 등의 탄화수소류; 메탄올, 에탄올, 프로판올류; 부탄올류 등의 저급 알코올류; 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등의 에테르류; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸-2-피롤리돈 등의 아미드류; 디메틸 설폭시드, 설포란 등의 비프로톤성 극성 용매 등을 들 수 있다. 용매를 사용하는 경우에는 반응은 용매의 비점 이하의 온도에서 실시하면 된다.
공정 (f)
공정 (f)는 화합물 VII에 설포닐 화합물을 반응시켜서 화합물 VIII을 얻는 공정이다.
사용하는 설포닐 화합물로서는 p-톨루엔설포닐 클로라이드, 메탄설포닐 클로라이드, 클로로메탄설포닐 클로라이드 등을 들 수 있다.
반응은 염기의 존재하에 행하는 것이 바람직하고, 해당 염기로서는 트리에틸아민, 트리부틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 등의 3급 알킬아민류; N,N-디메틸아닐린, N,N-디에틸아닐린 등의 디알킬아닐린류; 피리딘, N,N-디메틸아미노피리딘,N-메틸모르폴린 등의 복소환 아민류; 1,8-디아자비시클로[5,4,0]운데센 등을 예시할 수 있다.
용매를 사용하는 경우는 비프로톤계의 용매가 바람직하고, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등의 에테르류; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸-2-피롤리돈 등의 아미드류; 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄 등을 예시할 수 있다. 반응온도는 0~100℃ 정도가 바람직하다.
공정 (g)
공정 (g)는 화합물 VIII을 염기 조건하에 폐환시켜서 화합물 IX를 얻는 공정이다.
사용하는 염기로서는 무기염기, 유기염기 중 어느 것이어도 되고, 무기염기로서는 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 금속 수산화물, 탄산리튬, 탄산나트륨, 탄산칼륨 등의 금속 탄산염류; 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨 등의 금속 탄산수소염류를 들 수 있다. 유기염기로서는 트리에틸아민, 트리부틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 등의 3급 알킬아민류; N,N-디메틸아닐린, N,N-디에틸아닐린 등의 디알킬아닐린 등, 피리딘, N,N-디메틸아미노피리딘, N-메틸모르폴린 등의 복소환 아민류; 나트륨 메톡시드, 나트륨 에톡시드, 나트륨 이소프로폭시드, 칼륨 제3급부톡시드 등의 금속 알콕시드 등, 이 밖에 1,8-디아자비시클로[5,4,0]운데센, N-벤질트리메틸암모늄 히드록시드 등을 예시할 수 있다.
반응 용매로서는 메탄올, 에탄올, 프로판올류, 부탄올류 등의 저급 알코올류; 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산, 1,2-디메톡시에탄, 2-메톡시에틸에테르, 에틸렌글리콜·디에틸에테르 등의 에테르류; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N,N-메틸-2-피롤리돈 등의 아미드류; 디메틸설폭시드, 설포란 등의 비프로톤성 극성 용매 등을 들 수 있다.
반응온도는 실온~150℃의 범위에서 실시하면 된다.
또한, 이 폐환반응에는 반응촉진제로서 요오드화칼륨, 요오드화나트륨, 크라운에테르 등을 프로폭시벤젠 화합물에 대해서 1/20 당량 또는 그 이상을 가하는 것이 유효한 것이다.
공정 (h)
공정 (h)는 화합물 IX를 붕소 화합물의 존재하 또는 비존재하에 가열하여 화합물 X을 얻는 공정이다.
반응을 붕소 화합물의 비존재하에 행하면, 화학식 X 중 R6이 C1-C6알킬기인 화합물이 얻어진다. 한편, 반응을 붕소 화합물의 존재하에 행하면 화학식 X 중 R6이 BZ2인 화합물이 얻어진다. 붕소 화합물로서는 구체적으로는 트리플루오르화 붕소·테트라히드로푸란 착체, 트리플루오르화 붕소·디에틸에테르 착체 등을 들 수 있다.
붕소 화합물의 비존재하의 반응은 폴리인산 등의 용매 중에서 100℃~200℃로 가열하여 행하는 것이 바람직하다. 붕소 화합물의 존재하의 반응은 무수 초산, 무수 프로피온산 등의 용매 중에서 트리플루오르화 붕소·테트라히드로푸란 착체, 트리플루오르화 붕소·디에틸에테르 착체 등을 가하고 150℃~200℃로 가열하여 행하는 것이 바람직하다.
공정 (i)
공정 (i)는 화합물 X에 4-메틸피페라진을 반응시켜서 화합물 XI을 얻는 공정이다. 또한, 화학식 X 중의 R6이 C1-C6알킬기인 경우는 염기성 또는 산성 조건하에서 가수분해하여 카르복실산으로 한 후에 4-메틸피페라진을 반응시키는 것이 바람직하다.
반응은 염기의 존재하에 행하는 것이 바람직하다. 이 염기는 무기염기여도 되고 유기염기여도 되며, 무기염기로서는 알칼리금속, 또는 알칼리토류금속의 탄산염, 탄산수소염 등을 들 수 있다. 유기염기로서는 트리알킬아민이나 질소함유 복소환 화합물을 들 수 있다. 구체적으로는 트리에틸아민, 트리부틸아민, 에틸디이소프로필아민 등, 또한 4-메틸모르폴린, 디메틸아미노피리딘 등, 더 나아가서는 4-메틸피페라진을 과잉량 사용하여 염기와 겸용시켜도 된다. 이 반응은 용매, 예를 들면 디메틸설폭시드를 사용할 수 있다.
공정 (j)
공정 (j)는 화합물 XI을 가수분해하여 화합물 XII를 얻는 공정이다.
이 가수분해 반응은 예를 들면 염기 존재하에 프로톤성 용매 중에서 가열함으로써 행할 수 있다. 예를 들면, 알코올 용매 중에서 트리알킬아민 존재하에 가열하는 조건을 예시할 수 있지만, 구체적으로는 에탄올 중에서 트리에틸아민의 존재하에 가열 교반하면 된다.
화학식 XII 중, X1이 불소원자인 화합물이 레보플록사신이다.
이하, 실시예 및 참고예로서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.
또한, 얻어진 화합물의 광학순도(%ee)는 HPLC 또는 GC에 의해 측정하였다.
얻어진 화합물의 절대 배치는, 별도로 합성된 절대 배치가 이미 알려진 샘플과 비교하여 결정된 것이다.
실시예 1:(R)-2-벤질옥시프로피온산 에틸
2-벤질옥시프로피온산 에틸(300 mg)을 0.1 M 인산완충액(pH 6.5)(30 ml)에 현탁하고, 리파제 Fine Grade(SEIKAGAKU CORPORATION제, 리조푸스 델레머(Rhizopus delemer); 6 mg)를 가하여 30℃에서 24시간 교반하였다. 반응액에 초산에틸을 가하여 셀라이트 여과에 의해 변성 단백질을 제거하고, 추가로 1 N 수산화나트륨 수용액으로 pH 7.0으로 조정한 후 분액 추출하였다. 유기층을 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 용매를 유거함으로써 기름형상의 표제 화합물(102 mg, 98.8%ee)을 얻었다.
1Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ:１．３０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．４４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．０５（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．２２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．２３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ）７．２３－７．４２（５Ｈ，ｍ）
실시예 2:(R)-2-벤질옥시-1-프로판올
40℃에서 수소화붕소 나트륨(21.8 mg)을 톨루엔 0.8 ml에 현탁하고, 그 용액에 실시예 1에서 얻은 (R)-2-벤질옥시프로피온산 에틸(100 mg, 98.8%ee)의 톨루엔용액(0.8 ml)을 가하였다. 반응액에 MeOH(0.15 ml)를 가하여 동일 온도에서 3시간 교반하였다. 반응액에 물을 가하고 톨루엔으로 추출하였다. 유기층을 물, 포화 염화암모늄 수용액으로 세척한 후 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용매를 유거한 후, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토그래피에 의해 기름형상 물질로서 표제 화합물(79 mg, 99%ee)을 얻었다.
1Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ:１．１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．２０（１Ｈ，ｂｓ），３．４３－３．７２（３Ｈ，ｍ），４．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），７．２２－７．４４（５Ｈ，ｍ）
참고예 1
마이크로박테리움 라에바니포르마스(Microbacterium laevaniformas)IFO14471의 종균을 보통 부용 배지 100 ml[사카구치(Sakaguchi) 플라스크]에 접종하고, 30℃에서 하룻밤 진탕하여 배양하였다. 원심분리에 의해 집균한 후 동결건조하여 IFO 14471의 동결건조 균체를 얻었다.
실시예 3:(R)-2-벤질옥시프로피온산 에틸
2-벤질옥시프로피온산 에틸 2.0 g(9.6 mmol)을 0.1 M 인산염 완충액(pH 7.0) 100 ml에 현탁하고, 참고예 1에 따라서 조제한 IFO 14471의 동결건조 균체 100 mg을 가하여 30℃에서 교반하였다. 반응이 진행됨에 따라(카르복실산의 생성에 의해) pH가 저하되기 때문에, 1 N 수산화나트륨을 가하여 계내의 pH를 6.8~7.2 사이로 유지하였다. 14시간 반응 후 초산에틸 100 ml를 가하여 잠시동안 교반한 후, 셀라이트 여과에 의해 균체를 제거하였다. 분액한 후 추가로 초산에틸 100 ml로 추출하고, 초산에틸층을 모아 5% 중조수로 2회 세척하여 완전히 카르복실산을 제거하였다. 유기층을 건조한 후 용매를 유거함으로써 표제 화합물을 0.93 g(46.5%, 99.9%ee) 얻었다.1Ｈ－ＮＭＲ은 실시예 1과 일치하였다.
실시예 4:(R)-2-벤질옥시프로피온산 에틸
2-벤질옥시프로피온산 에틸 2.0g(9.6 mmol)을 0.1 M 인산염 완충액(pH 7.0) 100 ml에 현탁하고, 참고예 1과 동일한 방법으로 조제한 ATCC 14579의 동결건조 균체 100 mg을 가하여 30℃에서 교반하였다. 반응이 진행됨에 따라(카르복실산의 생성에 의해) pH가 저하되기 때문에, 1 N 수산화나트륨을 가하여 계내의 pH를 6.8~7.2 사이로 유지하였다. 16시간 반응 후 초산에틸 100 ml를 가하여 잠시동안 교반한 후, 셀라이트 여과에 의해 균체를 제거하였다. 분액한 후 추가로 초산에틸 100 ml로 추출하고, 초산에틸층을 모아 5% 중조수로 2회 세척하여 완전히 카르복실산을 제거하였다. 유기층을 건조한 후 용매를 유거함으로써 표제 화합물을 0.88 g(44.0%, 99.9%ee) 얻었다.1Ｈ－ＮＭＲ은 실시예 1과 일치하였다.
실시예 5:2-벤질옥시프로피온산 에틸(라세미화 공정)
실시예 3에서 초산에틸에 의한 추출 조작시의 모든 수층을 모아 10% 염산으로 pH 2로 조정한 후, 초산에틸 100 ml로 2회 추출하였다. 유기층을 건조한 후, 용매를 유거하여 (S)-벤질옥시프로피온산을 0.83 g(48.0%, 96%ee) 얻었다. 그 중 0.8 g(4.4 mmol)을 에탄올 10 ml에 용해하고, 진한 황산 0.01 ml를 가하여 가열 환류하였다. 8시간 후, 용매를 유거에 의해 제거하고 잔사를 초산에틸 20 ml로 추출하였다. 5% 중조수(10 ml) 및 물(10 ml)로 세척한 후, 유기층을 건조하고 용매를 유거하여 (S)-벤질옥시프로피온산 에틸을 얻었다. 이것을 톨루엔 10 ml에 용해하고, 빙냉 교반하 나트륨 에톡시드 0.33 g(1.1 eq)을 가하여 실온에서 14시간 교반하고, 광학활성 칼럼을 사용한 가스 크로마토그래피를 사용하여 라세미화 반응종료를 확인하였다. 그 후, 반응액을 10% 구연산 수용액(10 ml) 중에 적하하였다. 유기층을 물 10 ml로 세척하여 건조한 후 용매를 유거함으로써 표제 화합물을 0.74 g 얻었다.1Ｈ－ＮＭＲ은 실시예 1과 일치하였다. 이 라세미체는 실시예 1~4와 같은 에스테르 비대칭 가수분해의 원료로 사용할 수 있다.
비교예 1:(R)-2-벤질옥시프로피온산 메틸
-30℃에서 벤질브로마이드(9.86 g) 및 60% 수소화나트륨(2.11 g)의 디메틸포름아미드(DMF) 및 테트라히드로푸란(THF)의 혼합용액(50 ml, 3:2 용적비)에 용해하였다. 그 용액에 (R)-젖산메틸(5.0 g, 99%ee)을 가하였다. 동일 온도에서 30분간 교반하였다. 이어서, 실온에서 30분간 교반하고, 추가로 50℃에서 30분간 교반하였다. 반응액에 물, 디이소프로필에테르를 가하고, 유기층을 물로 세척한 후 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용매를 유거한 후, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토그래피에 의해 황색 기름형상 물질로서 표제 화합물(8.87 g, 92.1%ee)을 얻었다.
1Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ:１．４４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．７５（３Ｈ，ｓ），４．０７（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．４５（１H，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），７．２２－７．３７（５Ｈ，ｍ）
실시예 6:(R)-3,4-디플루오로-2-(2-벤질옥시프로폭시)니트로벤젠
빙냉하, 수산화칼륨(5.40 g) 및 탄산칼륨(3.33 g)을 톨루엔 180 ml에 현탁하였다. 그 용액에 실시예 2와 동일하게 하여 얻어진 (R)-2-벤질옥시-1-프로판올 (4.0 g) 및 2,3,4-트리플루오로니트로벤젠(4.13 g)의 톨루엔용액(40 ml)을 가하여 동일 온도에서 1시간 교반하였다. 반응액에 물을 가하고 톨루엔으로 추출하였다. 유기층을 물로 세척한 후 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용매를 유거한 후, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토그래피에 의해 황색 기름형상 물질로서 표제 화합물(7.55 g)을 얻었다.
1Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ:１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．９３－４．０３（２Ｈ，ｍ），４．５３－４．６５（２Ｈ，ｍ），６．９０－６．９９（１H，ｍ），７．２３－７．３５（５Ｈ，ｍ），７．６０－７．６６（１Ｈ，ｍ）
실시예 7:(R)-3,4-디플루오로-2-(2-벤질옥시프로폭시)니트로벤젠
빙냉하, 제3급부톡시 나트륨(63.6 mg)을 톨루엔(0.5 ml)에 현탁하였다. 그 용액에 실시예 2와 동일하게 하여 얻어진 (R)-2-벤질옥시-1-프로판올(100 mg)을 가하였다. 이어서 빙냉하, 그 용액을 2,3,4-트리플루오로니트로벤젠(103.5 mg)의 톨루엔용액(0.5 ml)에 가하여 1시간 교반하였다. 반응액에 물을 가하고 톨루엔으로 추출하였다. 유기층을 물로 세척한 후 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용매를 유거한 후, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토그래피에 의해 황색 기름형상 물질로서 표제 화합물(161.2 mg)을 얻었다. 또한, 스펙트럼 데이터는 실시예 6에서 얻은 것과 일치하였다.
실시예 8:(R)-3,4-디플루오로-2-(2-히드록시프로폭시)아닐린
실온에서, 실시예 6에서 얻어진 (R)-3,4-디플루오로-2-(2-벤질옥시프로폭시)니트로벤젠(1.0 g)을 에탄올(10 ml)에 용해하고, 7.5% Pd-C(1.0 g)를 가하여 수소분위기하에 6시간 교반하였다. Pd-C를 여과하여 제거한 후 얻어진 여과액을 감압하 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토그래피에 의해 기름형상 물질로서 표제 화합물(600 mg, 99.0%ee)을 얻었다.
1Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ:１．２３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．８１－４．８９（１Ｈ，ｍ），４．０６－４．１７（２Ｈ，ｍ），６．３７－６．４４（１Ｈ，ｍ），６．７７－６．８７（１Ｈ，ｍ）
실시예 9:(R)-3,4-디플루오로-2-(2-히드록시프로폭시)아닐린
실온에서, 실시예 6에서 얻어진 (R)-3,4-디플루오로-2-(2-벤질옥시프로폭시)니트로벤젠(0.3 g)을 톨루엔(3 ml)에 용해하고, 10% Pd-C(90 mg)를 가하여 80℃에서 수소분위기하 4시간 교반하였다. Pd-C를 여과하여 제거한 후, 얻어진 여과액을 감압하 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토그래피에 의해 기름형상 물질로서 표제 화합물(181.0 mg, 99.0%ee)을 얻었다. 스펙트럼 데이터는 실시예 8에서 얻은 것과 일치하였다.
실시예 10:2,3-디플루오로-6-(2,2-디에톡시카르보닐에테닐)아미노-[(R)-2-히드록시프로폭시]벤젠
100℃에서, 실시예 8과 동일하게 하여 얻어진 (R)-3,4-디플루오로-2-(2-히드록시프로폭시)아닐린(1.02 g) 및 디에틸에톡시메틸렌말로네이트(1.14 g)를 무용매로 1시간 교반하였다. 더욱이 약한 감압으로 발생하는 에탄올을 제거하면서 30분간 교반하였다. 반응혼합물을 방냉한 후 감압하 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토그래피에 의해 표제 화합물(1.83 g, 99.0%ee)을 백색 결정으로서 얻었다.
융점: 52-55℃
１Ｈ－ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ:１．２２－１．４６（ｍ，９Ｈ）、３．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ）、３．８８－４．４３（ｍ，７Ｈ）、６．７５－７．０８（ｍ，２Ｈ），８．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ）
실시예 11:2,3-디플루오로-6-(2,2-디에톡시카르보닐에테닐)아미노-[(R)-2-(메탄설포닐옥시프로필)옥시]벤젠
실시예 10과 동일하게 하여 얻어진 2,3-디플루오로-6-(2,2-디에톡시카르보닐에테닐)아미노-[(R)-2-(히드록시프로필)옥시]벤젠 3.00 g을 1,2-디클로로에탄 30 ml에 용해하여, 빙냉 교반하에 트리에틸아민 0.98 g을 가하고, 추가로 동일 온도에서 메탄설포닐 클로라이드 1.01 g을 교반하에 가하였다. 실온에서 2시간 교반하여불용물을 여과해 제거하였다. 여과액을 1,2-디클로로에탄으로 희석하고 물로 세척한 후 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 건조한 유기층에 실리카겔 1.5 g을 가하여 30분간 교반한 후, 불용물을 여과해 제거하였다. 용매를 감압 유거하고, 잔사를 디이소프로필에테르로부터 결정화한 후 여과하여 모았다. 표기 화합물 3.27 g을 얻었다.
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．２２－１．４７（６Ｈ，ｍ），１．５８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），１．５０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），３．１３（３Ｈ，ｓ），３．９８－４．６０（６Ｈ，ｍ），４．９５－５．３５（１Ｈ，ｍ），６．７９－７．１４（２Ｈ，ｍ），８．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ）
실시예 12:(S)-디에틸(7,8-디플루오로-3-메틸-3,4-디히드로-2H-[1,4]벤즈옥사진-4-일)메틸렌말로네이트
실시예 11에서 얻어진 2,3-디플루오로-6-(2,2-디에톡시카르보닐에테닐)아미노-[(R)-2-(메탄설포닐옥시프로필)옥시]벤젠 3.00 g을 무수 DMF, 15 ml에 용해하고, 탄산칼륨 0.92 g을 가하여 80℃에서 2시간 교반하였다. 용매를 감압 유거하여 잔사를 초산에틸로 추출하고, 추출액을 물로 세척하여 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용매를 감압 유거하여 얻은 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토그래피에 의해 표기 화합물 2.14 g을 얻었다.
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．２２－１．４２（９Ｈ，ｍ），３．９０－４．４４（７Ｈ，ｍ），６．７４－６．８８（２Ｈ，ｍ），７．７８（１Ｈ，ｓ）
실시예 13:(3S)-9,10-디플루오로-3-메틸-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도[1,2,3-de][1,4]벤즈옥사진-6-카르복실산보론 디플루오리드 킬레이트 착체
실시예 12에서 얻어진 (S)-디에틸(7,8-디플루오로-3-메틸-3,4-디히드로-2H-[1,4]벤즈옥사진-4-일)메틸렌말로네이트(2 g) 및 무수 초산(2 ml)을 혼합하고 140℃에서 47% 트리플루오르화 붕소·테트라히드로푸란 착체(0.8 ml)를 가하여, 동일 온도에서 1시간 가열 교반하였다. 생성하는 저비점물을 유거한 후에 반응액을 실온까지 냉각한다. 반응혼합물에 아세톤(10 ml)을 가하여 동일 온도에서 30분 교반하였다. 석출된 결정을 모아 아세톤으로 세척하고 표기 화합물 1.55 g을 얻었다.
실시예 14:(3S)-(-)-9-플루오로-3-메틸-10-(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도[1,2,3-de][1,4]벤즈옥사진-6-카르복실산(레보플록사신)
실시예 13에서 얻어진 (3S)-9,10-디플루오로-3-메틸-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도[1,2,3-de][1,4]벤즈옥사진-6-카르복실산보론 디플루오리드 킬레이트 착체(310 mg)를 디메틸설폭시드(6 ml)에 용해하고, 트리에틸아민(0.32 ml) 및 N-메틸피페라진(0.13 ml)을 가하여 실온에서 17시간 교반한 후 감압하 건고하였다. 잔류물을 디에틸에테르로 세척한 후, 트리에틸아민(0.5 ml)을 포함하는 95% 에탄올(20ml)에 용해하고 8시간 가열 환류하였다. 냉각한 후 감압하 건고하여 얻은 잔류물을 묽은 염산(5%)에 용해하고, 클로로포름으로 나누어 수층을 수산화나트륨(1 mol/l)으로 pH 11로 하고, 이어서 염산(1 mol/l)으로 pH 7.4로 조정하였다. 이것을 클로로포름(50 ml×3)으로 추출하여 무수 황산나트륨으로 건조한 후 클로로포름을 유거하고, 얻은 분말을 에탄올-디에틸에테르로부터 재결정하여 투명하고 미세한 바늘결정의 표기 화합물 120 mg을 얻었다.
융점: 225~227℃(분해)
원소분석: C18H20FN3O4·1/2H2O로서;
계산값: C, 58.37; H, 5.72; N, 11.35
분석값: C, 58.17; H, 5.58; N, 11.27
실시예 15
(1) 균체 파쇄(프렌치 프레스)
ATCC 14579의 사카구치 배양균체(배지량 1200 ml)를 20 mM 인산완충액 80 ml(pH 7.0, 1 mM EDTA, DTT 함유)에 현탁하고, 프렌치 프레스로 15000 psi의 압력을 가하여 균체를 파쇄하였다.
파쇄된 균체를 원심분리기(10,000 G, 30분)로 원심분리함으로써 균체 추출액 85.0 ml[총활성 123 unit, 비활성(比活性) 0.032 unit/mg]를 얻었다.
(2) 음이온 크로마토그래피
균체 추출액을 하기의 음이온 크로마토 정제조건에서 분획하였다. 각 획분마다 2-벤질옥시프로피온산 에틸의 가수분해 활성을 측정하고, 활성획분 206 ml(총활성 88 unit, 비활성 0.058 unit/mg, 활성수율 72%)를 얻었다.
음이온 크로마토그래피 정제조건
담체; Source Q(Pharmacia Biotech, Inc.) 400 ml
칼럼; 50 mm×200 mmH
이동상; A액: 20 mM 인산완충액 pH 7.0(1 mM EDTA, DTT 함유) 900 ml
B액: A액 + 1.0 M NaCl 900 ml
A→B linear gradient
검출; 280 nm, 온도; 4℃
15분마다 획분 분취, 2-벤질옥시프로피온산 에틸의 가수분해 반응 실시
(3) 소수 크로마토그래피
음이온 교환 칼럼 활성획분 206 ml에 황산암모늄 54.4 g(2.0 M 상당)을 소량씩 첨가하고, 30분 교반한 후 생성한 침전물을 원심분리(10,000 G, 30분)로 제거하였다. 얻어진 상청을 하기의 소수 크로마토그래피 정제조건에서 분획하였다. 각 획분마다 2-벤질옥시프로피온산 에틸의 가수분해 활성을 측정하고, 활성획분(251-308분)을 확인하였다. 분취된 활성획분을 한외여과로 탈염 농축하고, 활성 본체획분 1.0 ml(총활성 16.8 unit, 비활성 3.23 unit/mg, 활성수율 19%)를 얻었다.
소수 크로마토그래피 정제조건
담체; Resource ETH(Pharmacia Biotech, Inc.) 100 ml
칼럼; 45 mm×60 mmH
이동상; A액: 20 mM 인산완충액 pH 7.0(1 mM EDTA, DTT 함유) 600 ml
B액: A액 + 2.0 M 황산암모늄 600 ml
B→A linear gradient
검출; 280 nm, 온도; 4℃
7분마다 획분 분취, 2-벤질옥시프로피온산 에틸의 가수분해 반응 실시
(4) 음이온 크로마토그래피(Mono Q)
소수 크로마토그래피 활성획분 1.0 ml를 음이온 크로마토그래피(Mono Q)로 분획하였다. 각 획분마다 2-벤질옥시프로피온산 에틸의 가수분해 활성을 측정하고, 활성획분(23-25분)을 확인하였다. 분취된 활성획분을 한외여과로 탈염 농축하고, 활성 본체획분 1.0 ml(총활성 5.9 unit, 비활성 4.54 unit/mg, 활성수율 35%)를 얻었다. 이 활성본체의 분자량은 약 38,000(SDS PAGE), 약 40,000(겔 여과)이었다.
음이온 크로마토그래피(Mono Q) 정제조건
칼럼; 음이온 교환 칼럼 Mono Q 1 ml(Pharmacia Biotech, Inc.)
이동상; A액: 20 mM 인산완충액(pH 7.0)
B액: A액 + 1.0 M NaCl
A→B linear gradient
유속; 1.0 ml/분
검출; 280 nm, 온도; rt
1분마다 획분 분취, 2-벤질옥시프로피온산 에틸의 가수분해 반응 실시
얻어진 미생물 유래 정제 효소를 사용하여 실시예 1, 2, 3 및 4와 동일하게 에스테르 비대칭 가수분해 반응을 행한 바, 광학순도 99%ee 이상의 (R)-2-벤질옥시프로피온산 에틸이 효율좋게 얻어졌다.
본 발명의 방법에 의하면, 저렴하고 짧은 공정으로 광학순도가 높은 광학활성 프로폭시아닐린 유도체 (V)를 얻을 수 있고, 이것에 의해 항균제로서 유용한 광학순도가 높은 레보플록사신이 공업적으로 유리하게 얻어진다.

Claims (27)

  1. 화학식 I
    (식중, R1은 탄소수 1~6의 알킬기를 의미하고, R2는 수산기의 보호기를 의미한다.)로 표시되는 화합물을 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소, 또는 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 미생물의 배양액, 상기 미생물 균체 또는 상기 미생물 균체 처리물로 처리한 후의 혼합물로부터 단리 채취하는 것을 특징으로 하는 화학식 I-a
    화학식 I-a
    (식중, R1및 R2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 광학활성인 화합물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, R2가 치환기를 갖고 있어도 되는 아랄킬기인 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R2가 벤질기인 제조방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 에틸기인 제조방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 리파제인 제조방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 세균인 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 세균이 바실루스(Bacillus)속, 마이크로박테리움(Microbac terium)속, 마이크로코카스(Micrococcus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 세균이 바실루스(Bacillus)속 또는 마이크로박테리움 (Microbacterium)속인 것인 제조방법.
  9. 제6항에 있어서, 세균이 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 마이크로박테리움 라에바니포르마스(Microbacterium laevaniformas)인 제조방법.
  10. 제6항에 있어서, 세균이 바실루스 세레우스 DSC0007(Bacillus cereus DSC0007), 바실루스 세레우스 ATCC14579(Bacillus cereus ATCC14579) 또는 마이크로박테리움 라에바니포르마스 IFO14471(Microbacterium laevaniformas IFO14471)인 제조방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가, 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 미생물의 균체를 고압하에 파쇄하여, 음이온 크로마토그래피, 소수(疎水) 크로마토그래피, 이어서 음이온 크로마토그래피로 정제함으로써 얻어지는 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소인 제조방법.
  12. 화학식 I
    (식중, R1은 탄소수 1~6의 알킬기를 의미하고, R2는 수산기의 보호기를 의미한다.)로 표시되는 화합물을 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소, 또는 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 미생물의 배양액, 상기 미생물 균체 또는 상기 미생물 균체 처리물로 처리한 후의 혼합액으로부터 단리 채취하여 화학식 I-a
    화학식 I-a
    (식중, R1및 R2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 광학활성인 화합물을 얻고, 이 화합물 I-a를 비알코올계 용매 중에서 1급 알코올류 존재하에 수소화붕소 금속 화합물로 처리하여 화학식 II
    화학식 II
    (식중, R2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻고, 이 화합물 II와 화학식 III
    화학식 III
    (식중, X1, X2및 X3은 각각 독립적으로 할로겐원자를 의미한다.)으로 표시되는 화합물을 염기 존재하에 처리하여 화학식 IV
    화학식 IV
    (식중, R2, X1및 X2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻고, 이 화합물 IV의 니트로기의 아미노기로의 변환과 R2의 탈리를 동시에 행하는 것을 특징으로 하는 화학식 V
    화학식 V
    (식중, X1및 X2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 화학식 IV
    화학식 IV
    (식중, X1및 X2는 각각 독립적으로 할로겐원자를 의미한다. R2는 수산기의 보호기를 의미한다.)로 표시되는 화합물의 니트로기의 아미노기로의 변환과 R2의 탈리를 동시에 환원 조건하에서 행하여 화학식 V
    화학식 V
    (식중, X1및 X2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 비알코올계 용매가 방향족 탄화수소인 제조방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 1급 알코올류가 메탄올인 제조방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 수소화붕소 금속 화합물이 수소화붕소 나트륨인 제조방법.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 치환기를 갖고 있어도 되는 아랄킬기인 제조방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 벤질기인 제조방법.
  19. 화학식 I
    (식중, R1은 탄소수 1~6의 알킬기를 의미하고, R2는 수산기의 보호기를 의미한다.)로 표시되는 화합물을 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소, 또는 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 미생물의 배양액, 상기 미생물 균체 또는 상기 미생물 균체 처리물로 처리한 후의 혼합물로부터 단리 채취하는 것을 특징으로 하는 화학식 I-a
    화학식 I-a
    (식중, R1및 R2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 광학활성인 화합물을 얻어, 이 화합물을 비알코올계 용매 중에서 1급 알코올류 존재하에 수소화붕소 금속 화합물로 처리하여 화학식 II
    화학식 II
    (식중, R2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 광학활성인 화합물을 얻고, 이 화합물 II와 화학식 III
    화학식 III
    (식중, X1, X2및 X3은 각각 독립적으로 할로겐원자를 의미한다.)으로 표시되는 화합물을 염기로 처리하여 화학식 IV
    화학식 IV
    (식중, R2, X1및 X2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 광학활성인 화합물을 얻고, 이 화합물 IV의 니트로기의 아미노기로의 변환과 R2의 탈리를 동시에 행하여 화학식 V
    화학식 V
    (식중, X1및 X2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻고, 이 화합물 V에 화학식 VI
    화학식 VI
    (식중, Y는 탄소수 1~6의 알콕시기, 할로겐원자 또는 디(C1-C6알킬)아미노기를 의미하고, R3및 R4는 각각 독립적으로 탄소수 1~6의 알킬기를 의미한다.)로 표시되는 화합물을 반응시켜서 화학식 VII
    화학식 VII
    (식중, X1, X2, R3및 R4는 상기와 동일하다)로 표시되는 화합물을 얻고, 이 화합물 VII에 설포닐 화합물을 반응시켜서 화학식 VIII
    화학식 VIII
    (식중, R5는 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬설포닐기 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴설포닐기를 의미하고, X1, X2, R3및 R4는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻고, 이 화합물 VIII을 염기 조건하에 폐환하여 화학식 IX
    화학식 IX
    (식중, X1, X2, R3및 R4는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻고, 이 화합물 IX를 붕소 화합물의 존재하 또는 비존재하에 가열하여 화학식 X
    화학식 X
    (식중, R6은 탄소수 1~6의 알킬기 또는 BZ2(여기서 Z는 할로겐원자, C1-C6알콕시기 또는 C2-C7알킬카르보닐옥시기를 나타낸다)를 나타내고, X1및 X2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻고, 이 화합물 X에 4-메틸피페라진을 반응시켜서 화학식 XI
    화학식 XI
    (식중, X1및 R6은 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻고, 이어서 가수분해하는 것을 특징으로 하는 화학식 XII
    화학식 XII
    (식중, X1은 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서, 화학식 IV
    화학식 IV
    (식중, X1및 X2는 각각 독립적으로 할로겐원자를 의미한다. R2는 수산기의 보호기를 의미한다.)로 표시되는 화합물의 니트로기의 아미노기로의 변환과 R2의 탈리를 동시에 환원 조건하에 행하여 화학식 V
    화학식 V
    (식중, X1및 X2는 상기와 동일하다.)로 표시되는 화합물을 얻는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 비알코올계 용매가 방향족 탄화수소인 제조방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 1급 알코올류가 메탄올인 제조방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 수소화붕소 금속 화합물이 수소화붕소 나트륨인 제조방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 치환기를 갖고 있어도 되는 아랄킬기인 제조방법.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 벤질기인 제조방법.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 불소원자인 제조방법.
  27. 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 미생물의 균체를 고압하에 파쇄하여, 음이온 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 이어서 음이온 크로마토그래피로 정제함으로써 얻어지는 에스테르 비대칭 가수분해능을 갖는 효소.
KR1020037011568A 2001-03-07 2002-03-06 광학활성인 프로폭시아닐린 유도체의 제조방법 KR100868619B1 (ko)

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