JPWO2011052771A1 - パラミクソウイルスベクターを用いた経鼻噴霧型結核ワクチン - Google Patents

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Abstract

ヒト結核、特に成人結核、に対して、高い予防効果のある経鼻噴霧型ワクチンを提供すること。抗酸菌由来のα抗原（例えば、Mycobacterium kansaii又はMycobacterium bovis BCG由来のもの）、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体をコードする遺伝子をパラミクソウイルス遺伝子（特に、rhPIV2）に組み込んだ経鼻噴霧型結核ワクチンによって達成される。【選択図】 図１０

Description

本発明は、パラミクソウイルスベクター、特にヒトのパラインフルエンザ２型ウイルスベクター（hPIV2）を用いた経鼻噴霧型結核ワクチンに関する。
結核は、マイコバクテリウム属に属するヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）によって引き起こされる感染症である。現在においても、結核は大量の感染者を発生させる疾患の一つである。世界中で毎年800万人以上が結核を発病し、約200万人が死亡している。これは現行の結核ワクチンであるBCG（Bacille de Calmette et Guerin：カルメット・ゲラン桿菌）ワクチンの効果が成人において認められず、このために乳幼児期でのワクチン接種で若年層のみでの結核予防効果しか得られず、追加接種を行っても成人での結核予防効果が誘導されないためである。なお、日本では、毎年2万人以上の結核患者が発生しており（約20患者／10万人）、中蔓延国となっている。
結核の予防に用いられるBCGワクチンは、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）が原型となっている。ウシ型結核菌を長期間に渡って継代培養することで、ヒトに対する毒性が失われ、抗原性のみが残った細菌をBCGワクチンとして用いている。その生きた細菌をヒトに接種することで免疫を獲得させ、ヒト型結核菌に対する感染防御を行わせる。BCGワクチンは、現在のところ実用化されている唯一の結核予防ワクチンであり、乳幼児結核の予防効果が広く認められている。
BCGワクチンの効果は十数年程度で失われてしまい、成人後には自然免疫力の増加によって結核の発生を防いでいる。しかし、自然免疫力に依っては、成人結核の発症は十分には食い止められていない。この事態に対しては、成人後にBCGワクチンを再接種する方法が考えられるが、成人結核に対してはBCGワクチンの効果は低い（或いは、ほとんどない）ことが知られている。
国際公開公報２００２／０６６０５５ 特開２００８−０７４７４９号公報
第５２回日本ウイルス学会学術集会、M蛋白欠損パラインフルエンザ２型ウイルス(PIV2)及びマウスIL-4を挿入したPIV2の性状解析、２００４年１１月２１日
上記事態に対し、いくつかの成人結核ワクチンの開発が進められている。例えば、MVA85Aワクチン（ワクシニアウイルスAnkaraに抗酸菌の85A抗原を発現させたワクチン）、Aeras402ワクチン（35型アデノウイルスに85A抗原とTB10.4を発現させたワクチン）、およびM72F（別名GSK TB101：GSK（Glaxo Smith Kline）社によって開発されたワクチンであり、Mycobacterium tuberculosisのタンパク質をGSK社のAS02アジュバントと共に使用するワクチン）などの開発が行われている。しかしながら今のところ、十分に効果のある成人結核ワクチンは知られていない。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、結核予防に効果のある経鼻噴霧型ワクチンを提供することである。
hPIV2は、パラミクソウイルス科に属するウイルスであり、そのゲノムは約15000塩基の一本鎖マイナスRNAである。この核酸にヌクレオカプシド蛋白（NP）が結合し、らせん対称リボヌクレオシドプロテイン複合体（ヌクレオカプシド、RNP）を形成している。ウイルスゲノムがコードするタンパク質のうちM蛋白は、ウイルス糖蛋白の細胞質内ドメイン、エンベロープ脂質二重膜およびRNPと相互作用し、ウイルス粒子の出芽に重要である。遺伝子組換えにより、M蛋白を欠失させたウイルスゲノムは、細胞に感染して、所定のウイルスタンパク質を発現するものの、出芽することができない。本発明者は、M蛋白を欠失させたPIV2が、外来タンパク質を標的細胞で発現させるためのベクターとして使用できることを見出した（非特許文献１）。
一方、本発明者は、抗酸菌由来のα抗原がアレルギー性疾患の予防・治療に効果的であることを見出した（特許文献１）。α抗原をCMVプロモーターおよびTPAシグナルペプチドの下流に組み込んだ発現ベクターpcDNA-α-Kとして構築し、喘息マウスモデルでの検証を行った。更に、α抗原を有効に用いるために発現量が多いベクターとして、PIV2を用いたところ、アレルギー性疾患に有効であることを見出した（特許文献２）。
本発明者の上記技術が、結核ワクチンに応用できるか否かを検討したところ、驚くべきことに、従来の方法では、ほとんど効果が認められなかった結核菌の感染予防に関して、M蛋白質又はF蛋白質を欠損させたhPIV2（rhPIV2）にα抗原を組み込んだ発現ベクターが結核予防効果を示すことを見出し、基本的に本発明を完成するに至った。
こうして、第一の発明に係る経鼻噴霧型結核ワクチンは、抗酸菌由来のα抗原（Ag85B）、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体（以下、「α抗原等」という）をコードする遺伝子を、M遺伝子、F遺伝子又はHN遺伝子を欠損させたパラミクソウイルス遺伝子に組み込んだことを特徴とする。
また、第二の発明に係る結核の予防または治療方法は、抗酸菌由来のα抗原、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体をコードする遺伝子を、M遺伝子、F遺伝子又はHN遺伝子を欠損させたパラミクソウイルス遺伝子に組み込み、これをヒトを含む哺乳動物に噴霧し経鼻投与することを特徴とする。
パラミクソウイルスとは、パラミクソウイルス科に属するウイルスを意味する。パラミクソウイルスは、マイナス一本鎖RNAをゲノムに持ち、ビリオンが150nm〜350nmの多形性を示すウイルスの分類を意味する。パラミクソウイルス粒子は、エンベロープに包まれ、エンベロープの表面には２種類の糖タンパク質（FとHN）が配列している。パラミクソウイルスには、例えばパラインフルエンザウイルス（PIV）、ウシパラインフルエンザウイルス３、センダイウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ウシ疫ウイルス、麻疹ウイルス、ヒツジ疫ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、トリパラミクソウイルス２〜９型、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、ウシＲＳウイルス、ヒトＲＳウイルス、ヒトニューモウイルスなどが含まれる。
α抗原は、Mycobacterium kansasii又はMycobacterium bovis BCG由来のものであることが好ましい。また、α抗原の類似体が、抗原85複合体構成蛋白85Aまたは抗原85複合体構成蛋白85Cであることが好ましい。
本発明によれば、成人結核に対しても予防・治療効果の高いワクチンを提供できる。
本発明に係るワクチンは、骨格となるパラミクソウイルス（特に、hPIV2）のもつ呼吸器感染における高い蛋白発現特性を活かしつつ、投与利便性の高い経鼻噴霧型の生ワクチンである。現在開発中のMVA85A及びAeras402の組換え生ワクチンは、いずれも注射剤であるのに対し、本発明に係る経鼻ワクチンは噴霧剤であり、目的蛋白の発現量も注射剤投与よりも高い。結核予防においては、全身免疫よりも病態発現部位である肺での局所免疫の誘導が重要視されている。細胞性免疫(Th1)移行性機能をもつ蛋白遺伝子を挿入したパラミクソウイルスベクターを用いることにより、肺での高い細胞性免疫誘導が得られることから、他のベクターと比較して結核菌に対するワクチン効果が、より高いと考えられる。また、骨格となるウイルスの病原性においても、特に成人での安全性は高い。
更に、製造面においても、培養細胞の使用及び噴霧剤化により、高い歩留り率とコストの低減化が可能となる。
ストップコドン導入によるM蛋白質を発現しないアンチセンスrhPIV2ゲノムの概要を説明する図である。 T7プロモーターの下流に組込んだストップコドン導入よるM遺伝子欠損型アンチセンスrhPIV2ゲノムcDNAを含むプラスミドベクターからのウイルス粒子を回収する方法を説明する図である。 M蛋白遺伝子又はF蛋白遺伝子を欠失させて、Ag85B等の遺伝子を発現型として組み込んだΔM/rhPIV2及びΔF/rhPIV2の構造を示す図である。 rhPIV2-GFP経鼻投与ハムスターの気道におけるGFPの発現を確認した顕微鏡写真図である。 rhPIV2-Ag85Bによって、遺伝子産物の発現の有無を確認したときのウエスタンブロットの写真図である。 F発現細胞でGFP遺伝子を含むΔF/rhPIV2が増殖し、GFPの蛍光を呈する細胞が増えている様子を示す図である。 ΔF/rhPIV2にBCG-Ag85Bを導入したベクターによって、BCG-Ag85Bが発現している様子を示すウエスタンブロットの図である。 rhPIV2-Ag85B（M終始）ワクチンとして経鼻投与したマウスに、結核菌を感染させた後の肺における結核菌の結節を確認した写真図である。(A)はコントロール（rhPIV2-GFP）を４回投与後、(B)は発現型Ag85B-DNAを２回・rhPIV2-Ag85B（M終始）を２回投与後、(C)はrhPIV2-Ag85B（M終始）を４回投与後に、それぞれ結核菌に感染させたマウスの肺である。 図８に示した肺病変の様子を示す顕微鏡写真図である。(A)はrhPIV2-Ag85B（M終始）を４回投与後、(B)はコントロール（rhPIV2-GFP）を４回投与後に、それぞれ結核菌に感染させたマウスの肺である。 rhPIV2-Ag85B（M終始）ワクチンの結核感染予防試験における結核菌数を比較したグラフである。
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施できる。本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶ。
本発明に用いるヒトパラミクソウイルス（特に、hPIV2）は病原性が極めて少なく、かつ蛋白質の発現量が多い。このため、そのまま外来蛋白質であるα抗原等をコードする遺伝子を組み込んだパラミクソウイルス遺伝子を調製して、これを用いることも不可能ではない。
しかしながら、ウイルスの構成蛋白質遺伝子を除去し、当該遺伝子を細胞・プラスミド等より供給し、より安全な非増殖型ウイルスベクターを供給するアデノウイルスベクター等にならい、パラミクソウイルスベクターの一種であるhPIV2ベクターにおいてもhPIV2のM遺伝子、F遺伝子、又はHN遺伝子を欠損させたrhPIV2を用いることにより、感染および蛋白質の発現は同等に行われるものの、感染性hPIV2を産生しない、より安全なhPIV2ベクターとなる。このため、本発明においては、M遺伝子、F遺伝子、又はHN遺伝子を欠損させたhPIV2（rhPIV2）にα抗原等をコードする遺伝子を組み込むこととした。α抗原等を組み込む場所としては、rhPIV2ゲノムのいずれの位置でも良いが、アンチセンスウイルスゲノムの5'末端側に組み込むことにより、外来蛋白質の発現量が多くなるので好ましい。アンチセンスPIV2ゲノムは、一本鎖RNAであり、5'末端から3'末端に向かって、リーダー（Leader：プロモーター配列)、NP、V/P、M、F、HN、L、トレイラー(Trailer)という構造を持っている。このため、α抗原等をコードする遺伝子は、リーダー（プロモーター配列）の直後、またはNPとV/Pの間等の5'末端側に近い位置であることが好ましい。
マトリックス蛋白であるM遺伝子ならびに膜蛋白質を構成する遺伝子であるF遺伝子、又はHN遺伝子を欠損させるには、M蛋白質、F蛋白質、又はHN蛋白質をコードする遺伝子部分の全部または一部を取り除く方法、またはM蛋白質、F蛋白質、又はHN蛋白質をコードする遺伝子のどこかにストップコドンを組み込む方法などが例示される。
M遺伝子、F遺伝子、又はHN遺伝子を欠損させたPIV2ゲノム遺伝子にM蛋白質、F蛋白質、又はHN蛋白質のそれぞれを発現するプラスミドを一過性に細胞に導入し当該遺伝子を発現させる方法、又はM遺伝子、F遺伝子、又はHN遺伝子のそれぞれを発現する細胞を造成し、当該細胞上でM遺伝子、F遺伝子、又はHN遺伝子を欠損させたPIV2を増殖させることにより、これら遺伝子を発現しない細胞・組織では多段階増殖をしない非増殖型のPIV2を作製することができる。M遺伝子、F遺伝子、又はHN遺伝子を完全欠損し自律増殖ができないウイルスを、それぞれΔM/rhPIV2若しくはrhPIV2(ΔM)、ΔF/rhPIV2若しくはrhPIV2(ΔF）、又はΔHN/rhPIV2若しくはrhPIV2(ΔHN)と呼称する。
本発明において、α抗原（Ag85B）とは、抗酸菌に普遍的に存在する蛋白の一つであり、抗原85複合体の一つである抗原85複合体構成蛋白85Bとして同定されたものである。この抗原85複合体は、分子量が30〜32kD程度の抗原85複合体構成蛋白85A（Ag85A：Infect. Immun. 57: 3123-3130, 1989）、抗原85複合体構成蛋白85B（Infect. Immun. 58(2), 550-556(1990). Accession No. X53897）、および抗原85複合体構成蛋白85C（Ag85C：Infect. Immun. 59: 5205-3212, 1991）から構成されている。これらの蛋白質は、抗酸菌の主要な分泌蛋白である。これらの分泌蛋白は、 Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium kansasii 等の同属の細菌間では、遺伝子・アミノ酸配列が種を超えて高い相同性を示し、モノクローナル抗体に対する交差反応性を示すことが知られている（Microbiol. Rev. 56: 648-661, 1992）。α抗原（抗原85複合体構成蛋白85B: Ag85B）の類似体としては、抗原85複合体構成蛋白85A（Ag85A）、抗原85複合体構成蛋白85C（Ag85C）などが挙げられる。
本発明において、抗酸菌由来のα抗原もしくはその類似体をコードする遺伝子とは、α抗原蛋白あるいは抗原85複合体構成蛋白85A、抗原85複合体構成蛋白85Cなどのα抗原蛋白の類似体を発現することが可能な遺伝子を意味する。具体的には、α抗原もしくはその類似体をコードする遺伝子を含む発現ベクターの形態にある遺伝子が挙げられる。α抗原をコードする遺伝子としては、Mycobacterium kansasii （Infect. Immun. 58: 550-556, 1990）、Mycobacterium bovis BCG (J. Bacteriol. 170:3847-3854、1988)、Mycobacterium avium （Infect. Immun. 61: 1173-1179, 1993）、Mycobacterium intracellulare （Biochem, Biophys. Res. Commun. 196: 1466-1473, 1993）、Mycobacterium leprae （Mol. Microbiol. 6: 153-163, 1992）などの抗酸菌由来のα抗原をコードする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子のいずれも本発明に用いることができる。これらのうち、Mycobacterium kansasii のα抗原をコードする遺伝子として、配列番号1に示す390番目〜1244番目までの塩基配列を有するDNA、Mycobacterium bovis BCG のα抗原をコードする遺伝子として、配列番号3に示す121番目〜975番目までの塩基配列を有するDNAが挙げられる。これらのDNA以外にも、このDNAに相補的な配列を持つDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする変異体DNA、このDNAによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して1若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNAであってMycobacterium kansasii 又は Mycobacterium bovis BCG由来のα抗原と同様の機能を有する蛋白質をコードする変異体DNAを用いることもできる。Mycobacterium kansasii 又は Mycobacterium bovis BCG由来のα抗原と同様の機能とは、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の感染に対して同様の予防効果を奏することを示している。
Mycobacterium bovis BCGのα抗原は285個のアミノ酸残基の成熟蛋白質で構成され、当該アミノ酸配列はMycobacterium kansasiiのα抗原より、Mycobacterium tuberculosisにより高いアミノ酸相同性（100%）をもっており、当該α抗原を導入することにより高い結核発症予防効果を奏すると考えられる。
変異体DNAを得るための具体的方法としては、例えば次の方法が挙げられる。即ち、50%ホルムアミド、4 x Denhardt、5 x SSPE （SSPE溶液：EDTAリン酸ナトリウム塩（SSPE）、1 x Denhardt: 0.02%フィコール、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02%ウシ血清アルブミン）、0.2% SDS、100μg/mL ssDNA、および12.5 ngのプローブ（配列番号1に示す390番目〜1244番目までの塩基配列、または配列番号3に示す121番目〜975番目までの塩基配列を有するcDNA断片12.5 ngを、BcaBest DNA Labeling Kit (TaKaRa) を用いて[α-32P]dCTP（Amersham）により標識したもの） 存在下で、45℃で14-16時間コロニーハイブリダイゼーションを行った後、フィルターを1 x SSPE、0.5% SDS溶液中で45℃にて30分間、その後0.1 x SSPE、0.5% SDS溶液中で55℃にて1時間、最後に0.1 x SSPE、0.5% SDS溶液中で65℃にて1時間洗浄し、バックグラウンドを落とした後、X線フィルム（Fuji）に-80℃で72時間露出し、対応するコロニーの位置を決定して単離することによって変異体DNAを得ることができる。これらの変異体がコードするアミノ酸配列は、α抗原のアミノ酸配列に対して通常60%以上の相同性、好ましくは75%以上の相同性を有する。Mycobacterium kansasii 又は Mycobacterium bovis BCG以外の抗酸菌由来のα抗原をコードする遺伝子の場合にも、同様にそれらの変異体であってもよい。
α抗原の類似体である抗原85複合体構成蛋白85Aをコードする遺伝子としては、上記したα抗原遺伝子についての各種抗酸菌と同様の抗酸菌由来の遺伝子が挙げられる。より具体的には、Mycobacterium tuberculosis 由来の抗原85複合体構成蛋白85AをコードするDNAが挙げられる（Infect. Immun. 57: 3212-3130, 1989）。抗原85複合体構成蛋白85Cをコードする遺伝子についても、同様に各種抗酸菌由来の遺伝子が挙げられる。より具体的には、Mycobacterium tuberculosis 由来の抗原85複合体構成蛋白85CをコードするDNAが挙げられる（Infect. Immun. 59: 3205-3212, 1991）。これらのDNAについても、上記と同様に、これらのDNAに相補的な配列を持つDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAや、このDNAによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して1若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNAであって、抗原85複合体構成蛋白85Aあるいは抗原85複合体構成蛋白85Cと同様の機能を有する蛋白質をコードする変異体を用いることができる。
上記DNAは、前記文献に記載されている配列情報、Genbank等の配列情報等に基づき適当なDNA部分をPCRプライマーとして用い、抗酸菌由来のmRNAに対してRT-PCR反応を行うことなどにより、クローニングできる。また、アミノ酸配列情報に基づき化学合成することもできる。上記DNAの変異体は、例えば部位特異的突然変異誘発法、PCR法、又は通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができる。
本発明では、結核予防に抗酸菌由来のα抗原蛋白、その類似体である抗原85複合体構成蛋白85Aもしくは抗原85複合体構成蛋白85Cそのもの、あるいはそれらの変異体蛋白を用いることもできる。このようなα抗原としては、上記したα抗原をコードする遺伝子によってコードされる蛋白質が挙げられる。具体的には、例えば配列番号１に示した Mycobacterium kansasii 由来の塩基配列を有するDNAによってコードされるα抗原であって配列番号２に示したアミノ酸配列を有するα抗原、又は配列番号３に示した Mycobacterium bovis BCG 由来の塩基配列を有するDNAによってコードされるα抗原であって配列番号４に示したアミノ酸配列を有するα抗原などが挙げられる。後者の塩基配列およびアミノ酸配列は、このURL（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X62397?ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Sequence.Sequence_ResultsPanel.Sequence_RVDocSum）にて入手できる。
これらのアミノ酸配列を有するα抗原以外にも、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列に対して1若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であって該α抗原と同様の機能を有する変異体蛋白質であってもよい。Mycobacterium kansasii 又は Mycobacterium bovis BCG 以外の抗酸菌由来のα抗原の場合にも、同様にそれらのアミノ酸配列に対して1若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であって該α抗原と同様の機能を有する変異体蛋白質であってもよい。また、抗原85複合体構成蛋白85Aもしくは抗原85複合体構成蛋白85Cについても、Mycobacterium tuberculosis 由来の抗原85複合体構成蛋白85A（Infect. Immun. 57: 3213-3130, 1989）、Mycobacterium tuberculosis 由来の抗原85複合体構成蛋白85C（Infect. Immun. 59: 3205-3212, 1991）などが挙げられる。これらのα抗原蛋白の類似体についても、α抗原蛋白の変異体と同様の変異体であってもよい。
このような蛋白質は、それをコードする遺伝子を用いた組換えDNA法により製造することもでき、また化学合成によって製造することもできる。あるいは、Mycobacterium kansasii 、Mycobacterium bovis BCGなどの抗酸菌を適当な培地で培養し、その培養液から公知の精製法によって精製して得ることもできる（Scand. J. Immunol. 43: 202-209, 1996; J. Bacteriol. 170: 3847-3854, 1988: Hiroshima J. Med. Sci. 32: 1-8, 1983; J. Bacteriol. 170:3847-3854、1988）。
本発明においては、結核ワクチンとして、抗酸菌由来のα抗原、その類似体またはそれらの変異体をコードする遺伝子を用いる場合には、具体的には、抗酸菌由来のα抗原、その類似体またはそれらの変異体をコードする遺伝子を含むhPIV2の形態で用いる。rhPIV2としては、M遺伝子、F遺伝子、又はHN遺伝子を欠失させたhPIV2ゲノムを用いることができる。M遺伝子、F遺伝子、又はHN遺伝子欠失hPIV2（rhPIV2）ゲノムにα抗原等をコードする遺伝子を組み込むことにより、α抗原等を発現するrhPIV2ベクターが構築される。
この発現ベクターは、通常、噴霧剤としてヒトを含む哺乳動物に投与できる。噴霧剤は常法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（PBS等の緩衝液、生理食塩水、安定化剤等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。噴霧剤には、必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。こうして得られた発現ベクターを結核ワクチンとして用いるためには、噴霧剤の通常使用方法によって投与できる。
結核ワクチンの投与量としては、対象患者の体重などにより変動し得るが、通常、発現ベクターとして、1回に、約1ｘ103〜1ｘ1010個のウイルス、好ましくは約1ｘ104〜1ｘ109個のウイルスを用い、数日〜数週間の間隔を経て、合計２〜５回投与するのが好ましい。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１ ストップコドン導入によるM蛋白欠失アンチセンスrhPIV2（M終始）ゲノムの構築
図１には、M蛋白質をコードする遺伝子の所定の位置にストップコドンを組み込んだアンチセンスrhPIV2（M終始）ゲノムの概要を示した。Δ119（M蛋白遺伝子の259位のAAGをTAGとしたもの）およびΔ289（M蛋白遺伝子の89位のATGをTAGとし、併せて259位のAAGをTAGとしたもの）の２種類のM蛋白質欠損hPIV2（それぞれ、rhPIV2（Δ119）、およびrhPIV2（Δ289））アンチセンスrhPIV2ゲノムをT7プロモーターの下流にcDNAとして組み込んだプラスミドベクターの様子を示した（これらを総称してrhPIV2（M終始）と呼ぶ）。M蛋白を欠損させたhPIV2（M終始）を構築するには、当業者に公知の遺伝子手法（例えば、PCR法）を用いることができる。
実施例２ rhPIV2（M終始）の調製方法
次に、T7プロモーターの下流に挿入したアンチセンスrhPIV2ゲノムcDNAを含むプラスミドからのウイルス粒子の回収方法について説明する。図２には、その方法の概要を示した。図1のようにして構築したアンチセンスrhPIV2ゲノム（rhPIV2、rhPIV2（Δ289）、rhPIV2（Δ119））をT7 RNA ポリメラーゼを発現する細胞（例えば、BSR-T7/5）にトランスフェクションした。このとき、hPIV2ポリメラーゼユニット（すなわち、NP蛋白、P蛋白、L蛋白）を発現するベクターであるhPIV2-NP、hPIV2-P、hPIV2-Lの3種類の発現ベクターを共にトランスフェクションした。なお、DNAのトランスフェクションには、当業者に周知の方法を用いることができる（本実施形態では、リポフェクトアミンを用いた）。
48時間毎にVero細胞との共培養を5-7回行ったところ、細胞変性効果（Cytopathic effect: CPE）が90%以上の効率で確認された。このとき、hPIV2では、上清中に大量の組換えウイルス粒子が認められたが、rhPIV2（Δ289）およびrhPIV2（Δ119）では、ほとんど組換えウイルス粒子が確認されなかった。これは、M蛋白質を欠損すると、hPIV2の出芽が行われないことを示している。
そこで、Vero細胞に代えて、hPIV2-Mを発現するCos細胞（M蛋白を発現するベクターであるhPIV2-MをトランスフェクションしたCos細胞）を用いて共培養した。その結果、rhPIV2（Δ289）およびrhPIV2（Δ119）についても、上清中に大量の組換えウイルス粒子が認められた。
上記では、T7プロモーターを用いたrhPIV2の調製方法について説明したが、本発明によれば、いずれのベクター（ファージベクター、プラスミドベクターなど）を用いて調製したrhPIV2であっても使用することができる。
実施例３ M遺伝子またはF遺伝子を完全に欠損するアンチセンスゲノム（ΔM/rhPIV2、ΔF/rhPIV2）の構築
図３に示すように、hPIV2のゲノム遺伝子を含むプラスミドのうちM遺伝子、F遺伝子及びHN遺伝子の一部をコードするSacI-KpnI制限酵素切断サイト間のおよそ5.5kbの遺伝子をpUC118ベクターのSacI-KpnI制限酵素切断サイトに導入した。
M遺伝子欠損ゲノムの構築については、M遺伝子のR1領域およびR2領域を含むM遺伝子コード領域を完全に欠失した△M/rhPIV2をPCRにより作製した。M遺伝子を欠失したM遺伝子上流域配列と下流域配列を結合したプライマーを合成し、多段階PCRを実施しM遺伝子コード領域を完全に欠失した△M/rhPIV2を構築した。プライマー配列は、制限酵素切断部位を含む配列として5’-tgaaggagat cattgagctc ttaaagggac ttg -3’（配列番号５）、 M遺伝子上流域配列として5’-tggaacgttt agttttttta ttaaatttat catgtccagc ct-3’（配列番号６）、 M遺伝子下流域配列として、5’-ttaataaaaa aactaaacgt tccacaataa atcaacgttc ag-3’ （配列番号７）、および5’-ggattcttaa agcttggatg gaga-3’ （配列番号８）とした。また、全体の塩基数が6の倍数となるように塩基数を調整した。
F遺伝子欠損ゲノムの構築については、F遺伝子のR1領域およびR2領域を含むF遺伝子コード領域1,884bpを完全に欠失したΔF/rhPIV2を作製した。F遺伝子欠損ゲノムについては、F構造遺伝子の直上領域にBclI制限酵素切断配列及びHN遺伝子中にKpnI制限酵素切断配列が存在しており、当該制限酵素切断配列をもちいてF遺伝子の完全欠損を行った。使用したプライマーは、5’-actgatcaat ctaacaaaaa aactaaacgt tctaagcacg aacccttaag gtgtcgtaac gtctcgt-3’（配列番号９）、および、5’-acttgatagg acggtaccca ttgagcctca atg -3’（配列番号１０）を用いて構築した。
実施例４ 一過性ウイルスの回収
結核ワクチンのα抗原用遺伝子を導入しM遺伝子又はF遺伝子を完全に欠損したΔM/rhPIV2またはΔF/rhPIV2ウイルスを一過的に発現し回収する系については、rhPIV2（M終始）ウイルス回収方法と同様の方法又は別法によりウイルスの回収を図った。
実施例５ M蛋白質発現細胞またはF蛋白質発現細胞の造成
hPIV2のM蛋白質およびF蛋白質を単独で恒常的に細胞に発現させることは、当該蛋白質が細胞毒性をもつことが考えられるため、（１）常時当該蛋白質を発現する系の他に、（２）誘導的に当該蛋白質を発現させる系を構築した。
（１）蛋白質常時発現系の構築
ネオマイシン耐性遺伝子又はピューロマイシン耐性遺伝子を保持し、chicken β-actin promoter配列およびRabbitβ-globin polyA配列（CAG romoter）を保持するベクターにM又はF遺伝子配列を導入したベクターを用いて実施した。
（２）蛋白質誘導発現系の構築
誘導発現系によるM蛋白質発現細胞またはF蛋白質発現細胞の造成
誘導発現系用Creリコンビナーゼにより、2つのloxP配列に存在するstuffer配列を除去することにより、発現を誘導する系（pCALNベクター）を用いて実施した。当該ベクターは、SwaI制限酵素切断部位に外来遺伝子で挿入することが可能である。SwaI制限酵素切断部位は平滑末端であり、当該平滑末端部位にM遺伝子の場合には、M遺伝子の上下領域に平滑末端切断を生じるPmeI制限酵素切断部位をPCRにより導入し、当該M遺伝子の誘導発現ベクターを構築した。
F遺伝子誘導発現系については、F遺伝子の上下領域にSwaI平滑末端切断を生じる制限酵素切断部位をPCRにより導入し、当該F遺伝子の誘導発現ベクターを構築した。当該F遺伝子回収用に使用したPCR用プライマー配列は、5’-aaatttaaat atattcagcc atgcatcacc tg-3’（配列番号１１）及び5’-aaatttaaat cttgtgatag atttcttaag atatcc-3’（配列番号１２）を使用した。
実施例６ 発現細胞の構築
上記ベクターをリポフェクタミン2000（Invitrogen）等を用いて、Vero細胞をトランスフェクションし、ネオマイシンを添加し培養（1mg/ml）した。ネオマイシンによる薬剤耐性よりスクリーニングを行った。M遺伝子の誘導系発現系可能なVero細胞を回収した。当該細胞にCre蛋白質を発現するアデノウイルスを感染させ、M蛋白質を発現させた。前述実施例により回収したM遺伝子欠損ウイルスを当該細胞に感染させ、非増殖型ウイルスの回収を図った。その結果、M遺伝子を欠損した非増殖型ウイルスの回収を図ることができた。
M蛋白質発現細胞と同様の方法又は別法でF蛋白質誘導発現細胞及びF蛋白質常時発現細胞の構築を行った。その結果、F蛋白質誘導発現細胞及びF蛋白質常時発現細胞を取得することができた。これら細胞を用いて、F遺伝子を欠損した非増殖型ウイルスの回収を図ることができた（図６）。
実施例７ α抗原をコードする遺伝子を含むrhPIV2の構築
配列番号1に示した390番目〜1244番目の塩基配列からなるMycobacterium kansasiiのα抗原遺伝子（αK）の５’にTPAのシグナル配列をさらに３’にhPIV2のR1、介在配列およびR2を付加させ、rhPIV2のNot I部位に挿入することにより、α抗原遺伝子を組み込んだrhPIV2（以下、「rhPIV2-Ag85B」または「rhPIV2/Ag85B」という）を構築した（図３を参照）。Not I部位はrhPIV2ゲノムのリーダー配列の直後に組み込まれたものであり、アンチセンスrhPIV2ゲノムの5'末端付近に設けられている。なおコントロールとして、Not I部位にGFP（オワンクラゲ由来の蛍光タンパク質）遺伝子を組み込んだrhPIV2（以下、「rhPIV2-GFP」または「rhPIV2/GFP」という）を構築した。
実施例２の方法により、rhPIV2-Ag85BおよびrhPIV2-GFPを大量に調製した。
次に、配列番号３に示した121番目〜975番目の塩基配列からなるMycobacterium bovis BCGのα抗原遺伝子（αK）BCG-Ag85B の遺伝子を、配列番号3に示す121番目〜975番目までの塩基配列を有するDNAに開始コドン（ATG）を付加しrhPIV2のNot I部位に挿入することにより、BCG-Ag85Bを組み込んだrhPIV2（以下、「ΔM/rhPIV2 -Ag85B(BCG)」又は「またはΔF/rhPIV2-Ag85B(BCG)」という）を構築した（図３を参照）。Not I部位はrhPIV2ゲノムのリーダー配列の直後に組み込まれたものであり、アンチセンスrhPIV2ゲノムの5'末端付近に設けられている。
つまり、BCGのAg85Bは、配列番号４のアミノ酸配列において、シグナル配列部分（1〜40）を削除し、41番目〜325番目のアミノ酸（FSR……）に該当する121番目〜975番目の塩基（ttctccc……）を組み込んだ。
実施例８ ハムスターにおけるGFPの発現確認
ハムスターにrhPIV2-GFPを経鼻投与（IN: 5 x 105ウイルス）したところ、図５に示すように、気道（trachea）および肺（lung）の上皮細胞において、GFPの蛍光が確認された。このことから、rhPIV2は経鼻投与により、気道や肺に極めて高い外来遺伝子の発現を促すことが分かった(図４)。
実施例９ マウスを用いた結核の予防に関する効果確認
30匹のBALB/CマウスをA〜Cの3群（10匹/群）に分け、各群をそれぞれ下記処置を施した。
A群（コントロール群）：rhPIV2-GFPを2週間隔で4回経鼻投与した。rhPIV2-GFPの経鼻投与量として、1 x 107ウイルス/20μL を1 回分とした。
B群（試験群１）：発現型Ag85B-DNAを2週間隔で2回に渡って腹腔内投与し、rhPIV2-Ag85B（M終始）を2週間隔で2回に渡って経鼻投与した。発現型Ag85B-DNAの投与量として、1匹あたり50μgとした。また、rhPIV2-Ag85B（M終始）の経鼻投与量として、1 x 107ウイルス/20μL を1 回分とした。
C群（試験群２）：rhPIV2-Ag85B（M終始）を2週間隔で4回経鼻投与した。rhPIV2-Ag85B（M終始）の経鼻投与量として、1 x 107ウイルス/20μL を1 回分とした。
各群については、最終免疫1週後に強毒性の結核菌（Mycobacterium tuberculosis Kurono strain）を経鼻感染させた。実験開始から49日目に、肺および脾臓を摘出し、結核結節の確認、病変切片の顕微鏡像、および結核菌数を確認した。
結果を図８〜図１０に示した。
経鼻噴霧型ワクチンの最大の特徴は、注射等によるワクチン接種に比べて、接種が容易であり、かつ安全性が高いことである。rhPIV2を用いた結核ワクチンは、現存の喉スプレータイプの容器で接種が可能であり、迅速かつ安全な接種が行える。特に、医師不足や注射による感染等を考慮にいれると、発展途上国等でのワクチン接種に絶大な効果をもたらし、世界的なインパクトも強いと考えられる。
結核菌は、マクロファージなどの食細胞の中で増殖する細胞内寄生性細菌である。結核菌の感染予防には、抗体が主体となる液性免疫ではなく、活性化マクロファージや細胞傷害性Ｔ細胞(CTL)を誘導する細胞性免疫(Th1)が中心となる。Ag85Bは、遺伝子背景に左右されずにTh1タイプの免疫反応を誘導する抗酸菌の生物活性を示す単一蛋白であり、結核予防に重要な活性化マクロファージを誘導するインターフェロンガンマ(INF-γ)の産生やT細胞のCTLへの分化を促進する。
そこで、結核ワクチンとして利用するために、外来遺伝子 Ag85Bを分泌型として導入したベクター（rhPIV2-Ag85B）を調製し、Ag85Bの発現を確認した。その結果、図５に示すように、Ag85Bが蛋白質として発現することが認められた。
GFP-PIV2（ΔF）をF発現細胞に感染させたところ、図６に示すように、GFP蛍光が認められたことから、GFP-PIV2(ΔF）ウイルスの発現と回収が行えることが分かった。また、BCG-Ag85Bを導入したΔF/rhPIV2-Ag85B(BCG)ベクターについても、BCG-Ag85Bが蛋白質として発現することが分かった（図７）。
また、rhPIV2（M終始）、rhPIV2（ΔF）、rhPIV2（ΔM）にAg85B又はBCG−Ag85Bを経鼻投与したマウスにおいては、肺での強毒結核菌（Mycobacterium tuberculosisi Kurono strain）による肺結核特有の病変（結核結節）が有意に減少することが分った。これらのうち、図８〜図１０には、rhPIV2-Ag85Bの結果を示した。図８(A)では、多くの結核結節が認められる一方、図８(B)および図８(C)では、この順に結核結節の数がコントロール群に比べて有意に減少した。図９には、結核結節の顕微鏡写真図を示した。コントロール群（B）では、肺胞が壊れている様子が分る一方、試験群２（A）では、通常の状態とほぼ同等の様子が確認された。なお、rhPIV2（ΔF）、rhPIV2（ΔM）についても、Ag85B 及びBCG-Ag85Bについて上記と同等の効果が認められた。
図１０には、肺および脾臓における結核菌数を示した。コントロール群では、肺において105.05 、脾臓において104.08 の菌数が、それぞれ計数された。一方、試験群１では、肺において104.20 、脾臓において103.45 の菌数が、試験群２では、肺において103.10 、脾臓において103.28 の菌数が、それぞれ計数された。一般に、肺結核の計数試験においては、従来のワクチン試験ではBCGを除くと、有意差が認められ難く、試験群とコントロール群との間で、菌数が10倍も異なることはまれである。しかし、本試験では、rhPIV2-Ag85Bを用いた試験群の結核菌数がコントロール群の結核菌数の1/10〜1/100程度の少数となったことから、本実施形態のワクチンは非常に予防効果の高いものであることが分った。
＜本実施形態の結核ワクチンに関する考察＞
hPIV2プロトタイプベクターは、気道粘膜特異的に感染し、(-)極性の非分節型１本鎖RNAをゲノムとしてもっており、このRNAゲノムを６塩基に１個のヌクレオカプシド蛋白が取り巻き、ラセン状のリボヌクレオ蛋白（RNP）を構成している。非分節型RNAをゲノムとしてもつことで、分節型のRNAゲノムをもつインフルエンザウイルスのように分節間の変異（不連続変異）は起こらない。また、ゲノムが６の倍数でなければ、転写・複製の効果が著しく減少するため相同性組換え等による遺伝子変異も考えにくい。先に示した臨床試験段階にあるMVA85A（ワクシニアアンカラ）ならびにAeras402（アデノ35型）は、母体がDNAウイルスであり、偶発的な相同組換え等の危険性は避けられないが、本実施形態のhPIV2ベクターの母体はRNAウイルスであり、生活環のすべてを細胞質内で行うため、上記２種のDNAベクターとは異なり、ゲノムが核内の染色体に組込まれることはない。
M遺伝子、F遺伝子またはHN遺伝子の発現をストップコドンまたは遺伝子の欠損により除去したベクターは、2次感染性粒子産生の危険性もなく、経鼻的に気道粘膜特異的に遺伝子導入可能なRNPマシーンである。当該ベクターは、元来の病原性が、上記DNAベクターよりも弱く、ヒト（成人）での病原性の報告もなく、極めて安全である。更に、当該ベクターは、hPIV2ゲノムからの転写の特徴を最大限に活かし、ゲノムからの外来遺伝子の発現量が最大となるように設計されているうえ、M遺伝子、F遺伝子またはHN遺伝子がゲノムからの転写を抑制すると考えられていることから、M遺伝子、F遺伝子またはHN遺伝子の産物を欠失させたこのベクターの蛋白発現量は極めて高い。GFP (green fluorescent protein)を挿入したrhPIV2（M終始）-GFPをハムスターに経鼻投与したところ、GFPの強い発現を確認した（図４）。
結核予防においては、全身免疫よりも病態発現部位である肺での局所免疫（細胞性免疫）の誘導が重要視されている。本実施形態では、細胞性免疫誘導蛋白(Ag85BまたはBCG-Ag85B)を挿入した非増殖型rhPIV2-Ag85BベクターまたはrhPIV2-BCG-Ag85Bをワクチンとして用いた。このベクターは、安全でかつ肺への細胞性免疫誘導蛋白の強発現が可能であることから、成人結核ワクチンベクターとしては非常に有効であると考えられた。
このワクチンベクターは、接種によって一回の感染のみが行われ、２次感染性粒子は産生されないという安全な弱毒半生経鼻噴霧ワクチン用として開発された。外来抗原として発現させる非定型抗酸菌(Mycobacterium kansasii及びMycobacterium bovis BCG)由来のα抗原（Ag85B）は、細胞性免疫誘導能を有している。Ag85Bを病態発現部位である肺で高発現させることにより、結核菌に対する高い細胞性免疫(Th1)が誘導されると考えられた。実際に、rhPIV2-GFPベクターをハムスターに鼻腔感染させると、気道上皮細胞および肺の終末気管支にまでマーカー遺伝子であるGFPの強い発現が見られた（図４）。
マウスを用いた感染防御試験（結核予防試験）では、rhPIV2-Ag85Bに強力な結核予防効果が認められた（図８〜図１０）。この試験プロトコールでは、rhPIV2-Ag85Bの単独投与（試験群２）に加えて、発現型Ag85B-DNAとrhPIV2-Ag85Bとの併用投与（試験群１）の効果を調べた。試験群２では、非常に高い予防効果が認められた一方、試験群１では、限定的な効果しか認められなかった。従来の報告によれば、発現型Ag85B-DNAについても、予防効果が認められることが示されているが、今回の試験結果では、発現型Ag85B-DNAの予防効果は限定的であると考えられ、試験群１の予防効果の多くは、rhPIV2-Ag85Bに依るものと考えられた。
また、Ag85Bに代えて、BCG-Ag85Bを導入したhgPIV2-BCG-Ag85Bについても、rhPIV2-Ag85Bと同様の予防効果が得られた。
また、Ag85A、Ag85Cについても、上記同様の試験を行えば、Ag85Bと同様に結核予防効果を奏する可能性が非常に高い。
このように本実施形態によれば、α抗原等をコードする遺伝子をパラミクソウイルス（特に、rhPIV2）に組み込んだ発現ベクターを投与することにより、顕著な結核予防効果を発揮できることが明らかとなった。

Claims (6)

  1. 抗酸菌由来のα抗原、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体をコードする遺伝子を、M遺伝子、F遺伝子又はHN遺伝子を欠損させたパラミクソウイルス遺伝子に組み込んだことを特徴とする経鼻噴霧型結核ワクチン。
  2. 前記α抗原は、Mycobacterium kansaii又はMycobacterium bovis BCG由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の経鼻噴霧型結核ワクチン。
  3. 前記α抗原の類似体が、抗原85複合体構成蛋白85Aまたは抗原85複合体構成蛋白85Cであることを特徴とする請求項１または２に記載の経鼻噴霧型結核ワクチン。
  4. 抗酸菌由来のα抗原、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体をコードする遺伝子を、M遺伝子、F遺伝子又はHN遺伝子を欠損させたパラミクソウイルス遺伝子に組み込み、ヒトに噴霧し経鼻投与することを特徴とする結核の予防方法。
  5. 前記α抗原は、Mycobacterium kansaii又はMycobacterium bovis BCG由来のものであることを特徴とする請求項４に記載の結核の予防方法。
  6. 前記α抗原の類似体が、抗原85複合体構成蛋白85Aまたは抗原85複合体構成蛋白85Cであることを特徴とする請求項４または５に記載の結核の予防方法。
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