WO2007037265A1 - Dnaワクチン組成物 - Google Patents

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WO2007037265A1
WO2007037265A1 PCT/JP2006/319162 JP2006319162W WO2007037265A1 WO 2007037265 A1 WO2007037265 A1 WO 2007037265A1 JP 2006319162 W JP2006319162 W JP 2006319162W WO 2007037265 A1 WO2007037265 A1 WO 2007037265A1
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amino acid
dna vaccine
acid sequence
virus
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Masaji Okada
Shigeto Yoshida
Toshihiro Nakajima
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National Hospital Organization
Jichi Medical University
Genomidea Inc.
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a virus envelope vector and a virus envelope vector effective for treating or preventing various diseases (infectious diseases, cancer diseases, neurodegenerative diseases, allergic diseases, autoimmune diseases, etc.).
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising an enclosed DNA vaccine as an active ingredient, and a method for producing the same.
  • the present invention relates to a DNA-activator comprising a virus envelope vector as an active ingredient and improving the efficiency of transferring a DNA vaccine into a living body.
  • DNA vaccines are being developed as new vaccine species based on induction of immunity by administration of plasmid DNA encoding an immunogenic protein.
  • DNA vaccines can induce not only humoral immune responses but also cellular immunity, so that they can protect against diseases, DNA vaccines can be highly purified, even at room temperature or at high temperatures.
  • Stable, refrigerated storage is not essential and can be stored for a long period of time, it is easy to improve DNA vaccines quickly by genetic engineering techniques, and the time spent on vaccine development is shortened. .
  • infectious diseases Diseases and disorders caused by infection with various microorganisms and viruses (hereinafter referred to as infectious diseases) exist, and not only humans but all animals including domestic animals, pet animals, etc. bear the risk. Since ancient times, drugs and treatments for various infectious diseases have been developed, and among them, vaccines have been effective against many infectious diseases. However, most of the infectious diseases have been eradicated.
  • tuberculosis is one of the world's largest infectious diseases, and there is an urgent need for the development of a vaccine that is more effective than BCG.
  • the present inventors have developed a DNA vaccine against tuberculosis (see Non-Patent Document 1). Among them, it has been clarified that HSP65 DNA + IL-12 DNA vaccine is effective as a tuberculosis-preventing vaccine (see Non-Patent Documents 2 and 3).
  • Non-Patent Documents 4 and 5 many gene methods and non-viral (synthetic) methods for gene transfer have been developed for gene therapy. In general, viral methods are more effective than non-viral methods for gene delivery into cells.
  • viral vectors can create safety issues due to co-introduction of essential genetic elements from the parent virus, leaky expression of viral genes, immunogenicity, and alteration of host genome structure.
  • non-viral methods are less cytotoxic and immunogenic.
  • most non-viral methods are particularly less efficient at transferring genes into the body than some viral vectors.
  • both viral and non-viral methods have their advantages. Therefore, in order to develop in vivo transfer vectors with high efficiency and low toxicity, the limitations of one type of vector system are compensated by introducing the advantages of another type of system. There is a need.
  • Patent Document 1 WO01 / 57204
  • Patent Document 2 JP 2002-065278
  • Patent Document 3 WO03 / 014338
  • Non-patent document 1 Zenji Okada "Immune decline and tuberculosis” clinical science 35, 344, 1999
  • Non-Patent Document 2 Zenji Okada “Latest Medicine” 57 ⁇ 9 1942-1952 (2002)
  • Non-Patent Document 3 Zenji Okada and Takao Tanaka “Gene Therapy” 6-2 No. 251-258 (2002)
  • Non-Patent Document 4 Mulligan, R.C., Science, 260, 926-932 (1993)
  • Non-Patent Document 5 Adams, R. M., et al, J. Virol, 69, 1887-1894 (1995)
  • the present invention has been made in view of such a situation, and its purpose is to treat various diseases (infectious diseases, cancer diseases, neurodegenerative diseases, allergic diseases, autoimmune diseases, etc.). Or a virus envelope vector effective for prevention and the virus envelope vector. It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising a DNA vaccine encapsulated in Kuta as an active ingredient, and a method for producing the same. Another object of the present invention is to provide a DNA vaccine enhancer characterized by using a virus envelope vector as an active ingredient and improving the efficiency of transferring a DNA vaccine into a living body.
  • the present inventors have encapsulated a DNA vaccine in a viral envelope vector and examined whether the effect of the DNA vaccine can be enhanced.
  • a DNA vaccine (Hsp65 DNA and IL-12 DNA) effective as a tuberculosis vaccine is encapsulated in a Sendai virus envelope vector and administered to a model mouse, whereby the DNA vaccine composition is infected with M. tuberculosis. Whether or not it shows preventive and therapeutic effects.
  • Sendai virus envelope vector enhances the efficacy of tuberculosis DNA vaccines HSP65 and IL-12. It was also found that the combined use of Sendai virus envelope vector encapsulating DNA vaccine and BCG, a tuberculosis vaccine, enhances the prevention and treatment effect of M. tuberculosis infection.
  • the present inventors have found that the effect of the DNA vaccine is enhanced by enclosing the DNA vaccine in a virus envelope vector for the first time according to the present invention, and have completed the present invention. .
  • the present invention provides the following [1] to [34].
  • a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient a virus envelope vector and a DNA vaccine enclosed in the virus envelope vector.
  • the Winores Envelope Vector is a Retroviridae, Togaviridae, Coronawinores, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Boxviridae, Herpesviridae and [1]
  • the virus envelope vector is derived from one virus selected from the group consisting of Sendai virus, retrovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, box virus and influenza virus force, [1 Pharmaceutical composition object.
  • virus envelope vector is Sendai virus envelope vector (HVJ-E).
  • DNA vaccine power Infectious disease, cancer disease, neurodegenerative disease, allergic disease, autoimmune disease power group power selected DNA vaccine consisting of DNA that codes for immunogenic proteins involved in one type of disease
  • infectious disease is an infectious disease selected from the group consisting of tuberculosis, malaria, toxoplasma and HIV.
  • DNA vaccine power The pharmaceutical composition according to [1], which is a DNA vaccine comprising a polynucleotide encoding a heat shock protein and / or an immunoregulatory protein in a form capable of expressing.
  • a polynucleotide composition encoding an immunomodulating protein The pharmaceutical composition according to [7], which is a polynucleotide encoding IL-12.
  • Polynucleotide force encoding HSP65 A polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or one or more amino acids in the amino acid sequence are substituted, deleted, added and Z or inserted.
  • a DNA vaccine enhancer comprising a virus envelope vector as an active ingredient.
  • Retroviridae Virus envelope vector strength Retroviridae, Togaviridae, Coronaviruses, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyawirs, Rhabdoviridae, Boxviridae, Herpesviridae and [16]
  • the DNA-enhancing agent according to [16] which is derived from one virus selected from the group that also has the ability of Baculovirus.
  • the virus envelope vector is derived from a single virus selected from the group consisting of Sendai virus, retrovirus, adeno-associated Winores, herpes virus, vaccinia virus, box virus and influenza virus, [16] The DNA vaccine enhancer described.
  • the DNA vaccine potentiator according to [16] which enhances a DNA vaccine against one selected disease, consisting of infectious diseases, cancer diseases, neurodegenerative diseases, allergic diseases, and autoimmune diseases .
  • DNA vaccine power The DNA vaccine enhancer according to [16], which is a DNA vaccine comprising a polynucleotide capable of expressing a heat shock protein and / or a polynucleotide encoding an immunoregulatory protein.
  • Infectious disease, cancer disease, neurodegenerative disease, allergic disease, or autoimmune disease comprising the step of administering to the subject the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [14] How to prevent or treat.
  • a method for preventing or treating an infectious disease comprising a step of simultaneously administering BCG to a subject in addition to the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [14].
  • a pharmaceutical composition kit comprising the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [14] and BCG as active ingredients.
  • a vaccine enhancer that enhances the efficacy of a conventional DNA vaccine, a virus envelope vector with the enhanced efficacy, and a pharmaceutical composition comprising a DNA vaccine encapsulated in the virus envelope vector as an active ingredient, And a method for producing the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition comprising the virus envelope vector and the DNA vaccine encapsulated in the virus envelope vector as an active ingredient in the present invention has a remarkable vaccine efficacy compared to the case where the DNA vaccine is not encapsulated in the vector. Has been enhanced. Therefore, a pharmaceutical composition comprising a virus envelope vector and a DNA vaccine encapsulated in the virus envelope vector as an active ingredient has improved the effectiveness of the DNA vaccine, and various diseases (infectious diseases, cancer diseases, neurodegeneration) Diseases, allergic diseases, autoimmune diseases, etc.).
  • FIG. 1 is a diagram showing lung CFU (loglO) in groups 1 to 8 (see Table 1).
  • FIG. 2 is a graph showing liver CFU (loglO) in groups 1 to 8 (see Table 1).
  • FIG. 3 is a photograph showing HE stained microscopic images of lungs of groups 1, 2, 4 and 6 (see Table 1).
  • FIG. 4 is a photograph showing HE-stained microscopic images of livers of Groups 1, 2, 4, and 6 (see Table 1). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention is based on the knowledge that the DNA vaccine for various diseases can be further enhanced by encapsulating the DNA envelope in a viral envelope.
  • the pharmaceutical composition comprising the viral envelope vector of the present invention and the DNA vaccine encapsulated in the viral envelope vector as an active ingredient is obtained by encapsulating the DNA and DNA construct acting as a DNA vaccine in the viral envelope vector. It is out.
  • the pharmaceutical composition is a composition for administration to a patient or a subject, containing one or more active ingredients that are effective in treating or preventing a disease, and the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the product contains a DNA vaccine as an active ingredient.
  • infectious diseases for example, viral hepatitis, HIV, Japanese encephalitis, malaria, toxoplasma, tuberculosis
  • cancer diseases regardless of site and cancer type. No.
  • neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, senile dementia
  • allergic diseases such as atopic dermatitis, hay fever
  • autoimmune diseases include all diseases, disorders and symptoms, but examples include infectious diseases (for example, viral hepatitis, HIV, Japanese encephalitis, malaria, toxoplasma, tuberculosis), cancer diseases (regardless of site and cancer type). No.), neurodegenerative diseases (such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, senile dementia), allergic diseases (such as atopic dermatitis, hay
  • the pharmaceutical thread composition of the present invention can be used for the treatment and / or prevention of any disease, but in particular for infectious diseases such as tuberculosis, malaria, toxoplasma and HIV, most preferably M. tuberculosis infection. It is valid.
  • the DNA vaccine that can be used in preparing the pharmaceutical composition of the present invention may be any as long as it contains DNA or a DNA construct having the efficacy of a vaccine against any infectious disease.
  • DNA or DNA constructs that act as DNA vaccines, especially against tuberculosis are preferred and may be mentioned as examples.
  • Various DNA proteins are known for various diseases, any of which can be used, and DNA vaccines invented in the future can also be used.
  • Examples of the DNA vaccine in the present invention include a DNA vaccine comprising DNA encoding a heat shock protein and / or an immunomodulatory protein.
  • heat shock protein in the present invention, any heat shock protein can be mentioned.
  • heat shock proteins are known to be involved in a wide variety of reactions in the body, many heat shock proteins having a function of modifying the immune system have been reported, for example, HSP70, HSP65, HSP60 and the like have been reported, and these may be heat shock proteins used in the present invention.
  • the immunoregulatory protein in the present specification is a general term for proteins having a function of regulating the immune response, and includes, for example, various interleukins (IL), tumor necrosis factor (TNF) and the like.
  • IL-12, GM-CSF, IL-1, TNF- ⁇ , TNF-j8, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, IL-18 , And BL-1 are examples of forces that are not limited to these.
  • the DNA vaccine enhancer in the present invention include a composition that can enhance the effect of the DNA vaccine as a vaccine by being administered together with any DNA vaccine.
  • tuberculosis DNA vaccines include DNA molecules that contain both a polynucleotide encoding HSP65 and a polynucleotide encoding IL-12, where HSP65 is derived from any Mycobacterium tuberculosis, for example. Can be illustrated.
  • tuberculosis DNA-cutting of the present invention includes both a polynucleotide encoding HSP65 derived from Mycobacterium tuberculosis H37RV and a polynucleotide encoding mouse IL-12, as reported by the present inventors.
  • a DNA molecule A DNA molecule.
  • the polynucleotide encoding HSP65 and the polynucleotide encoding IL-12 may be used in combination with two types of DNA molecules each containing one of the sequences that need not be included in the same DNA molecule. .
  • polynucleotide encoding HSP65 refers to a polynucleotide encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Furthermore, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, one or several, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, amino acid residue substitution, deletion, addition, and Z or insertion It also includes an amino acid sequence and a DNA that encodes a protein functionally equivalent to the protein having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 1, ie, a protein having activity as HSP65. For amino acid residues to be mutated, it is desirable that the amino acid side chain properties be preserved and mutated to another amino acid. .
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids with aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids with hydroxyl-containing side chains (S, T, ⁇ ), sulfur atom-containing side chains
  • the amino acids (, F, Y, W) that can be used can be listed (the parentheses indicate the single letter of amino acids). It has already been found that a polypeptide having an amino acid sequence modified by deletion, addition or substitution of one or more amino acid residues to a certain amino acid sequence and substitution by Z or other amino acid retains its biological activity. Known.
  • the “polynucleotide encoding IL-12” used in the present invention is preferably a polynucleotide encoding IL-12 derived from the animal species to be administered.
  • it when administered to a human, it means DNA encoding the A and B subunits of human IL-12 (also referred to as p35 and p40, respectively).
  • the amino acid sequence of each subunit of HL-12 is shown in SEQ ID NOs: 2 and 3.
  • the amino acid sequence at positions 1 to 56 is a signal peptide
  • the amino acid sequence at positions 57 to 253 is a mature peptide.
  • the “polynucleotide encoding -12” only needs to include a polynucleotide encoding the mature peptide so that the mature peptide can be expressed.
  • the amino acid sequence at positions 1 to 22 is a signal peptide
  • the amino acid sequence at positions 23 to 328 is a mature peptide.
  • the “polynucleotide encoding HL-12” may contain a polynucleotide encoding the mature peptide so that the mature peptide can be expressed.
  • DNA encoding a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 2 and 3, ie, a protein having an activity as a subunit of IL-12 may be used.
  • DNA encoding a partial fragment of length that functions to modulate the immune response may be used.
  • IL-12 IL-12 derived from the species of animal to which it is administered. Since the amino acid sequences of mouse IL-12 and HI-12, which do not need to be tides, are highly homologous, they can be used interchangeably. Furthermore, those derived from other animal species can be used for humans.
  • the mature peptide power of two subunits of IL-12 are linked by an appropriate linker peptide (eg, Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, SEQ ID NO: 6). It may be expressed in For example,
  • the phrase "comprising an expressible form" of a polynucleotide encoding a predetermined peptide means that when the polynucleotide is inserted into an expression vector and enters an animal cell, It means that a predetermined peptide can be expressed in the cell. That is, for example, it means that the code DNA is arranged under the control of a promoter suitable for the animal species to be administered and the administration site.
  • a DNA molecule to be expressed and a DNA molecule having a DNA force necessary to express the DNA are sometimes referred to as “DNA construct”.
  • the DNA molecule constituting the DNA vaccine contains elements necessary for the DNA to act as a vaccine (that is, elements necessary for expressing the encoded protein), such as a promoter sequence. There is a case. That is, it may be in a form linked to an expression cassette or expression vector so that the protein encoded by the DNA can be expressed.
  • HSP65 and IL-12 are included in an expression cassette or expression vector capable of functioning in the animal to which the DNA is administered. It can be obtained by linking them so that they are expressed together.
  • DNA encoding HSP65 and DNA encoding IL-12 are linked in appropriate expression vectors (for example, pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, CA)) in an expressible form.
  • appropriate expression vectors for example, pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, CA)
  • the DNA containing the sequence encoding HSP65 and the DNA containing the sequence encoding IL-12 are contained in different DNA constructs (expression vectors). Also good.
  • the DNA construct may contain one or more enhancers in order to increase the expression level of the target peptide.
  • encapsulation may be performed by any of these methods.
  • the method may be performed as described in the examples below, or Encapsulation may be performed by a person skilled in the art with any modification.
  • the encapsulation efficiency can be improved by using a surfactant.
  • the surfactant used here may be any one such as Triton X100, deoxycholic acid or cholic acid or a salt thereof, and Triton X100 is particularly preferred.
  • a virus envelope or a virus envelope vector is a virus outer membrane after removing RNA or DNA from a virus envelope, and is usually transferred to a cell by enclosing a gene, polynucleotide, oligonucleotide or the like. It is used to do.
  • the vector used in the present invention may be derived from any virus.
  • the type of virus is not limited, but specific examples include, for example, Retroviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Boujainoridae, Ravineinores, Examples include the Box Winores family, the Henolepesuinoles family, the Baculovirus family, and the Hepadnavirus family.
  • Preferred viruses include Sendai virus, retrovirus, subdenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, box virus, influenza virus and the like.
  • a particularly preferred virus is Sendai virus (HVJ), which is one of the mouse pneumonia viruses.
  • Sendai virus and “HVJ” (Hemagglutinating virus of Japan) are used interchangeably, and belong to the genus Paramyxovirus belonging to the family Nomyxoviridae and have a cell fusion action.
  • Sendai virus particles have envelopes and have the ability to fuse various cells, so they are widely used for cell fusion, such as the formation of heterokaryons in cells and the production of hybrid cells.
  • the Sendai virus envelope vector is referred to as HVJ-E.
  • Sendai virus includes VR-105 strain and VR-907 strain, which are available from, for example, American Type Culture Collection (ATCC: http: ⁇ www.atcc.org/).
  • JP 2001-286282 A (WO01 / 57204), JP 2002-065278 A, WO-A03 / 014338 (PCT / JP02 / 07879)
  • JP 2001-286282 A (WO01 / 57204)
  • JP 2002-065278 A WO-A03 / 014338
  • PCT / JP02 / 07879) For example, according to Example 8 in JP-A-2001-286282.
  • the DNA vaccine composition of the present invention comprises any pharmaceutically acceptable carrier (eg, isotonic solution containing physiological saline, glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D -mann -Tolu, sodium chloride sodium salt, suitable solubilizers such as alcohol, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM ), HCO-50 and the like, but not limited thereto.
  • the composition may contain appropriate excipients and adjuvants.
  • DNA vaccine compositions are also suitable pharmaceutically acceptable, including other compounds that promote envelope processing to prepare excipients or pharmaceutically acceptable carriers.
  • a carrier may be included.
  • biocompatible materials such as silicone, collagen, and gelatin may be included.
  • it may be an emulsion containing various adjuvants.
  • Various adjuvants are known, and those skilled in the art can easily select an appropriate one.
  • one or more additives for formulation selected from diluents, fragrances, preservatives, excipients, disintegrants, lubricants, binders, emulsifiers, plasticizers, and the like. May contain!
  • a DNA vaccine composition for oral administration may be formulated using pharmaceutically acceptable carriers well known in the art in a dosage form suitable for administration.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited, but is preferably administered parenterally.
  • Parenteral administration includes, for example, intravenous, intraarterial, subcutaneous, intradermal, intramuscular or intraperitoneal administration, more preferably nasal administration, pulmonary administration, transmucosal administration, intratracheal administration, Intraocular administration and the like can be mentioned.
  • the dose and frequency of administration of the vaccine composition according to the present invention depend on the purpose of administration, whether the infection is initial infection or reinfection, and the age and weight of the patient, the severity of symptoms and disease. It can be appropriately selected and changed according to various conditions such as severity.
  • An amount equivalent to the amount of DNA vaccine encapsulated in the envelope can be administered without encapsulating it, but a smaller amount may be administered.
  • the DNA vaccine is administered within a range of 0.01 to 5 mg per kg body weight, for example, 1 to 15 mg / dose of DNA can be administered per adult. It is preferable to administer several times, preferably about 1 to 3 times at intervals of about 1 to 4 weeks (for example, 8 days or 3 weeks). The number of doses can be determined while monitoring the disease state.
  • the vaccine composition of the present invention can be used in combination with other drugs or vaccines.
  • the vaccine composition of the present invention may be administered simultaneously with other drugs, or may be administered at intervals, but the order of administration is not particularly limited.
  • the vaccine thread and the composition of the present invention is administered once, twice or three times (for example, at intervals of 1, 2, 3 or 4 weeks). Thereafter, the usual amounts of BCG may be administered at 1, 2, 3 or 4 week intervals.
  • the effect of preventing tuberculosis can be increased compared to a single administration of BCG.
  • the vaccine thread and the composition of the present invention may be administered 1, 2 or 3 times (for example, at intervals of 1, 2, 3 or 4 weeks) after administration of the usual amount of BCG.
  • the effect of preventing tuberculosis can be increased compared to a single administration of BCG.
  • a polynucleotide encoding the above-mentioned HSP65 and a polynucleotide encoding IL-12 are used as a DNA vaccine as a DNA vaccine
  • these polynucleotides can be used as they are in a form that can act as a DNA vaccine (in other words, Compared with the case of administration in the naked state), when the polynucleotide is encapsulated in a viral envelope, the DNA is used in combination with BCG and not with BCG. Potency as a vaccine can be increased.
  • the vaccine composition of the present invention is administered simultaneously with BCG, a higher vaccine effect can be obtained than when administered with BCG alone.
  • the dose of BCG may be less than or equal to the amount normally used as a preventive or therapeutic vaccine in the clinical medicine field, and can be appropriately determined by those skilled in the art. Togashi.
  • the method for producing the vaccine composition of the present invention is also included in the scope of the present invention.
  • the method comprises the steps of (1) preparing a DNA or DNA construct that acts as a DNA vaccine, (2) encapsulating the DNA or DNA construct obtained in (1) in a viral envelope vector In addition to the process, and (3) the step of adding a pharmaceutically acceptable carrier, in addition to this, the step of adjusting the envelope vector, the step of confirming that it has been encapsulated, etc. may be included.
  • a virus envelope vector encapsulates DNA therein, the efficiency of transferring the DNA into a living body can be improved and the efficacy of the DNA as a DNA vaccine can be enhanced.
  • a DNA vaccine potentiator containing as an active ingredient is also included in the scope of the present invention.
  • a DNA-acting enhancer containing Sendai virus envelope as an active ingredient is preferable.
  • a potent DNA vaccine enhancer can be used to encapsulate any DNA vaccine to construct a vaccine composition. Its usage and advantages should be understood from the above.
  • a potent vaccine enhancer is particularly effective for tuberculosis DNA vaccines, particularly tuberculosis DNA vaccines comprising sequences encoding at least one heat shock protein and / or at least one immunoregulatory protein. More preferably, the potent vaccine enhancer can be applied to a DNA vaccine comprising DNA encoding HSP65 and DNA encoding IL-12.
  • the viral envelope vector as an active ingredient of a potent DNA vaccine enhancer is selected from the group consisting of Sendai virus, retrovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, box virus and influenza virus 1 Although it is preferable that it is derived from a kind of virus, it is particularly preferable that it is derived from Sendai virus.
  • the present invention also includes an infectious disease, cancer disease, neurodegenerative disease, allergic disease, or self, which comprises the step of administering the above-described pharmaceutical composition (DNA vaccine composition) to a subject.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating an immune disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered as described above.
  • the "subject” refers to an organism to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered, a part of the organism, or a part removed or excreted from the organism.
  • Organisms include, but are not limited to, animals (eg, humans, domestic animal species, wild animals).
  • preventing or treating a disease means improving or reducing symptoms appearing in the diseases described above.
  • the period during which the disease is improved or reduced is not particularly limited, but may be temporary improvement or reduction, or may be improvement or reduction for a certain period.
  • the diseases to be prevented or treated are preferably infectious diseases such as tuberculosis, malaria, toxoplasma and HIV, and most preferably tuberculosis infection.
  • preventing or treating Mycobacterium tuberculosis infection more specifically means that the effect of inhibiting the growth of M. tuberculosis or the effect of stopping the growth of M. tuberculosis is exhibited.
  • a method for confirming whether or not the growth of Mycobacterium tuberculosis has been suppressed or stopped as described in the Examples, a method of measuring the CFU value after administration of the pharmaceutical composition of the present invention can be mentioned. come.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used for the prevention or treatment of infectious disease (preferably Mycobacterium tuberculosis infection)
  • BCG may be administered to the subject simultaneously with the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the administration of BCG may be performed at the same time as the administration of the pharmaceutical composition of the present invention, or may be performed before and after the administration of the pharmaceutical composition.
  • the dosing interval and dose can be appropriately selected and changed according to various conditions such as the state of infection and the condition of the subject.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition kit containing the above-described pharmaceutical composition (DNA vaccine composition) and BCG as active ingredients.
  • a powerful kit can contain each of the above DNA vaccine composition and BCG, preferably in one or more doses, in separate kits.
  • Such a kit may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above pharmaceutical composition (DNA vaccine composition) and BCG. Examples of the carrier that is acceptable for formulation include those described above. All prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
  • Mycobacterium tuberculosis standard strain H37Rv reaches a nearly logarithmic growth phase from a single colony at 37 ° C in Middlebrook 7H9 medium supplemented with albumin dextrose complex (DIFCO Laboratories, Detroit, MI: lot 137971 XA MD). Allowed to grow. Stored at -80 ° C until use, thawed 10 days before use, and cultured in 7H9 medium until logarithmic growth phase.
  • M. bo vis BCG Tokyo was maintained in synthetic Sauton medium (Wako Chemicals, Osaka, Japan).
  • the purified protein derivative PPD (Lot T-3-4) was obtained from JAPAN BCG Co, Ltd (Tokyo, Japan).
  • M. tuberculosis H37Ra dead cells (lot 13971XA) were obtained from DIFCO Laboratories.
  • hsp65 cDNA is PCR from Mycobacterium tuberculosis H37Rv genomic DNA using primers (phsp65Fl: 5, -ACCAAC GATGGTGTGTCCAT-3, (SEQ ID NO: 7) and phsp65Rl: 5,-CTTGTCGAACCGC ATACCCT-3, (SEQ ID NO: 8)) And cloned to pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, Calif.) (PcDNA-hsp65: sometimes referred to as Hsp65 DNA in this specification).
  • Mouse IL-12 (mIL-12) p40 and p35 cDNA amplified from pcDNA-p40p35 (Yoshida, S “et al, Biochem Biophys Res Commun 2000, 271 (1), 107-115.) On PCR And cloned into pcDNA3.1 (+) (pcDNA-mIL12p40p35-F; sometimes referred to as mIL-12 DNA in this specification)
  • Mouse IL-12A subunit is added to SEQ ID NO: 4 in mouse IL
  • the -12B subunit is shown in SEQ ID NO: 5.
  • HVJ-E Dilute the above Hsp65 DNA and mIL-12 DNA in TE solution to 1 mg / ml each. I gave it. HVJ-E was centrifuged at 15000 g for 30 minutes to collect the precipitate. Add each plasmid DNA solution (TE solution) to the HVJ-E precipitate so that HVJ-E is about 8.6mNAU for 1 ⁇ g of each plasmid DNA, and suspend the precipitate by pipetting. To this suspension, 1/3 volume of l% Triton X-100 was added, mixed by tapping, centrifuged at 15000 g for 30 minutes, and the supernatant was removed.
  • the precipitate is suspended in physiological saline (Otsuka Pharmaceutical, Japan), centrifuged at 15000 g for 30 minutes, washed, and then suspended in physiological saline at 100-200 ⁇ g DNA / ml. It was quickly frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C. The same treatment was performed for pcDNA-EGFP, which was cloned from EGFP in pcDNA, and used as a control sample. Furthermore, a TE solution was used instead of the DNA solution, and a control sample using only HVJ-E was also prepared.
  • mice Thirteen Balb / c mice were administered as one group, as shown below.
  • HSP65 + IL-12 is co-administration of HSP65 and IL-12
  • BCG is administration of lx 10 6 CFU M. bovis BCG Tokyo
  • Env is administration using HVJ-E as a vector .
  • the interval between each immunization was 3 weeks.
  • 5 X 10 5 C FU of M. tuberculosis H37Rv was intravenously injected (Miki, K., et al., Infect Immun 2004, 7 2 (4), 2014-2021) o
  • the lungs and liver were homogenized under aseptic conditions. Plated on zj, River Agar (Kyokuto, Tokyo, Japan) or 7H 11 Middlebrook Agar (Kyokuto). These agars were incubated at 37 ° C and CFU was counted after 2 or 4 weeks.
  • mice were inoculated in the anterior tibial muscle 1 to 3 times at 3 week intervals with HVJ-E mixture containing 50 ⁇ g pcDNA-IgHsp65 and 50 ⁇ g pcDNA-mIL12p40p35-F.
  • a mixture of 50 ⁇ g pcDNA-IgHsp65 and 50 ⁇ g pcDNA-mIL12p40p35-F was administered as in the case of HSP65 + IL-12 / Env above.
  • bovis BCG Tokyo was administered by subcutaneous injection simultaneously at 4 sites (upper left, upper right, lower left, lower right) of the back.
  • the CFUs in the lungs and livers of the mice of groups 1 to 8 are shown in Table 2 below, and graphs of the lung and liver results are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
  • HVJ-E enhances the effects of BCG, HSP65 and IL-12 as a tuberculosis vaccine regardless of the order of administration.
  • HSP65 and IL-12 as a tuberculosis vaccine in the absence of BCG was also enhanced by HVJ-E.
  • Sendai virus envelope vector enhances the efficacy of tuberculosis DNA vaccines HSP65 and IL-12. It was also revealed that the combined use of Sendai virus envelope vector encapsulating DNA vaccine and tuberculosis vaccine BCG enhances the prevention and treatment effect of Mycobacterium tuberculosis infection.
  • HSP65 + IL-12 / Env was administered to mice after multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis infection, and HSP6 The effect of 5 + IL-12 / Env on TB treatment vaccine was examined.
  • mice Five 8-week-old DBA / 1 mice (female) were administered as a group, as shown below.
  • HSP65 + IL-12 / Env + BCG HSP65 + IL-12 / Env + BCG
  • HSP65 + IL-12 / Env + BCG HSP65 + Co-administration of IL-12 / Env and M. bovis BCG Tokyo
  • BCG means administration of M. bovis BCG Tokyo alone
  • Env means administration using the HVJ-envelope as a vector.
  • mice received 5 ⁇ 10 5 CFU multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis strain 0305-0206 via the tail vein. One day, 8 days, and 16 days later, BCG or HSP65 + IL-12 / Env + BCG was administered, respectively.
  • Group 1 mice received no treatment.
  • Group 2 mice received 1 X 10 6 CFU of BCG subcutaneously.
  • Group 3 mice received 1 ⁇ 10 6 CFU of BCG subcutaneously in preparation for intramuscular administration of HVJ-envelope / 25 ⁇ g Hsp65 DNA + 25 ⁇ g IL-12 DNA to both anterior tibial muscles.
  • HVJ-envelope / Hsp6 at the same interval as above after infection with MDR 5 Survival of mice (group of 5) treated with 25 ⁇ g of DNA + 25 ⁇ g of IL-12 DNA without any treatment after multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis infection Compared with days.
  • a significant life-prolonging effect was observed in the HVJ-envelope / Hsp65 DNA 25 ⁇ g + IL-12 DNA 25 ⁇ g administration group (data not shown).
  • HSP65 + IL-12 is effective not only as a preventive tuberculosis vaccine but also as a therapeutic tuberculosis vaccine after tuberculosis infection, and is effective against multidrug-resistant tuberculosis bacteria as a therapeutic vaccine. It became clear that they had enough. It was also revealed that the combined use of BCG enhances the effect of BCG.
  • the present invention enhances the efficacy of DNA vaccines and is widely useful in the field of clinical medicine including preventive medicine. In particular, it will make the use of DNA vaccines against infectious diseases even more beneficial.

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Abstract

　本発明者らは、結核ワクチンとして有効性のあるDNAワクチン（Hsp65 DNAおよびIL-12 DNA）をセンダイウイルスエンベロープベクターに封入し、モデルマウスに投与することにより、結核菌感染への予防および治療効果を示すか否かを検討した。その結果、DNAワクチンをウイルスエンベロープベクターに封入することにより、該DNAワクチンの効果が増強されることを見出した。

Description

DNAワクチン組成物
技術分野
[0001] 本発明は、種々の疾患 (感染症疾患、癌疾患、神経変性疾患、アレルギー性疾患 、 自己免疫疾患等）の治療または予防に有効な、ウィルスエンベロープベクターおよ び該ウィルスエンベロープベクターに封入された DNAワクチンを有効成分とする医薬 組成物、およびその製造方法に関する。また、ウィルスエンベロープベクターを有効 成分とし、生体内への DNAワクチンの移入効率を向上させることを特徴とする DNAヮ クチン増強剤に関する。
背景技術
[0002] DNAワクチンは、免疫原性タンパク質をコードするプラスミド DNAの投与による免疫 の誘発に基づく新しいワクチン種として、開発が進んでいる。すなわち、 DNAワクチン は、体液性免疫応答のみならず、細胞性免疫を強力に誘導できるので、病気に対す る防御が可能となること、 DNAワクチンは高度に純ィ匕できること、室温又は高温下でも 安定であり、冷蔵保存は必須でなく長期間の貯蔵が可能であること、遺伝子工学的 手法により DNAワクチンの迅速な改良がし易いこと、ワクチン開発に費やす時間の短 縮、などの利点がある。
[0003] 種々の微生物およびウィルスの感染による疾患および障害 (以下感染性疾患)が存 在し、人類はもとより、家畜動物、愛玩動物等を含むあらゆる動物がそのリスクを背負 つている。古くから、種々の感染症に対する薬剤および治療法が開発されてきており 、中でもワクチンは多くの感染症に対して効力を発揮してきた。し力しながら、ほとん どの感染性疾患が撲滅するまでには至って 、な 、。
[0004] 特に、結核は世界最大の感染症の 1つであり、 BCGよりも効果的なワクチンの開発 が切望されている。本発明者らは、結核に対する DNAワクチンを開発してきた (非特 許文献 1参照のこと)。そして、その中でも、 HSP65 DNA+IL-12 DNAワクチン力 結核 予防ワクチンとして有効であることを明らかにしている (非特許文献 2および 3参照のこ と)。 [0005] 一方、遺伝子治療のために、遺伝子移入のための多くのウィルス法および非ウィル ス (合成)法が開発されている (非特許文献 4、 5)。一般に、細胞への遺伝子送達の ために、ウィルス法は、非ウィルス法より効果的である。しかし、ウィルスベクターは、 親ウィルスからの必須遺伝子要素の同時導入、ウィルス遺伝子のリーキーな発現、 免疫原性、および宿主ゲノム構造の改変のため安全性での問題を生じ得る。一般に 、非ウィルス法は、細胞傷害性および免疫原性がより少ない。しかし、大部分の非ゥ ィルス法は、ウィルスベクターのいくつかに比べ、特に生体内への遺伝子移入効率 はより悪い。従って、ウィルス法および非ウィルス法の両方は、それぞれに長所を持 つている。それ故、高効率および低毒性を持つ生体内への遺伝子移入ベクターを開 発するためには、 1つのタイプのベクターシステムの制限を、別のタイプのシステムの 有利な点を導入することにより補償する必要がある。
[0006] 近年、低毒性かつ生体内への高い遺伝子移入効率を示すウィルスベクターとして 、ウィルスエンベロープベクターの開発が進められている（特許文献 1〜3)。しかしな がら、 DNAワクチンを生体内へ導入する際に、ウィルスエンベロープベクターを用い る試みはこれまでに行われて 、なかった。
特許文献 1： WO01/57204
特許文献 2：特開 2002-065278
特許文献 3： WO03/014338
非特許文献 1 :岡田全司 「免疫低下と結核」臨床科学 35, 344, 1999
非特許文献 2 :岡田全司 「最新医学」 57卷 9号 1942〜1952(2002年）
非特許文献 3：岡田全司および田中高生「遺伝子治療」 6卷 2号 251〜258(2002年） 非特許文献 4: Mulligan, R.C., Science , 260, 926-932 (1993)
非特許文献 5 : Adams, R. M., et al, J. Virol, 69, 1887-1894 (1995)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は種々の疾患 (感 染症疾患、癌疾患、神経変性疾患、アレルギー性疾患、 自己免疫疾患等)の治療ま たは予防に有効な、ウィルスエンベロープベクターおよび該ウィルスエンベロープべ クタ一に封入された DNAワクチンを有効成分とする医薬組成物、およびその製造方 法を提供することにある。また、ウィルスエンベロープベクターを有効成分とし、生体 内への DNAワクチンの移入効率を向上させることを特徴とする DNAワクチン増強剤の 提供も課題とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、上記の課題を解決するために、 DNAワクチンをウィルスェンベロー プベクターに封入し、 DNAワクチンの効果が増強されるカゝ否かを検討した。
より具体的には、結核ワクチンとして有効性のある DNAワクチン（Hsp65 DNAおよび IL-12 DNA)をセンダイウィルスエンベロープベクターに封入し、モデルマウスに投与 することにより、該 DNAワクチン組成物が結核菌感染の予防および治療効果を示す か否かを検討した。
[0009] その結果、センダイウィルスエンベロープベクターは結核 DNAワクチンである HSP65 および IL-12の効力を増強させることが明ら力となった。また、 DNAワクチンを封入し たセンダイウィルスエンベロープベクターと、結核ワクチンである BCGを併用すること で、結核菌感染の予防および治療効果が増強されることも明らかとなった。
[0010] 即ち、本発明者らは、本発明により初めて DNAワクチンをウィルスエンベロープべク ターに封入することにより、該 DNAワクチンの効果が増強されることを見出し、本発明 を完成させるに至った。
[0011] 本発明は、より具体的には以下の〔1〕〜〔34〕を提供するものである。
〔 1〕ウィルスエンベロープベクターおよび該ウィルスエンベロープベクターに封入さ れた DNAワクチンを有効成分とする医薬組成物。
〔2〕ウイノレスエンベロープベクターが、レトロウイルス科、トガウィルス科、コロナウイノレ ス科、フラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ブニヤウィルス 科、ラブドウィルス科、ボックスウィルス科、ヘルぺスウィルス科およびバキュ口ウィル ス科力 なる群より選択される 1種のウィルスに由来する、〔 1〕記載の医薬組成物。
〔3〕ウィルスエンベロープベクターが、センダイウィルス、レトロウイルス、アデノ随伴ゥ イノレス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルスおよびインフルェン ザウィルス力もなる群より選択される 1種のウィルスに由来する、〔1〕記載の医薬組成 物。
〔4〕ウィルスエンベロープベクターがセンダイウィルスエンベロープベクター (HVJ-E) である、〔1〕記載の医薬組成物。
〔5〕DNAワクチン力 感染症疾患、癌疾患、神経変性疾患、アレルギー性疾患、自己 免疫疾患力 なる群力 選択される 1種の疾患に関与する免疫原生タンパク質をコー ドする DNAからなる DNAワクチンである、〔1〕記載の医薬組成物。
〔6〕感染性疾患が、結核、マラリア、トキソプラズマおよび HIVからなる群力 選択され る感染性疾患である、〔5〕記載の医薬組成物。
〔7〕 DNAワクチン力 熱ショックタンパク質および/または免疫調節タンパク質をコード するポリヌクレオチドを発現しうる形で含む DNAワクチンである、〔1〕記載の医薬組成 物。
〔8〕熱ショックタンパク質をコードするポリヌクレオチド力 HSP65をコードするポリヌク レオチドである、〔7〕記載の医薬組成物。
〔9〕免疫調節タンパク質をコードするポリヌクレオチド力 IL-12をコードするポリヌクレ ォチドである、〔7〕記載の医薬組成物。
〔10〕 DNAワクチンが、 HSP65および IL- 12をコードするポリヌクレオチドを発現しうる形 で含む DNAワクチンである、〔1〕記載の医薬組成物。
〔11〕HSP65をコードするポリヌクレオチド力 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列から なるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列において 1または 複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および Zもしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を コードするポリヌクレオチドである、〔8〕または〔10〕記載の医薬組成物。
〔12〕 IL-12をコードするポリヌクレオチド力 下記 (a)および (b)に記載のポリヌクレオ チドを含む、〔9〕または〔10〕記載の医薬組成物。
(a)配列番号： 2の第 57〜253位のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または 該アミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および Zもしくは 挿入されたアミノ酸配列を含み、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク 質と機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチド (b)配列番号： 3の第 23〜328位のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または 該アミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および Zもしくは 挿入されたアミノ酸配列を含み、配列番号： 3に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク 質と機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔13〕 HSP65をコードするポリヌクレオチドと IL- 12をコードするポリヌクレオチド力 異 なる DNA分子中に含まれて ヽることを特徴とする、〔 10〕記載の医薬組成物。
〔14〕 HSP65をコードするポリヌクレオチドと IL- 12をコードするポリヌクレオチドが、 1つ の DNA分子中に含まれて ヽることを特徴とする、〔10〕記載の医薬組成物。
〔15〕以下の（1)〜（3)の工程を含む、請求項 1〜〔14〕のいずれかに記載の医薬組 成物の製造方法。
(1) DNAワクチンとして作用する DNAまたは DNA構築物を調製する工程
(2) (1)で得られた DNAまたは DNA構築物を、ウィルスエンベロープベクター内に封 入する工程
(3)製剤上許容しうる担体を添加する工程
〔16〕ウィルスエンベロープベクターを有効成分とする、 DNAワクチン増強剤。
〔17〕生体内への DNAワクチンの移入効率を向上させることを特徴とする、〔16〕記載 の DNAワクチン増強剤。
〔18〕ウィルスエンベロープベクター力 レトロウイルス科、トガウィルス科、コロナウイ ルス科、フラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ブニヤウィル ス科、ラブドウィルス科、ボックスウィルス科、ヘルぺスウィルス科およびバキュロウィ ルス科力もなる群より選択される 1種のウィルスに由来する、〔 16〕記載の DNAヮクチ ン増強剤。
〔19〕ウィルスエンベロープベクターが、センダイウィルス、レトロウイルス、アデノ随伴 ウイノレス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルスおよびインフルェン ザウィルス力 なる群より選択される 1種のウィルスに由来する、〔16〕記載の DNAワク チン増強剤。
〔20〕ウィルスエンベロープベクターがセンダイウィルスエンベロープベクター (HVJ-E )である、〔16〕記載の DNAワクチン増強剤。 〔21〕感染症疾患、癌疾患、神経変性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患から なる群力 選択される 1種の疾患に対する DNAワクチンを増強するための、〔16〕記載 の DNAワクチン増強剤。
〔22〕感染性疾患が、結核、マラリア、トキソプラズマおよび HIVからなる群力 選択さ れる感染性疾患である、〔21〕記載の DNAワクチン増強剤。
〔23〕 DNAワクチン力 熱ショックタンパク質および/または免疫調節タンパク質をコー ドするポリヌクレオチドを発現しうる形で含む DNAワクチンである、〔16〕記載の DNAヮ クチン増強剤。
〔24〕熱ショックタンパク質をコードするポリヌクレオチド力 HSP65をコードするポリヌク レオチドである、〔23〕記載の DNAワクチン増強剤。
〔25〕免疫調節タンパク質をコードするポリヌクレオチド力 IL-12をコードするポリヌク レオチドである、〔23〕記載の DNAワクチン増強剤。
〔26〕 DNAワクチンが HSP65および IL- 12をコードするポリヌクレオチドを発現しうる形 で含む、〔16〕に記載の DNAワクチン増強剤。
〔27〕 HSP65をコードするポリヌクレオチド力 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列から なるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列において 1または 複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および Zもしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を コードするポリヌクレオチドである、〔24〕または〔26〕に記載の DNAワクチン増強剤。 〔28〕 IL-12をコードするポリヌクレオチド力 下記 (a)および (b)に記載のポリヌクレオ チドを含む、〔25〕または〔26〕に記載の DNAワクチン増強剤。
(a)配列番号： 2の第 57〜253位のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または 該アミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および Zもしくは 挿入されたアミノ酸配列を含み、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク 質と機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号： 3の第 23〜328位のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または 該アミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および Zもしくは 挿入されたアミノ酸配列を含み、配列番号： 3に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク 質と機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔29〕HSP65をコードするポリヌクレオチドと IL- 12をコードするポリヌクレオチドとが異 なる DNA分子中に含まれていることを特徴とする、〔26〕記載の DNAワクチン増強剤。 〔30〕 HSP65をコードするポリヌクレオチドと IL- 12をコードするポリヌクレオチドとが 1つ の DNA分子中に含まれていることを特徴とする、〔26〕記載の DNAワクチン増強剤。 〔31〕〔1〕〜〔14〕のいずれか〖こ記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、感 染症疾患、癌疾患、神経変性疾患、アレルギー性疾患、または自己免疫疾患を予防 または治療する方法。
〔32〕〔1〕〜〔14〕のいずれかに記載の医薬組成物に加えて、 BCGを対象に同時に 投与する工程を含む、感染症疾患を予防または治療する方法。
〔33〕〔1〕〜〔14〕のいずれかに記載の医薬組成物の対象への投与の前後に、 BCG を対象へ投与することを特徴とする、〔32〕に記載の方法。
〔34〕〔1〕〜〔14〕のいずれかに記載の医薬組成物および BCGを有効成分として含む 、医薬組成物キット。
発明の効果
[0012] 本発明により、従来の DNAワクチン効力を増強させるワクチン増強剤、該効力が増 強されたウィルスエンベロープベクターおよび該ウィルスエンベロープベクターに封 入された DNAワクチンを有効成分とする医薬組成物、および該医薬組成物を製造す る方法が提供される。
[0013] 本発明におけるウィルスエンベロープベクターおよび該ウィルスエンベロープべク ターに封入された DNAワクチンを有効成分とする医薬組成物は、 DNAワクチンを該 ベクターに封入しない場合に比べて、ワクチンの効力が顕著に増強されている。 したがって、ウィルスエンベロープベクターおよび該ウィルスエンベロープベクター に封入された DNAワクチンを有効成分とする医薬組成物は、 DNAワクチンの有効性 が向上しており、種々の疾患 (感染症疾患、癌疾患、神経変性疾患、アレルギー性 疾患、 自己免疫疾患等)の治療または予防に有用なものとなりうる。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]群 1〜8 (表 1参照）における肺の CFU(loglO)を示す図である。 [図 2]群 1〜8 (表 1参照）における肝臓の CFU(loglO)を示す図である。
[図 3]群 1、 2、 4および 6 (表 1参照）の肺の HE染色顕微鏡画像を示す写真である。
[図 4]群 1、 2、 4および 6 (表 1参照）の肝臓の HE染色顕微鏡画像を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
[0015] 本発明は、ウィルスエンベロープに様々な疾患に対する DNAワクチンを封入するこ とにより、該 DNAワクチンの効力をより増強させることができると 、う知見に基づ 、て ヽ る。
本発明のウィルスエンベロープベクターおよび該ウィルスエンベロープベクターに 封入された DNAワクチンを有効成分とする医薬組成物は、 DNAワクチンとして作用す る DNAおよび DNA構築物をウィルスエンベロープベクター内に封入することにより得 ることがでさる。
[0016] 本発明において、医薬組成物とは、疾患の治療または予防に効果を示す 1つ以上 の有効成分を含有する、患者または被験者に投与するための組成物であり、本発明 の医薬組成物は、 DNAワクチンを有効成分として含有する。上記疾患は、あらゆる疾 患、障害および症状を包含するが、例として、感染症疾患 (例えば、ウィルス性肝炎、 HIV、日本脳炎、マラリア、トキソプラズマ、結核)、癌疾患 (部位および癌種は問わな い)、神経変性疾患 (アルツハイマー病、パーキンソン病、老人性痴呆など)、アレルギ 一性疾患 (アトピー性皮膚炎、花粉症など)、自己免疫疾患などが挙げられる。これら は例示であり、これらに限定して解釈されるべきではな 、。
本発明の医薬糸且成物は、あらゆる疾患の治療および/または予防に使用することが 可能であるが、特に感染症疾患、例えば、結核、マラリア、トキソプラズマおよび HIV、 最も好ましくは結核菌感染に有効である。
[0017] 本発明の医薬組成物を調製する上で、使用できる DNAワクチンは、任意の感染性 疾患に対するワクチンの効力を有する DNAまたは DNA構築物を含むものであれば任 意のものであってよいが、特に結核に対する DNAワクチンとして作用する DNAまたは DNA構築物が好まし 、例として挙げられる。種々の疾患に対して種々の DNAヮクチ ンが公知であり、その任意のものを使用可能であり、また、将来において発明される D NAワクチンをも使用可能である。 本発明における DNAワクチンとしては、熱ショックタンパク質および/または免疫調 節タンパク質をコードする DNAからなる DNAワクチンを挙げることが出来る。
[0018] 本発明における熱ショックタンパク質 (HSP)としては、任意の熱ショックタンパク質を 挙げることができる。熱ショックタンパク質は生体の多岐に渡る反応に関与して 、るこ とは知られているが、免疫系を修飾する機能を有する熱ショックタンパク質も多数報 告されており、例えば、 HSP70、 HSP65、 HSP60等が報告されており、これらを本発明 に用いる熱ショックタンパク質としてもよい。また、本明細書における免疫調節タンパ ク質とは、免疫応答を調節する機能を有するタンパク質を総称する意味であり、例え ば、各種インターロイキン (IL)、腫瘍壊死因子 (TNF)などが含まれ、さらに具体的には 、 IL- 12、 GM-CSF, IL- 1、 TNF- α、 TNF- j8、 IL- 2、 IL- 4、 IL- 5、 IL- 10、 IL- 15、 IL-18 、および BL-1などが例として挙げられる力 これらに限定されるものではない。本発 明における DNAワクチン増強剤としては、任意の DNAワクチンと共に投与することに より、その DNAワクチンのワクチンとしての効果を増強し得る組成物を挙げることがで きる。例えば、結核 DNAワクチンとしては、 HSP65をコードするポリヌクレオチドと IL-12 をコードするポリヌクレオチドの両方を含む DNA分子が挙げられ、ここで HSP65は例え ば、任意のヒト結核菌に由来するものなどが例示できる。本発明の 1つの結核 DNAヮ クチンの態様としては、本発明者らが報告しているヒト型結核菌 H37RV由来の HSP65 をコードするポリヌクレオチドおよびマウス IL- 12をコードするポリヌクレオチドの両方を 含む DNA分子が挙げられる。この場合、 HSP65をコードするポリヌクレオチドと IL-12を コードするポリヌクレオチドとは同一の DNA分子中に含まれる必要はなぐいずれか の配列をそれぞれに含む 2種の DNA分子を併用してよ 、。
[0019] 本明細書中、「HSP65をコードするポリヌクレオチド」とは、配列番号： 1に示すアミノ 酸配列をコードするポリヌクレオチドを指す。さらにまた、配列番号： 1に示すアミノ酸 配列のうち、 1または数個、例えば 1〜10個、好ましくは 1〜5個のアミノ酸残基力 置 換、欠失、付加、および Zまたは挿入されたアミノ酸配列を含み、配列番号： 1に記載 のアミノ酸配列力もなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質、すなわち HSP65とし ての活性を有するタンパク質をコードする DNAも含む。変異するアミノ酸残基にお!ヽ ては、アミノ酸側鎖の性質が保存されて 、る別のアミノ酸に変異されることが望ま ヽ 。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、 親水性アミノ酸 (R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸 (G 、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を 有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q )、塩基含有側鎖を有するアミノ酸 (R、 K、 Η)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (Η、 F、 Y、 W)を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あ るアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び Z又は他のァ ミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的 活性を維持することはすでに知られて 、る。
本発明に用いる「IL-12をコードするポリヌクレオチド」は、投与される動物種に由来 する IL-12をコードするポリヌクレオチドが好ましい。例えば、ヒトに投与する場合、ヒト IL- 12の Aおよび Bサブユニット（それぞれ、 p35および p40ともいう）をコードする DNAを 意味する。ヒ HL-12の各サブユニットのアミノ酸配列を配列番号： 2および 3に示す。 配列番号： 2に示す IL-12 Aサブユニットのアミノ酸配列のうち、第 1〜56位のアミノ酸 配列はシグナルペプチドであり、第 57〜253位のアミノ酸配列が成熟ペプチドである ため、「ヒ HL-12をコードするポリヌクレオチド」は、この成熟ペプチドが発現されうるよ うに、この成熟ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいればよい。また、配列 番号： 3に示す IL-12 Bサブユニットのアミノ酸配列のうち、第 1〜22位のアミノ酸配列 は、シグナルペプチドであり、第 23〜328位のアミノ酸配列が成熟ペプチドであるため 、「ヒ HL-12をコードするポリヌクレオチド」は、この成熟ペプチドが発現されうるように 、この成熟ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいればよい。さらに、上記ァ ミノ酸配列うち、 1または数個、例えば 1〜10個、好ましくは 1〜5個のアミノ酸残基が、 置換、欠失、付加、および Zまたは挿入されたアミノ酸配列を含み、配列番号: 2およ び 3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質、すなわち IL-12のサブユニットとしての活性を有するタンパク質をコードする DNAを使用しても よい。さらにまた、免疫応答を調節する機能を有する長さの部分断片をコードする DN Aを使用してちょい。
し力しながら、必ずしも投与される動物種に由来する IL-12をコードするポリヌクレオ チドである必要はなぐマウス IL-12とヒ HL-12のアミノ酸配列は相同性が高いため、 相互に代替して用いることも可能である。さらに他の動物種に由来するものを、ヒトに 用いることも可能である。
[0021] さらに、 IL- 12の 2つのサブユニットの成熟ペプチド力 適当なリンカ一ペプチド（例 えば、 Gly- Gly- Gly- Gly- Gly- Gly- Ser、配列番号： 6)で連結された形で発現されても よい。例えば、以下の、
Bサブユニットのシグナルペプチドを含む全ペプチド Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-S er— Aサブユニットの成熟ペプチド
t 、うアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製して、これを発現しうる形で適 当なベクターに組み込んで用いることもできる。
[0022] 本明細書中、所定のペプチドをコードするポリヌクレオチドを「発現しうる形で含む」 とは、該ポリヌクレオチドが発現ベクターに挿入されており、動物の細胞内に侵入した 場合に、該細胞内で所定のペプチドを発現させうる形態で含むことをいう。すなわち 、例えば、投与される動物種および投与部位に適したプロモータの制御下に該コー ド DNAが配置されていることを指す。本発明においては、発現される DNAおよび、該 DNAを発現させうるために必要な DNA力 なる DNA分子を、「DNA構築物」と記載す ることちある。
[0023] DNAワクチンを構成する DNA分子は、該 DNAがワクチンとして作用するために必要 なエレメント (すなわち、コードするタンパク質を発現するのに必要なエレメントなど)、 例えばプロモータ配列等を含有している場合がある。すなわち、 DNAがコードするタ ンパク質が発現可能なように発現カセットまたは発現ベクターに連結された形態であ り得る。上記の HSP65をコードする配列および IL- 12をコードする配列の両方を含む D NAの場合、該 DNAを投与される動物内で機能しうる発現カセットまたは発現ベクター に、 HSP65と IL-12とが共に発現されるように連結させることによって得ることができる。 例えば、 HSP65をコードする DNAと IL-12をコードする DNAをそれぞれに適切な発現 ベクター (例えば pcDNA3.1 (+)(Invitrogen, San Diego, CA))に、発現可能な形で連結 させた形態で、すなわち、 HSP65をコードする配列を含む DNAと IL-12をコードする配 列を含む DNAとが異なる DNA構築物 (発現ベクター)中に含まれて 、る形態であって もよい。本発明において、 DNA構築物は目的のペプチドの発現量を増加させるため に、 1つ、または複数のェンハンサーを含んでいてもよい。
[0024] DNAをウィルスエンベロープに封入する方法はすでに公知であり、これらの任意の 方法により封入を行ってもよいが、例えば、後述の実施例に記載の通りに行ってもよ ぐまた、この方法に当業者が任意の改変を加えた方法により封入を行ってもよい。 特に、封入過程においては、界面活性剤を使用することにより封入効率を向上させる ことができる。ここで用いる界面活性剤は、例えば Triton X100、デォキシコール酸も しくはコール酸またはその塩等、任意のものであってよいが、 Triton X100が特に好ま しい。
[0025] 本明細書において、ウィルスエンベロープまたはウィルスエンベロープベクターとは 、ウィルスカゝら RNAまたは DNAを取り除いた後のウィルス外膜であり、通常は遺伝子、 ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等を封入して細胞移入するのに利用されるもの である。
[0026] 本発明に用いる該ベクターは、任意のウィルスに由来するものであってよい。ウィル スの種類は限定されないが、具体的には、たとえば、レトロウイルス科、トガウィルス科 、コロナウィルス科、フラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、 ブ-ャウイノレス科、ラブドウイノレス科、ボックスウイノレス科、へノレぺスゥイノレス科、バキ ュロウィルス科、およびへパドナウィルス科などが例示できる。好ましいウィルスとして は、センダイウィルス、レトロウイルス、亜デノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺス ウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、インフルエンザウイルス等を挙げるこ とができる。特に好ましいウィルスは、マウス肺炎ウィルスの 1つであるセンダイウィル ス（HVJ)である。
[0027] 本明細書にお！、て「センダイウィルス」と「HVJ」（Hemagglutinating virus of Jap an)とは、互換的に用いられ、ノ ミクソウィルス科パラミクソウィルス属に属する、細 胞融合作用を有するウィルスを 、う。センダイウィルスのウィルス粒子にはェンベロー プがあり、種々の細胞を融合する能力をもつことから、細胞のへテロカリオン形成、雑 種細胞の作製などの細胞融合に広く利用されている。本明細書中、センダイウィルス エンベロープベクターを、 HVJ- Eと称する。 [0028] センダイウィルスは、 VR- 105株および VR- 907株等があり、これらは例えば American Type Culture Collection (ATCC :http：〃 www.atcc.org/)から入手可能である。本発 明に使用するウィルスエンベロープベクターについては、例えば特開 2001-286282 号公報（WO01/57204号公報）、特開 2002-065278号公報、 WO-A03/014338号公報 (PCT/JP02/07879)に記載されており、例えば、特開 2001-286282号公報中の実施例 8などに従って、調製可能である。
[0029] 本発明の DNAワクチン組成物は、任意の製剤上許容しうる担体 (例えば生理食塩 水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば D-ソルビトール、 D-マンノース 、 D-マン-トール、塩ィ匕ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコー ル、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレ ングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート 80 (TM)、 HCO- 50等を 挙げることができるが、それらに限定されない)と共に投与され得る。また、該組成物 は、 DNAとウィルスエンベロープのほかに、適切な賦形剤、アジュバントを含んでもよ い。
[0030] また、これらの DNAワクチン組成物は、賦形剤または製剤上許容しうる担体を調製 するために、エンベロープのプロセシングを促進する他の化合物を含む、適切な薬 学的に許容可能なキャリアを含み得る。例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等 の生体親和性材料を含んでもよい。あるいはまた、種々のアジュバントを含む乳濁液 であってもよい。アジュバントは種々のものが公知であり、当業者であれば、適切なも のを容易に選択することができる。さらには、上記アジュバントの他に例えば、希釈剤 、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤などから選択さ れる 1または 2以上の製剤用添加物を含有させてもよ!ヽ。
[0031] 経口投与のための DNAワクチン組成物は、投与に適した投与形態において当該分 野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
本発明に係る医薬組成物の投与経路は、特に限定されないが、非経口的に投与 することが好ましい。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、 筋肉内または腹腔内の投与が挙げられるが、より好ましくは、鼻腔投与、経肺投与、 経粘膜投与、気道内投与、点眼投与などが挙げられる。 [0032] 本発明に係るワクチン組成物の 1回の投与量および投与回数は、投与の目的によ り、また感染が初感染か再感染かにより、さらに患者の年齢および体重、症状および 疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である 。エンベロープ中に封入される DNAワクチンをエンベロープに封入せずに投与する 量と同程度の量を投与できるが、これより少ない量を投与してもよい。例えば、体重 1 kgあたり、 DNAワクチンを 0.01〜5mgの範囲内で投与するとよぐ例えば、成人ひとり あたり l〜15mg/回の DNAを投与することができる。投与回数および投与頻度、約 1 〜4週間程度 (例えば、 8日間または 3週間）の間隔で、数回、好ましくは約 1〜3回程 度投与するのが好ましい。疾患の状態をモニターしながら投与回数を決定することも できる。
[0033] 本発明のワクチン組成物は、他の薬剤またはワクチンと併用することも可能である。
他の薬剤と同時に本発明のワクチン組成物を投与してもよぐまた間隔を空けて投与 してもょ 、が、その投与順序は特に問わな 、。
[0034] 特に、結核に対する DNAワクチンを本発明の医薬組成物に用いる場合、本発明の ワクチン糸且成物を 1、 2または 3回 (例えば、 1、 2、 3または 4週間間隔で)投与後、 1、 2 、 3または 4週間間隔で BCGを通常用いられる量を投与してもよい。 BCG1回投与に 比べて明らかに、結核予防効果を増大させることができる。あるいはまた、通常用いら れる量の BCGを投与後、本発明のワクチン糸且成物を 1、 2または 3回 (例えば、 1、 2、 3 または 4週間間隔で)投与してもよい。 BCG1回投与に比べて明らかに、結核予防効 果が増大させることができる。例えば、 DNAワクチンとして、前述の HSP65をコードす るポリヌクレオチドと IL-12をコードするポリヌクレオチドとを DNAワクチンとして用いる 場合、これらのポリヌクレオチドを DNAワクチンとして作用しうる形態でそのまま (すな わち、 nakedな状態で)投与する場合と比較すると、該ポリヌクレオチドをウィルスェン ベロープに封入した形態で投与した場合の方が、 BCGと併用した場合および BCGと 併用しない場合のいずれの場合も、 DNAワクチンとしての効力が増大しうる。また、本 発明のワクチン組成物を BCGと同時に投与した場合には、 BCG単独で投与するより も、高いワクチン効果が得られる。 BCGの投与量は、臨床医学分野で、予防または治 療ワクチンとして通常用いて 、る量以下の量であってよく、当業者が適宜決定するこ とがでさる。
[0035] 以上のように、本発明のワクチン組成物を製造する方法もまた、本発明の範囲に包 含される。該方法は、上述のように、（l) DNAワクチンとして作用する DNAまたは DNA 構築物を調製する工程、 (2) (1)で得られた DNAまたは DNA構築物を、ウィルスェン ベロープベクター内に封入する工程、および（3)製剤上許容しうる担体を添加するェ 程を含むが、この他に、エンベロープベクターを調整する工程、封入されたことを確 認する工程等を含んでよ!ヽ。
[0036] 力かる方法により製造されるワクチン組成物は、 DNAをそのまま DNAワクチンとして 投与した場合に比べて、その効果はより増強されている。得られた医薬組成物は、上 記のとおり投与することができる。
[0037] また、ウィルスエンベロープベクターは、その中に DNAを封入することにより、生体 内への該 DNAの移入効率を向上させ、該 DNAの DNAワクチンとしての効力を増強し うるため、ウィルスエンベロープベクターを活性成分とする DNAワクチン増強剤も本発 明の範囲に包含される。特にセンダイウィルスエンベロープを活性成分とする DNAヮ クチン増強剤が好ましい。力かる DNAワクチン増強剤は、任意の DNAワクチンを封入 させてワクチン組成物を構築するために用いることができる。その使用方法および利 点は、上記より理解されるはずである。力かるワクチン増強剤は、結核用 DNAワクチン 、特に少なくとも 1つの熱ショックタンパク質および/または少なくとも 1つの免疫調節タ ンパク質をコードする配列を含む結核用 DNAワクチンに特に有効である。さらに好ま しくは、力かるワクチン増強剤は、 HSP65をコードする DNAと IL-12をコードする DNAと を含む DNAワクチンに適用することができる。
[0038] 力かる DNAワクチン増強剤の効力成分としてのウィルスエンベロープベクターは、 センダイウィルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニア ウィルス、ボックスウィルスおよびインフルエンザウイルスからなる群より選択される 1種 のウィルスに由来するものであることが好ましいが、特にセンダイウィルスに由来する ものが好ましい。
[0039] また、本発明は上記に記載の医薬組成物（DNAワクチン組成物）を対象に投与する 工程を含む、感染症疾患、癌疾患、神経変性疾患、アレルギー性疾患、または自己 免疫疾患を予防または治療する方法に関する。本発明の医薬組成物は、上記の通り 投与することができる。
[0040] 本発明において、「対象」とは、本発明の医薬組成物を投与する生物体、該生物体 の体内の一部分、または生物体より摘出または排出されたその一部分をいう。生物 体は、特に限定されるものではないが、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物） を含む。
[0041] 本発明にお 、て、「疾患を予防または治療する」とは、上記に記載の疾患にお!、て 表れる症状を、改善または軽減することを意味する。上記の方法において、疾患が改 善または軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善または軽減であって もよ 、し、一定期間の改善または軽減であってもよ 、。
[0042] 本発明にお 、て、予防または治療する疾患としては、好ましくは感染症疾患、例え ば、結核、マラリア、トキソプラズマおよび HIV、最も好ましくは結核菌感染を挙げるこ とが出来る。本発明において、「結核菌感染を予防または治療する」とは、より具体的 には結核菌の増殖抑制効果、または増殖停止効果が発現することを意味する。結核 菌の増殖が抑制または停止した力否かを確認する方法としては、実施例に記載の方 法の通り、本発明の医薬組成物を投与後、 CFU値を測定する方法を挙げることが出 来る。本発明の医薬組成物を感染症疾患 (好ましくは結核菌感染)の予防または治 療に使用する際には、 BCGを本発明の医薬組成物と同時に対象に投与してもよい。
BCGの投与は、本発明の医薬組成物の投与と同時期に行われてもよいし、該医薬組 成物の投与の前後において行われてもよい。投与間隔および投与量は、感染の状 況、さらに対象の状態などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可 能である。
[0043] 本発明は、上記に記載の医薬組成物（DNAワクチン組成物）および BCGを有効成 分として含有する医薬組成物キットに関する。力かるキットは、上記 DNAワクチン組成 物と BCGのそれぞれを、 1回または複数回用量含有することが好ましぐこれらを別々 の製剤としてキットに含有することができる。このようなキットには、上記の医薬組成物 (DNAワクチン組成物）および BCG以外に、製剤上許容される担体が含まれてもよい 。製剤上許容される担体としては、上記に記載のものを挙げることが出来る。 なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0044] 以下の実施例にお!ヽて、本発明を例証するが、これら実施例の記載に限定される わけではない。
〔実施例 1〕
腿
結核菌標準株 H37Rvは、単一コロニーから、アルブミンデキストロース複合体を添 加した Middlebrook 7H9培地 (DIFCO Laboratories, Detroit, MI: lot 137971 XA MD) 中で、 37°Cにてほぼ対数増殖期に至るまで増殖させた。使用するまで- 80°Cで保存 し、使用する 10日前に解凍して 7H9培地で対数増殖期まで培養して使用した。 M. bo vis BCG Tokyoは、合成 Sauton培地 (Wako Chemicals, Osaka, Japan)中で維持した。 精製タンパク質誘導体 PPD (ロット T- 3- 4)は、日本 BCG製造株式会社 (JAPAN BCG Co, Ltd (東京， 日本)）から入手した。 M. tuberculosis H37Raの死菌体 (lot 13971XA) は DIFCO Laboratoriesから入手した。
[0045]
プラスミドのコンストラクシヨン
hsp65 cDNAは、結核菌 H37Rvゲノム DNAからプライマー（phsp65Fl: 5，- ACCAAC GATGGTGTGTCCAT- 3，（配列番号： 7)および phsp65Rl： 5， - CTTGTCGAACCGC ATACCCT- 3，（配列番号： 8))を用いて PCRにより増幅し、 pcDNA3.1 (+)(Invitrogen, San Diego, CA)にクローユングした（pcDNA- hsp65 :本明細書中、 Hsp65 DNAと標記 する場合もある）。マウス IL- 12(mIL- 12)の p40および p35の cDNAは、 pcDNA- p40p35 (Yoshida, S" et al, Biochem Biophys Res Commun 2000, 271(1), 107— 115.)から PC Rにて増幅させ、 pcDNA3.1 (+)にクローユングした（pcDNA- mIL12p40p35-F;本明細 書中、 mIL- 12 DNAと標記する場合もある）。マウス IL- 12Aサブユニットを配列番号: 4 に、マウス IL-12Bサブユニットを配列番号： 5に示す。
[0046] ワクチン組成物の作成
上述の Hsp65 DNAおよび mIL-12 DNAを、それぞれ 1 mg/mlになるよう TE溶液で希 釈した。 HVJ-Eを 15000 gにて 30分遠心し、沈殿を回収した。各プラスミド DNA 1 μ gに 対して HVJ- Eが約 8.6mNAUとなるように、 HVJ- E沈殿に各プラスミド DNA溶液 (TE溶 液)を添カ卩し、ピペッティングにより沈殿を懸濁する。該懸濁液に、 1/3容量の l%Trito nX-100を添加して、タッピングにより混合し、 15000 gにて 30分間遠心後、上清を除去 した。さらに、沈殿を生理食塩水 (大塚製薬、 日本)に懸濁して 15000 gにて 30分間遠 心して洗浄し、生理食塩水を 100〜200 μ gDNA/mlになるように添カ卩して懸濁し、液 体窒素中で急速に凍結させて、 - 80°Cにて保存した。 EGFPを pcDNAにクローユング した pcDNA-EGFPにつ!/、ても同様の処理を行 、、コントロール用のサンプルとした。 さらに、 DNA溶液の代わりに TE溶液を用 、た HVJ-Eのみのコントロール用サンプルも 作製した。
[0047] 投 +画
Balb/cマウス 13匹を 1群として、それぞれ以下に示すとおり、投与した。
[0048] [表 1]
Figure imgf000019_0001
上記表 1中、 HSP65+IL- 12とは HSP65と IL- 12との共投与、 BCGとは lx 106 CFU M. bovis BCG Tokyoの投与、および Envは HVJ- Eをベクターとする投与を示す。
免疫各回の間隔は、 3週間間隔とした。第 3回免疫が終わった 4週間後に 5 X 105 C FUの M. tuberculosis H37Rvを静脈注射した（Miki, K., et al., Infect Immun 2004, 7 2(4), 2014-2021) o その 5週間後に、肺、肝臓を無菌条件下でホモジヱネートして、 zj、川寒天培地 (Kyokuto, Tokyo, Japan)または 7H 11 Middlebrook寒天培地 (Kyokuto) 上にプレーティングした。これらの寒天培地を 37°Cでインキュベートして、 2週間また は 4週間後に CFUをカウントした。
[0050] 投与方法
(0HSP65+IL- 12/Env
BALB/cマウスに、 50 μ gの pcDNA- IgHsp65および 50 μ gの pcDNA- mIL12p40p35- F を含む HVJ-E混合物を 3週間間隔で、両前脛骨筋に 1〜3回接種した。
G0HSP65+IL-12
50 μ gの pcDNA- IgHsp65および 50 μ gの pcDNA- mIL12p40p35- Fの混合物を、上記 HSP65+IL- 12/Envの場合と同様に投与した。
(iii)BCG
lx 106 CFU M. bovis BCG Tokyoを、同時に 4箇所 (背中の左上方、右上方、左下 方、右下方)、皮下注射により投与した。
[0051] ¾
上記群 1〜8のマウスの肺および肝臓における CFUを下記表 2に示し、肺および肝 臓の結果のグラフをそれぞれ図 1および図 2に示す。
[0052] [表 2]
CFU LoglO 群 第 1回免疫 第 2回免疫 第 3回免疫 肺 肝臓
1 なし なし なし 6. 65726 6. 15585
2 なし なし BCG 5. 95070 5. 14516
3 HSP65+IL-12 HSP65+IL-12 BCG 2. 31484 2. 75839
4 HSP65+IL-12/Env HSP65+IL- 12/Env BCG 1. 65258 2. 26365
5 BCG HSP65+IL-12 HSP65+IL-12 4. 79671 5. 23869
6 BCG HSP65+IL- 12/Env HSP65+IL- 12/Env 2. 23929 3. 13321
7 HSP65+IL- 12 HSP65+IL-12 HSP65+IL-12 6. 76860 6. 14567
8 HSP65+IL- 12/Env HSP65+IL- 12/Env HSP65+IL- 12/Env 3. 52880 4. 96925 [0053] 上記結果が示すとおり、肺および肝臓のいずれにおいても、同様の結果が得られ た。何も投与しない群 (群 1)に比べて、 BCGの 1回投与 (群 2)は、結核菌の数を減少 させていた。また、 BCG投与の前に HSP65と IL-12を 2回投与した群 (群 3)では、一層 結核菌の数が減少して 、たが、 BCG投与の前に HSP65と IL-12との HVJ-E混合物を 2 回投与した群 (群 4)では、さらに一層効果的に結核菌の数が減少していた。すなわ ち、 HVJ-E混合物とすることで、 HSP65+IL-12の結核ワクチンとしての効力を増強させ ることがでさた。
[0054] また、 BCGを初回に 1回のみ投与し、その後 2回 HSP65+IL-12を投与した群 (群 5)と B CG初回投与後 2回 HSP65と IL-12との HVJ-E混合物を投与した群 (群 6)とでは、 HVJ- E混合物投与群 (群 6)で肺および肝臓の結核菌数が減少していた。
すなわち、 BCGと HSP65および IL-12とを併用する場合、その投与の順序に関係な く、 HVJ-Eは結核ワクチンとしての BCGと HSP65および IL- 12の効果を増強させること がわかった。
また、 BCGを併用しない場合の HSP65と IL-12との結核ワクチンとしての効力もまた、 HVJ-Eにより増強されることが、群 7と群 8との比較により明ら力となった。
[0055] 上記の結果より、センダイウィルスエンベロープベクターは結核 DNAワクチンである HSP65および IL- 12の効力を増強させることが明ら力となった。また、 DNAワクチンを 封入したセンダイウィルスエンベロープベクターと、結核ワクチンである BCGを併用す ることで、結核菌感染の予防および治療効果が増強されることも明らかとなった。
[0056] また、上記群のうち、群 1、 2、 4および 6の肺および肝臓切片を HE染色に供し、顕 微鏡にて観察した。その顕微鏡画像を図 3と図 4に示す。
図 3および図 4とも、コントロール群の群 1に比べて群 2 (BCGのみ投与群）の方が肉 芽腫の形成、単核球侵潤 (青色斑状の部分）は抑制されていたが、群 4および群 6で はさらに、肉芽腫の形成、単核球侵潤 (青色斑状の部分)が抑制されていた。このこと は、群 1および群 2に比して、群 4および群 6では、結核菌による影響が少なぐ感染 菌数が少な 、ことが示唆される。
[0057] 〔実施例 2〕
次に、多剤耐性結核菌感染後のマウスに対し、 HSP65+IL-12/Envを投与し、 HSP6 5+IL-12/Envの結核治療ワクチン効果について検討した。
8週齢 DBA/1マウス (メス) 5匹を 1群として、それぞれ以下に示すとおり、投与した。
[表 3] 結核菌投
群 第 1回免疫 第 2回免疫 第 3回免疫 与
1 有 なし なし なし
2 有 BCG BCG BCG
3 (6) 有 HSP65+IL-12/Env+BCG HSP65+IL-12/Env+BCG HSP65+IL-12/Env+BCG 上記表 3中、 HSP65+IL- 12/Env+BCGとは HSP65+IL- 12/Envと M. bovis BCG Toky oとの共投与、 BCGとは M. bovis BCG Tokyoのみの投与、および Envは HVJ-ェンべ ロープをベクターとする投与を示す。
[0059] 投与方法
全てのマウスに 5 X 105 CFUの多剤耐性結核菌 0305- 0206株を尾静脈投与した。そ の 1日後、 8日後、 16日後にそれぞれに BCGまたは HSP65+IL-12/Env+BCGを投与し た。群 1のマウスは処置を行わなかった。群 2のマウスには 1 X 106 CFUの BCGを皮下 投与した。群 3のマウスには、 HVJ-エンベロープ/ Hsp65 DNA 25 μ g+IL- 12 DNA 25 μ gの両前脛骨筋への筋肉投与にカ卩えて、 1 X 106 CFUの BCGを皮下投与した。
[0060] ¾
30日後に肺を摘出し CFUを算出した。結果を下記表に示す。
[0061] [表 4] 群 平均 CFU (loglO) SD
1 6. 18498 0. 340454
2 5. 89678 0. 280836
3 5. 53073* 0. 41 1117
* 群 1に対して Pく 0. 01
HSP65+IL-12/Env+BCGを投与した群（群 3)は、群 1に対して有意に CFUが減少し ていたのに対し、 BCGのみを投与した群 (群 2)は群 1に対して有意な CFU減少が認 められな力つた (表 4)。
さらにまた、多剤耐性結核菌感染後上記と同様の間隔で HVJ-エンベロープ /Hsp6 5 DNA 25 μ g+IL-12 DNA 25 μ gを投与したマウス（5匹一群）の生存日数を、多剤耐 性結核菌感染後何の処置も行わな 、マウス（5匹一群）の生存日数と比較した。その 結果、 HVJ-エンベロープ/ Hsp65 DNA 25 μ g+IL-12 DNA 25 μ g投与群では顕著な 延命効果が認められた (データ示さず)。このことからも、 HSP65+IL-12は、予防用結 核ワクチンとしてのみではなぐ結核感染後の治療用結核ワクチンとしても有効であり 、多剤耐性結核菌に対しても治療ワクチンとしての効果を十分に有していることが明 らかとなつた。また、 BCGと併用することにより BCGの効果を増強させることも明らかと なった。
産業上の利用可能性
本発明は、 DNAワクチンの効力を増強させるものであり、予防医学を始め臨床医学 の分野で広く有用である。特に、感染性疾患に対する DNAワクチンの利用をより一層 有益にするものである。

Claims

請求の範囲
[I] ウィルスエンベロープベクターおよび該ウィルスエンベロープベクターに封入された DNAワクチンを有効成分とする医薬組成物。
[2] ウィルスエンベロープベクターが、レトロウイルス科、トガウィルス科、コロナウィルス 科、フラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ブニヤウィルス科 、ラブドウィルス科、ボックスウィルス科、ヘルぺスウィルス科およびバキュロウィルス 科力もなる群より選択される 1種のウィルスに由来する、請求項 1記載の医薬組成物。
[3] ウィルスエンベロープベクター力 センダイウィルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイ ルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルスおよびインフルエンザ ウィルス力もなる群より選択される 1種のウィルスに由来する、請求項 1記載の医薬組 成物。
[4] ウイノレスエンベロープベクターがセンダイウイノレスエンベロープベクター (HVJ-E)で ある、請求項 1記載の医薬組成物。
[5] DNAワクチンが、感染症疾患、癌疾患、神経変性疾患、アレルギー性疾患、自己免 疫疾患力 なる群力 選択される 1種の疾患に関与する免疫原生タンパク質をコード する DNAからなる DNAワクチンである、請求項 1記載の医薬組成物。
[6] 感染性疾患が、結核、マラリア、トキソプラズマおよび HIVからなる群力 選択される 感染性疾患である、請求項 5記載の医薬組成物。
[7] DNAワクチン力 熱ショックタンパク質および/または免疫調節タンパク質をコードす るポリヌクレオチドを発現しうる形で含む DNAワクチンである、請求項 1記載の医薬組 成物。
[8] 熱ショックタンパク質をコードするポリヌクレオチド力 HSP65をコードするポリヌクレ ォチドである、請求項 7記載の医薬組成物。
[9] 免疫調節タンパク質をコードするポリヌクレオチド力 IL-12をコードするポリヌクレオ チドである、請求項 7記載の医薬組成物。
[10] DNAワクチン力 HSP65および IL- 12をコードするポリヌクレオチドを発現しうる形で 含む DNAワクチンである、請求項 1記載の医薬組成物。
[II] HSP65をコードするポリヌクレオチド力 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列からなる タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列において 1または複数 のアミノ酸が置換、欠失、付加および Zもしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、配列 番号： 1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコー ドするポリヌクレオチドである、請求項 8または 10記載の医薬組成物。
[12] IL-12をコードするポリヌクレオチド力 下記 (a)および (b)に記載のポリヌクレオチド を含む、請求項 9または 10記載の医薬組成物。
(a)配列番号： 2の第 57〜253位のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または 該アミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および Zもしくは 挿入されたアミノ酸配列を含み、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク 質と機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号： 3の第 23〜328位のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または 該アミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および Zもしくは 挿入されたアミノ酸配列を含み、配列番号： 3に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク 質と機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチド
[13] HSP65をコードするポリヌクレオチドと IL-12をコードするポリヌクレオチド力 異なる D NA分子中に含まれて 、ることを特徴とする、請求項 10記載の医薬組成物。
[14] HSP65をコードするポリヌクレオチドと IL- 12をコードするポリヌクレオチド力 1つの D NA分子中に含まれて 、ることを特徴とする、請求項 10記載の医薬組成物。
[15] 以下の（1)〜（3)の工程を含む、請求項 1〜14のいずれかに記載の医薬組成物の 製造方法。
(1) DNAワクチンとして作用する DNAまたは DNA構築物を調製する工程
(2) (1)で得られた DNAまたは DNA構築物を、ウィルスエンベロープベクター内に封 入する工程
(3)製剤上許容しうる担体を添加する工程
[16] ウィルスエンベロープベクターを有効成分とする、 DNAワクチン増強剤。
[17] 生体内への DNAワクチンの移入効率を向上させることを特徴とする、請求項 16記 載の DNAワクチン増強剤。
[18] ウィルスエンベロープベクターが、レトロウイルス科、トガウィルス科、コロナウィルス 科、フラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ブニヤウィルス科 、ラブドウィルス科、ボックスウィルス科、ヘルぺスウィルス科およびバキュロウィルス 科力もなる群より選択される 1種のウィルスに由来する、請求項 16記載の DNAヮクチ ン増強剤。
[19] ウィルスエンベロープベクター力 センダイウィルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイ ルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルスおよびインフルエンザ ウィルス力もなる群より選択される 1種のウィルスに由来する、請求項 16記載の DNA ワクチン増強剤。
[20] ウイノレスエンベロープベクターがセンダイウイノレスエンベロープベクター (HVJ-E)で ある、請求項 16記載の DNAワクチン増強剤。
[21] 感染症疾患、癌疾患、神経変性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患からなる 群力も選択される 1種の疾患に対する DNAワクチンを増強するための、請求項 16記 載の DNAワクチン増強剤。
[22] 感染性疾患が、結核、マラリア、トキソプラズマおよび HIVからなる群力 選択される 感染性疾患である、請求項 21記載の DNAワクチン増強剤。
[23] DNAワクチン力 熱ショックタンパク質および/または免疫調節タンパク質をコードす るポリヌクレオチドを発現しうる形で含む DNAワクチンである、請求項 16記載の DNA ワクチン増強剤。
[24] 熱ショックタンパク質をコードするポリヌクレオチド力 HSP65をコードするポリヌクレ ォチドである、請求項 23記載の DNAワクチン増強剤。
[25] 免疫調節タンパク質をコードするポリヌクレオチド力 IL-12をコードするポリヌクレオ チドである、請求項 23記載の DNAワクチン増強剤。
[26] DNAワクチンが HSP65および IL- 12をコードするポリヌクレオチドを発現しうる形で含 む、請求項 16に記載の DNAワクチン増強剤。
[27] HSP65をコードするポリヌクレオチド力 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列からなる タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列において 1または複数 のアミノ酸が置換、欠失、付加および Zもしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、配列 番号： 1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコー ドするポリヌクレオチドである、請求項 24または 26に記載の DNAワクチン増強剤。
[28] IL-12をコードするポリヌクレオチド力 下記 (a)および (b)に記載のポリヌクレオチド を含む、請求項 25または 26に記載の DNAワクチン増強剤。
(a)配列番号： 2の第 57〜253位のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または 該アミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および Zもしくは 挿入されたアミノ酸配列を含み、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク 質と機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号： 3の第 23〜328位のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または 該アミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および Zもしくは 挿入されたアミノ酸配列を含み、配列番号： 3に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク 質と機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチド
[29] HSP65をコードするポリヌクレオチドと IL-12をコードするポリヌクレオチドとが異なる D
NA分子中に含まれて 、ることを特徴とする、請求項 26記載の DNAワクチン増強剤。
[30] HSP65をコードするポリヌクレオチドと IL- 12をコードするポリヌクレオチドとが 1つの D
NA分子中に含まれて 、ることを特徴とする、請求項 26記載の DNAワクチン増強剤。
[31] 請求項 1〜14のいずれかに記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、感 染症疾患、癌疾患、神経変性疾患、アレルギー性疾患、または自己免疫疾患を予防 または治療する方法。
[32] 請求項 1〜14のいずれかに記載の医薬組成物に加えて、 BCGを対象に同時に投 与する工程を含む、感染症疾患を予防または治療する方法。
[33] 請求項 1〜14のいずれかに記載の医薬組成物の対象への投与の前後に、 BCGを 対象へ投与することを特徴とする、請求項 32に記載の方法。
[34] 請求項 1〜14のいずれかに記載の医薬組成物および BCGを有効成分として含む
、医薬組成物キット。
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