WO2002066055A1

WO2002066055A1 - NOVEL MEDICINAL USE OF α ANTIGEN OR α ANTIGEN GENE

Info

Publication number: WO2002066055A1
Application number: PCT/JP2002/001459
Authority: WO
Inventors: Yasuhiro Yasutomi; Hitoshi Mizutani
Original assignee: Maruho Co., Ltd.
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2002-08-29
Also published as: EP1369127B1; US20060153880A1; US7622297B2; JPWO2002066055A1; JP4159362B2; US20090286734A1; ATE464065T1; EP1369127A1; US7524675B2; CA2443502A1; EP1369127A4; US20040076639A1; DE60235971D1; US20080132463A1

Description

明細書 a抗原または α抗原遺伝子の新規医薬用途技術分野

本突明は、抗酸菌（Mycobacterium) 由来の α抗原もしくはその類似体またはそれらをコードする遺伝子の新規医薬用途に関する。更に詳細には、 Mycobacterium kansasiiなどの抗酸菌由来の α抗原もしくはその類似体またはそれらをコードする遺伝子を含む発現ベクターの、アトピー性皮膚炎、喘息、ァレルギー性鼻炎、ァレルギ一性結膜炎などのァレルギ一性疾患の予防もしくは治療に用いる新規医薬用途に関する。背景技術

アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などのァレルギ一性疾患は、正常人が反応しない環境抗原などに対して過敏に反応を示し、自己の免疫系による各臓器の破壊、障害を生ずる疾患である。これらの疾患の発生機序としては、抗原に対する細胞性免疫応答に関与する Thl細胞と Th2 細胞のうち Th2細胞が産生するィンターロイキン- 4、ィンタ一口インキン- 5などの Th2型サイトカインがアレルギー反応を増強することが想定されている (Progress in Medicine 17 : 19-20, 1997) 。その誘導機序、調節機序の解明が生理学上、薬理学上重要な意味を持つが、詳細なメカニズムは明らかにされていない。現在これらの疾患の治療には、抗原からの回避、ヒスタミンなどのメディエーターの受容体への結合に拮抗する抗ヒスタミン剤の内服ゃステロイド外用剤などによる非特異的炎症反応の抑制が行われている（医学のあゆみ 180 : 51 - 55, 1997) 。

アレルギー性疾患の治療には、 Th2型サイトカイン優位のアレルギー状態を Thl型サイトカイン優位にすることによりァレルギ一反応を抑制することが考えられ、 Thl細胞が産生するインターフヱロン一 y力 Th2細胞が産生するインターロイキン - 4の IgE産生亢進作用を抑制することから（Progress in Medicine 17 : 19-20， 1997) 、インターフェロン- γがアレルギー性疾患の治療に試用されているが（J. Am. Acad. Dermatol. 32 : 684 - 685， 1991 ; Allergy 49 : 120-128, 1994; Acta Derm. Venereol 73 : 130-132, 1993) 、その効果が少なく満足な結果が得られておらず、臨床に供されていない。

アトピー性疾患の成立には、 Th2型サイトカイン優位の免疫状態の持続と続発する炎症反応の持続が問題となる。 Th2型サイトカイン優位の免疫状態の改善には、免疫抑制剤によるサイト力インの抑制も試みられているが（Br. J. Dermatol. 143 : 365-72， 2000 ; J. Allergy Clin. Immunol. 106 (1 Pt2)： S58-64, 2000) 、免疫状態の根本的改善にはつながらず効果に限界がある。

—方、 BCGワクチンは、牛型結核菌（Mycobacterium bovis) の弱毒株を用いたワクチンであり、ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis) 感染に対するヮクチンとして唯一認められている生菌ワクチンである。 BCGワクチンは、アジュバント活性が強く副作用が非常に少ないため、安全なワクチンとして、今日世界中で多くの人々に使用されている。現在では、 BCGワクチンは、 CD4+ヘルパー T細胞を、インターフェロン- γやインターロイキン- 2を産生し細胞性免疫に関与する Thl細胞にシフトさせる効果があることが報告されている（Cancer Immunol. Iramunother. 39 : 401-406, 1994; ibid. 40 : 103-108, 1995) 。

また、抗酸菌に普遍的に存在する蛋白として、抗原 85複合体が同定された。この蛋白複合体は分子量が 30- 32kd程度の抗原 85複合体構成蛋白 85A (Infect. Immun. 57 : 3123-3130, 1989)、抗原 85複合体構成蛋白 85B (J. Bacteriol. 170 : 3847- 3854, 1988)、抗原 85複合体構成蛋白 85C (Infect. Immun. 59 : 3205-3212， 1991) からなり、これらは抗酸菌の主要な分泌蛋白である。とれらの分泌蛋白は、 Mycobacterium tuberculosis、 Mycobacterium bovis、 Mycobacterium kansasii 等の同属の細菌間では遺伝子 ·アミノ酸配列が種を超えて高い相同性やモノク口ーナル抗体に対する交差反応性を示し (Microbiol. Rev. 56 : 648-661， 1992) 、共通の機能としてファイブロネクチン結合活性や細胞壁合成におけるミコリル基転移酵素活性を有する（Microbiol. Rev. 56 : 648-661, 1992 ; Science 276 : 1420-1422, 1997； Nat. Struct. Biol. 7 : 87-88, 2000) 。これら分泌、蛋白のなかで抗原 85複合体構成蛋白 858はひ抗原として広く知られている。更に現在では、結核菌の培養上精よりッベルクリン反応性蛋白質として、ひ抗原が分離 ·精製され、その分子中に抗原決定基が存在することが明らかにされ ( Am. Rev. Respir. Dis. 130 : 647—649， 1984; ibid. 132 : 173-174, 1985 ; Microbiological Reviews 56 : 648-661, 1992) 、この α抗原が上記した Thl細胞にシフトさせる効果を引き起こすものであることが報告されている（Infect. Immun. 60 : 2880-2886, 1992)。また、 BCG菌を組換え DNA技術を利用して改良し、これを種々の病原体に対するワクチンに利用する試みも行われている。例えば、 ct抗原をコードする遺伝子中にエイズウイルス表面抗原をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを構築し、このベクターで BCG菌を形質転換し、この形質転換体を BCGワクチンとして用いることが報告されている（W0 96/4009号公報)。しかしながら、今日まで、 a抗原をコードする遺伝子あるいは抗原そのものをアレルギー性疾患の治療に用いる試みはなされていない。また、ひ抗原が、 CD4+ヘルパー T細胞を Thl細胞にシフトさせる効果を有することが報告されてはいるが、 a抗原またはひ抗原遺伝子が、その発生機序等が未だ明確にされていないアトピー性皮膚炎、喘息等のァレルギ一性疾患の予防もしくは治療に有効であるかどうかは、未だ不明の状態である。また、前記した通り、アレルギー性疾患の成立には、 Thl型/ Th2型のバランスが Th2型優位な状態にシフトすることが重要と考えられてはいるものの、 Thl細胞側にシフトさせることのみにより、例えばァトピー十生皮膚炎の皮膚症状の改善がなされたという事例は未だ報告されていない。発明の開示

従って、本発明の目的は、 BCG菌などの抗酸菌由来のひ抗原もしくはその類似体またはそれらをコードする遺伝子をアレルギー性疾患の予防もしくは治療に用いる新規医薬用途を提供することにある。

本発明者は、抗酸菌由来のひ抗原遺伝子を、 Th2型サイトカイン優位の免疫状態にあって持続的にァトピー性皮膚炎様の皮膚炎症が起こるマウスモデルである Caspase - 1トランスジエニックマウスに対して、 α抗原をコードする遺伝子を含む発現べクタ一を適用したところ、インターロイキン -4の産生が抑制され、血中ヒスタミン値や IgE値も抑制され、皮膚疾患の改善も見られ、アトピー性皮膚炎が治癒されることを見出した。また、抗原蛋白によっても同様にアトピー性皮膚炎が治癒されることを見出した。更に、ひ抗原をコードする遺伝子を含む発現べクターをマウス喘息モデルに適用したところ、 IgE産生が抑制され好酸球浸潤等のアレルギー性症状が改善し喘息が治癒されることも見出した。従って、 α抗原遺伝子あるいは α抗原蛋白が、 Th2型サイト力イン優位の免疫状態を改善し、更にアレルギー性疾患の諸症状を抑制 '改善でき、広くアレルギー性疾患の予防もしくは治療に有効であることを明らかにし、本発明を完成させた。

従って、本発明は、抗酸菌由来のひ抗原、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体、またはそれらをコードする遺伝子を有効成分とするァレルギー性疾患の予防もしくは治療用医薬組成物に関する。

更に本発明は、抗酸菌由来の α抗原、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体、またはそれらをコードする遺伝子の有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することからなるアレルギー性疾患の予防もしくは治療方法に関する。更に本発明は、ァレルギ一性疾患の予防もしくは治療用医薬組成物を製造するための、抗酸菌由来の α抗原、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体、またはそれらをコードする遺伝子の使用に関する。

好ましい態様としては、本発明では、抗酸菌由来のひ抗原もしくはその類似体をコードする遺伝子を含む発現ベクター、あるいは α抗原蛋白もしくはその類似体蛋白を、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などのァトピー性疾患の予防もしくは治療に用いる。ここで、ひ抗原の類似体としては、抗原 85複合体構成蛋白 85Α、抗原 85複合体構成蛋白 85Cなどが挙げられる。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1で構築した、本発明のアレルギー性疾患の予防もしくは治療用医薬組成物の有効成分として用いるひ抗原をコードする遺伝子を含む発現べクターの構成を示す。

図 2は、抗原をコードする遺伝子を含む発現ベクターによるアトピー性皮膚炎の治療効果を示す図面である。図 3は、ひ抗原をコードする遺伝子を含む発現ベクターをマウス喘息モデに投与した時の血清中 IgE濃度を示すグラフである。

図 4は、抗原をコードする遺伝子を含む発現ベクターをマウス喘息モデルに投与した時の肺胞洗浄液中の蛋白濃度を示すグラフである。

図 5は、 α抗原をコードする遺伝子を含む発現ベクターをマウス喘息モデルに投与した時の肺胞洗浄液中の好酸球数を示すグラフである。

図 6は、 α抗原をコードする遺伝子を含む発現ベクターをマウス喘息モデルに投与した時の肺組織における好酸球の浸潤の度合!/ヽを示す図面である。

図 7は、 α抗原をコードする遺伝子を含む発現ベクターをマウス喘息モデルに投与した時の肺の組織学的検討結果を示す図面である。発明を実施するための最良の形態

本発明で対象とする疾患は、アレルギー性疾患であり、より具体的には、 Th2 型サイトカイン優位の状態によって引き起こされるアレルギー性疾患である。本発明で対象とする好適なァレルギ一性疾患は、特にァトピー性疾患であり、例えば、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などであり、なかでも特に、アトピー性皮膚炎および喘息である。

本発明で用いる抗酸菌由来のひ抗原もしくはその類似体をコードする遺伝子とは、ひ抗原蛋白あるいは抗原 85複合体構成蛋白 85A、抗原 85複合体構成蛋白 85C などの抗原蛋白の類似体を発現することが可能な遺伝子を指す。具体的には、 α抗原もしくはその類似体をコードする遺伝子を含む発現べクターの形態にある遺伝子が挙げられる。 α抗原をコードする遺伝子としては、 Mycobacterium kansasii Infect. Immun. 58 : 550-556， 1990 ) 、 Mycobacterium avium ( Infect. Immun. 61 : 1173-1179， 1993 ) 、 Mycobacterium intracellulare (Biochera. Biophys. Res. Commun. 196 : 1466 - 1473, 1993) 、 Mycobacterium leprae (Mol. Microbiol. 6 : 153-163， 1992) などの抗酸菌由来の o;抗原をコ一ドする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子のいずれも本発明に用いることができ、例えば Mycobacterium kansasiiの <¾抗原をコードする遺伝子として、配列番号 1に示す 390番目〜 1244番目までの塩基配列を有する DNAが挙げられる。この DNA以外にも、この DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズする変異体 DNAや、この DNAによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して 1若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び Z又は付加されたァミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNAであって、 Mycobacterium kansasii由来のひ抗原と同様の機能を有する蛋白質をコードする変異体であってもよい。ここで、この DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする変異体 DNAを得るための具体的方法としては、例えば次ぎのような方法が挙げられる。即ち、 50%ホルムアミド、 4xDenhardt、 5xSSPE (SSPE溶液： EDTAリン酸ナトリゥム塩 (SSPE)、 lxDenhardt ： 0. 02%フイコール、 0. 02%ポリビュルピロリドン、 0. 02%ゥシ血清アルブミン）、 0. 2%SDS、 100 /i g/ml ssDNA、および 12. 5ngのプローブ（配列番号 1に示す 390番目〜 1244番目までの塩基配列を有する、精製した cDNA断片 12. 5ngを、 BcaBest DNA Labeling Kit (TaKaRa)を用いて [ a - 32P] dCTP (Araersham) により標識したもの）存在下で 45°Cで 14〜16時間コロニーハイプリダイゼーシヨンを行って、フィルターを lxSSPE、 0. 5%SDS溶液中で 45°C/30分、その後 0. lxSSPE、 0. 5%SDS溶液中で 55°C/1時間、最終的に 0. lxSSPE、 0. 5%SDS溶液中で 65°C/1時間洗浄し、バックグラウンドを完全に落とした後、 X線フィルム (Fuji) に- 80°Cで 72時間露出し、対応するコ口ニーの位置を決定して単離することによって変異体 DNAを得ることができる。また、上記の Mycobacterium kansasii由来のひ抗原と同様の機能とは、同様のァレルギ一性疾患の予防もしくは治療効果を奏することを指す。これらの変異体は、それらがコードするァミノ酸配列が、ひ抗原蛋白のァミノ酸配列に対して通常 60%以上の相同性、好ましくは 75%以上の相同性を有するものである。 Mycobacterium kansasii以外の抗酸菌由来のひ抗原をコードする遺伝子の場合にも、同様にそれらの変異体であってもよい。

抗原の類似体である抗原 85複合体構成蛋白 85Aをコードする遺伝子としては、上記したひ抗原遺伝子についての各種抗酸菌と同様の抗酸菌由来の遺伝子が挙げられ、より具体的には、 Mycobacterium tuberculosis 由来の抗原 85複合体構成蛋白 85Aをコードする DNAが挙げられる（Infect. Immun. 57 : 3123-3130, 1989) 。抗原 85複合体構成蛋白 85Cをコードする遺伝子についても、同様に各種抗酸菌由来の遺伝子が挙げられ、より具体的には、 Mycobacterium tuberculosis 由来の抗原 85複合体構成蛋白 85Cをコードする DNAが挙げられる（Infect. Immun. 59 : 3205-3212, 1991) 。これらの DNAについても、上記したと同様に、これらの DNA 以外にも、これらの DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA や、この DNAによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して 1若しくは複数

(好ましくは数個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNAであって、抗原 85複合体構成蛋白 85Aあるいは抗原 85複合体構成蛋白 85Cと同様の機能を有する蛋白質をコードする変異体であってもよい。

上記した DNAは、前記文献に記載されている配列情報、 Genbank等の配列情報等に基づき適当な DNA部分を PCRのプライマーとして用レ、、抗酸菌由来の mRNAに対して RT - PCR反応を行うことなどにより、クローニングすることができる。また、ァミノ酸配列情報に基づき化学的に合成することも可能である。また上記した DNA の変異体は、例えば部位特異的突然変異誘発法、 PCR法、又は通常のハイブリダィゼーション法などにより容易に得ることができる。

本発明では、ァレルギ一性疾患の予防もしくは治療に抗酸菌由来のひ抗原蛋白、その類似体である抗原 85複合体構成蛋白 85Aもしくは抗原 85複合体構成蛋白 85Cそのもの、あるいはそれらの変異体蛋白を用いることもできる。このようなひ抗原としては、上記した α抗原をコードする遺伝子によってコードされる蛋白質が挙げられる。具体的には、例えば配列番号 1に示した Mycobacterium kansasii由来の塩基配列を有する DNAによってコードされる抗原であって配列番号 2に示したアミノ酸配列を有する抗原が挙げられる。このアミノ酸配列を有する α抗原以外にも、配列番号 2のアミノ酸配列に対して 1若しくは複数（好ましくは数個）の了ミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されたァミノ酸配列からなる蛋白質であって該 α抗原と同様の機能を有する変異体蛋白質であってもよい。 Mycobacterium kansasii以外の抗酸菌由来の α抗原の場合にも、同様にそれらのァミノ酸配列に対して 1若しくは複数（好ましくは数個）のァミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されたァミノ酸配列からなる蛋白質であって該抗原と同様の機能を有する変異体蛋白質であってもよい。また、抗原 85複合体構成蛋白 85Α もしくは抗原 85複合体構成蛋白 85Cについても、 Mycobacterium tuberculosis 由来の抗原 85複合体構成蛋白 85A ( Infect. Immun. 57 : 3123-3130， 1989 ) 、 Mycobacterium tuberculosis 由来の抗原 85¾合体構成蛋白 85C (Infect. Immun. 59 : 3205-3212, 1991) などが挙げられる。これらの a抗原蛋白の類似体についても、上記したひ抗原蛋白の変異体と同様の変異体であってもよい。

このような蛋白質は、それをコードする遺伝子を用いた組換え DNA法により製造することもでき、また化学的合成法によって製造することもできる。あるいは、 Mycobacterium kansasiiなどの抗酸菌を適当な培地で培養し、その培養液から公知の精製法によって精製して得ることもできる（Scand. J. Immunol. 43 : 202 - 209, 1996; J. Bacteriol. 170 : 3847-3854, 1988 ; Hiroshima J. Med. Sci. 32 : 1—8， 1983) 。

本発明において、アレルギー性疾患の予防もしくは治療に、抗酸菌由来の抗原、その類似体またはそれらの変異体をコードする遺伝子を用いる場合には、具体的には、通常、抗酸菌由来のひ抗原、その類似体またはそれらの変異体をコードする遺伝子を含む発現ベクターの形態で用いられる。これらの遺伝子を含む発現ベクターとしては、非ウィルスベクターを用いた場合と、ウィルスベクターを用いた場合の二つに大別される。

非ウィルスベクターとしては、生体内で抗原、その類似体またはそれらの変異体をコードする遺伝子を発現させ分泌させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターであっても良く、例えば pCAGGS (Gene 108 : 193-200，

1991) ) や、 pBK - CMV、 pcDNA3. 1、 pZeoSV (インビトロゲン社、ストラタジーン社）などの発現ベクターが挙げられる。

ウィルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターが代表的なものである。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイノレス、アデノゥイノレス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ヮクシニァゥイノレス、ボックスゥイノレス、ポリオウイルス、シンビスウイス、センダィウィルス、 SV40、免疫不全症ウィルス（HIV) 等の DNAウィルスまたは RNAウイルスが挙げられる。

これらのベクターに、ひ抗原、その類似体またはそれらの変異体をコードする遺伝子を発現可能なように導入にすることにより、発現ベクターが構築できる。これらの発現ベクターは、生体内への導入法にもよるが、通常、注射剤の形態としてヒトを含む哺乳動物に投与される。なお、ウィルスベクターの場合にはそのままの形態で投与することもできる。注射剤は常法により調製することができ、例えば適切な溶剤（PBS等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルタ一等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、後述するリボソーム製剤の形態とすることもできる。

かくして得られる発現べクターをァレルギ一性疾患の治療に用いるためには、通常の方法によって投与することができる。このような投与方法としては、細胞への遺伝子導入による方法がある。具体的には、リポフエクシヨン法、リン酸一カルシウム共沈法、 DEAE—デキストラン法、エレクトロポレーシヨン法、微小ガラス管を用いた DNAの直接注入法などが挙げられる。また、組織への遺伝子導入による方法もある。かかる方法としては、内包型リボソーム（internal type liposome) による遺伝子導入法、静電気型リボソーム（electrostatic type liposome) による遺伝子導入法、 HVJ—リボソーム法、改良型 HVJ—リボソーム法 (HVJ- AVEリボソーム法）、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともに DNA分子を細胞に移入する方法、 in vivoエレクトロポレーシヨン法などが挙げられる。また、非ウィルスベクターである発現プラスミドを生理食塩水に溶解してそのまま投与する、いわゆる naked- DNAの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等の方法を採用することもできる。

発現ベクターがウィルスベクターである場合には、そのまま投与することもでき、また、上記した注射剤の形態にして投与することもできる。

α抗原、その類似体またはそれらの変異体をコードする遺伝子を含む発現べクターは、通常ヒトを含む哺乳動物の皮膚、筋肉、腹腔等に投与される。投与量としては、発現ベクターの種類、投与形態、投与方法、対象患者、疾患の種類などにより変動しうるが、通常、発現ベクターとして、約 0. 005mg〜約 2mg、好ましくは約 0. lmg〜約 lmgであり、通常数ケ月に亘つて 1日 1回、合計 2〜3回投与するのが好ましい。本発明において、アレルギー性疾患の治療に、抗酸菌由来のひ抗原蛋白、その類似体蛋白またはそれらの変異体蛋白そのものを用いる場合には、通常、静脈、筋肉、腹腔、皮下、皮膚等に非経口的に投与することができる。非経口的に投与するには、通常、注射剤、局所投与剤等の形で投与することができる。

注射剤としては、無菌の溶液または懸濁液等が挙げられる。局所投与剤としては、例えば、クリーム、軟膏、ローション、スプレー、エアロゾル、経皮剤（通常のパッチ剤、マトリクス剤など）等が挙げられる。これらの製剤は通常の方法で、薬学的に許容される賦形剤、添加剤とともに製剤化される。薬学的に許容される賦形剤、添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。

具体的には、注射剤としては、溶液、懸濁液、？し剤等が挙げられる。例えば、

PBS緩衝液、生理食塩水、滅菌水等に α抗原蛋白を加え、必要に応じてアルブミン等を添加し、フィルタ一等で濾過滅菌し、無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また、凍結乾燥し、投与時に溶解して注射剤とすることもできる。局所投与剤として用いられる軟膏およびクリームは、例えば、水性または油' I"生の基剤に、 a抗原蛋白を增粘剤またはゲル化剤と共に加えて製剤化することができる。該基剤としては、例えば、水、液体パラフィン、植物油（ピーナッッ油、ひまし油等）等が挙げられる。増粘剤としては、例えばソフトパラフィン、ステアリン酸ァノレミニゥム、セトステアリルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ラノリン、水素添力卩ラノリン、蜜蟎等が挙げられる。ローションは、水性又は油性の基剤に、一種類またはそれ以上の薬学的に許容される安定剤、懸濁化剤、乳化剤、拡散剤、増粘剤、着色剤、香料等を加えて通常の方法により製剤化することができる。スプレー、エアロゾル、パッチ剤、マトリックス剤等も通常の方法により製剤化することができる。これら局所投与剤は、必要に応じて、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、クロロタレゾール、ベンズアルコニゥムク口リド等の防腐剤、細菌増殖防止剤を含んでいても良い。

α抗原蛋白、その類似体蛋白またはそれらの変異体蛋白の投与量、投与回数は症状、年齢、体重、投与形態等によって異なるが、注射剤として投与する場合には約 lmg〜約 lOmgの範囲、好ましくは約 lrag〜約 5mgの範囲を通常 1回または数回に分けて投与することができる。局所投与する場合には、通常程度の投与量で数日間に亘つて投与することができる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではなレ、。

実施例 1

ひ抗原をコードする遺伝子を含む発現べクターのァトピー性皮膚炎に対する効果 ( 1 ) 発現ベクターの構築

配列番号 1に示した 390番目〜 1244番目の塩基配列からなる Mycobacterium kansasiiの抗原遺伝子（α - K) を、 pcDNA3. 1 (Invitrogen CA) の Kpnl - Apal部位に挿入して、 CMVプロモーター及ぴ TPAシグナルぺプチドの下流に組み込んだ、図 1に示した構成を有する発現ベクター pcDNA - α - Kを、本発明のアレルギー性疾患治療用医薬組成物の有効成分として構築した（Infect. Imraun. 58 : 550-556， 1996) 。

( 2 ) ァトピー性皮膚炎マウスモデルに対する発現ベクターの投与

i) 方法

皮膚特異的 Caspase- 1発現をし Th2優位の免疫状態にあるトランスジヱニックマウス（CTg) (J. Immunol. 165 : 997-1003, 2000; Nat. Immunol. 1 : 132-137， 2000) を用いた。このマウスは、生後 8週目よりアトピー性皮膚炎を発症した。生後 4、 10および 12週目（4、 10および 12週齢）の CTgマウスに、上記（1 ) で構築した発現ベクター 100 gを PBSに溶解して腹腔内に投与した。そして、 4、 10 および 12週齢の CTgマウスに投与後 8週目に、 CTgマウスの血清中のヒスタミン濃度および IgE濃度、並びに皮膚におけるィンターロイキン一 4mRNAの発現レベルを調べた。ヒスタミン濃度および IgE濃度は RIA法により、インターロイキン一 ½RNAは RT- PCR法により測定した。

ii) 結果

得られた結果を表 1に示した。表 1の結果から判るように、発現ベクターを投与した CTgマウス群では、血中 IgE濃度おょぴヒスタミン濃度の上昇は認められず、正常域であった。また、皮膚のインターロイキン- 4mRNAは検出されなくなった。また、観察期間中、皮膚炎の発症は観察されず、搔破行動もなかった。

これに対して、無処置 CTgマウスでは、 8週目より皮膚炎を発症し、搔破行動を示した。また、血中 IgE値およびヒスタミン値も高値を示した。

：アトピー性皮膚炎に対する効果

ヒスタミン（n M/L) IgE濃度（ R /ml) 皮膚 IL-4mRNA 投与後同腹無処投与後投与後投与時期投与前 8週目 8週目投与前 8週目

4週齢 158 15 16 0 + + 一 10週齢 230 47 19 0 + + —

12週齢 200 170 35 0 + + 一また、図 2として、各種 CTgマウスの写真を示した。左上の写真は、アトピー性皮膚炎発症時の CTgマウスを示しており、右上の写真は、 12週齢の無処置の同腹 CTgマウスを示す。左下の写真は、プレドニゾロンを同腹 CTgマウスに 7日間筋注投与して治療した結果を示す。右下の写真は、上記（1 ) で構築した発現べクターを、 4週齢の CTgマウスに腹腔内投与し投与後 8週目の治療効果を示す。発現ベクター投与後、観察期間中（1年間）発症は認められなかった。これらの写真から、 α抗原をコードする遺伝子を含む発現ベクターを投与することにより、ァトピー性皮膚炎の発症予防および治療を極めて効果的にできることが判る。

実施例 2

α抗原蛋白のァトピー性皮膚炎に対する効果

i) 方法

Mycobacterium kansasiiを Sauton培地にて 3週間培養し、この培養液上清を 80% 硫酸アンモニゥムで沈殿させ蛋白質画分とした。この蛋白質画分を二次元電気泳動で展開♦分離したゲルの対応するスポットより抽出 ·精製した α抗原蛋白質 ( Scand. J. Immunol. 43 : 202 - 209， 1996 ; J. Bacteriol. 170 : 3847-3854, 1988 ; Hiroshima J. Med. Sci. 32 : 1-8， 1983) を PBSに 1 mg/mlの濃度で溶解した。この α抗原蛋白溶液またはコントロール PBS溶液 1 μ 1ずつを 4週令の CTgマウス（N = 3ずつ）の頭部に、 1日 1回ずつ 1週間塗布後の体毛の状態を目視による観察で効果を判定した。

ii) 結果

効果の有無を体毛の生え残り方の多少で + (体毛が生えているのが見える）または- （皮膚に体毛が見えない）と判定したところ、 PBS溶液のみ塗布のコント口ールでは頭部の体毛が（痒みのため）搔破されてただれた皮膚表面が露出していた（）のに比較し、ひ抗原蛋白塗布群では頭部の体毛がそのまま残っていた

( +〜+ +) 。

実施例 3

α抗原をコードする遺伝子を含む発現ベクターの喘息に対する効果

i) 方法

BALB/Cマウス（各群 N=6) に、卵白アルブミン 10 _§、ミヨウパン lmgを実験開始 0日目及び 14日目にそれぞれ等量を腹腔内投与して免疫し、 21日目より毎日 5日間エア口ゾルにて 5%卵白アルブミンを吸引させ、喘息モデルを作製した。実施例 1の（1 ) で構築した発現ベクター 100 // gまたは加熱 BCG死菌 100 μ _§を 0日目及び 14日目にそれぞれ等量ずつ腹腔内投与した。実験開始 25日目に効果判定のため、血清中 IgE濃度、肺胞洗浄液中の蛋白濃度、好酸球数を測定し、更に肺組織における好酸球染色（Luna染色）により好酸球の浸潤を調べた。また、肺組織を組織学的に検討した。

ii) 結果

測定した血清中 IgE濃度、肺胞洗浄液中の蛋白濃度、好酸球数、好酸球の浸潤および月巿組織像の結果をそれぞれ図 3力、ら 7に示した。図 3の結果から分かるように、血清中 IgE濃度はひ抗原遺伝子を含む発現べクター投与群では無治療群に比べ有意に低下していた。図 4の結果から分かるように、炎症反応の指標である肺洗浄液中の蛋白濃度は、発現べクター投与群では無治療群および BCG投与群に比べて明らかに低値であった。図 5の結果から分かるように、発現ベクター投与群においては肺洗浄液中に浸潤する好酸球数は明らかに抑制され、その効果は BCG投与群よりも顕著であった。図 6の結果から分かるように、無治療群では多くの好酸球の浸潤が認められたが発現べクター投与群では殆ど認められなかった。図 7の結果から分かるように、無治療群では明らかなァレルギ一性炎症が認められたが発現べクタ一投与群では正常マウスとほとんど差がなかった。

以上から、 α抗原遺伝子を含む発現べクタ一投与群では無処理正常マウスにより近い、著しい喘息症状の抑制効果が認められ、その効果は等量の BCG投与を上回ると考えられた。産業上の利用の可能性

以上に詳細に記載した通り、抗原、その類似体またはそれらの類似体をコ一ドする遺伝子を含む発現ベクターをァトピー性皮膚炎に対して投与した場合には、ヒスタミンの放出を抑制し、更に IgE、インターロイキン- 4の産生を抑制し、皮膚疾患の改善をもたらしアトピー性皮膚炎の治療に極めて有効な効果を発揮することができる。また、ひ抗原蛋白、その類似体蛋白またはそれらの類似体蛋白も同様にァトビー性皮膚炎の治療に極めて有効な効果を発揮する。 α抗原蛋白、その類似体蛋白またはそれらの類似体蛋白が Th2型サイトカイン優位の免疫状態を改善する効果を発揮すると考えられ、従って、ひ抗原、その類似体またはそれらの変異体をコードする遺伝子、および α抗原蛋白、その類似体蛋白またはそれらの変異体蛋白は、 Th2型サイトカイン優位の免疫状態に起因する、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などのァトピー性疾患、更に広くァレルギ一性疾患の予防もしくは治療に極めて有効である。

Claims

請求の範囲

I . 抗酸菌由来のひ抗原、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体、またはそれらをコ一ドする遺伝子を有効成分とするァレルギ一性疾患の予防もしくは治療用医薬組成物。

2 . 遺伝子が発現べクターの形態にある請求項 1のァレルギ一性疾患の予防もしくは治療用医薬組成物。

3 . ひ抗原が、 Mycobacterium kansasii由来のひ抗原である請求項 1または 2 のァレルギ一性疾患の予防もしくは治療用医薬組成物。

4 . α抗原の類似体が、抗原 85複合体構成蛋白 85Αまたは抗原 85複合体構成蛋白 85Cである請求項 1または 2のァレルギ一性疾患の予防もしくは治療用医薬組成物。

5 . アレルギー性疾患が、 Th2型サイト力イン優位の状態によって引き起こされるァレルギ一性疾患である請求項 1カゝら 4のいずれかのァレルギ一性疾患の予防もしくは治療用医薬組成物。

6 . アレルギー性疾患が、アトピー性疾患である請求項 1から 5のいずれかのァレルギ一†生疾患の予防もしくは治療用医薬組成物。

7 . アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎または了レルギ一性結膜炎である請求項 1カゝら 6のいずれかのァレルギ一性疾患の予防もしくは治療用医薬 ¾S成物。

8 . ァレルギ一性疾患が、ァトピー性皮膚炎または喘息である請求項 1から 7 のいずれかのアレルギー性疾患の予防もしくは治療医薬組成物。

9 . 抗酸菌由来のひ抗原、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体、またはそれらをコードする遺伝子の有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することからなるァレルギ一性疾患の予防もしくは治療方法。

1 0 · 遺伝子が発現べクターの形態にある請求項 9の予防もしくは治療方法。

I I . α抗原が、 Mycobacterium kansasii由来の抗原である請求項 9または 1 0の予防もしくは治療方法。

1 2 . α抗原の類似体が、抗原 85複合体構成蛋白 85Αまたは抗原 85複合体構成蛋白 85Cである請求項 9カゝら 1 1のいずれかの予防もしくは治療方法。

1 3 . アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎またはァレルギ一性結膜炎である請求項 9カゝら 1 2のいずれかの予防もしくは治療方法。

1 4 . アレルギー性疾患の予防もしくは治療用医薬組成物を製造するための、抗酸菌由来のひ抗原、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの類似体、またはそれらをコードする遺伝子の使用。

1 5 . 遺伝子が発現ベクターの形態にある請求項 1 4の使用。

1 6 . ひ抗原カ、 Mycobacterium kansasii由来のひ抗原である請求項 1 4または 1 5の使用。

1 7 . ひ抗原の類似体が、抗原 85複合体構成蛋白 85Aまたは抗原 85複合体構成蛋白 85Cである請求項 1 4から 1 6のいずれかの使用。

1 8 . アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎またはアレルギー性結膜炎である請求項 1 4カゝら 1 7のいずれかに記載の使用。