WO2002029396A2 - Verfahren und vorrichtung zur 2d-elektrophorese in grossen gelen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur 2d-elektrophorese in grossen gelen Download PDF

Info

Publication number
WO2002029396A2
WO2002029396A2 PCT/DE2001/003869 DE0103869W WO0229396A2 WO 2002029396 A2 WO2002029396 A2 WO 2002029396A2 DE 0103869 W DE0103869 W DE 0103869W WO 0229396 A2 WO0229396 A2 WO 0229396A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gel
tubes
gels
tube
electrophoresis
Prior art date
Application number
PCT/DE2001/003869
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2002029396A3 (de
Inventor
Joachim Klose
Original Assignee
Protagen Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Protagen Ag filed Critical Protagen Ag
Priority to CA002424298A priority Critical patent/CA2424298A1/en
Priority to AU2002220491A priority patent/AU2002220491A1/en
Priority to JP2002532919A priority patent/JP2004510978A/ja
Priority to EP01986344A priority patent/EP1322950A2/de
Priority to US10/398,408 priority patent/US20040069631A1/en
Publication of WO2002029396A2 publication Critical patent/WO2002029396A2/de
Publication of WO2002029396A3 publication Critical patent/WO2002029396A3/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44773—Multi-stage electrophoresis, e.g. two-dimensional electrophoresis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/24—Extraction; Separation; Purification by electrochemical means
    • C07K1/26—Electrophoresis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/24—Extraction; Separation; Purification by electrochemical means
    • C07K1/26—Electrophoresis
    • C07K1/28—Isoelectric focusing
    • C07K1/285—Isoelectric focusing multi dimensional electrophoresis

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for separating complex protein mixtures with the aid of high-resolution two-dimensional electrophoresis (2D electrophoresis, 2DE) in large gels.
  • 2DE forms the basic technology e.g. for proteome analysis, i.e. for the separation and identification of the total protein of a cell type, organ or organism.
  • High-resolution 2-dimensional electrophoresis is an established method for the separation of protein mixtures (patents: US 5837116 - California Inst of Technology, US, 1999; Bio-Rad Lab. Inc., US, 1998: US 5773645, EP 877245 and 1990: US 4874490, EP 366897; DE 4244082 - ETC GmbH, DE, 1994; JP 05048421, US 4666581 - Hitachi Ltd., JP, 1986; Aimes, GF, Nikaido, K .: PubMed Abstract: Biochemistry, 1976, Vol. 15, No. 3, pp. 616-623; US 5534121), which are extracted from organ tissues.
  • the protein mixture is applied to a polyacrylamide gel, which is located in a glass capillary.
  • the proteins are separated in the electric field according to the principle of isoelectric focusing: the freely movable ampholytes form a pH gradient under the electric voltage, into which the proteins are classified according to their isoelectric points.
  • the gel is expelled from the capillary tube.
  • the Gel is then present as a thin, long, gelatinous thread. This gel thread is picked up and placed in a rectangular, large-area glass cassette which in turn contains polyacrylamide gel (FIG. 1).
  • SDS SDS gel electrophoresis
  • the CA-2DE was further developed by Klose and Kobalz [6] into a so-called large gel technique: the 1 D gel thread is 41 cm long (diameter 0.9 mm), the 2D gel has the dimensions 46 cm x 30 cm; Thickness 0.75mm (the gel is made in half). With this gel technique, the highest possible resolution is achieved today (more than 10,000 proteins per gel).
  • Two solutions are made, one with ampholytes for the low pH range and one for the high pH range. Then, with these two solutions, a gel is poured over a gradient mixer, which contains the finished pH gradient.
  • IPG gels IPG - immobilized pH gradients, Immobiline ®
  • the gel is dried and cut into strips. The strips are offered commercially. The user swells the strip in a buffer, applies the sample and then carries out the 1-D step. The separation in the 2nd dimension is the same as with the CA technique.
  • the gels offered are relatively small, ie a maximum of 23cm x 20cm.
  • CA technology Advantages: High resolution due to large gels, clean separation, good reproducibility. Disadvantages: Largely manual in implementation, therefore complex and dependent on
  • IPG technology Advantages: The 1 D gels (dried gel strips) are offered ready for use. This means a significant simplification of the method. In addition, there is a very distinctive marketing of the companies Pharmacia and BioRad (manual, sales events, workshops). The method is therefore dominant today. Practically all beginners use it. After the IPG patent expires (Swedish patent 14049-1), the number of manufacturers will increase. Disadvantages: Dissolution and separation are comparatively bad, since only relatively small gels (see above) can be used. The IPG technique was developed with the intention of significantly improving the reproducibility by binding the ampholytes to the gel matrix. The improvement that can theoretically be expected is practically of no consequence (cause: influence of
  • the most difficult and time-consuming steps are pouring the 1 D gels in the capillary, ejecting the gel thread from the capillary after the run and transferring the long gel thread to the 2D gel.
  • the invention has for its object to develop a method and an apparatus with which the separation of protein mixtures can be simplified considerably.
  • the object was achieved according to the invention as follows:
  • the separation of the proteins in the first dimension is carried out in protein-permeable materials - porous, capillary tubes, which can also be tubular.
  • the porous capillary tube is then introduced into a glass cassette containing a flat gel without ejecting the gel thread and having to transfer it further as such.
  • the proteins then migrate under current through the wall of the tube into the flat gel.
  • Plastic fiber braided tubes and capillary tubes made of ceramic have proven to be suitable tube types:
  • the gel thread then no longer needs to be ejected after the isoelectric focusing, but the entire capillary tube can be inserted into the glass cassette for further separation of the proteins.
  • the proteins then migrate under current through the wall of the tube into the flat gel. After the electrophoresis of the proteins in the second dimension, the capillary tube with the empty gel is thrown away.
  • the capillary tube with the ready-to-use gel (gel tube) is offered commercially. This eliminates the need to pour and eject the gels, and the transfer of the 1-D gel to the 2-D gel is easy for the user.
  • the tube material used according to the invention is permeable to proteins up to a size of approximately 400 kDa (FIG. 2). By choosing the pore size, certain molecular weight ranges can be preferred, whereby an additional improvement in the resolution can be achieved.
  • the device according to the invention for the separation of complex protein mixtures with the aid of high-resolution two-dimensional electrophoresis consists - in addition to standard elements of 1D and 2DE technology - of protein-permeable materials in the form of porous tubes, e.g.
  • a capillary tube or capillary tube in particular a plastic fiber braided tube or a ceramic capillary tube or ceramic hollow fibers, also a glass cassette that contains a flat gel, from a gel tube, from tube array and pipetting robot, tube array and buffer chamber, 2D cassettes, 2D cassettes in the buffer chamber, a special 1 D chamber, 2D gels as finished gels, a 2D chamber, possibly IPG gels in tubes and an HTP-2DE apparatus (high-throughput technology).
  • the device according to the invention initially consists of standard elements of 1D and 2DE technology (FIGS. 1 and 2) with the glass tube (3), the protein sample (1) in the IEF gel (2) in an isoelectric focusing device (4 ).
  • the SDS gel electrophoresis device (5) in the gel cassette (7) contains the IEF gel on the SDS gel (6), which after electrophoresis involves the protein sample (9) in the porous gel tube (11, 12) after removing the plastic cover (10) is placed on the gel cassette (7), which provides protein spots (8).
  • the porous capillary tubes (14) are encased (15) by a plastic sleeve (13) which connects several tubes (FIG. 3, in cross section FIG. 4).
  • the tube array (17) form capillary tubes, encased and connected by a double-layer plastic film. After tearing open the two layers, the pipes can be removed.
  • a cross reinforcement (platform) is used to attach the tube array in the focusing chamber.
  • the tube array (17) is provided with a pipetting robot (16) (FIG. 5).
  • the tube array (FIG. 6) is fastened in the focusing chamber with the aid of a clamping device (18). It forms a platform (19 - supervision).
  • the 2D cassette according to the invention (20 in cross section, 21 in side view, 22 in the buffer chamber in FIG. 8) contains the SDS gel and the IEF gel (FIG. 7). In addition to standard elements of 1D and 2DE technology (FIGS.
  • the device according to the invention thus consists of gel tubes (FIG. 3, FIG. 4) and gel tubes bundled to form tube arrays (17, FIG. 5, FIG. 6) (17) and pipetting robot (16), tube array and buffer chamber (22, FIG. 8), 2D cassettes (20, 21), 2D cassettes in the buffer chamber (22), a special 1-D chamber (FIG. 6), 2D -Gels as ready-to-use gels (20, 21), a 2D chamber ( Figures 7 and 8) and an HTP-2DE apparatus.
  • the polymer membranes used according to the invention in the form of hollow fibers (diameter up to 0.5 mm), capillaries (diameter up to approx. 3 mm) and tubes are commercially available from various manufacturers: Fresenius GmbH, Gambro Dialysatoren GmbH & Co KG, Akzo Faser AG [14 ] or Reichelt Chemietechnik [11] in Germany, X-Flow BV in Holland and AGT - A / G Technology Corporation in the USA [16] are such manufacturers.
  • the artificial kidneys and plasma separators represent a very large market with millions of square meters.
  • the main components of these elements are capillary membranes with a defined pore structure.
  • the polysulfone tubes mentioned in Example 1 come from the US company. AGT.
  • the braided hoses mentioned in the examples go back to the company Erfurter Flechttechnik [15].
  • the pores are formed by the structure and arrangement of the fibers.
  • polyester polycarbonates, polyalkylene terephthalates
  • polysulfones polyether sulfones, polyaryl ether sulfones, polyarylsulfones
  • polyamides polyurethanes, polyacrylonitrile, polypropylene, polyvinylidene fluoride (PVDF) or polyether ketones for membranes
  • natural fibers such as silk or cotton
  • Porous hollow fibers are described by Lück and others [13].
  • Fibers made from polyalkylene terephthalates have proven to be very suitable for the production of braided tubes, in particular polyethylene terephthalate - in addition to polybutylene terephthalate and poly (1,4-cyclohexanedimethylene) terephthalate.
  • the gel tubes according to the invention have pore sizes of 0.2 to 0.005 ⁇ m: 0.2 ⁇ m for proteins smaller than 400 kDa
  • the combination consists of known elements (1D and 2DE technology, CA-2DE and IPG-2DE technology) and new solutions (1-DE protein separation in hollow porous protein-permeable materials and their unchanged use in the second dimension, 2D -Gels as ready-to-use gels, HTP-2DE technology), which mutually influence each other and result in an advantage (synergistic effect) and the desired success in their new overall effect, which is that simple handling is now combined with high and clean protein resolution ,
  • the use of the new large gel technology according to the invention lies in the separation of complex protein mixtures. Furthermore, the use according to the invention relates to the fact that the hollow porous materials in the form of hollow plastic fibers or plastic braided sleeves, in particular polyester braided sleeves or ceramic capillary tubes / ceramic hollow fibers, are used in 1-D electrophoresis and thereafter unchanged in 2D electrophoresis become.
  • the gels are poured into tubes that have the same dimensions as the long, thin gel tubes; the wall of these tubes is made of porous material.
  • the material must have a pore size that allows the proteins to migrate freely through the wall. After passing through, the proteins in the SDS gel must form the same round, unlubricated 'spots' as is the case with the usual 'naked' gels. This was by no means to be expected, since experience had shown that even the smallest obstacles in the gel (tiny air bubbles or lumps of gel) lead to spot smearing.
  • the porous tubes must be tightly covered with a plastic film to prevent the gel from drying out during storage (as a commercial product) and to prevent buffer contact during the IEF run.
  • the film must continue the 'tube' at the top for the sample application.
  • the film must be easy to remove after the focusing run so that the porous tube can then be placed on the SDS gel without a cover and the proteins can migrate through.
  • the new type of tube represents an essential feature of the invention, which only makes sense in the large gel technology due to the concept according to the invention - high resolution through long, thin capillary tubes.
  • the separation of the proteins in the first dimension is carried out in protein-permeable materials - porous tubes, for example in a capillary tube or capillary tube - and the capillary tube / capillary tube for further separation of the proteins into one Glass cassette introduced, which contains a flat gel. The proteins then migrate under current through the wall of the tube into the flat gel.
  • the protein-permeable materials consist of plastic [12, 13, 14, 15, 16], ceramic capillary tubes [9, 10, 12], plastic braided sleeves [12, 15] or polymer membranes in the form of hollow fibers made of polyester ( Polycarbonates, polyalkylene terephthalates), polysulfones (polyether sulfones, polyaryl ether sulfones, polyarylsulfones), polyamides, polyurethanes, polyacrylonitrile, polypropylene, PVDF (polyvinylidene fluorides) or polyether ketones, made from natural fibers (such as silk or cotton) or inorganic fibers (besides ceramic fibers and others - so - glass - glass Oxide fibers) and non-oxide fibers.
  • polyester Polycarbonates, polyalkylene terephthalates
  • polysulfones polyether sulfones, polyaryl ether sulfones, polyarylsulfones
  • polyamides poly
  • polyalkylene terephthalates have proven to be very suitable, in particular polyethylene terephthalate - in addition to polybutylene terephthalate or
  • test sample A self-made protein mixture of known proteins was used as the test sample in the following examples. This test sample contained seven proteins with different molecular weights and isoelectric points.
  • Example 1 1 .: plastic pipes
  • the 2D gels showed the expected seven protein spots. This finding clearly proves that the proteins in the gel tubes of the "polyester braided tube” type [15] could be focused normally and that they entered the 2D gel through the tube wall.
  • Example 1 1.1 .: polyethylene terephthalate
  • Example 1 1.2 .: polycarbonate
  • Example 1 1.3 .: polysulfone
  • Example 1 2. Ceramic capillary tube [9, 10, 12] A ceramic capillary tube (AI203)
  • Gel tubes with different pore sizes are produced in order to be able to separate a different molecular weight class from a cell extract depending on the selected pore size.
  • the gel concentration of the 2D gel is adjusted accordingly. In this way, the highly complex and densely packed protein patterns of tissue extracts can be fractionated into several clear patterns. Benefits:
  • the gels are dried in the tubes by air drying. This is possible with the gel tubes designed here because they are porous.
  • Drying is of great advantage for the storage and distribution of the gels in the gel tubes.
  • the gel tubes are welded in plastic and bundled together - preferably in sets of 10 (tube array figures 3 and 4).
  • the plastic cover has the following tasks:
  • the plastic envelope forms a platform in a central area or at the upper end of the gel tube, with which the entire tube array is clamped in the 1-D chamber (FIG. 5)
  • the plastic cover consists of two parts that are torn apart after the 1-D run to remove the gel tubes (the plastic cover is thrown away).
  • Example 5 Special 1-D chamber A special 1-D chamber is designed in such a way that the tube array is clamped into it with a simple movement ( Figure 5). The clamping ensures a complete seal against the buffer solution in the 1 D chamber, since the gel tubes must pass through the bottom of the 1 D chamber.
  • a pipetting robot specially designed for the inventive purposes is able to fill capillary tubes with liquid (FIG. 4). It fulfills the following functions:
  • the sample is applied when the tube array is already inserted in the chamber.
  • the 2D gels are also offered to prospective customers / consumers as ready-made gels. They are supplied ready for use in a plastic cassette (Figure 6).
  • the plastic cassette has the following properties:
  • the cassette (b) it ends in a platform with which it can be easily clamped into the 2D chamber (see example 4 (d)) (c) the cassette can be torn open after the run and then releases the gel (the used cassette is thrown away; the particularly complex cleaning of the plates is not necessary) (d)
  • the cassette has a simple mark at the bottom - 0.5 cm before the end - with which the current can be recognized.
  • Example 8 2D chamber A 2D chamber is designed in such a way that up to 10 gel cassettes can be hung in it (Figure 7). Sealing takes place with the help of the cassette platform (see example 7 (b) above).
  • Example 9 IPG gels in tubes Analog to Examples 2 and 4, IPG gels are produced in tubes.
  • the filling, emptying and rinsing of the chambers is automated to such an extent that only storage vessels have to be filled with buffer.
  • FIGS 1 to 8 show:
  • a transverse reinforcement is used to fasten the tube array in the focusing chamber 18.
  • the platform mentioned in FIG. 17 is shown in plan view
  • 20 2D cassette in cross-section contains the SDS gel and the lEF gel
  • HTP-2DE high-throughput technology lEF gels Isoelectric focusing gels IPG Immobilized pH Gradients, Immobiline ®
  • IPG-2DE IPG-2-dimensional electrophoresis kDa kilodalton (measure of molecular weight)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Auftrennung komplexer Proteingemische mit Hilfe der hochauflösenden zweidimensionalen Elektrophorese (2D-Elektrophorese, 2DE) in grossen Gelen. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass die Trennung der Proteine in der ersten Dimension in hohlen porösen proteindurchlässigen Materialien vorgenommen wird und in der zweiten Dimension die porösen Materialien unverändert in eine Glaskassette eingebracht werden, die ein Flachgel enthält, in das die Proteine während der Elektrophorese durch die Wand des porösen Materials wandern. Die 2DE bildet zusammen mit der Massenspektrometrie die Basistechnik z.B. für die Proteomanalyse, d.h. für die Auftrennung und Identifizierung des Gesamtproteins eines Zelltyps, Organs oder Organismus.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur 2D-Elektrophorese in großen Gelen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Auftrennung komplexer Proteingemische mit Hilfe der hochauflösenden zweidimensionalen Elektrophorese (2D- Elektrophorese, 2DE) in großen Gelen. Die 2DE bildet zusammen mit der Massenspektrometrie die Basistechnik z.B. für die Proteomanalyse, d.h. für die Auftrennung und Identifizierung des Gesamtproteins eines Zelltyps, Organs oder Organismus.
Die hochauflösende 2-dimensionale Elektrophorese (2-DE) ist eine etablierte Methode zur Auftrennung von Proteingemischen (Patente: US 5837116 - California Inst of Technology, US, 1999; Bio-Rad Lab. Inc., US, 1998: US 5773645, EP 877245 und 1990: US 4874490, EP 366897; DE 4244082 - ETC GmbH, DE, 1994; JP 05048421 , US 4666581 - Hitachi Ltd., JP, 1986; Aimes, G.F., Nikaido, K.: PubMed Abstract: Biochemistry, 1976, Vol. 15, No. 3, S. 616-623; US 5534121 ), die aus Organgeweben extrahiert werden. Gegenwärtig, und insbesondere nach Abschluß des Human Genomprojektes, gewinnt diese Technik als eine zentrale Methode der Postgenomära in Forschung und Pharmaindustrie zunehmend an Bedeutung. Die Durchführung der 2-DE erfolgt jedoch noch immer weitgehend in Handarbeit. Der Erfolg hängt sehr stark von dem Geschick der Person ab, die die Methode anwendet. Die 2-DE in ihrer hochauflösenden Form wurde gleichzeitig und unabhängig voneinander 1975 von J. Klose [1 - Literaturverzeichnis] und P. O'Farrell [2] veröffentlicht. In den 80er Jahren wurde die Methode in einem wesentlichen technischen Detail von der Firma LKB, heute Pharmacia, modifiziert [3-5]: Die im elektrischen Feld frei wandernden Trägerampholyte (Carrier Ampholyte, CA) wurden durch Ampholyte ersetzt, die fest an die Gelmatix binden (immobilisierte pH-Gradienten, IPG; Immobiline®). Demnach wird die 2-DE heute in zwei Versionen benutzt: CA-2DE (Klose, O'Farrell) und IPG-2DE (Pharmacia). Die CA-2DE-Technik:
Das Proteingemisch wird auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen, das sich in einer Glaskapillare befindet. Die Proteine werden im elektrischen Feld nach dem Prinzip der isoelektrischen Fokussierung aufgetrennt: Die freibeweglichen Ampholyte bilden unter der elektrischen Spannung einen pH-Gradienten aus, in den sich gleichzeitig die Proteine, entsprechend ihren isoelektrischen Punkten, einordnen. Nach erfolgter Trennung der Proteine in der ersten Dimension (1 D) wird das Gel aus dem Kapillarrohr ausgestoßen. Das Gel liegt dann als ein dünner langer gallertartiger Faden vor. Dieser Gelfaden wird aufgenommen und in eine rechteckige, großflächige Glaskassette eingebracht, die wiederum Polyacrylamidgel enthält (Figur 1 ). Die Proteine wandern unter Strom aus dem Gelfaden aus und werden in dem dünnen, flächigen Gel in Richtung der zweiten Dimension (2D) nach dem Prinzip der SDS-Gelelektrophorese (SDS - Natriumdodecylsulfat, Sodium Dodecylsulfat) weiter aufgetrennt. Die CA-2DE wurde vor einigen Jahren von Klose und Kobalz [6] zu einer sog. Großgeltechnik weiterentwickelt: Der 1 D-Gelfaden ist 41cm lang (Durchmesser 0,9 mm), das 2D-Gel hat die Ausmaße 46cm x 30cm; Dicke 0,75mm (das Gel wird in zwei Hälften hergestellt). Mit dieser Geltechnik wird heute die höchst-mögliche Auflösung erreicht (mehr als 10.000 Proteine pro Gel). Die IPG-2DE-Technik:
Bei dieser Technik werden die Ampholyte an das Acrylamid (= Gelmatrixsubstanz) chemisch gebunden. Es werden zwei Lösungen hergestellt, eine mit Ampholyten für den niedrigen pH- Bereich und eine für den hohen pH-Bereich. Dann wird mit diesen beiden Lösungen über einen Gradientenmischer ein Gel gegossen, das den fertigen pH-Gradienten enthält. Diese IPG-Gele (IPG - immobilisierte pH-Gradienten, Immobiline®) werden nicht in Kapillarröhrchen, sondern in einem Flachgel gegossen. Das Gel wird getrocknet und in Streifen geschnitten. Die Streifen werden kommerziell angeboten. Der Anwender quillt den Streifen in einem Puffer auf, trägt die Probe auf und führt damit dann den 1 D-Schritt durch. Die Trennung in der 2. Dimension erfolgt wie bei der CA-Technik. Die angebotenen Gele sind relativ klein, d.h. maximal 23cm x 20cm.
Vergleich zwischen CA- und IPG-Technik: CA-Technik: Vorteile: Hohe Auflösung aufgrund großer Gele, saubere Trennung, gute Reproduzierbarkeit. Nachteile: Weitgehend manuell in der Durchführung, daher aufwendig und abhängig vom
Geschick des Anwenders. IPG-Technik: Vorteile: Die 1 D-Gele (getrocknete Gelstreifen) werden gebrauchsfertig angeboten. Das bedeutet eine wesentliche Vereinfachung der Methode. Dazu kommt ein sehr ausgeprägtes Marketing der Firmen Pharmacia und BioRad (Manual, Verkaufsveranstaltungen, Workshops). Die Methode ist daher heute marktbeherrschend. Praktisch alle Einsteiger benutzen sie. Nach Auslaufen des IPG-Patents (Schwedisches Patent 14049-1 ) werden sich die Hersteller mehren. Nachteile: Auflösung und Trennung sind vergleichsweise schlecht, da nur relativ kleine Gele (s.o.) verwendet werden können. Die IPG-Technik wurde entwickelt mit der Absicht, die Reproduzierbarkeit durch die Bindung der Ampholyte an die Gelmatrix wesentlich zu verbessern. Die theoretisch zu erwartende Verbesserung kommt aber praktisch kaum zum Tragen (Ursache: Einfluss der
Proteine auf den pH-Gradienten und anderes; siehe auch IPG-2DE „Warentest" auf der 7. Arbeitstagung „Mikromethoden in der Proteinchemie", MPI
Martiensried, Juni 2000).
Anmerkung: Die von Klose entwickelte Großgeltechnik ist in Fachkreisen weltweit bekannt [Vorträge, Publikationen, z.B. 7, 8]. Ihre hohe Auflösung und Trennschärfe ist allgemein anerkannt. Die Methode gilt aber praktisch als kompliziert.
Bei der Durchführung der CA-2DE-Technik sind die schwierigsten und aufwendigsten Schritte das Gießen der 1 D-Gele in der Kapillare, das Ausstoßen des Gelfadens aus der Kapillare nach dem Lauf und das Übertragen des langen Gelfadens auf das 2D-Gel.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu entwickeln, mit denen sich die Auftrennung von Proteingemischen wesentlich vereinfachen lässt. Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß folgendermaßen gelöst: Die Trennung der Proteine in der ersten Dimension wird in proteindurchlässigen Materialien - porösen, kapillaren Rohren, die auch schlauchartig sein können - vorgenommen. Das poröse Kapillarrohr wird dann, ohne den Gelfaden ausstoßen und als solchen weiter transferieren zu müssen, in eine Glaskassette eingebracht, die ein Flachgel enthält. Unter Strom wandern dann die Proteine durch die Wand des Rohres in das Flachgel ein. Als geeignete Rohrtypen haben sich Kunststofffaser-Geflechtschläuche und kapillare Rohre aus Keramik erwiesen:
Bei Verwendung von Polyester-Geflechtschläuchen [12, 14, 15, 16] zeigten die 2D-Gele anhand einer Testprobe die erwarteten Proteinspots. Dieser Befund belegt eindeutig, dass sich die Proteine in diesen Geltubes normal fokussieren lassen und dass sie durch die Rohrwand hindurch in das 2D-Gel eintreten.
Bei Verwendung von Keramik-Kapillarrohren bzw. Keramikhohlfasern [9, 10, 12] wurden zunächst eine Gellösung mit der Testprobe gemischt und mit dieser Mischung die Rohre gefüllt. Nach der Polymerisation und Auflegen der Rohre auf 2D-Gele wurde die SDS- Gelelektrophorese wie üblich durchgeführt. Das Ergebnis zeigte, dass die Proteine im elektrischen Feld ohne weiteres durch das Rohr wandern. Die Testprobe enthielt Proteine mit unterschiedlichem Molekulargewicht und isoelektrischem Punkt. Nach ihrem Durchtritt durch das Rohr und nach Auftrennung im SDS-Gel erschienen die Proteinbanden, wie erhofft, entsprechend den verschiedenen Molekulargewichten.
Dieser Befund ist insofern überraschend, als er nicht der allgemeinen Erwartung entspricht und daher zuvor auch noch nicht erprobt wurde. Die allgemeinen Erfahrungen haben gezeigt, dass geringe Störungen (kleine Luftblasen, Verunreinigungen) in der elektrophoretischen Laufbahn der Proteine die Trennung der Proteine stören. Daher musste angenommen werden, dass das poröse Rohr auf die durchtretenden Proteine einen Siebeffekt auslöst, der danach ein sauberes Zusammentreten der Proteinmoleküle zu individuellen Proteinspots verhindert oder beeinträchtigt. Dieser Effekt trat aber nicht ein. Es bildeten sich vielmehr die gewünschten Proteinspots.
Der Gelfaden braucht demzufolge dann nach der isoelektrischen Fokussierung nicht mehr ausgestoßen zu werden, sondern das ganze Kapillarrohr kann zur weiteren Trennung der Proteine in die Glaskassette eingebracht werden. Unter Strom wandern dann die Proteine durch die Wand des Rohres in das Flachgel ein. Nach der Elektrophorese der Proteine in der zweiten Dimension wird das Kapillarrohr mit dem leeren Gel weggeworfen. Das Kapillarrohr mit dem gebrauchsfertigen Gel (Geltube) wird kommerziell angeboten. Damit entfällt das Gießen und Ausstoßen der Gele, und der Transfer des 1 D-Gels auf das 2D-Gel wird für den Anwender zu einem einfachen Handgriff. Das erfindungsgemäß verwendete Rohrmaterial ist für Proteine bis zur Größe von etwa 400 kDa durchlässig (Figur 2). Durch die Wahl der Porengröße können bestimmte Molekulargewichtsbereiche bevorzugt werden, wodurch eine zusätzliche Verbesserung der Auflösung zu erreichen ist.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Auftrennung komplexer Proteingemische mit Hilfe der hochauflösenden zweidimensionalen Elektrophorese (2-DE / 2DE) besteht - neben Standardelementen der 1 D- sowie der 2DE-Technik - aus proteindurchlässigen Materialien in Gestalt poröser Rohre, z.B. einem Kapillarrohr oder kapillaren Schlauch, insbesondere einem Kunststofffaser-Geflechtschlauch oder einem Keramik-Kapillarrohr bzw. Keramikhohlfasern, ferner einer Glaskassette, die ein Flachgel enthält, aus einem Geltube, aus Tubearray und Pipettierroboter, Tubearray und Pufferkammer, 2D-Kassetten, 2D- Kassetten in der Pufferkammer, einer speziellen 1 D-Kammer, 2D-Gelen als Fertiggele, einer 2D-Kammer, ggf. IPG-Gelen in Tubes sowie einer HTP-2DE-Apparatur (High-throughput- Technik).
Im einzelnen besteht die erfindungsgemäße Vorrichtung zunächst aus Standardelementen der 1 D- sowie der 2DE-Technik (Figuren 1 und 2) mit der Glastube (3), der Proteinprobe (1) in dem lEF-Gel (2) in einer isoelektrischen Fokussierungeinrichtung (4). Die SDS- Gelelektrophorese-Einrichtung (5) in der Gelkassette (7) enthält das lEF-Gel auf dem SDS- Gel (6), das nach der Elektrophorese, bei der die Proteinprobe (9) in dem porösen Gelrohr (11 , 12) nach Entfernen der Plastikhülle (10) auf die Gelkassette (7) gebracht wird, die Proteinspots (8) liefert. Die porösen Kapillarrohre (14) werden von einer Plastikhülle (13) ummantelt (15), die mehrere Röhrchen verbindet (Figur 3, im Querschnitt Figur 4). Den Tubearray (17) bilden Kapillarrohre, ummantelt und verbunden durch eine doppelschichtige Plastikfolie. Nach Aufreißen der zwei Schichten kann man die Rohre entnehmen. Eine Querverstärkung (Plattform) dient der Befestigung des Tubearrays in der Fokussierungskammer. Der Tubearray (17) ist mit einem Pipettierroboter (16) versehen (Figur 5). Der Tubearray (Figur 6) ist in der Fokussierungskammer mit Hilfe einer Klemmvorrichtung befestigt (18). Er bildet eine Plattform (19 - Aufsicht). Die erfindungsgemäße 2D-Kasssette (20 im Querschnitt, 21 in der Seitenansicht, 22 in der Pufferkammer in Figur 8) enthält das SDS-Gel und das lEF-Gel (Figur 7). Die erfindungsgemäße Vorrichtung besteht also - neben Standardelementen der 1 D- sowie der 2DE-Technik (Figuren 1 und 2) - aus Geltubes (Figur 3, Figur 4) sowie zu Tubearrays (17, Figur 5, Figur 6) gebündelten Geltubes, aus Tubearray (17) und Pipettierroboter (16), Tubearray und Pufferkammer (22, Figur 8), 2D-Kassetten (20, 21), 2D-Kassetten in der Pufferkammer (22), einer speziellen 1 D-Kammer (Figur 6), 2D-Gelen als Fertiggelen (20, 21), einer 2D-Kammer (Figur 7 und 8) sowie einer HTP-2DE-Apparatur.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Polymermembranen in Form von Hohlfasern (Durchmesser bis 0,5 mm), Kapillaren (Durchmesser bis ca. 3 mm) und Rohren werden von verschiedenen Herstellern kommerziell angeboten: Fresenius GmbH, Gambro Dialysatoren GmbH & Co KG, Akzo Faser AG [14] oder Reichelt Chemietechnik [11] in Deutschland, X- Flow B.V. in Holland und AGT - A/G Technology Corporation in den USA [16] sind solche Hersteller. Einen sehr großen Markt mit Millionen Quadratmetern stellen die künstlichen Nieren und die Plasma-Separatoren dar. Hauptbestandteile dieser Elemente sind Kapillarmembranen mit einer definierten Porenstruktur.
Die im Beispiel 1 genannten Polysulfonrohre stammen von der US-Fa. AGT. Die in den Beispielen genannten Flechtschläuche gehen auf die Firma Erfurter Flechttechnik [15] zurück. In den Geflechtschläuchen aus Kunststoff-Vollfasern werden die Poren durch die Struktur und die Anordnung der Fasern gebildet.
Neben den Kunststoffen Polyester (Polycarbonate, Polyalkylenterephthalate), Polysulfone (Polyethersulfone, Polyarylethersulfone, Polyarylsulfone), Polyamide, Polyurethane, Polyacrylnitril, Polypropylen, Polyvinylidenfluoride (PVDF) oder Polyetherketone für Membranen kommen für Geflechtschläuche auch Naturfasern (wie Seide oder Baumwolle) oder anorganische Fasern (wie Glas-, Keramik- und andere Oxidfasern) sowie Nichtoxidfasern in Frage. Poröse Hohlfasern werden von Lück u.a. beschrieben [13]. Für die Herstellung von Geflechtschläuchen haben sich Fasern aus Polyalkylen- terephthalaten als sehr geeignet erwiesen, insbesondere Polyethylenterephthalat - neben Polybutylenterephthalat und Poly(1 ,4-cyclohexandimethylen)-terephthalat. Die erfindungsgemäßen Geltubes weisen Porengrößen von 0,2 bis 0,005 μm auf: - 0,2 μm für Proteine kleiner als 400 kDa
- 0, 1 μm für Proteine kleiner als 200 kDa
- 0,05 μm für Proteine kleiner als 100 kDa
- 0,03 μm für Proteine kleiner als 60 kDa
- 0,01 μm für Proteine kleiner als 20 kDa - 0,005 μm für Proteine kleiner als 10 kDa.
Die Merkmale der Erfindung gehen außer aus den Ansprüchen auch aus der Beschreibung hervor, wobei die einzelnen Merkmale jeweils für sich allein oder zu mehreren in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Die Kombination besteht aus bekannten Elementen (1 D- sowie 2DE-Technik, CA-2DE- sowie IPG-2DE-Technik) und neuen Lösungswegen (1-DE-Proteintrennung in hohlen porösen proteindurchlässigen Materialien und ihre unveränderte Verwendung in der zweiten Dimension, 2D-Gele als Fertiggele, HTP-2DE-Technik), die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Vorteil (synergistischen Effekt) und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, dass nunmehr einfache Handhabung mit hoher und sauberer Protein-Auflösung verbunden sind.
Die erfindungsgemäße Verwendung der neuen Großgeltechnik liegt in der Auftrennung komplexer Proteingemische. Des weiteren bezieht sich die erfindungsgemäße Verwendung darauf, dass die hohlen porösen Materialien in Gestalt von hohlen Kunststofffasern oder Kunststoff-Geflechtschläuchen, insbesondere von Polyester-Flechtschläuchen oder Keramik-Kapillarrohren / Keramikhohlfasern in der 1 D-Elektrophorese und danach unverändert in der 2D-Elektrophorese eingesetzt werden.
Seit der Entwicklung der 2-D Elektrophorese vor etwa 25 Jahren wurde die isoelektrische Fokussierung, d.h. die Trennung der Proteine in der ersten Dimension, in Röhrchen durchgeführt; etwas später dann in Flachgelen, insbesondere in Gelstreifen. Die Gelröhrchen wurden aus Glas oder Plastikmaterial gefertigt, also aus Wasser- und Luftundurchlässigem Material. Es hat nie einen Grund gegeben, diese Röhrchen aus porösem Material herzustellen, da das Gel in solchen Röhrchen schnell eintrocknen würde und während des Elektrophoreselaufs seitlich in Kontakt mit der Elektrodenlösung treten würde. Letzteres hätte zur Folge, dass sich der pH-Gradient nicht aufbaut und somit eine Fokussierung nicht zustande kommen kann. Die Fokussierung in porösen Tubes ist daher nicht als eine logische, auf der Hand liegende Modifizierung der Röhrchentechnik zu betrachten. Erst mit der Entwicklung der erfindungsgemäßen Grossgeltechnik kommt hier ein völlig neuer Gedanke ins Spiel. Da die Gele in den erfindungsgemäßen Glasröhrchen über 40cm lang und weniger als 1 mm dünn sind, liefern sie zwar eine ungewöhnlich hohe Auflösung, sind aber praktisch sehr schwierig zu handhaben. Diese langen, dünnen und weichen Gelfäden lassen sich kaum unverletzt aus dem Röhrchen herausdrücken und können nur mit viel Geschick und Erfahrung auf das SDS-Gel - zur Trennung in der zweiten Dimension - gebracht werden. Dieses Problem wurde erfindungsgemäßen durch die Entwicklung eines völlig neuen Typs von Gelröhrchen gelöst:
1. Die Gele werden in Röhrchen gegossen, die die gleichen Ausmaße haben wie die langen, dünnen Gelröhrchen; die Wand dieser Röhrchen besteht aber aus porösem Material.
2. Es musste Material gefunden werden, das die Polymerisation der Gellösung nicht hemmt.
3. Das Material muss eine Porenweite haben, die es erlaubt, dass die Proteine ungehindert durch die Wand wandern können. Nach dem Durchtritt müssen die Proteine im SDS-Gel die gleichen runden, unverschmierten 'Spots' bilden, wie das bei den üblichen 'nackten' Gelen der Fall ist. Das war keineswegs zu erwarten, da die Erfahrung bisher gezeigt hatte, dass schon kleinste Hindernisse im Gel (winzige Luftblasen oder Gelklümpchen) zu Spotverschmierungen führen.
4. Die porösen Röhrchen müssen mit einer Plastikfolie dicht umhüllt sein, damit die Austrocknung der Gele bei Lagerung (als kommerzielles Produkt) und ein Pufferkontakt während des lEF-Laufes verhindert werden.
5. Die Folie muss oben für den Probenauftrag das 'Röhrchen' fortsetzen.
6. Die Folie muss sich nach dem Fokussierungslauf leicht entfernen lassen, damit das poröse Röhrchen dann ohne Hülle auf das SDS-Gel gelegt werden kann und die Proteine durchwandern können. Der neue Röhrchentyp stellt ein wesentliches Merkmal der Erfindung dar, die nur aufgrund des erfindungsgemäßen Konzepts - hohe Auflösung durch lange, dünne Kapillarröhrchen - an der Großgeltechnik ihren Sinn bekommt.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Ausführungsbeispiele
Die Trennung der Proteine in der ersten Dimension wird in proteindurchlässigen Materialien - porösen Rohren, z.B. in einem Kapillarrohr oder kapillaren Schlauch - vorgenommen und das Kapillarrohr / der kapillare Schlauch zur weiteren Trennung der Proteine in eine Glaskassette eingebracht, die ein Flachgel enthält. Unter Strom wandern dann die Proteine durch die Wand des Rohres in das Flachgel ein.
Die proteindurchlässigen Materialien bestehen aus Kunststoff- [12, 13, 14, 15, 16], Keramik- Kapillar-Rohren [9, 10, 12], Kunststoff-Geflechtschläuchen [12, 15] oder aus Polymermembranen in Form von Hohlfasern aus Polyestern (Polycarbonaten, Polyalkylenterephthalaten), Polysulfonen (Polyethersulfonen, Polyarylethersulfonen, Polyarylsulfonen), Polyamiden, Polyurethanen, Polyacrylnitril, Polypropylen, PVDF (Polyvinylidenfluoriden) oder Polyetherketonen, aus Naturfasern (wie Seide oder Baumwolle) oder anorganischen Fasern (neben Keramikfasem - s.o. - Glas- und andere Oxidfasern) sowie aus Nichtoxidfasern.
Unter den Fasern aus Kunststoffen haben sich Polyalkylenterephthalate als sehr geeignet erwiesen, insbesondere Polyethylenterephthalat - neben Polybutylenterephthalat oder
Poly(1 ,4-cyclohexandimethylen)terephthalat.
Als Testprobe in den folgenden Beispielen wurde ein selbst hergestelltes Proteingemisch aus bekannten Proteinen verwendet. Diese Testprobe enthielt sieben Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten und isoelektrischen Punkten.
Beispiel 1 : Trennung der Proteine in der zweiten Dimension
Beispiel 1:1.: Kunststoff- Rohre
Ein Polyester-Geflechtschlauch [12, 14, 15] - 50 Fäden mit 0,1 mm Durchmesser - wurde mit
Gellösung gefüllt und für die 2D Elektrophorese eingesetzt.
Die 2D-Gele zeigten die erwarteten sieben Proteinspots. Dieser Befund belegt eindeutig, dass sich die Proteine in den Geltubes des Typs "Polyester-Flechtschlauch"[15] normal fokussieren ließen, und dass sie durch die Rohrwand hindurch in das 2D-Gel eintraten.
Beispiel 1 :1.1.: Polyethylenterephthalat
Wie Beispiel 1 :1., unter Verwendung von Polyethylenterephthalat [12, 15, 16].
Beispiel 1 :1.2.: Polycarbonat
Wie Beispiel 1 :1., unter Verwendung von Polycarbonat [13].
Beispiel 1 :1.3.: Polysulfon
Wie Beispiel 1 :1., unter Verwendung von Polysulfonen [12], jedoch mit weniger guten Ergebnissen als unter 1.1.1. und 1.1.2..
Beispiel 1 :2. Keramik-Kapillarrohr [9, 10, 12] Ein Keramik-Kapillarrohr (AI203)
- Porengröße 0,2 μm, Durchmesser 0,8 mm, Wandstärke 0,18 mm - wurde für eine 2-D Elektrophorese vorbereitet.
Um zu testen, ob diese Rohre durchlässig für Proteine sind, wurde eine Gellösung mit der Testprobe gemischt. Mit dieser Mischung sind die Rohre gefüllt worden. Nach der Polymerisation wurden die Rohre auf 2D-Gele gelegt. Die SDS-Gelelektrophorese ist dann wie üblich durchgeführt worden. Das Ergebnis belegt, dass die Proteine im elektrischen Feld ohne weiteres durch das Rohr wandern. Das Muster zeigte nach Anfärbung der Proteine sieben Banden entsprechend den verschiedenen Molekulargewichten.
Beispiel 2: Weiterentwicklung der Geltubes
Es werden Geltubes mit unterschiedlicher Porenweite hergestellt, um je nach gewählter Porenweite eine andere Molekulargewichtsklasse aus einem Zellextrakt heraus auftrennen zu können. Die Gelkonzentration des 2D-Gels wird entsprechend angepasst. Auf diesem Wege lassen sich die hochkomipexen und dicht gedrängten Proteinmuster von Gewebsextrakten in mehrere übersichtliche Muster fraktionieren. Vorteile:
(a) Übersichtliche Muster vereinfachen die automatische Auswertung der Muster
(b) die Muster erleichtern das automatische Ausstechen der Spots zur Massenspektromethe
(c) es wird eine höhere Auflösung des Gesamtextraktes ermöglicht
(d) es wird eine größere Reinheit der Spots für die Massenspektrometrie (wegen geringerer Spotüberlappung) erreicht.
Beispiel 3: Trocknung der Gele
Die Trocknung der Gele in den Tubes erfolgt durch Lufttrocknung. Das ist bei den hier konzipierten Gelrohren möglich, da sie porös sind.
Die Trocknung ist von großem Vorteil für die Lagerung und den Vertrieb der Gele in den Geltubes.
Vor Gebrauch werden die Gele in Gellösung wieder aufgequollen.
Beispiel 4: Tubearray
Die Geltubes werden in Plastik eingeschweißt und dabei - vorzugsweise im 10er Set - gebündelt (Tubearray Figuren 3 und 4).
Die Plastikhülle hat folgende Aufgaben zu erfüllen:
(a) Stabilisierung der Tubes (insbesondere bei Tubeschläuchen) (b) Schutz vor Austrocknung der Gele
(c) die Plastikhülle liefert zugleich für die einzelnen Röhrchen das Ansatzstück für den Probenauftrag
(d) die Plastikhülle formt in einem mittleren Bereich oder am oberen Ende der Geltubes eine Plattform, mit der das ganze Tubearray in die 1 D-Kammer eingespannt wird (Figur 5)
(e) die Plastikhülle besteht aus zwei Teilen, die nach dem 1 D-Lauf auseinandergerissen werden, um die Geltubes zu entnehmen (die Plastikhülle wird weggeworfen).
Beispiel 5: Spezielle 1 D-Kammer Eine spezielle 1 D-Kammer ist so ausgelegt, dass in sie das Tubearray mit einem einfachen Handgriff eingespannt wird (Figur 5). Die Einspannung gewährleistet eine völlige Abdichtung gegen die Pufferlösung in der 1 D-Kammer, da die Geltubes durch den Boden der 1 D- Kammer treten müssen.
Beispiel 6: Pipettierroboter
Ein eigens für die erfinderischen Zwecke ausgelegter Pipettierroboter ist in der Lage, Kapillartubes mit Flüssigkeit zu füllen (Figur 4). Er erfüllt folgende Funktionen:
(a) Kapillaren mit etwa 1 mm im Durchmesser in einer Tiefe von etwa 3,5 cm luftblasenfrei mit leicht dickflüssiger Lösung zu füllen
(b) im μl-Bereich die Lösungen genau zu portionieren
(c) drei Flüssigkeiten mit unterschiedlicher Dichte zu überschichten
(d) 10 Tubes hintereinander zu füllen
(e) beim Auftrag verschiedener Proben den Pipettierkopf zu wechseln, um Verunreinigung durch Verschleppung der Proben zu vermeiden.
Der Probenauftrag erfolgt, wenn das Tubearray bereits in die Kammer eingesetzt ist.
Beispiel 7: 2D-Gele als Fertiggele
Die 2D-Gele werden den Interessenten / Verbrauchern ebenfalls als Fertiggele angeboten. Sie werden gebrauchsfertig in einer Plastikkassette geliefert (Figur 6). Die Plastikkassette hat folgende Eigenschaften:
(a) Sie ist durchsichtig
(b) sie endet in einer Plattform, mit der sie in die 2D-Kammer leicht eingespannt werden kann (s.o. Beispiel 4 (d)) (c) die Kassette kann nach dem Lauf aufgerissen werden und gibt dann das Gel frei (die gebrauchte Kassette wird weggeworfen; das besonders aufwendige Putzen der Platten entfällt) (d) die Kassette hat unten - 0,5 cm vor dem Ende - eine einfache Markierung, mit der das Laufende erkannt werden kann.
Beispiel 8: 2D-Kammer Eine 2D-Kammer ist so ausgelegt, dass in sie wahlweise bis zu 10 Gelkassetten eingehangen werden können (Figur 7). Die Abdichtung erfolgt mit Hilfe der Kassettenplattform (s.o. Beispiel 7 (b)).
Beispiel 9: IPG-Gele in Tubes Analog zu Beispiel 2 und 4 werden IPG-Gele in Tubes hergestellt.
Beispiel 10: HTP-2DE-Apparatur
In der letzten Ausbaustufe der HTP-2DE-Apparatur (High-throughput-Technik) verbleiben nur noch folgende Handgriffe: Einspannen des Tubearray in die 1 D-Kammer, Einspannen der 2D-Gele in die 2D-Kammer, Auflegen der Tubegele auf die 2D-Gele, Puffer einfüllen für die 1 D- und 2D-Kammem.
Das Füllen, Entleeren und Spülen der Kammern wird soweit automatisiert, dass nur noch Vorratsgefäße mit Puffer gefüllt werden müssen.
Legende zu den Figuren
Die Figuren 1 bis 8 zeigen:
Figur 1 Standard-2D-Elektrophorese Figur 2 Verbesserung der 1 D-Geltechnik
Figur 3 Geltube, Längsansicht
Figur 4 Geltube, Querschnitt
Figur 5 Tubearray und Pipettierroboter
Figur 6 Tubearray und 1 D-Pufferkammer (Ausschnitt) Figur 7 2D-Kassette
Figur 8 2D-Kassetten in der Pufferkammer
Bezugszeichenliste zu den Figuren
1 Proteinprobe
2 lEF-Gel 3 Glastube
4 isoelektrische Fokussierung
5 SDS-Gelelektrophorese
6 lEF-Gel auf dem SDS-Gel 7 Gelkassette
8 Proteinspots
9 Proteinprobe
10 Plastikhülle
1 1 poröses Gelrohr 12 poröses Gelrohr mit Gel auf dem SDS-Gel
13 Plastikhülle ummantelt das Röhrchen und verbindet mehrere Röhrchen
14 poröses Kapillarrohr
15 wie 13 / 14, aber quer geschnitten
16 Pipettierroboter 17 Tubearray: Kapillarrohre, ummantelt und verbunden durch eine doppelschichtige
Plastikfolie. Nach Aufreißen der zwei Schichten kann man die Rohre entnehmen. Eine Querverstärkung (Plattform) dient der Befestigung des Tubearrays in der Fokussierungskammer 18 Befestigung des Tubearrays in der Fokussierungskammer (Klemmvorrichtung) 19 Die in 17 genannte Plattform ist in der Aufsicht gezeigt
20 2D-Kasssette im Querschnitt: Enthält das SDS-Gel und das lEF-Gel
21 2D-Kassette in der Seitenansicht
22 2D-Kassetten in der Pufferkammer
Abkürzungsverzeichnis
[1] bis Literaturstelle 1
[16] Literaturstelle 16
AGT A/G Technology Corporation, USA
1 D Eindimensional
1 D-Gele 1 -Dimensionale Gele
2D Zweidimensional
2DE / 2-DE 2-Dimensionale Elektrophorese
CA Carrier Ampholyte
CA-2DE CA-2-Dimensionale Elektrophorese
HTP-2DE High-throughput Technik lEF-Gele Isoelektrische Fokussierungsgele IPG Immobilisierte pH-Gradienten, Immobiline®
IPG-2DE IPG-2-Dimensionale Elektrophorese kDa Kilodalton (Maß für Molekulargewicht)
PAGE Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese PVDF Polyvinylidenfluoride
SDS- Natriumdodecylsulfat (Sodium Dodecylsulfat)
Literaturverzeichnis
[1 ] Klose J. (1975) Humangenetik 26: 231-243 [2] O'Farrell, P.H. (1975) J. Biol. Chem. 250, 4007-4021
[3] Gasparic, V., Bjiellquist, B., Rosengren, A. (1975) Swedish patent 14049-1 [4] Bjiellquist, B., Ek, K. (1982) LKB Application Note 321 [5] Bjiellquist et al. (1982) J. Biochem. Biophys. Methods 6, 317-.339 [6] Klose J., Kobalz U. (1995) Electrophoresis 16: 1034-1059 [7] Klose J., (1999) Methods in Molecular Biology 112: 147-172 [8] Klose J. , (1999) Methods in Molecular Biology 112: 67-86 [9] Tudyka S., K. Pflanz, N. Stroh, H. Brunner, F. Aldinger (1998): Herstellung und
Eigenschaften von Keramikmembranen für die Flüssigfiltration, Keram. Z. 50 (10): 818-826 [10] Stroh N., D. Sporn: Keramische Hohlfasern - Eine neue Geometrie in der Separationstechnik, DECHEMA-Jahrestagung Membrantechnik 1999, 27. - 29. April 1999, Wiesbaden [1 1] Katalog Reichelt Chemietechnik 2000, Reichelt Chemietechnik, [12] Fraunhofer-Institut, Grenzflaechen- und Bioverfahrenstechnik, Nobelstr. 12, D - 70569 Stuttgart, Tel.: +49 [0]711 970 4120, Fax.: +49 [0]711 970 4200
[13] Lück, H.B. u.a., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B50, 1990,
395-400 [14] Akzo Faser AG, Öhder Str. 28, D-42289 Wuppertal
Fresenius GmbH, Frankfurter Str. 6-8, D-66606 St. Wendel Gambro Dialysatoren GmbH & Co KG, Holger-Crafoord-Strasse 26, D-72373
Hechingen [15] Erfurter Flechttechnik GmbH, Stauffenbergallee 13, D-99086 Erfurt [16] - X-Flow B.V., Bedrijvenpark Twente 289, NL-7602 KK Almelo, NIEDERLANDE - AGT - A/G Technology Corporation, 101 Hampton Avenue, Needham, MA 02194-2628, USA

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Auftrennung komplexer Proteingemische mit Hilfe der zweidimensionalen Elektrophorese (2D-Elektrophorese, 2DE), dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung der Proteine in der ersten Dimension in hohlen porösen proteindurchlässigen Materialien vorgenommen wird und in der zweiten Dimension die porösen Materialien unverändert in eine Glaskassette eingebracht werden, die ein Flachgel enthält, in das die Proteine während der Elektrophorese durch die Wand des porösen Materials wandern.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als hohle poröse proteindurchlässige Materialien, die mit einem gebrauchsfertigen Gel gefüllt sind und als Geltube vorliegen,
2.1. Kunststoffrohre oder Kunststoffschläuche 2.2. Keramikrohre eingesetzt werden.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Kunststoffe
3.1. Polyester in Gestalt von 3.1.1. Polyalkylenterephthalaten 3.1.2. Polycarbonaten oder
3.2. Polysulfone oder
3.3. Polyamide, Polyurethane, Polyacrylnitril, Polypropylen, Polyvinylidenfluoride oder Polyetherketone und als hohle poröse proteindurchlässige Materialien Polyester-Geflechtschläuche aus Polyethylenterephthalat eingesetzt werden.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Geltubes mit Porengrößen von 0,2 bis 0,005 μm für Proteine kleiner als 400 bis kleiner als 10 kDa versehen sind.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Gele in den Tubes getrocknet, in dieser Form dem Verbraucher angeboten und vor Gebrauch in einer Gellösung wieder aufgequollen werden.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Geltubes in Plastik eingeschweißt und zu Tubearrays gebündelt werden, wobei die Plastikhülle eine Plattform bildet, mit der das ganze Tubearray in die 1 D-Kammer eingespannt wird und die Plastikhülle aus zwei Teilen besteht, die nach dem 1 D-Lauf getrennt werden, um die Geltubes zu entnehmen.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in eine spezielle 1 D-Kammer das Tubearray durch eine Klemmvorrichtung (Figur 6) eingespannt wird.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillartubes von einem Pipettierroboter mit Flüssigkeit gefüllt werden.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die 2D-Gele als Fertiggele eingesetzt werden, die gebrauchsfertig in einer Plastikkassette geliefert werden.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Gele als IPG-Gele in Tubes eingesetzt werden.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass unter Nutzung der High-throughput-Technik (HTP-2DE) die Tubearrays in die 1 D-Kammer und die 2D-Gele in die 2D-Kammer eingespannt, die Tubegele auf die 2D-Gele gelegt und Pufferlösungen für die 1 D- und 2D-Kammern eingefüllt werden.
12. Vorrichtung zur Auftrennung komplexer Proteingemische mit Hilfe der 2D-Elektrophorese (2DE), bestehend - neben Standardelementen der 1 D- sowie der 2DE-Technik - aus hohlen porösen proteindurchlässigen Materialien für den 1 D-Schritt und einer Glaskassette mit einem Flachgel zur Aufnahme der nach dem 1 D-Schritt unverändert weiterverwendeten hohlen porösen proteindurchlässigen Materialien für den 2-DE-Schritt.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die hohlen porösen proteindurchlässigen Materialien aus porösen Rohren, Kapillarrohren oder kapillaren Schläuchen bestehen.
14. Vorrichtung nach den Ansprüchen 12 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die porösen Materialien aus
14.1. Kunststoffrohren oder Kunststoffschläuchen oder
14.2. Keramikrohren bestehen, die mit einem gebrauchsfertigen Gel gefüllt sind und als Geltubes vorliegen.
15 Vorrichtung nach den Ansprüchen 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die porösen Kunststoff-Materialien aus 15.1. Polyester in Gestalt von
15.1.1. Polyalkylenterephthalaten
15.1.2. Polycarbonaten oder 15.2. Polysulfonen oder
15.3. Polyamiden, Polyurethanen, Polyacrylnitrilen, Polypropylen, Polyvinylidenfluoriden oder Polyetherketonen und die hohlen porösen proteindurchlässigen Materialien aus Polyester-Geflechtschläuchen in Gestalt von Polyethylenterephthalat bestehen.
16. Vorrichtung nach den Ansprüchen 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Geltubes mit Porengrößen von 0,2 bis 0,005 μm für Proteine kleiner als 400 bis kleiner als 10 kDa versehen sind.
17. Vorrichtung nach den Ansprüchen 12 bis 16, bestehend ferner aus Geltubes (Figur 3, Figur 4) sowie zu Tubearrays (17, Figur 5, Figur 6) gebündelten Geltubes, aus Tubearray und Pipettierroboter (16), Tubearray und Pufferkammer (22, Figur 8), 2D-Kassetten (20, 21 ), 2D-Kassetten in der Pufferkammer, einer speziellen 1 D-Kammer (Figur 6), 2D-Gelen als Fertiggelen (20, 21), einer 2D-Kammer (Figur 8) sowie einer HTP-2DE-Apparatur.
18. Vorrichtung nach den Ansprüchen 12 bis 17, bestehend ferner aus IPG-Gelen in Tubes.
19. Verwendung des Verfahrens und der Vorrichtung nach den Ansprüchen I bis 18 zur Auftrennung komplexer Proteingemische.
20. Verwendung nach Anspruch 19 in der Großgeltechnik.
21. Verwendung nach den Ansprüchen 19 und 20, dadurch gekennzeichnet, dass die hohlen porösen Materialien in Gestalt von hohlen Kunststofffasern, Kunststoff-Geflechtschläuchen oder Keramik-Kapillarrohren / Keramikhohlfasern in der 1 D-Elektrophorese und danach unverändert in der 2D-Elektrophorese eingesetzt werden.
PCT/DE2001/003869 2000-10-05 2001-10-04 Verfahren und vorrichtung zur 2d-elektrophorese in grossen gelen WO2002029396A2 (de)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002424298A CA2424298A1 (en) 2000-10-05 2001-10-04 Method and device for carrying out 2d electrophoresis in large gels
AU2002220491A AU2002220491A1 (en) 2000-10-05 2001-10-04 Method and device for carrying out 2D electrophoresis in large gels
JP2002532919A JP2004510978A (ja) 2000-10-05 2001-10-04 大きなゲルの中で２ｄの電気泳動を行なう方法及び装置
EP01986344A EP1322950A2 (de) 2000-10-05 2001-10-04 Verfahren und vorrichtung zur 2d-elektrophorese in grossen gelen
US10/398,408 US20040069631A1 (en) 2000-10-05 2001-10-04 Method and device for carrying out 2d electrophoresis in large gels

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10050838.3 2000-10-05
DE10050838A DE10050838A1 (de) 2000-10-05 2000-10-05 Verfahren und Vorrichtung zur 2D-Elektrophorese in großen Gelen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2002029396A2 true WO2002029396A2 (de) 2002-04-11
WO2002029396A3 WO2002029396A3 (de) 2002-12-05

Family

ID=7659706

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2001/003869 WO2002029396A2 (de) 2000-10-05 2001-10-04 Verfahren und vorrichtung zur 2d-elektrophorese in grossen gelen

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20040069631A1 (de)
EP (1) EP1322950A2 (de)
JP (1) JP2004510978A (de)
AU (1) AU2002220491A1 (de)
CA (1) CA2424298A1 (de)
DE (1) DE10050838A1 (de)
WO (1) WO2002029396A2 (de)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1353171A2 (de) * 2002-04-12 2003-10-15 Tecan Trading AG Streifenhalter, Kammer, Kassette und 2D-Gelelektrophoresen-Verfahren
WO2004023131A1 (de) * 2002-09-03 2004-03-18 Proteosys Ag Isoelektrische fokussierung auf immobilisierten ph-gradienten
WO2007025507A1 (de) * 2005-08-27 2007-03-08 Wita Gmbh System zur zweidimensionalen (2d) gelelektrophorese
WO2007106370A2 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 Protein Forest, Inc. Transfer device for two - dimensional electrophoresis

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007256037A (ja) * 2006-03-23 2007-10-04 Gunma Prefecture 二次元電気泳動システムにおける等電点電気泳動用ゲル
US20140374260A1 (en) * 2012-02-07 2014-12-25 Sharp Kabushiki Kaisha Two-dimensional electrophoresis kit, method for manufacturing two-dimensional electrophoresis kit, two-dimensional electrophoresis method, and two-dimensional electrophoresis chip

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0393478A2 (de) * 1989-04-18 1990-10-24 Millipore Corporation Verfahren zur Übertragung eines Gels und Verbundwerkstoff
WO2001085830A1 (en) * 2000-05-05 2001-11-15 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Improved electrophoresis gel support

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3795600A (en) * 1973-03-23 1974-03-05 Instrumentation Specialties Co Electrophoresis and method apparatus
US4747919A (en) * 1987-01-16 1988-05-31 Large Scale Biology Corporation Apparatus and method for electrophoresis in tubes
US5534121A (en) * 1994-05-16 1996-07-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Preparative two dimensional gel electrophoresis system
WO1996009537A1 (en) * 1994-09-19 1996-03-28 Novel Experimental Technology Plastic mold for electrophoresis gel

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0393478A2 (de) * 1989-04-18 1990-10-24 Millipore Corporation Verfahren zur Übertragung eines Gels und Verbundwerkstoff
WO2001085830A1 (en) * 2000-05-05 2001-11-15 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Improved electrophoresis gel support

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1353171A2 (de) * 2002-04-12 2003-10-15 Tecan Trading AG Streifenhalter, Kammer, Kassette und 2D-Gelelektrophoresen-Verfahren
EP1353171A3 (de) * 2002-04-12 2004-11-03 Tecan Trading AG Streifenhalter, Kammer, Kassette und 2D-Gelelektrophoresen-Verfahren
WO2004023131A1 (de) * 2002-09-03 2004-03-18 Proteosys Ag Isoelektrische fokussierung auf immobilisierten ph-gradienten
WO2007025507A1 (de) * 2005-08-27 2007-03-08 Wita Gmbh System zur zweidimensionalen (2d) gelelektrophorese
WO2007106370A2 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 Protein Forest, Inc. Transfer device for two - dimensional electrophoresis
WO2007106370A3 (en) * 2006-03-10 2007-11-01 Protein Forest Inc Transfer device for two - dimensional electrophoresis

Also Published As

Publication number Publication date
CA2424298A1 (en) 2003-04-04
AU2002220491A1 (en) 2002-04-15
US20040069631A1 (en) 2004-04-15
EP1322950A2 (de) 2003-07-02
DE10050838A1 (de) 2002-04-25
WO2002029396A3 (de) 2002-12-05
JP2004510978A (ja) 2004-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69928230T2 (de) Elektrophoretisches nukleinsäure-aufreinigungsverfahren
DE69326680T2 (de) Verfahren zum aufbringen/zurückgewinnen einer gelelektrophorese-probe
DE69807240T2 (de) Gussmembranstruktur zur probenaufbereitung
DE69926725T2 (de) Eingekapselte ipg-streifen
DE69124897T2 (de) Vorrichtung zur Gewinnung von durch Kapillarelektrophorese getrennten Proben auf einer Membran
DE3688527T2 (de) Verfahren und vorrichtung zur behandlung einer flüssigkeit.
DE60110769T2 (de) Verfahren und vorrichtung zur analyse von geladenen molekülen durch isoelektrische fokussierung einer lösung
EP0738733B1 (de) Vorrichtung zur Isolierung von Nukleinsäuren
DE69305947T2 (de) Vorrichtung und Methode zur Affinitätstrennung
DE69905425T2 (de) Verfahren und vorrichtung zur trennung von bioorganischen molekülen mittels elektrophorese
DE2142628A1 (de) Elektrophorese Gerat
WO1988009201A1 (en) Process and device for separating and cleaning molecules
CH642454A5 (de) Mikroelektrophoretische vorrichtung.
DE10113257C1 (de) Elektrophoresevorrichtung und ihre Verwendung
WO2016169678A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur extraktion von nukleinsäuren
DE60112284T2 (de) Prozesskammer mit Öffnungen zum Einführen einer Pipette
WO2008122267A2 (de) Biochip für die fluoreszenzanalyse von einzelnen transportern
DE69509221T2 (de) Probenhalter und verfahren zur automatischen hochdurchsatz elektroforese
WO2002029396A2 (de) Verfahren und vorrichtung zur 2d-elektrophorese in grossen gelen
JP2002525191A (ja) 巨大分子の分離方法
WO1999064850A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur miniaturisierten, hochparallelen elektrophoretischen trennung
DE102007011866A1 (de) Vorrichtung zur Aufnahme, Behandlung und Aufbewahrung kleinvolumiger Proben
EP1262759B1 (de) Mikroplatte zum Bearbeiten von Proben
DE20017414U1 (de) Vorrichtung zur 2D-Elektrophorese in großen Gelen
WO2000049173A2 (de) Verfahren und probenträgersystem zur trennung und anreicherung von stoffen in situ

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CR CU CZ DK DM EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AE AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CR CU CZ DK DM EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001986344

Country of ref document: EP

Ref document number: 2424298

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002532919

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002220491

Country of ref document: AU

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001986344

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10398408

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2001986344

Country of ref document: EP