DE69509221T2

DE69509221T2 - Probenhalter und verfahren zur automatischen hochdurchsatz elektroforese

Info

Publication number: DE69509221T2
Application number: DE69509221T
Authority: DE
Inventors: John Williams
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1994-01-19
Filing date: 1995-01-18
Publication date: 1999-12-23
Anticipated expiration: 2015-01-19
Also published as: ZA95262B; AU691563B2; AU1526495A; IL112147A0; JPH09508206A; DE69509221D1; IL112147A; EP0740787B1; WO1995020155A1; US5858189A; CA2179883A1; EP0740787A1; TW279201B

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft einen Probenhalter und ein hochwirksames Verfahren zum Laden einer Probe zur Gelelektrophorese.

TECHNISCHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Elektrophorese ist ein Verfahren bei dem Makromoleküle auf der Basis ihres Ladungs-Masse-Verhältnisses getrennt werden, indem sie gezwungen werden, sich durch ein Trägermedium, wie z. B. ein poröses Gel, mittels eines an das Gel angelegten Spannungsgradienten zu bewegen. Moleküle mit einheitlichen Ladung-Masse-Verhältnissen, wie z. B. DNA und RNA, werden auf der Basis der Größe unterschieden.
Die Gelelektrophorese ist ein Verfahren, das bei Proteinen und Nucleinsäuren häufig zur Trennung verwendet wird. Bei der herkömmlichen Methodik wird ein Gel zwischen Platten zu einer dünnen Tafel bzw. Platte gegossen (für vertikale Durchläufe) oder alternativ auf ein flaches Bett gegossen (für horizontale Durchläufe) und zwischen Puffer/Elektroden- Kammern in einer Elektrophoreseapparatur angeordnet. In die Puffer/Elektroden-Kammern der Apparatur wird eine geeignete Pufferlösung gegeben, und dann wird eine kleine Menge der Probenlösung sorgfältig in vorgefertigte Einschnitte bzw. Kavitäten auf dem Gel pipettiert. Gewöhnlich sind Glycerin und ein "Nachweis"-Farbstoff in den Einschnitten enthalten oder werden der Probenlösung zugesetzt. An das Gel wird dann ein elektrischer Strom angelegt, bis die Nachweisfarbstoffbande bzw. -zone die Länge der Platte durchlaufen hat. Der elektrische Strom wird unterbrochen, und das Gel wird aus der Apparatur entfernt. Zu diesem Zeitpunkt wird das Gel analysiert, um die relative Wanderung der Probenmoleküle zu bestimmen. Das Gel kann beispielsweise mit einem Farbstoff gefärbt werden, der eine Bindung mit Proteinen oder Nucleinsäuren eingeht, und dann kann das Gel getrocknet oder konserviert werden, oder es kann eine Photographie aufgenommen werden, so daß eine permanente optische Aufzeichnung der Größenverteilung der Moleküle in der ursprünglichen Probenlösung entsteht.
Elektrophoresegele werden typischerweise so gegossen, daß sie mehrere Proben in einer langgestreckten Gelplatte aufnehmen. Die Gelplatte wird gewöhnlich geformt, indem in nicht erstarrtes Gelmedium eine Kammvorrichtung eingesetzt wird. Die Kammvorrichtung weist gewöhnlich mehrere in gleichen Abständen angeordnete Vorsprünge auf, die den Zähnen eines Haarkamms ähneln. Dann läßt man das Gelmedium "gelieren" oder festwerden, und der Kamm wird entfernt, was zur Bildung von Probeaufnahmevertiefungen oder -kavitäten im oberen Abschnitt der Gelplatte führt.
Gelelektrophorese, die auf die oben beschriebene herkömmliche Weise betrieben wird, ist dem Wesen nach ineffizient. Typischerweise muß ein Bediener die Kavitäten der Gelplatte manuell mit einer Handpipette füllen bzw. beladen. Die Proben müssen dann sofort getestet werden, um eine Diffusion der Proben in den Puffer zu verhindern. Daher können eingefüllte Proben nicht gelagert werden, und folglich muß ein Bediener Tests sofort durchführen, statt zur gelegenen Zeit. Außerdem ist die Anzahl der Proben pro Gel, das auf die herkömmliche Weise hergestellt wird, begrenzt, um eine Zielkavität bereitzustellen, die groß genug für eine genaue Beladung ist.
Roger C. Wiggins beschreibt in einem Artikel mit dem Titel "Agarose Drop Method for Loading Thin Polyacrylamide Gels" (Agarosetröpfchenverfahren zum Beladen von dünnen Polyacrylamidgelen). Analytical Biochemistry 126 (1982) 422-424, ein Gelelektrophorese verfahren, wobei geschmolzene Agarose einer kristallinen Probe zugesetzt und zum Erstarren gebracht wird. Jede Probe wird dann durch Zerschneiden der Unterlage, auf der sie angeordnet ist, getrennt, und die Probe wird auf eine Glasträgerplatte einer horizontalen Gelform geschoben und in Kontakt mit einem polymerisierten Sammelgel gebracht. Die Nachteile des Verfahrens von Wiggins sind, daß der Prozeß arbeitsintensiver ist als das einfache Beladen von Kavitäten, und daß es nur für sehr kleine Probengrößen brauchbar ist. Die Technologie eignet sich nicht zur Automatisierung und beschränkt daher die Anzahl der Proben, die innerhalb einer Zeitspanne analysiert werden könnten. Die Technologie ist außerdem dadurch beschränkt, daß das resultierende Bandenprofil eine Funktion von der Größe und Form des Probentröpfchens ist, wodurch nichtreproduzierbare Bahnmuster entstehen.
Bei Bemühungen zur Erhöhung des Probendurchsatzes in Elektrophoreseprozessen ist eine Automatisierung versucht worden. Zum Beispiel ist in einem Entwicklungsprogramm zur Automatisierung der Gelbeladung bei Beckman Instruments, Inc., eine programmierbare Pipettiermaschine, die Biomek Workstation, entwickelt worden. Jedes einzelne vorgefertigte Gel wird auf der Biomek montiert. Elektrophoreseproben werden durch das Instrument geladen, und dann wird das Gel entfernt. Der Nachteil dieses Systems ist, daß nur ein einziges Gel auf einmal beladen werden kann. Außerdem müssen wegen der begrenzten Pipettiergenauigkeit die mit Proben zu beladenden Kavitäten ziemlich groß sein, um einen genauen Zugriff durch den Roboterarm zu ermöglichen. Es ist schwierig, die Biomek-Pipette genau in eine dünne Probenkavität zu entleeren, und dünne Kavitäten sind wünschenswert, da sie die Bandenauflösung im Gel bestimmen. Wenn die Kavität dick genug gemacht wird, um ein genaues Pipettieren zu ermöglichen, tritt ein beträchtlicher Bandenauflösungsverlust auf. Ein weiterer Nachteil des Biomek-Verfahrens ist, daß nur ein Gel auf einmal beladen werden kann. Wegen der obigen Probleme und wegen des mangelnden Bedienungskomforts ist das Biomek-Verfahren zur automatisierten Gelbeladung von der Gemeinschaft der Forscher nicht umfassend eingeführt worden.
Ein System zur automatisierten Gelbeladung eliminiert auch einen Pipettierfehler, der auftritt, wenn Proben beim Beladen mit der Handpipette vertauscht oder vermischt werden. So beschleunigt ein Mehrfachpipettieren mit Hilfe von Robotern nicht nur das Beladeverfahren, sondern schützt auch gegen das Aufbringen von falschen Probensequenzen.
Beim Entwurf des Probenhalters und des automatisierbaren Beladeverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erkannte der Anmelder verschiedene Nebenbedingungen. Erstens würde die Leistungsfähigkeit eines automatisierten Verfahrens durch eine Erhöhung der Anzahl der Proben verbessert, die gleichzeitig auf einer Probenlademaschine geladen werden könnten. Wenn jedoch in dem Bemühen, eine höhere Dichte der Kavitäten pro Gel bereitzustellen, Größe und Abstand der Probenkavitäten verringert werden, muß die Pipettiermaschine immer genauer arbeiten, um Proben mit Erfolg in die kleineren Kavitäten abzugeben. Daher besteht ein zu lösendes Problem darin, wie sich die Anzahl der Probenkavitäten pro Gel vergrößern und gleichzeitig die Größe einer Zielkavität beibehalten läßt, die durch einen Roboterarm an der Pipettiermaschine genau angesteuert werden kann. Eine zweite, verwandte Nebenbedingung betrifft den Versuch, eine sehr dünne Kavität in der Dimension der Elektrophoreserichtung der Probe beizubehalten, um eine hohe Bandenauflösung aufrechtzuerhalten. Eine dritte Nebenbedingung betrifft die Notwendigkeit, ein Probenladesystem zu konstruieren, durch das die automatisierte Probenabgabevorrichtung effizient Proben für mehr als eine Gelplatte auf einmal laden kann. Eine vierte Nebenbedingung ist die Notwendigkeit, ein Probenladesystem bereitzustellen, bei dem die geladenen Proben einige Zeit gelagert werden können, bevor sie durch das Gel elektrophoretisiert werden. Während der Lagerung müssen die Probendiffusion und - integrität kontrolliert werden.
Daher wird ein besseres, leistungsfähigeres Verfahren der automatisierbaren Gelelektrophorese benötigt. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die mit der herkömmlichen Gelelektrophorese verbundene Probleme durch Bereitstellen eines Verfahrens zum Laden von Proben in einen separaten Probenhalter zu lösen, der von der Gelplatte getrennt ist, wobei man die Proben innerhalb einzelner Kavitäten im Probenhalter gelieren lassen und darin bis zur Elektrophorese lagern kann. Ein weiteres außergewöhnliches und nützliches Merkmal des vom Anmelder entwickelten Gelbeladesystems ist, daß Probenteilmengen aus einer zur Elektrophorese-Achse parallelen und nicht senkrechten Position in die Probenkavitätskammer abgegeben werden: mit anderen Worten, in das Vorderende statt in das "obere Ende" der Probenkavitätskammer, bezogen auf die Richtung des Elektrophoresestroms, wenn die Kavität in der Elektrophorese-Position betrachtet wird. Folglich wird die für die Abgabe der Probe in die Kavität verfügbare Oberfläche im Vergleich zu herkömmlichen horizontalen Beladesystemen stark vergrößert, bei denen die Probe aus einem zur Elektrophorese-Achse senkrechten Winkel in den oberen Abschnitt der Kavitätskammer eingetragen wird.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung schafft einen Probenhalter zur Aufnahme einer vorerstarrten Elektrophoreseprobe und zum Zurückhalten der Elektrophoresegelprobe nach dem Erstarren zur Abgabe an ein Elektrophoresegel, wobei der Probenhalter eine Platte mit mindestens einer in der Vorderseite der Platte ausgebildeten Probenkavität und eine an der Rückseite der Platte befestigte Unterlage aufweist, wobei die Unterlage das Einbringen des Probenhalters in eine Elektrophoresekammer in unmittelbarer Nähe eines Elektrophoresegelbetts erleichtert.
Die Erfindung schafft außerdem ein Verfahren gemäß Anspruch 7 zum Laden einer Elektrophoresegelprobe auf ein Elektrophoresegel, mit den folgenden Schritten:
(a) Abgabe der Probe und eines geschmolzenen ersten Gelmediums in eine Probenkavität, die innerhalb eines Probenhalters ausgebildet ist, wobei der Probenhalter eine Platte mit mindestens einer Probenkavität aufweist, die in der Vorderseite der Platte ausgebildet ist;
(b) Erstarrenlassen des geschmolzenen ersten Gelmediums innerhalb der Probenkavität;
(c) Anordnen des Probenhalters in einer Elektrophoresekammer auf eine Weise, die ausreicht, um das in der Probenkavität enthaltene erstarrte erste Gelmedium in unmittelbarer Nähe eines Betts innerhalb der Elektrophoresekammer anzuordnen;
(d) Zugabe eines geschmolzenen zweiten Gelmediums auf das Bett innerhalb der Elektrophoresekammer, wodurch das geschmolzene zweite Gelmedium in Kontakt mit dem erstarrten ersten Gelmedium gebracht wird, das in der im Schritt (c) erwähnten Probenkavität enthalten ist; und
(e) Erstarrenlassen des geschmolzenen zweiten Gelmediums in dem Bett.
In dem obenerwähnten Verfahren kann der Probenhalter in seiner Position verbleiben, wenn er aus elektrisch leitendem Material besteht, oder er wird entfernt, wenn er aus anderem, nichtleitendem Material besteht. Im einen wie im anderen Falle bleiben die erstarrte Probe und das erste Gelmedium an dem erstarrten zweiten Gelmedium in einer Position haften, die ausreicht, um die Probe dort zuzuführen, wenn ein elektrischer Strom an das Gelmedium angelegt wird.
Die vorliegende Erfindung schafft außerdem ein System zur Durchführung einer Gelelektrophorese, das aufweist:
(a) eine Elektrophoresekammer mit einem Elektrophoresebett, wobei das Bett zwischen zwei Puffer/Elektrodenkammern angeordnet ist und sich von einer Seitenwand der Elektrophoresekammer zu einer gegenüberliegenden Seitenwand der Elektrophoresekammer erstreckt; und
(b) einen Probenhalter mit einer Platte, die mindestens eine in der Vorderseite der Platte ausgebildete Probenkavität aufweist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die bei gefügten Zeichnungen, die in die Beschreibung einbezogen sind und einen Teil davon bilden, zeigen die gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit der oben gegebenen allgemeinen Beschreibung und der weiter unten gegebenen ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen zur Erläuterung der Grundgedanken der Erfindung.
Fig. 1 zeigt eine perspektivische Ansicht des bevorzugten erfindungsgemäßen Probenhalters, die eine an der Rückseite der Platte befestigte Unterlage darstellt.
Fig. 2 zeigt eine perspektivische Ansicht der auseinandergenommenen Elemente des erfindungsgemäßen Elektrophoresesystems, die eine Elektrophoresekammer, einen Probenhalter und einen Keil darstellt.
Fig. 3 zeigt eine perspektivische Seitenansicht der erfindungsgemäßen Elektrophoreseeinheit gemäß Fig. 2, die den Probenhalter und ein Paar in der Elektrophoresekammer angeordnete Keile darstellt.
Fig. 4 zeigt einen Schnitt der Elektrophoreseeinheit gemäß Fig. 3, der der Probenhalter in einer Anordnung zeigt, die ausreicht, um die Probenkavitäten in unmittelbare Nähe der Bettkante zu bringen.
Fig. 5 zeigt einen Schnitt, der das wahlfreie Entfernen des Probenhalters darstellt, um ein beladenes Elektrophoresegel mit einem erstarrten zweiten Elektrophoresegelmedium und einer Probe in einem ersten, daran anhaftenden Gelmedium zu erhalten, wobei das erste Gelmedium von der Kante des Elektrophoresebetts in der Elektrophoresekammer nach innen versetzt ist.
Fig. 6A zeigt eine Photographie des Elektrophoresegels gemäß Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung. Die Bahnen 1-4 zeigen die Banden, die aus der um 1" nach innen versetzten Position der Proben resultieren. Die Bahnen 5-8 zeigen die Banden, die aus den Proben resultieren, die über die Kante des Gelbetts hinausragen. Die Bahnen 1, 2, 5 und 6 enthielten Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt. Die Bahnen 3, 4, 7 und 8 enthielten Agarose vom Standardtyp.
Fig. 6B zeigt einen Schnitt durch das Gelbett, das erstarrte zweite Gelmedium und das Gemisch aus der Probe und dem ersten Gelmedium gemäß Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung, der die um 1" von der Gelbettkante nach innen versetzte Probe darstellt.
Fig. 6C zeigt einen Schnitt durch das Gelbett, das erstarrte zweite Gelmedium und das Gemisch aus der Probe und dem ersten Gelmedium gemäß Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung, der die jenseits der Gelbettkante angeordnete Probe darstellt.
Fig. 7 zeigt eine Photographie des Elektrophoresegels gemäß Beispiel 2 der, vorliegenden Erfindung, welche die Banden darstellt, die aus den Proben resultieren, die um 1/8", 1/4", 1/2", 1" und 2" von der Gelbettkante nach innen versetzt sind. Bahn 1 enthielt 0.750% Agarose: Bahn 2 - 0.675% Agarose: Bahn 3 - 0,600% Agarose; Bahn 4 - 0,525% Agarose.
Fig. 8A zeigt eine Photographie des Elektrophoresegels gemäß Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung. Die Bahnen 1-5 zeigen die Banden, die aus den Proben resultieren, die von der Gelbettkante um 1/8" nach innen versetzt sind. Die Bahnen 6-10 zeigen die Banden, die aus den Proben resultieren, die von der Gelbettkante um 1" nach innen versetzt sind. Die Bahnen 1 und 6 enthielten 0,50% Agarose: die Bahnen 2 und 7 - 0.45% Agarose; die Bahnen 3 und 8 - 0.40% Agarose; die Bahnen 4 und 9 - 0.35% Agarose; und die Bahnen 5 und 10 - 0,30% Agarose.
Fig. 8B zeigt einen Schnitt durch das Gelbett, das erstarrte zweite Gelmedium und das Gemisch aus der Probe und dem ersten Gelmedium gemäß Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung, der die von der Gelbettkante um 1/8" nach innen versetzte Probe darstellt.
Fig. 8C zeigt einen Schnitt durch das Gelbett, das erstarrte zweite Gelmedium und das Gemisch aus der Probe und dem ersten Gelmedium gemäß Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung, der die von der Gelbettkante um 1" nach innen versetzte Probe darstellt.
Fig. 9 zeigt eine Photographie des Elektrophoresegels gemäß Beispiel 4 der vorliegenden Erfindung, welche die Banden von 76 DNA-Proben darstellt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Im folgenden wird ausführlich auf die gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen, die in den beigefügten Zeichnungen dargestellt sind.
Die vorliegende Erfindung bietet einen Probenhalter zur Aufnahme einer vorerstarrten Elektrophoreseprobe und zum Zurückhalten der Elektrophoresegelprobe nach dem Erstarren zur Abgabe an ein Elektrophoresegel. Die vorerstarrte Probe kann Protein, Nucleinsäuren oder andere Moleküle aufweisen, die vor dem Laden in den Probenhalter mit einem geschmolzenen oder nichterstarrten Gelmedium vermischt werden, oder alternativ können die Probe und das Gelmedium innerhalb einer Probenkavität im Probenhalter vermischt werden.
Ein Probenhalter ist bei 24 in Fig. 1 und 2 dargestellt. Der Probenhalter 24 weist eine Platte 25 auf. Die Platte 25 ist vorzugsweise im wesentlichen eben und rechteckig, wie in Fig. 1 dargestellt. Repräsentative Abmessungen der Platte 25 sind: Länge 24 cm; Breite 2,5 cm; Höhe 0,6 cm. Diese Abmessungen können in Abhängigkeit von der Größe einer Elektrophoreseeinheit variieren.
Wie in Fig. 1 dargestellt, ist in der Vorderseite 27 der Platte 25 mindestens eine Probenkavität 26 ausgebildet. Vorzugsweise sind in der Vorderseite 27 der Platte 25 mehrere Probenkavitäten ausgebildet. Noch besser sind mehrere in gleichen Abständen angeordnete Probenkavitäten 26 entlang der Vorderseite 27 der Platte 25 in Längsrichtung ausgerichtet. Die Anzahl der innerhalb der Platte 25 ausgebildeten Probenkavitäten 26 und die Abmessungen der Probenkavitäten 26 sind von der Größe des Probenhalters 24 und dem gewünschten Elektrophoresegel abhängig. Eine bevorzugte Anzahl der Probenkavitäten 26 ist ein Vielfaches der Pipettenzahl an einer Roboter-Pipettiervorrichtung zuzüglich mindestens einer Extra-Probenkavität zum Laden von Molekulargewichts-Markierungsmolekülen. Eine bevorzugte Anzahl von Probenkavitäten 26 innerhalb eines Probenhalters 24 von 24 cm · 2,5 cm · 0,6 cm ist 76, und repräsentative Abmessungen für eine Probenkavität 26, die in einem Probenhalter mit diesem Abmessungen ausgebildet ist, sind 2,5 mm Länge; 4 mm Breite und 1 mm Tiefe. Probenkavitäten mit diesen Abmessungen könnten mit etwa bis zu 25 ul Probe und Gelmedium gefüllt werden.
Vorzugsweise weist der Probenhalter 24 ferner eine an der Rückseite 21 der Platte 25 befestigte Unterlage 28 auf, wobei die Unterlage 28 das Einbringen des Probenhalters 24 in eine Elektrophoresekammer 12 in unmittelbarer Nähe eines Elektrophoresegelbetts 14 erleichtert, wie in Fig. 2-4 dargestellt. Die Unterlage 28 dient zum Positionieren der Probenkavität 26 im Halter 24 über dem Bett 14, wie aus Fig. 3 und 4 erkennbar. Die hier realisierte Unterlage 28 ist so konstruiert, daß sie sich vom Boden der Platte 25 vertikal nach unten erstreckt, wenn der Probenhalter 24 innerhalb einer horizontalen Elektrophoreseeinheit zur Abgabe von Proben an das Elektrophoresegel ausgerichtet ist, wodurch die Unterlage 28 die Platte 25 in einer von der Kante nach innen versetzten Position und über der oberen Fläche des Elektrophoresegelbetts 14 hält, das in der horizontalen Elektrophoreseeinheit enthalten ist (siehe Fig. 2). Vorzugsweise bedeckt die Platte 25 etwa 1/8 bis 1/2 der Länge einer der Oberflächen der Unterlage 28 in Längsrichtung, und entlang einer Längskante der Platte 25 sind Probenkavitäten 26 so angeordnet, daß die Probenkavitäten 26 in unmittelbare Nähe zur Oberfläche des Betts 14 gebracht werden, wenn sich der Probenhalter 24 in der Position für einen Elektrophoresedurchlauf befindet. Vorzugsweise ist die Platte 25 ausreichend tief, so daß die Probenkavität 26 von der Kante her und über dem Bett 14 um einen Abstand von etwa 3 bis etwa 50 mm nach innen versetzt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Platte 25 und die Unterlage 28 einstückig ausgebildet.
Für Elektrophoresesysteme, bei denen der Probenhalter 24 vor der Elektrophorese aus der Kammer 12 zu entfernen ist, sollte der Probenhalter 24 aus einem Material bestehen, welches das Entfernen (siehe Fig. 5) des Probenhalters 24 nach dem Erstarren des Elektrophoresegels 36 erleichtert, so daß die zwischen der erstarrten Probe sowie dem ersten Gelmedium in der Probenkavität 26 und dem zweiten Elektrophoresegelmedium 36 entstandene Haftung nicht zerstört wird. Der Probenhalter 24 kann spanend bearbeitet, ausgestanzt oder geformt werden, zum Beispiel aus einem Kunststoff, wie etwa Lucite® oder Nylon, wobei Lucite® bevorzugt wird. Der Probenhalter 24 kann auch aus einem elektrisch leitenden Material bestehen, das den Durchgang von Elektrophoresestrom zuläßt, wodurch es unnötig wird, den Probenhalter 24 vor dem Anlegen der Spannung an das System zu entfernen, wobei die Leifähigkeit des Probenhalters der des Elektrophoresegels nahekommt. Beispiele für elektrisch leitendes Material sind Kunstharze, die mit leitfähigen Füllstoffen kombiniert sind, wie z. B. hochfesten Metallfasern, Metallflocken-Füllstoffe, metallisierte Glimmerplättchen, Füllstoffe mit niedrigem Höhe-Breite-Verhältnis und niedriger Dichte und Kohlefasern. Zu Identifikations- und Protokollzwecken können auch Ziffern, Buchstaben, Codes oder dergleichen in den Probenhalter 24 eingearbeitet, gestanzt oder eingepreßt werden.
Die vorliegende Erfindung schafft außerdem ein Verfahren zum Laden einer Elektrophoresegelprobe auf ein Elektrophoresegel, mit den folgenden Schritten:
(a) Abgabe der Probe und eines geschmolzenen ersten Gelmediums in eine Probenkavität, die innerhalb eines Probenhalters ausgebildet ist, wobei der Probenhalter eine Platte mit mindestens einer in deren Vorderseite ausgebildeten Probenkavität aufweist;
(b) Erstarrenlassen des geschmolzenen ersten Gelmediums innerhalb der Probenkavität;
(c) Anordnen des Probenhalters in einer Elektrophoresekammer auf eine Weise, die ausreicht, um das in der Probenkavität enthaltene erstarrte erste Gelmedium in unmittelbarer Nähe eines Betts innerhalb der Elektrophoresekammer anzuordnen;
(d) Zugabe eines geschmolzenen zweiten Gelmediums auf das Bett innerhalb der Elektrophoresekammer, wodurch das geschmolzene zweite Gelmedium in Kontakt mit dem erstarrten ersten Gelmedium gebracht wird, das in der im Schritt (c) erwähnten Probenkavität enthalten ist; und
(e) Erstarrenlassen des geschmolzenen zweiten Gelmediums in dem Bett.
Bei dem oben angegebenen Verfahren kann der Probenhalter in seiner Position verbleiben, wenn er aus einem elektrisch leitenden Material besteht, oder er wird entfernt, wenn er aus einem anderen, nichtleitenden Material besteht. Im einen wie im anderen Falle bleiben die erstarrte Probe und das erste Gelmedium an dem erstarrten zweiten Gelmedium haften, wodurch die in dem erstarrten ersten Gelmedium enthaltene Probe zu dem erstarrten zweiten Gelmedium wandert, wenn elektrischer Strom an das Gelmedium angelegt wird.
Die Probenkavität 26 kann zwar manuell mit einer Handpipette 38 beladen werden, wie in Fig. 1 dargestellt, aber für einen erhöhten Durchsatz kann das Beladen auch mit Hilfe von automatischen Einrichtungen erfolgen, beispielsweise unter Verwendung einer programmierbaren oder Roboter-Pipettiervorrichtung, wie z. B. einer Beckman Biomek Workstation von Beckman Instruments, Inc.. Palo Alto, CA. Das in der Biomek Workstation vorhandene Pipettensystem kann an eine Zufuhr des geschmolzenen oder nichterstarrten ersten Gelmediums 34 angeschlossen werden, das dann zur automatischen Abgabe an einen oder mehrere Probenhalter, die entlang der Ladefläche der Biomek-Einheit angeordnet sind, mit einzelnen Proben vermischt wird. Andere Einrichtungen zur automatischen oder manuellen Mischung und Abgabe von Proben an das erste Gelmedium werden erwogen. Die Probe kann mit dem ersten Gelmedium vermischt und dann in die Probenkavität geladen werden; oder das erste Gelmedium kann in die Probenkavität gegeben und die Probe dann zugesetzt werden; oder umgekehrt.
Beispiele für gebräuchliche gelbildende Medien, die sich zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung eignen, sind unter anderem Agarose, Polysaccharid. Polyacrylamid, wasserlösliches vernetztes Polymer und Stärke. Der Begriff "geschmolzen", wie er im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gebraucht wird, bezieht sich auf den flüssigen oder nichtfesten Zustand des Gels. Wenn zum Beispiel bei der Ausführung der Erfindung Agarose als das mit der Probe zu vermischende erste Gelmedium verwendet wird, dann wird der "geschmolzene" Zustand durch Erhitzen des Gelmediums erzielt. Zum Estarrenlassen anderer Gelmedien können auch chemische Mittel verwendet werden. Die Erfindung kann unter Verwendung von Acrylamid als Trennmedium ausgeführt werden, indem beispielsweise die Probe zuerst in der Probenkavität mit geschmolzener Agarose vermischt wird, das Erstarren der Proben abgewartet wird und die Proben an ein gegossenes Acrylamidgel abgegeben werden, dem eine obere Schicht aus geschmolzener Agarose zugesetzt wurde. Agarose wird bei der vorliegenden Erfindung sowohl für das erste als auch für das zweite Gelmedium bevorzugt. Bei Verwendung von Agarose als Gelmedium beträgt der mit der Probe zu vermischende Agaroseanteil etwa 0,35% bis etwa 0,7%. Der bevorzugte Agaroseanteil liegt im Bereich von 0,5%.
Das Gemisch aus der Probe und dem geschmolzenen ersten Gelmedium 34 kann in die Probenkavität 26 eingebracht werden, wie in Fig. 1 dargestellt. Da der Probenhalter 24 in horizontaler Orientierung beladen wird, können kleine Probenkavitäten 26 entlang dem Probenhalter 24 sehr dicht beabstandet sein und bieten dabei immer noch eine große Zielfläche für das Laden der Proben. Die Anzahl der Probenkavitäten 26 ist vorzugsweise ein Vielfaches der Anzahl der Pipetten, die an der Roboter-Pipettiervorrichtung vorhanden sind, zuzüglich mindestens einer zusätzlichen Kavität an mindestens einem Ende der Vorderseite 27.
Auf der Roboter-Pipettiervorrichtung können viele Probenhalter 24 gleichzeitig montiert werden, so daß sich die Anzahl der Probenkavitäten 26 erhöht, die während einer bestimmten Zeitspanne gefüllt werden können. Ein offensichtlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß wegen des Beladens des Probenhalters unabhängig vom Trenngel das große Trenngel nicht aufgenommen und bearbeitet zu werden braucht.
Das Verfahren zum Laden einer Probe auf ein Gel kann ferner nach dem Schritt (b) das Lagern des Probenhalters, der die erstarrte Probe und das erste Gelmedium enthält, über eine Zeitspanne bis zur Durchführung des Schritts (c) aufweisen. Der beladene Probenhalter 24 kann bei Temperaturen im Bereich von etwa 4ºC bis etwa 23ºC bis zum geeigneten Zeitpunkt für die Durchführung der Elektrophoresedurchlaufs gelagert werden, vorausgesetzt, daß ein Austrocknen oder Zersetzen der Probe sorgfältig verhindert wird. Zum Abdecken der erstarrten Proben im Probenhalter kann ein Klebeband verwendet werden, um eine Verdunstung zu verhindern.
Eine typische, für die Elektrophorese verwendete Elektrophoreseeinheit gemäß der vorliegenden Erfindung, die in Fig. 2 im auseinandergenommenen Zustand und in Fig. 3 im zusammengesetzten Zustand dargestellt ist, weist eine Elektrophoresekammer 12, einen Probenhalter 24 und Einrichtungen 22, 18 und 14 zum Festhalten des Probenhalters auf. Die Elektrophoresekammer 12 ist so geformt, daß ein Teil ihrer Grundplatte erhöht ist, um ein Bett 14 zu bilden, das sich von einer Innenfläche 17 der Seitenwand 16 der Elektrophoresekammer 12 zu einer gegenüberliegenden Innenfläche 17 der Seitenwand 16 erstreckt, so daß das Bett 14 zwischen zwei Puffer/Elektrodenkammern 20 angeordnet ist. Vorzugsweise weist die Innenfläche 17 jeder Seitenwand 16 mindestens einen darin ausgebildeten vertikalen Durchgangsschlitz 18 auf, der senkrecht zu einer Kante des Betts 14 ist. Die Durchgangsschlitze 18 dienen zur Aufnahme des Keils 22 und des Probenhalters 24.
Für den erhöhten Teil der Grundplatte der Elektrophoresekammer 12, der das Bett 14 bildet, kann ultraviolettdurchlässiges (UV-durchlässiges) Glas verwendet werden. Die Verwendung dieses Materialtyps erleichtert das Sichtbarmachen und Photographieren der Ergebnisse der Elektrophorese.
Eine ausreichende Zeit vorausgesetzt, "geliert" das Gemisch aus der Probe und dem ersten geschmolzenen Gelmedium 34 oder erstarrt durch Abkühlung oder durch andere Erstarrungsmittel, wie z. B. chemische Mittel. Der Probenhalter 24 wird dann hochkant gedreht, wie in Fig. 2, 3 und 4 dargestellt, und in vertikale Durchgangsschlitze 18 an der Innenfläche 17 der Seitenwände 16 eingeschoben und so an einer Kante des Betts 14 montiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Probenkavität 26 und damit das Gemisch aus der Probe und dem ersten Gelmedium von der Kante des Betts nach innen in eine Position über der Oberseite des Betts 14 versetzt. Am besten wird die Probenkavität 26 von der Bettkante 14 insgesamt über der Oberfläche des Betts 14 um einen Abstand von etwa 3 mm bis etwa 50 mm von der Kante des Betts 14 nach innen versetzt, wie in Fig. 5 dargestellt. Diese Positionierung kann durch Verwendung eines bevorzugten Probenhalters 24 erleichtert werden, der eine Unterlage 28 und eine Platte 25 aufweist, wobei die Unterlage 28 zumindest vertikal nach unten über die Platte 25 hinausragt, wenn der Probenhalter 24 zur Abgabe der Probe an das Elektrophoresegel ausgerichtet ist.
Einrichtungen zum Festhalten des Probenhalters können beispielsweise eine Klammer, einen Keil, einen Stift aufweisen, oder der Probenhalter kann durch einen Bediener mit der Hand gehalten werden. Vorzugsweise ist ein Keil 22 in vertikalen Durchgangsschlitzen 18 so angeordnet, daß der Probenhalter 24 zwischen einer Kante des Betts 14 und dem Keil 22 angeordnet ist (siehe Fig. 2 und 3). Der Keil 22 dient dazu, den Probenhalter 24 in direktem Kontakt mit einer Kante des Betts 14 zu halten, der ausreicht, um einen Kontakt des ersten Gelmediums 34 zum zweiten Elektrophoresegelmedium 36 und dadurch die Abgabe der Probe an das Elektrophoresegel 36 zu ermöglichen, wie in Fig. 3 und 4 dargestellt. Vorzugsweise sind zwei Keile 22 vorhanden, wobei der zweite Keil in vertikale Durchgangsschlitze 18 an der gegenüberliegenden Kante des Betts 14 paßt, wie gleichfalls in Fig. 3 und 4 erkennbar. Der zweite Keil 22 definiert zusammen mit dem Probenhalter 24, den inneren Seitenwänden 17 und der oberen Fläche des Betts 14 den Bereich, in dem das Elektrophoresegel 36 gebildet wird, wie in Fig. 3 und 4 dargestellt. Der Keil 22 kann spanend bearbeitet, ausgestanzt oder aus Kunststoff geformt werden, wie z. B. aus Lucite® oder Nylon. Der Keil besteht aus einem elektrisch leitenden Material, wenn er während der Elektrophorese nicht entfernt wird, wobei die Leitfähigkeit des Keils der des Elektrophoresegels nahekommt. Beispiele des elektrisch leitenden Materials sind Kunstharze, die mit leitfähigen Füllstoffen kombiniert sind, wie z. B. mit hochfesten Metallfasern, Metallflocken-Füllstoffen, metallisierten Glimmerplättchen, Füllstoffen mit niedrigem Höhe-Breite-Verhältnis und niedriger Dichte und Kohlefasern.
Bei der bevorzugten praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung sind Elektrophoresebanden, die aus einem Elektrophoresedurchlauf resultieren, gewöhnlich schärfer, wenn die erstarrte Probe und das erste Gelmedium von der Kante des Betts 14 nach innen versetzt sind. Wenn das Probengel nicht so angeordnet ist, daß es insgesamt über dem Bett 14 nach innen versetzt ist, kann eine Verzerrung des elektrischen Feldes auftreten, möglicherweise auf Grund einer schnelleren Wanderung am Boden der Probe. Dies kann zu einer Schräglage der Banden und zu einem erheblichen Bandenauflösungsverlust führen, einem unerwünschten Ergebnis bei Elektrophoresedurchläufen.
Nach dem Anordnen des Probenhalters 24 in der Elektrophoreseeinheit wird eine geeignete Menge geschmolzenes zweites Gelmedium zugesetzt, zum Beispiel indem es auf die obere Fläche des Betts 14 gegossen wird. Dieses geschmolzene zweite Gelmedium läßt man ausreichend lange "gelieren" oder erstarren, entweder durch Abkühlen oder durch chemische Mittel, um ein Elektrophoresegel 36 zu bilden. Nach dem Erstarren des zweiten Gelmediums sind die Probe und das erste Gelmedium 34 in der Position zur Abgabe der Probe fixiert. Dies wird dadurch ermöglicht, daß das Elektrophoresegel 36 ausreichend an der Probe und dem ersten Gelmedium 34 anhaftet oder anklebt, die in der Probenkavität 26 enthalten sind, so daß die Probe beim Entfernen des Probenhalters 24 an dem Elektrophoresegel 36 haften bleibt. Wenn der Probenhalter 24 anschließend aus der Elektrophoreseeinheit 10 entfernt wird, dann erfolgt dies so, daß die Probe und das erste Gelmedium 34 aus der Probenkavität herausgleiten, dabei aber in der Position zur Abgabe der Probe an das Elektrophoresegel 36 fixiert bleiben, so daß ein beladenes Elektrophoresegel 32 gebildet wird. Wenn der Probenhalter 24 und der Keil 22 aus leitfähigem Material bestehen, brauchen sie nicht entfernt zu werden, wodurch Zeit eingespart wird. Das beladene Elektrophoresegel 32 weist das Elektrophoresegel 36 auf, an dem die Probe und das erste Gelmedium 34 in der Position zur Abgabe der Probe an das Elektrophoresegel 36 fixiert sind. Die Elektrophorese kann dann ablaufen, indem auf herkömmliche Weise Strom an das Gel angelegt wird.
Die vorliegende Erfindung bietet außerdem ein System zur Ausführung der Gelelektrophorese, das aufweist: (a) eine Elektrophoresekammer mit einem Elektrophoresebett, wobei das Bett zwischen zwei Puffer/Elektrodenkammern angeordnet ist und sich von einer Seitenwand der Elektrophoresekammer zu einer gegenüberliegenden Seitenwand der Elektrophoresekammer erstreckt; und (b) einen Probenhalter mit einer Platte, die mindestens eine in der Vorderseite der Platte ausgebildete Probenkavität aufweist.
Die Elektrophoresekammer und der Probenhalter sind so beschaffen, wie oben beschrieben und in Fig. 1-5 dargestellt. Vorzugsweise weist der Probenhalter mehrere Probenkavitäten auf.
Das System kann ferner eine automatische Einrichtung zur Abgabe mehrerer Elektrophoreseproben und eines geschmolzenen ersten Gelmediums in die Probenkavitäten des Probenhalters gemäß der obigen Beschreibung aufweisen.
Als das erste Gelmedium können, wie oben beschrieben, die verschiedensten Medien verwendet werden, wobei Agarose bevorzugt wird. Im Schritt (a) kann das System ferner ein zweites Gelmedium aufweisen, das aus Agarose besteht, die in der Elektrophoresekammer auf der Oberfläche des Betts enthalten ist.
Die vorliegende Erfindung wird bevorzugt in horizontalen Elektrophoreseeinheiten verwendet. Es ist jedoch zu erwarten, daß auch vertikale Elektrophoreseeinheiten verwendet werden könnten. Bei vertikalen Ausführungsformen, in denen oft Acrylamid als zweites Gelmedium verwendet wird, könnte die obere Kante des Elektrophoresegels mit einer dünnen Schicht geschmolzener Agarose bedeckt werden, und der mit erstarrter Agarose und Proben beladene Probenhalter wird dann sofort darin eingetaucht, wodurch dann eine Bindung zwischen der Agaroseschicht des Elektrophoresegels und der erstarrten Agarose und der Probe entsteht, die in den Kavitäten des Probenhalters enthalten sind.
Die vorliegende Erfindung bietet eine befriedigende Möglichkeit, einen hohen Probendurchsatz bei der Gelelektrophorese zu erzielen, was bei bestimmten Elektrophorese- Anwendungen besonders wünschenswert ist, wie z. B. bei der Analyse des endonuklearen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) und bei der Analyse von ungeordneter amplifizierter polymorpher DNA (RAPD) (U.S. 5126239).

BEISPIEL 1

Replikatproben wurden durch Mischen von 10 ul DNA (2 ug eines 1-Kilobasen- Doppelstrangs, BRL, Inc.. Gaithersberg, MD) mit 10 ul geschmolzener 1,4%iger Agarose bei 48ºC hergestellt. Die Agarose war entweder vom Standardtyp (BioRad, Inc.) (siehe die Bahnen 3, 4, 7 und 8 von Fig. 6) oder vom niedrigschmelzenden Typ (BRL, Inc.) (siehe die Bahnen 1, 2, 5 und 6 von Fig. 6). Die Endkonzentration der Agarose im Gemisch betrug 0,7%. Vor dem Erstarren der Gemische wurden 20 ul jedes Gemischs in eine Probenkavität eines Probenhalters pipettiert, wie in Fig. 1 und 2 dargestellt, wobei aber die Probenkavitäten in der Unterlage des Probenhalters ausgebildet waren und keine Probenplatte vorhanden war.
Der Probenhalter, der jeden Satz von DNA-Proben enthielt, wurde in eine Elektrophoreseeinheit eingesetzt, wie in Fig. 2 und 3 dargestellt. Nach dem Fachmann bekannten Verfahren wurde eine 1%ige Agaroselösung hergestellt und bei 48ºC äquilibriert. Die 1%ige Agaroselösung wurde bei 48ºC auf das horizontale Gelbett der Elektrophoreseeinheit gegossen und bei Raumtemperatur zum Erstarren gebracht, um das erstarrte zweite Gelmedium zu bilden. Die Keile wurden entfernt, und dann wurde der Probenhalter vom Gelbett entfernt, wobei die Proben an der Kante des erstarrten zweiten Gelmediums haften blieben (wie in Fig. 5 dargestellt).
Der erste und der zweite Probensatz wurden dann getrennt, indem die Gelplatte in Elektrophoreserichtung halbiert wurde. Eine Hälfte der Platte wurde nach innen geschoben, so daß die anhaftenden Proben in dem erstarrten ersten Gelmedium in etwa 1 Zoll Abstand von der Kante des Gelbetts angeordnet waren (Fig. 6B). Die verbleibende Hälfte der Platte wurde in ihrer Position belassen, so daß die anhaftenden Proben an der Kante des Gelbetts angeordnet waren (Fig. 6C).
Die Elektrophorese wurde in 1 · TBE (89 mM Tris, pH 8,4, 89 mM Borsäure und 2 mM EDTA-Dinatriumsalz) bei 100 Volt über 100 Minuten ausgeführt; die getrennten Banden der mit Ethidiumbromid gefärbten DNA wurden nach dem Fachmann bekannten Verfahren unter ultraviolettem Licht sichtbar gemacht und photographiert.
Wie in Fig. 6A dargestellt, wurden die in den Probenhalter eingebrachten Proben in dem erstarrten zweiten Gelmedium wirksam getrennt und zeigen, daß die von der Kante des Gelbetts um 1" nach innen versetzten DNA-Proben (Bahnen 1-4) besser aufgelöst wurden als die Proben, die man über die Kante des Gelbetts hinausragen ließ (Bahnen 5-8). Bei Betrachtung der horizontalen Gelplatte von oben waren die DNA-Banden schärfer, wenn die Proben von der Kante des Gelbetts nach innen versetzt waren. DNA-Proben, die über die Gelbettkante hinausragten, durchliefen das Gel in Schräglage. Beim Zerschneiden der Gelplatte und Betrachten der Banden von der Seite war die Schräglage der Banden sichtbar, derart, daß der dem Gelbett am nächsten liegende Abschnitt (der unterste Teil der Bande) schneller gewandert war als der Abschnitt an der Geloberfläche (der oberste Teil der Bande). Dieser Effekt war für die an der Gelbettkante anhaftenden Proben stärker als für die Proben, die von der Gelbettkante nach innen versetzt waren. Dieser Schräglageeffekt erklärt die schärferen Bandenbilder, die bei Proben zu sehen sind, welche von der Gelbettkante nach innen versetzt sind. DNA-Proben, die über die Gelbettkante hinausragen, sind während der ersten Augenblicke der Elektrophorese einem ungleichmäßigen elektrischen Feld ausgesetzt, was dazu führt, daß die DNA-Bande in schräger Ausrichtung durch das Gel wandert. Durch das Zurücksetzen der DNA-Probe von der Kante des Gelbetts wird die DNA- Probe während des Beginns der Elektrophorese in ein gleichmäßigeres elektrisches Feld gebracht, was zu einer Trennung mit höherer Auflösung führt. DNA-Proben, die in niedrigschmelzende Agarose des erstarrten ersten Gelmediums eingebracht wurden (Bahnen 1. 2, 5 und 6 von Fig. 6A) zeigten eine niedrigere Auflösung als Proben, die in normale Agarose eingebracht wurden (Bahnen 3, 4, 7 und 8 von Fig. 6A).

BEISPIEL 2

Ein Satz DNA-Proben wurde durch Zugabe von DNA ("1 kb Doppelstrang" von BRL. Inc., Gaithersberg, MD) zu geschmolzener Agarose hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben, um eine Agarose-Endkonzentration von 0,750, 0,675, 0,600 bzw. 0,525% zu erhalten (siehe Fig. 7, Bahn 1, 2, 3 bzw. 4). Es wurden fünf verschiedene Probensätze hergestellt und in ein Gel gegossen. Das Gel wurde in der Elektrophoreserichtung in 5 Stücke zerschnitten. Jedes Stück wurde von der Gelbettkante um Abstände von 1/8", 1/4", 1/2", 1" oder 2" nach innen verschoben. Die Elektrophorese und das Sichtbarmachen der DNA-Proben wurden ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Wie in Fig. 7 dargestellt, ist die Auflösung jeder Probe im wesentlichen gleichwertig, mit scharfen, leicht schrägliegenden Banden. DNA-Proben, die von der Gelbettkante um nur 1/8" zurückversetzt waren, wurden gut aufgelöst. Die Konzentration der Agarose in dem erstarrten ersten Gelmedium hatte keine beobachtbare Wirkung auf die Auflösung der DNA-Proben während der Elektrophorese. Für das erstarrte erste Gelmedium können daher niedrige Agarosekonzentrationen verwendet werden, die eine größere Flexibilität bei der Probenherstellung vor dem Erstarren der Agarose erlauben.

BEISPIEL 3

Es wurden 2 Sätze von DNA-Proben ("1 kb Doppelstrang" von BRL, Inc., Gaithersberg, MD) hergestellt und, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Agarose zu einer Agarose- Endkonzentration von 0,50, 0,45, 0,40, 0,35 bzw. 0,30% vermischt (siehe Fig. 8A. Bahnen 1 und 6 - 0,50%; Bahnen 2 und 7 - 0,45%; Bahnen 3 und 8 - 0,40%; Bahnen 4 und 9 - 0,35%; und Bahnen 5 und 10 - 0,30%). Die Proben wurden in den Probenhalter eingebracht und bei Raumtemperatur zum Erstarren gebracht. Proben in 0,30%iger Agarose erstarrten nicht in dem Probenhalter und wurden vor dem Gießen des erstarrten zweiten Gelmediums aus dem Probenhalter entfernt (Bahnen 5 und 10).
Der Probenhalter war so geformt, daß die anhaftenden Proben zu einem Punkt unmittelbar innerhalb der Gelbettkante nach innen versetzt wurden; die Rückseite der anhaftenden Probe war gerade bündig mit der Kante des Gelbetts, während die Vorderseite der anhaftenden Probe von der Gelbettkante um 1/8" nach innen versetzt war, wie in Fig. 8B dargestellt. Das Gel wurde in Richtung der Elektrophorese in zwei Hälften zerschnitten. Eine Hälfte wurde von der Gelbettkante um 1" nach innen verschoben (Fig. 8C), und die andere Hälfte wurde in ihrer Position belassen (Fig. 8B). Die Elektrophorese und das Sichtbarmachen der DNA-Proben wurden ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die in Fig. 8A dargestellten Ergebnisse zeigen, daß eine so niedrige Agarosekonzentration wie 0,35% als erstarrtes zweites Gelmedium funktioniert, und daß an Ort und Stelle gegossene und von der Gelbettkante um 1/8" zurückgesetzte DNA-Proben (Bahnen 1-5) ebenso gut aufgelöst werden wie Proben, die von der Gelbettkante um 1" zurückgesetzt werden (Bahnen 6-10).

BEISPIEL 4

DNA-Proben wurden durch Vermischen von 203 ul 10M Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA mit 498 ul DNA ("1 kb Doppelstrang" von BRL, Inc.. Gaithersberg, MD), und 378 ul 1%iger Agaroselösung hergestellt und auf 55ºC gehalten. In einem Probenhalter wurde jede von 76 Probenkavitäten mit 13 ul der DNA/Agaroselösung gefüllt und dann bei Raumtemperatur erstarren gelassen. Der Probenhalter wurde in die Elektrophoreseeinheit eingesetzt, ein Gel wurde mit einer 1%igen Agaroselösung auf das Gelbett gegossen und erstarren gelassen, und die Elektrophorese und das Sichtbarmachen der DNA wurden ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die Ergebnisse, die in der Fig. 9 dargestellt sind, zeigen daß alle 76 DNA-Proben mit hoher Auflösung getrennt wurden.

Claims

1. Probenhalter (24) zur Aufnahme einer vorerstarrten Elektrophoreseprobe und zum Zurückhalten der Elektrophoresegelprobe nach dem Erstarren zur Abgabe an ein Elektrophoresegel (16), wobei der Probenhalter (24) aufweist:

eine Platte (25) mit mindestens einer in der Vorderseite (27) der Platte ausgebildeten Probenkavität (26), und

eine an der Rückseite (21) der Platte (25) befestigte Unterlage (28), wobei die Unterlage (28) das Einbringen des Probenhalters (24) in eine Elektrophoresekammer (12) in unmittelbarer Nähe eines Elektrophoresegelbetts (14) erleichtert.

2. Probenhalter nach Anspruch 1, wobei sich die Unterlage (28) vom Boden der Platte (25) vertikal nach unten erstreckt, wenn der Probenhalter (24) innerhalb einer horizontalen Elektrophoreseeinheit (10) zur Abgabe von Proben an das Elektrophoresegel (36) ausgerichtet ist, und wodurch die Unterlage (28) die Platte (25) in einer von der Kante her nach innen versetzten Position und über der oberen Fläche des Elektrophoresegelbetts (14) hält, das in der horizontalen Elektrophoreseeinheit (10) enthalten ist.

3. Probenhalter nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Platte (25) und die Unterlage (28) einstückig ausgebildet sind.

4. Probenhalter nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Platte (25) im wesentlichen eben und rechteckig ist und mehrere Probenkavitäten (26) aufweist, die in Längsrichtung entlang der Vorderseite der Platte ausgerichtet sind.

5. Probenhalter nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Platte (25) aus einem Material besteht, welches das Entfernen des Probenhalters (24) aus den in den Probenkavitäten (26) enthalten erstarrten Gelproben (34) erleichtert.

6. Probenhalter nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Probenhalter (24) aus elektrisch leitendem Material besteht.

7. Verfahren zum Laden einer Elektrophoresegelprobe auf ein Elektrophoresegel (36), mit den folgenden Schritten:

(a) Abgabe der Probe und eines geschmolzenen ersten Gelmediums (34) in eine Probenkavität (26), die innerhalb eines Probenhalters (24) ausgebildet ist, wobei der Probenhalter (24) so beschaffen ist, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert; und

(b) Erstarrenlassen des geschmolzenen ersten Gelmediums innerhalb der Probenkavität;

(c) Anordnen des Probenhalters (24) in einer Elektrophoresekammer (12) auf eine Weise, die ausreicht, um das in der Probenkavität (26) enthaltene erstarrte erste Gelmedium (34) in unmittelbarer Nähe eines Betts (14) innerhalb der Elektrophoresekammer (12) anzuordnen;

(d) Zugabe eines geschmolzenen zweiten Gelmediums (36) auf das Bett innerhalb der Elektrophoresekammer (12), wodurch das geschmolzene zweite Gelmedium (36) in Kontakt mit dem erstarrten ersten Gelmedium (34) gebracht wird, das in der im Schritt (c) erwähnten Probenkavität (26) enthalten ist; und

(e) Erstarrenlassen des geschmolzenen zweiten Gelmediums (36) in dem Bett.

8. Verfahren nach Anspruch 7, das ferner den folgenden Schritt aufweist:

(f) Entfernen des Probenhalters, wobei die Probe und das an dem erstarrten zweiten Gelmedium (36) anhaftende erste Gelmedium (34) zurückbleiben, wodurch die in dem erstarrten ersten Gelmedium (34) enthaltene Probe zu dem erstarrten zweiten Gelmedium (36) wandert, wenn der Elektrophoresestrom angelegt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Probe und das erste Gelmedium (34) durch den Anordnungsschritt (c) in einer von der Kante des Betts (14) her nach innen versetzten Position über der oberen Fläche des Betts (14) angeordnet werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei sowohl das erste (34) als auch das zweite (36) Gelmedium Agarose sind und die Elektrophorese in einer horizontalen Elektrophoreseeinheit (10) ausgeführt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei im Schritt (a) die Abgabe der Probe und des geschmolzenen Gelmediums an den Probenhalter (24) mit Hilfe automatischer Einrichtungen ausgeführt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, das ferner nach dem Schritt (b) das Lagern des Probenhalters (24), der die erstarrte Probe und das erste Gelmedium (34) enthält, für einige Zeit vor der Ausführung des Schritts (c) aufweist.

13. System zur Ausführung einer Gelelektrophorese, das aufweist:

(a) eine Elektrophoresekammer mit einem Elektrophoresebett (14), wobei das Bett zwischen zwei Puffer/Elektrodenkammern angeordnet ist und sich von einer Seitenwand (16) der Elektrophoresekammer (12) zu einer gegenüberliegenden Seitenwand (16) der Elektrophoresekammer erstreckt; und

(b) einen Probenhalter (24) mit einer Platte (25), die mindestens eine in der Vorderseite (27) der Platte ausgebildete Probenkavität (26) aufweist, wobei der Probenhalter (24) so konstruiert ist, daß er auf eine Weise in die Elektrophoresekammer (12) eingebracht wird, die ausreicht, um eine erstarrte Probe, die ein erstes Gelmedium (34) enthält, in der Probenkavität (26) in unmittelbarer Nähe des Elektrophoresebetts (14) anzuordnen.

14. System nach Anspruch 13, wobei der Probenhalter so beschaffen ist, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert.

15. System nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Vorderseite (27) des Probenhalters (24) mehrere Probenkavitäten (26) aufweist.

16. System nach einem der Ansprüche 13 bis 15, das ferner aufweist:

(c) eine automatische Einrichtung zur Abgabe von mehrfachen Elektrophoreseproben und eines geschmolzenen ersten Gelmediums (34) in die Probenkavitäten (26) des Probenhalters (24).

17. System nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei im Schritt (c) das erste Gelmedium (34) Agarose ist, und das im Schritt (a) ferner ein zweites, aus Agarose bestehendes Gelmedium (36) aufweist, das in der Elektrophoresekammer (12) auf der Oberfläche des Betts (14) enthalten ist.