DE69315342T2

DE69315342T2 - Vorrichtung und verfahren zur reinigung von nukleinsauren

Info

Publication number: DE69315342T2
Application number: DE69315342T
Authority: DE
Inventors: William P Macconnell
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-07-10
Filing date: 1993-04-19
Publication date: 1998-06-18
Anticipated expiration: 2013-04-20
Also published as: WO1994001763A1; EP0649528B1; US5217593A; DE69315342D1; EP0649528A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Reinigung von Nukleinsäuren und umfaßt insbesondere ein verbessertes Verfahren und eine Vorrichtung zur Reinigung von Nukleinsäuren, Plasmiden und dergleichen.
Es wird viel Laborforschung unternommen, bei der rekombinante DNA-Techniken verwendet werden. Unter den ausgeführten Forschungsaktivitäten sind DNA-sequenzierungen, DNA-Restriktionskartierungen&sub1; DNA-Sondenerzeugung, Konstruktion von anderer Plasmid-DNA oder ähnlicher DNA aus kleineren Stücken, RNA-Transkription aus einer Plasmidmatrix, Hybridisierungstüpfelanalyse, Transformation in Bakterien-, Hefe- oder Säuqerzellen, S1-Nukleasekartierung, Mikroinjektion in Embryonen und Elektronenmikroskopieanalyse. Sie alle erfordern im wesentlichen reine Konzentrationen an Plasmid-DNA.
Es gibt viele Techniken und Geräte zur Reinigung von Plasmid- DNA im kleinen Maßstab. Ein typischer Ansatz aus dem Stand der Technik zur Reinigung von Plasmid umfaßt eine Reihe von Schritten, mit einer Aufnahme von Zellen, die in flüssigen Kulturen gezüchtet wurden, durch Zentrifugieren, Abtrennung der bakteriellen chromatischen (genomischen) DNA und Zellbruchstücke von den löslichen Inhaltsstoffen der Bakterien durch Zentrifugieren oder Filtrieren und Aufkonzentrieren der Plasmid-DNA getrennt von anderen Zellkomponenten durch Alkohol oder Isopropanol, Absorption auffeste Medien (z.B. Ionenaustauscherharz, Glaspulver, Ulnkehrphasenchromatographieharz etc.) oder Salzfällung. Zusätzliche Reinigungsschritte können diesen angeschlossen werden wie Phenol-/Chloroformextraktion, Fällung mit sekundärem Alkohol, Protease- oder Ribonukleasebehandlung zur weiteren Reinigung der Plasmid-DNA.
Andere Verfahren zur Plasmidreinigung umfassen die zusätzlichen Schritte des Zusatzes von CsCl zum Überstand der Bakterienlyse nach Entfernen der bakteriellen genomischen DNA, gefolgt von Ultrazentrifugierung. Die Ultrazentrifugierung führt zu einem Dichtegradienten des CsCl, in dem die Plasmid- DNA ein scharfes Band bildet. Dieses Band wird aus dem Gradienten entfernt und die DNA vom CsCl durch Alkoholfällung oder andere geeignete Mittel abgetrennt. Diese Vorgehensweisen werden in der molekularbiologischen Forschung zur Plasmidreinigung verbreitet angewendet und wurden verfeinert, um Plasmid-DNA zu erzeugen, die zur Verwendung in praktisch jedem nachfolgenden Verfahren der Molekularbiologie geeignet ist.
Es wurden bestimmte Geräte für die Reinigung von Plasmid-DNA entwickelt. Ein solches Gerät ist von einer Firma namens Applied Biosystems erhältlich und kann DNA aus Proben von Gewebe, Blut, Bakterien etc. reinigen. Das Gerät wendet wiederholte organische Extraktion von Probenmaterial an, um DNA freizusetzen und zu reinigen. Aus Reservoiren gezogene Reagenzien werden automatisch in Gefäße eingeführt, die Proben enthalten, in denen die wäßrige/organische Extraktion erfolgt. Es kann entweder Phenol oder Guanidinisothiocyanat von der Maschine als organisches Phasenmaterial verwendet werden. Nach den Extraktionsschritten wird die DNA auf Chromatographieharz aufkonzentriert, das im oberen Teil der Extraktionsgefäße gehalten wird. Das Bedienungspersonal entfernt dann die Gefäße aus dem Instrument und eluiert die DNA von Hand aus dem Harz. Dieses Gerät ist primär zur Reinigung von genomischer DNA aus Säugerzellen, Gewebe, Blut etc. vorgesehen und ist nicht sehr erfolgreich bei bakterieller Plasmid-DNA. Die Maschine besitzt keine Fähigkeit zur Trennung des Plasmids von bakterieller DNA.
Eine vollautornatische Maschine ist von Autogen Inc. erhältlich, die zum Reinigen von Plasmid-DNA aus rekombinanten Bakterien konstruiert ist. Diese Maschine ist im wesentlichen ein elektronisch gesteuerter mechanischer Roboter, der zahlreiche Plasmidreinigungen im kleinen Maßstab ausführt. Die Maschine verwendet eine Präzisionszentrifuge mit Sets von wegwerfkunststoffröhrchen, in die die Bakterienstartkulturen eingesetzt werden. Über der Zentrifuge positionierte Roboterpipettenhalter führen während des Durchlaufs Flüssigkeiten in Wegwerfprobenröhrchen ein und entfernen sie daraus, was Zentrifugieren der Proben in zwei verschiedenen Schritten oder Zyklen umfaßt. Diese Maschine kann bis zu zwölf Proben von Plasmid-DNA in weniger als einer Stunde reinigen. Die Maschine ist jedoch für den Laborgebrauch extrem teuer.
Andere Techniken zur Trennung von Substanz umfassen Elektrophoresetrennung. Als Beispiel für diesen Ansatz sind die folgenden US-Patente zu nennen:
Strauch, U.S. 3,533,933 erteilt am 13. Oktober 1970 mit dem Titel "Process and Device for the Isolation of Fractions of a Substance Mixture Electrophoretically Separated in a Carrier Gel" offenbart eine vertikale Trennungssäule, die teilweise oder vollständig mit einem Trägergel gefüllt ist, wobei sich eine Elutionskammer am Boden der Säule befindet.
Levy, U.S. 3,616,454, erteilt am 26. Oktober 1971 mit dem Titel "Method of an Apparatus for Electrophoretic Separation in a Gel Column" offenbart ein Gerät, in dem eine Probe im oberen Ende einer Polyacrylamidgelsäule einer Elektrophorese angeordnet ist, dessen unteres Ende in einer Aufnahme endet, die eine Elutionslösung enthält.
Nerenberg, U.S. 3,640,813 erteilt am 8. Februar 1972 mit dem Titel "Adapter for a Macromolecule Separation Device" offenbart ein in einer vertikalen Säule angeordnetes Gelmedium, mit einein Adapter für das untere Ende der Säule, die ein Gel enthält und Kanäle für Fluidzufuhr und -abfuhr auf die obere Geloberfläche.
Die folgenden Patente sind wegen der Offenbarung zugehöriger Verfahren und Geräte von Interesse:
US 3,579,433 erteilt am 18. Mai 1971,
US 3,715,295 erteilt am 6. Februar 1973,
US 3,755,121 erteilt am 28. August 1973,
US 3,951,776 erteilt am 20. April 1976, und
US 4,164,464 erteilt am 14. August 1979.
Viele der bekannten Verfahren und Vorrichtungen weisen eine Reihe von Nachteilen auf und sind im allgemeinen ungenügend, indem sie teuer sind und viele komplizierte Schritte und Verfahrensweisen erfordern. Andere sind nicht in der Lage, zufriedenstellende Reinheit und Mengen herzustellen.
In der oben vorgestellten früheren Anmeldung offenbarte der Anmelder ein verbessertes System und ein Verfahren zur Plasmidreinigung. Dieses System ist jedoch langsamer und komplizierter als gewünscht.
Es ist wünschenswert, daß ein einfaches, schnelles, kostengünstiges und doch zuverlässiges Verfahren und eine Vorrichtung zur Reinigung von Plasmid-RNA und -DNA ausgehend direkt von einer Bakterienkultur oder aufgenommenen Bakterienzellen zur Verfügung steht.
Es ist primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Vorrichtung und ein Verfahren zur Reinigung von Plasmiden und dergleichen zur Verfügung zu stellen.
Gemäß einem primären Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Vorrichtung zur Reinigung von DNA und dergleichen: ein Gehäuse, das ein Reservoir oder eine Kammer ausbildet, mit einem vorderen Ende und einem hinteren Ende zum Aufnehmen einer Pufferlösung, Mittel zum Zirkulieren eines Puffers im Rerservoir, entfembare Kassettenmittel, positionierbar im Gehäuse mit einem Einlaßende und einem Auslaßende und mit ersten Mitteln mit einem Gel zum Definieren eines ersten Weges, der sich zwischen dem Einlaßende und dem Auslaßende der Kammer erstreckt, Mitteln zum Einführen einer Bakterienprobe in den Weg an dessen vorderem oder Einlaßende, ein Auslaßmittel, das mit dem Gel am Auslaßende in Verbindung steht, und zweite Mittel selektiv positionierbar zum Definieren eines zweiten Weges, der sich von dem Auslaßmittel des ersten Weges über eine Elutionskammer am Auslaßende zu einer Sammelkammer erstreckt, und Mittel zum selektiven Aufbringen eines elektrischen Potentials entlang jedes der Wege zum selektiven Bewegen eines Plasmids zuerst entlang des ersten Weges von der Bakterienprobe zum Auslaßende des ersten Weges, dann entlang des zweiten Weges zu einem Sammelfenster an dessen Ende.
Dieses und weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden ersichtlich aus der folgenden Beschreibung, wenn sie in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird, in denen:
Fig. 1 eine Seitenaufrißansicht einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung darstellt,
Fig. 2 eine Draufsicht entlang der Linie 2-2 der Ausführungsform von Fig. 1 darstellt,
Fig. 3 eine Schnittansicht entlang der Linie 3-3 der Ausführungsform von Fig. 2 darstellt,
Fig. 4 eine Frontansicht entlang der Linie 4-4 von Fig. 3 darstellt, die die Mikrokammern zeigt,
Fig. 5 eine Draufsicht der Mikrokammern von Fig. 4 darstelltg und
Fig. 6 eine Schnittansicht entlang der Linie 6-6 von Fig. 5 darstellt.
In den Zeichnungen und insbesondere in Fig. 1 ist ein System gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dargestellt, das allgemein mit dem Bezugszeichen 10 bezeichnet ist. Das dargestellte System umfaßt ein primäres oder äußeres Gehäuse mit einer im allgemeinen kastenartigen nach oben offenen Konfiguration, mit einer Bodenwand 12, gegenüberliegenden Seitenwänden (nur eine) 14 gezeigt und gegenüberliegenden Endwänden 16 und 18, die ein allgemein oben offenes kastenartiges Gehäuse ausbilden. Das Gehäuse bildet eine oben offene Kammer oder ein Reservoir zur Aufnahme einer Pufferlösung, die bevorzugt hierdurch zirkuliert wird. Ein Paar Trägerelemente 20 und 22 bilden eine Trägervorrichtung zum Tragen und Anbringen einer entfembaren Kassette, die allgemein als 24 bezeichnet ist. Die entfembare Kassette 24 umfaßt bei genauerer Beschreibung eine bewegliche Mikrokammereinheit, die allgemein als 26 bezeichnet ist. Eine Brücke 28 erstreckt sich zwischen den Seitenwänden 14 und trägt ein Solenoid 30 zum Bewegen und Aktivieren der Mikrokammer 26 in ihre Betriebsposition.
Ein System zur Pufferzirkulation und -zufuhr umfaßt eine Pumpe 32, die durch Leitung 36 mit einem Zufuhrreservoir 34 verbunden ist, ein Dreiwegesolenoidventil 38 und Leitung 40 zur Zufuhr von Pufferflüssigkeit durch Leitung 42 zu einer öffnung 44 im Reservoir 15. Die Pumpe 32 und Ventil 38 können umgekehrt betrieben werden, um das Reservoir über die Entleerungsleitung 46 zu entleeren. Eine Überlaufleitung 48 verbindet über eine Überlauföffnung 50 zum Reservoir 15, um einen bestimmten oder maximalen Stand an Pufferlösung im Reservoir einzuhalten. Dieses Puffersystem kann durch ein programmierbares Steuerungssystem geregelt werden, das es ermöglicht, daß die Pufferlösung im Umlauf und auf einer optimalen Höhe gehalten wird, um Kontakt mit dem Gel in der Kassette aufrechtzuerhalten und sie zu ersetzen, wenn es gewünscht ist. Das System ist vorgesehen, um die Pufferlösung in Zirkulation zu halten und ihren pH einzuhalten und zu regeln, und bei der Regelung der Temperatur zu helfen. Es kann auch ein Ventilator 51 verwendet werden, um beim Regeln der Temperatur der Pufferlösung zu helfen.
Ein Steuerungssystem umfaßt eine zentrale elektronische Steuerschaltung 52, die bevorzugt eine programmierbare Zentraleinheit enthält, und programmierte Steuerung des Systems zur Verfügung stellt. Die zentrale Steuereinheit 52 ist über einen Leiter 54 mit einer Stromversorgung 56 verbunden, die durch einen Leiter 58 mit einer negativen Elektrode 60 am vorderen oder Einlaßende der Kammer 15 verbunden ist. Ein Leiter 62 verbindet die Stromversorgung mit einer positiven Elektrode 64 am hinteren oder Auslaßende der Kammer 15. Die Elektroden sind bevorzugt Platin- oder Palladiumdraht und bringen eine variable Spannung über die Kassette auf. Die zentrale Steuerschaltung 52 ist auch durch einen Leiter 66 verbunden, um die Pufferpumpe 32 zu steuern und durch einen Leiter 68, um das Dreiwegeventil 38 zu steuern. Ein Schwimmerschalter 69 ist durch einen Leiter 71 mit der Steuerschaltung verbunden. Ein Leiter 70 verbindet die zentrale Steuerschaltung 52, um das Solenoid 30 zu steuern, um die Mikrokammereinheit 26 durch ihre Bewegung nach unten in die Betriebsposition am Auslaßende der Kassette 24 zu aktivieren. Eine durch einen Leiter 74 angeschlossene Tastatur 72 ermöglicht das Programmieren und Steuern der zentralen Steuereinheit 52. Ein durch einen Leiter 78 angeschlossenes LED- oder LCD- Display 76 ergibt eine sichtbare Anzeige von Steuerungsinformationen.
Die Kassette ist aus nicht leitfähigem Material konstruiert und umfaßt allgemein ein Paar vertikal in einem Abstand angeordnete untere und obere Platten 80 und 82, die zwischen Seitenwänden 84 und 86 befestigt sind, so daß sie eine kastenartige Struktur mit offenem Ende bilden. Die Platten 80 und 82 sind ungefähr 10,16 cm (vier Zoll) auf 7,62 cm (drei Zoll) und in einem Abstand von ungefähr 0,88 cm (0,35 Zoll). Dies kann in Abhängigkeit von der Menge an Kultur, die zu verarbeiten ist, schwanken. Ein Fenster oder eine Öffnung 88 ist in der oberen Platte 82 nahe dem Front- oder Einlaßende ausgebildet mit vertikal sich erstreckenden umgebenden Wänden 90, 92, 94 und 96, die eine Vertiefung bilden. Eine Vielzahl von Trennwänden 98 erstrecken sich von direkt vor dem Fenster am vorderen Ende bis hinter die Enden der Platte am hinteren Ende, wobei eine Vielzahl von separaten parallelen Kanälen 100 ausgebildet ist. Die Trennwände erstrecken sich nach oben durch das Fenster 88, wobei eine separate Probenvertiefung 102 für jeden Kanal ausgebildet ist. Die dargestellte Kassette weist 12 Wege oder Kanäle auf, aber sie kann nach Wunsch mehr oder weniger aufweisen. Das Gehäuse kann so konstruiert sein, daß es eine oder mehrere der Mehrkanalkassetten aufnimmt.
Die Kassette umfaßt eine Elutionsvertiefung oder Kammer, die an ihrem hinteren Ende ausgebildet ist, durch einen Boden 104, nach oben stehende Seitenwände 106 und 108 und Endwände 110 und 112 zum Aufnehmen einer Mikrokammereinheit 26, die eine Elutionskammer und eine Sammelkammer für jeden der Kanäle enthält. Die Mikrokammereinheit 26 ist während der Trennungsphase des Verfahrens nach oben beweglich in eine nicht betriebsbereite Position, wie es in Fig. 1 gezeigt ist, und während der Elutionsphase nach unten in eine aktive Position, wie es in Fig. 3 gezeigt ist. Die nicht betriebsbereite Position ist über den Trennungskanälen der Kassette. Die Betriebsposition ist eine abgesenkte Position, worin Einlässe der Elutionskammern mit den Auslässen der Trennungskanäle der Kassette ausgerichtet sind und in Verbindung stehen.
In den Figuren 4 bis 6 ist die Struktur und Konfiguration einer beispielhaften Ausführungsform der Mikrokammereinheit dargestellt. Diese Einheit ist aus einem einteiligen Gehäuse 114 konstruiert, das durch Walzen oder Formen mit einer Elutionskammer 116 für jeden der Trennungskanäle ausgebildet ist. Die Vorderseite des Gehäuses ist aus Schlitzen 118 zwischen benachbarten Elutionskammern gebildet und einem Einlaß oder einer Öffnung 120, die mit dem Auslaß eines Trennungskanals 100 in Verbindung steht. In die Schlitze 118 greifen die nach außen vorspringenden Enden der Trennwände 98 ein und halten eine klare Trennung zwischen den benachbarten Kanälen und benachbarten Elutionskammern ein.
Die Elutionskammer 116 öffnet sich in eine Probensammelkammer 122, die durch einen nach unten sich erstreckenden Schlitz 124 gebildet ist, wobei eine Trennwand 126 dazwischen ist und ein Fenster oder eine Öffnung 128 an der Rückseite der Einheit. Das Fenster oder die Öffnung ist von einer Dialysenmembran 128 bedeckt.
Die Dialysen-/Ultrafiltrationsmembran, die sich durch die besten Ergebnisse auszeichnet, ist eine Membran aus regenerierter Cellulose, mit einem mittleren Molekulargewicht Cut- Off von 50000 Dalton, die von Spectrum Medical (Houston, Texas) hergestellt wird. Eine andere Reqeneratcellulosemembran mit einem mittleren Molekulargewicht Cut-Off von ungefähr 150000 Dalton ist von Bio Design of New York (Carmel, New York) erhältlich und zeichnet sich ebenfalls durch ausgezeichnete Ausbeuten und Reinheit der Nukleinäuren aus. Andere Membranen, die gute Ergebnisse zeigten, sind Celluloseestermembranen mit Molekulargewicht Cut-Offs von 300000 und 500000 Dalton, die von Spectrum Medical (Houston, Texas) erhältlich sind. Die letzteren beiden Membranen zeigten jedoch hohe Hintergrundbindungserscheinungen, was zu reduzierten Ausbeuten an gereinigter Nukleinsäure führt. Membranen mit Molekular gewicht Cut-Offs unter 50000 Dalton ergeben wegen ihrer Fähigkeit zum Einschließen geladener Polymere und Restproteine, die aus Agarose mit der Nukleinsäure eluiert werden, schlechte Ergebnisse.
Die Membran 130 wird über dem Fenster mittels eines geeigneten Leims oder Klebstoffs am Platz befestigt. Die Membran kann auch durch andere Mittel angebracht oder am Ort gehalten werden, wie durch einen Klemmrahmen (nicht gezeigt). Jede der Probenkammern 122 ist so konstruiert, daß sie 50 Mikroliter faßt, nachdem der Durchlauf beendet ist und der umgebende Puffer abgezogen ist. Ein Probenablaßloch oder eine -öffnung ist oben in der Kammer durch einen Schlitz 124 vorgesehen, um das Entfernen von Flüssigkeit aus der Kammer zu ermöglichen. Der Boden der Probenkammer 122 besitzt eine Wand, die sich von den Seiten nach oben erstreckt oder wölbt, um zu verhindem, daß Flüssigkeit in den Ecken des Kammerfensters eingeschlossen wird. Die Geometrie der Probenkammern und der Probenablaßlöcher ermöglicht, daß eine standardübliche 0 bis 200 µl Wegwerfmikropipettenspitze zum Entfernen von Flüssigkeit aus der Kammer verwendet werden kann. Die Probenkammergeometrie verhindert auch, daß das Bedienungspersonal die Membran punktiert, wenn eine Wegwerfspitze ganz eingeführt wird.
Als Vorbereitung für einen Durchgang werden die Kassettenkanäle am vorderen Ende und der Probenvertiefung verschlossen und mit einem Körper aus geeignetem Gel gefüllt, wie Agarosegel, das sandwichartig dazwischen angeordnet wird, und an beiden Enden an gegenüberliegenden Enden der Kammer 15 freigelegt. Es wird eine einprozentige (1 %) Agarose in einer wäßrigen Lösung mit 0,02 M Trisacetat, 0,0005 M EDTA hergestellt. Die Lösung wird dann auf 50 Grad Celsius gekühlt und in die Kassette gegossen, wobei ein Raum am Auslaß- oder Elutionsende freigelassen wird. Man läßt das Agarosegel erstarren und es wird eine Probenvertiefung direkt unter den Probenzugabeöffnungen 102 ausgeschnitten. Es können andere geeignete Gele anstelle von Agarose verwendet werden, wie Stärke, Gelatine oder vernetzte Varianten von Agarose, Polyacrylamid, Stärke oder Gelatine. Ein anderer Agaroseersatz ist unter der Marke Synergel von Diversified Biotech, 46 Marcellus Drive, Newton Centre, MA erhältlich. Das Gel sollte eine vertikale Dicke von ungefähr 0,76 bis 1,27 cm (3 bis 5 Zehntel, 0,30 bis 0,50 Zoll) aufweisen. Die obere Platte 82 ist mit einem Fenster oder einer Öffnung ausgebildet, das sich im wesentlichen über deren Breite ausdehnt. Eine Vielzahl von Abstandhalterwänden sind zwischen den Platten 80 und 82 angeordnet, so daß der Raum dazwischen in eine Vielzahl von Kanälen unterteilt ist, die sich von einem Ende (den Einlaßvertiefungen) zum anderen erstrecken, wobei sie ein Agarosegel enthalten, wie es noch beschrieben wird. Auf diese Weise erstrecken sich zahlreiche Wege (12 dargestellt) zwischen dem Einlaß an der Vorderseite und dem Auslaß an der Rückseite der Kassette.
Wenn die Kassetten 24 über längere Zeiträume als einen Tag gelagert werden sollen, werden 0,01 % Natriumazid (oder ein anderer verdünnt wirkender antimikrobieller Stoff) zum Agarosepuffer zugesetzt, bevor er in die Kassette gegossen wird. Außerdem werden für Lagerzeiten bis zu drei Monaten alle Öffnungen der Kassette mit Klebeband verschlossen. Weiterer Schutz gegen Austrocknung der Agarose wird durch dichtes Verpacken der Kassette in einen geeigneten Kunststoffbeutel vorgenommen, der ungefähr 0,5 ml steriles Wasser mit 0,01 % Natriumazid enthält, um die Feuchtigkeit im Beutel zu erhalten.
Wenn eine Isolierung von Nukleinsäure durchgeführt werden soll, wird das Klebeband von den Kassettenöffnungen entfernt. Ein Mikrokammerblock 26, wie in den Figuren 4 bis 6 dargestellt, wird mit einer nassen Dialysemembran vorbereitet, wie sie von Biodesign of New York erhältlich ist, die so am Mikrokammerblock 26 befestigt wird, daß alle Elutionsfenster bedeckt sind. Die zusammengesetzte Mikrokammer 26 wird in ihren richtigen Abstandhalter im hinteren Teil der Kassette eingeladen, wie es in Fig. 1 gezeigt ist. Der Mikrokammerblock wird oberhalb der Agarose in Position gehalten (der desaktivierten Position), während die Kassette in das Elektrophoresegerätegehäuse eingesetzt wird. Die Elektrophoresekammer wird dann mit fließendem Puffer gefüllt, typischerweise 0,02 M Trisacetat pH 8,3, 0,001 M EDTA, bis auf eine Höhe, die die Kassette umgibt, wobei es an beiden Enden der Kassette mit der Agarose in Kontakt kommt und sie bedeckt. Diese Höhe wird unter der Höhe des Mikrokammerblocks gehalten, während der letztere im desaktivierten Zustand ist. Die Kammer ist mit einer Überlauföffnung 50 ausgerüstet, die zu einem Ablauf führt, der sicherstellt, daß der oben genannte Flüssigkeitsstand gehalten wird. Im automatischen Instrument wird auch ein Schwimmerschalter verwendet, der der Steuerschaltung angibt, die Auffüllpumpe zu desaktivieren, wenn diese Höhe erreicht ist.
Zur Herstellung von DNA werden Bakterien (z. B. E. coli) mit Plasmid, Cosmid, M13 oder Lambdaphagen in reichem Medium kultiviert, wie Circle Grow, 2X YT Broth, Terrific Broth (Bio 101, Carlsbad, CA) usw., was bei 37 ºC 12 bis 16 Stunden dauert. Im Falle von E. coli mit Plasmiden oder Cosmiden, wie pUC19, Bluescript oder sCOS-1 (Stratagene, San Diego, CA) PBR322 usw. wurde gefunden, daß bei Kultur in Circle Grow Medium in einem Erlenmeyerkolben bei 37 ºC während 12 bis 16 Stunden bei 200 bis 250 Upm in einem Rotationsschüttler ausgezeichente Ausbeuten erzielt wurden.

Probenlysis und Ladeverfahren

Vor dem Laden wird eine Probe der Bakterienkultur, wie oben beschrieben, zunächst mit einem kombinierten Lyse- und Ladepuffer behandelt. Es wurde gefunden, daß die Zugabe von 0,1 Volumenteilen einer wäßrigen Lösung mit 60 % Glycerin, 0,025 M Tris-HCl, 0,05 M EDTA, 1 % Natriumdodecylsulfat und 200 Mikrogramm/ml Ribonuklease A (Amresco, Solon&sub1; Ohio) direkt zu der frischen Kultur, die Bakterien lysiert und gleichzeitig die Dichte der lysierten Lösung erhöht, so daß sie höher ist als die Dichte des fließenden Puffers. Alternativ kann die Lysenlösung aus 10 % Triton X-100 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), 25 mM EDTA, 25 mM Tris-HCL pH 8,0 und 200 mg/ml Ribonuklease A zusammengesetzt sein. Wenn dieser letztere Puffer verwendet wird, werden 0,1 Volumenteile zur Bakterienkultur zugegeben, die lysiert werden soll. 0,5 bis 10 Minuten nach der Lyse und nach der Wirkung von Ribonuklease A (RNase) auf die bakterielle RNA werden 50 bis 100 Mikrogramm Proteinase K (Amresco, Solon, Ohio) als Lösung in Wasser zur lysierten Bakterienprobe zugegeben. Die Lösung wird dann durch Verwirbeln gemischt und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubiert. Das mit RNase behandelte und mit Proteinase K behandelte Lysat wird dann in die Probenvertiefung 102 der Kassette eingeladen.

Trennung und Elution

Fließpuffer (z. B. 0,02 M Trisacetat, 0,001 M EDTA) wird in die Elektrophoresekammer zugegeben und ungefähr 120 Volt Gleichstrom werden über zwei Elektroden 60 und 64 aufgebracht, wobei die positive Leitung mit der Elektrode auf der Mikrokammerseite der Kammer verbunden ist und die negative Leitung mit der Probenöffnungsseite der Kammer verbunden ist. Diese Spannung wird ungefähr 25 Minuten fortgesetzt, bis die geladenen Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht (d. h. we niger als 500000 Dalton) aus jeder Probe bei der Elektrophorese durch die Agarose und hinaus in den fließenden Puffer wandern. Die Spannung während der Trennungsphase kann verändert werden, um optimale Trennungsergebnisse für DNA unterschiedlicher Größe zu erreichen. Beispielsweise kann ein Trennungsdurchlauf 25 Volt Gleichstrom für zehn Minuten gefolgt von 100 Volt Gleichstrom für zehn Minuten gefolgt von 150 Volt Gleichstrom für zehn Minuten bei einer Kassette mit Agarosefeldabmessungen von 0,71 x 0,89 x 3,30 cm (0,28 x 0,35 x 1,3 Zoll), wobei 500 Mikroliter lysierte Bakterien geladen sind. Dieses Programm kann am besten DNA im Größenbereich von 3 bis 10 Kilobasen auflösen, wobei die ersteren sehr nahe zum Ende der Agarosefelder migrieren. Andere Spannungen und Spannungsprogramme können für größere DNA angewendet werden oder geringere Spannung über längere Zeiträume aufgebracht werden, um eine bessere Auflösung und damit reinere DNA zu erhalten.
Nachdem die Trennungsstufe beendet ist und die gewünschten DNA nahe zum Ende des Agarosefelds migriert sind, wird die Mikrokammer 26 mit angebrachter Membran 128 nach unten geschoben, um ihre Elutionskammern direkt vor dem jeweils zugehörigen Agarosefeld zu positionieren (Fig. 2). Wie oben beschrieben ist die Mikrokammer so konstruiert, daß sie sich von selbst mit dem umgebenden Fließpuffer füllt. Bedingt durch die Anordnung von Schiebern 98, deren Enden in Nuten 118 im Mikrokammerblock hineingleiten, besteht eine nahezu vollständige Abdichtung zwischen den Feldern der Kassette, so daß Nukleinsäure aus einem Feld nicht in die Elutionskammer eines angrenzenden Feldes migrieren kann. Zusätzlich zu dem oben genannten neigt die Elektroelution dazu, daß Nukleinsäure nur in eine Richtung bewegt wird, was verhindert, daß sie um die hervorstehenden Schieber herum diffundiert. Die untere Fläche des Mikrokammerblocks erfordert jedoch keine Dichtung und ermöglicht daher, daß fließender Puffer in die Elution und die Probenkammern sickert, wenn die letzteren vor die Agarosefelder geschoben werden.
Während des Elutionsschrittes, der unmittelbar nach dem obigen Trennungsschritt durchgeführt wird, werden 90 bis 150 Volt Gleichspannung über die Elektroden in derselben Richtung wie zuvor aufgebracht, um zu bewirken, daß die Nukleinsäure in den Agarosefeldern in die Elutionskammer 116 des Mikrokammerblocks migriert und weiter in die Probenkammern 122, bis sie durch die Dialyse-/Ultrafiltrationsmembran 128 gestoppt wird. Es wurde gefunden, daß dieser Prozeß am effizientesten bei Spannungen von weniger als 150 Volt Gleichstrom verläuft und durch höhere Spannungen, wegen des Donnan-Effekts (siehe: Spectrum Medical Catalogue (1992) Seiten 131-135) nachteilig beeinflußt wird, der auftreten kann, wenn sich zu viele Ionen an der Oberfläche der Dialysemembran zusammenfinden. Die Ionenansammlung bewirkt eine Erhöhung der Temperatur in den Probenkammern, was zu einer Zunahme und anschließend einer Zerstörung der eluierten Moleküle führt. In der Praxis eluieren 120 Volt für 10 bis 45 Minuten fast alle abgetrennte Nukleinsäure aus der Agarose in die Probenkammer. Längere Zeiträume bewirken, daß Bakterienchromatin-DNA eluiert. Es wurde ebenso gefunden, daß gereinigte Nukleinsäure oft nicht nur auf der Membran ist, sondern in der Probenkammerflüssigkeit suspendiert.

Probenaufnahme

Wenn die Elektrophoresekammer entleert ist, wird die Mikrokammer, außer der Probenkammer 122 entleert. Die gereinigte Nukleinsäure kann dann durch Herauspipettieren der Flüssigkeit durch die Probenentnahmelöcher aus den Probenkammern 122 entfernt werden, ohne daß der Mikrokammerblock aus der Gelkassette entfernt werden muß. Die Probenkammern sind so konstruiert, daß sie 40 bis 50 Mikroliter Flüssigkeit zurückhalten, wenn das Elektrophoresegerät entleert wurde.
In der automatisierten Version dieses Trennungsvorgangs aktiviert die Steuerschaltung 52 die Flüssigkeitspumpe 32 und das Solenoidventil, um die Elektrophoresekammer aus dem Fließpufferreservoir 36 zu füllen. Derselbe Steuerschaltkreis 52 aktiviert eine Gleichstromquelle 56, um in einem der verschiedenen Programme, die zu Beginn des Durchlaufs von der Bedienungsperson aus einem Bedienteil 72 und einem Display 76 auf dem Instrumentengehäuse ausgewählt werden können, eine Spannung auf die Elektroden 60 und 64 aufzubringen. Wenn der Trennungsschritt beendet ist, aktiviert die Steuerschaltung ein Solenoid 30, das den Mikrokammerblock 26 nach unten in eine Nut in der Gelkassette schiebt und gegen einen Anschlag, um ihn richtig in Position vor die Agarosefelder zu bringen. Wie oben beschrieben füllt sich die Mikrokammer 26 kurz nach dem Einschieben an ihren Platz von selbst mit fließendem Puffer. Der Steuerkreis bringt dann 90 bis 150 Volt Gleichstrom für 10 bis 45 Minuten über die Elektroden, um den Elutionsschritt des Durchgangs abzuschließen. In den letzten 30 Sekunden dieser Zeit aktiviert die Steuerschaltung 52 das Solenoidentleerungsventil 38, was die Entleerung des Fließpuffers in ein Ablaufreservoir bewirkt, das mit dem Gerät über eine flexible Schlauchleitung verbunden ist. Wenn die Entleerung beendet ist, werden die Gleichstromspannungen desaktiviert und das Display des Instrumentengehäuses zeigt dem Bedienungspersonal an, daß der Durchlauf beendet ist. Ein typisches Durchlaufprogramm für Plasmid-DNA in E. coli im Bereich von 2 bis 10 kb kann sein:
1. Lysis von 500 Mikrolitern Bakterienproben und 5 Minuten Inkubieren mit Proteinase K.
2. Laden und Trennung 25 Minuten bei 120 Volt.
3. Aktivierung des Mikrokammerblocksolenoids.
4. Elution 20 Minuten bei 120 Volt, gefolgt vom Entleeren.
5. Probenentfernung. (Gesamtzeit 50 Minuten).

Beispiel

1. E. coli Stamm DH10B (Gibco/Bethesda Research Laboratories), die das Plasmid Bluescript mit 3,0 Kilobasenpaaren (Stratagene, San Diego, CA) enthalten, wurde in 50 ml Circle Grown Medium (Bio-101, San Marcos, CA) eingebracht, das 50 Mikrogramm/ml Ampicillin enthält, und in einem Rotationsschüttler 14 Stunden bei 37 ºC kultiviert.
2. Eine Kassette mit identischen Feldern mit den Abmessungen 0,71 x 0,89 x 3,30 cm (0,28 Zoll Breite x 0,35 Zoll Höhe x 1,3 Zoll Länge) wurde hergestellt, die 1 % Agarose (Amresco Type 1, Solon, Ohio) in 0,02 M Tris-acetate, 0,0005 M EDTA enthält, und mit einer Mikrokammer mit am vorgesehenen Ort befestigter Membran (Biodesign of New York, Carmel, New York). Die Dialysenmembran wurde 16 Stunden in sterilem Wasser eingeweicht und vor der Verwendung gespült.
3. Zu mehreren Probenmengen von 0,5 ml der obigen Bakterienkultur wurden 0,05 ml 10 %iges Triton X-100, 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA und 200 Mikrogramm/ml Rnase A (Amresco) zugegeben. Die Probe wurde auf einem Wirbelmischer gründlich vermischt und 2 Minuten stehen gelassen.
4. Zu den obigen 8 Mikrolitern wurden 10 mg/ml Proteinase K (Amresco) zugegeben und die Lösung gemischt und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert.
5. Identische Proben des obigen behandelten Lysats wurden in separate Probenvertiefungen der Gelkassette eingeladen und Fließpuffer (20 mM Tris-acetat, 0,0005 M EDTA pH 8,3) zum Elektrophoresegerät auf eine Höhe zugegeben, daß die Kassette gerade mit Puffer bedeckt ist.
6. 120 Volt Gleichspannung wurden 25 Minuten lang aufgebracht. Die Mikrokammer wurde nach unten geschoben und 120 Volt Gleichspannung für 30 Minuten fortgesetzt, um die abgetrennte DNA zu eluieren.
7. Fließpuffer wurde aus der Elektrophoresekammer 15 abgelassen, die Spannung abgeklemmt und die Proben gleichzeitig unter Verwendung einer Mehrkanalpipette mit 12 Spitzen entfernt und in Mikrotitervertiefungen pipettiert. Anmerkung: der Abstand der Felder, Probenkammern, Elutionskammern und Probenentnahmelöcher betrug von Mitte zu Mitte 0,89 cm (0,35 Zoll), daher konnte eine Standardmehrkanalpipette alle Proben zu einer Zeit entfernen.
8. Eine Hälfte der ungefähr 60 Mikroliter gereinigter DNA wurde mit Ladepuffer vermischt, der Glycerin und Farbstoff enthält und auf einem 1 %igen neutralen Agarosegel, das Ethidiumbromid enthält, aufgegeben. Das erhaltene Gel wurde mit einem Satz von DNA-Molekulargewichtsstandards verglichen (die Kilobasenleiter von Bethesda Research Labs). Die Ergebnisse zeigten, daß die Plasmid-DNA nahezu zu 100 % in Superspiralform vorliegt und praktisch frei ist von chromosomaler DNA und RNA. Die Ausbeute von 0,5 ml Bakterienkultur wird auf ungefähr 6 Mikrogramm geschätzt, das sind 12 Mikrogramm/ml Kultur. Wachstum der Kultur in 15 ml Kulturgläschen ergibt eine ähnliche Ausbeute wie bei Wachstum in Erlenmeyerkolben, vorausgesetzt, daß eine angemessene Durchmischung und Belüftung der Kultur erfolgt. Es wurde ebenso gefunden, daß Kultur in weniger reicher Brühe viel geringere Ausbeuten ergibt.
9. Ein Viertel der gereinigten DNA von oben wurde mit der Restriktionsendonuklease BamH1, Eco R1, Pvu II, Sal I und Hind III geschnitten und auf ein 1 %iges neutrales Agarosegel in 1X TAE Puffer mit Ethidiumbromid aufgegeben (siehe Figur 3b). Die Daten in dieser Figur zeigen, daß die DNA in der Form geschnitten werden kann, die direkt von der Probenkammer genommen wird, wobei Restriktionsenzyme wie typischerweise beim molekularen Klonen verwendet werden.
10. Ein Mikrogramm der verbliebenen DNA, die durch die obige Verfahrensweise gereinigt wurde, wurde einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen, unter Verwendung des Sequenase-Kits (Markenname) Version 2.0 von United States Biochemical (Cleveland, Ohio). 35-S Deoxyadenosintriphosphat wurde als radioaktiver Marker bei den Sequenzierungsreaktionen verwendet, die auf einem 6 %igen Polyacrylamidharnstoffgel (0,4 mm Dicke) bei 35 Watt konstantem Strom aufgelöst wurden. Das Gel wurde gemäß der Betriebsanleitung des Sequenase-Kits (Markenname) fixiert, getrocknet und mit Hyper Paper (Markenname) von Sequencing Film (Amersham, Arlington Heights, 111.) autoradiographiert. Das Ergebnis ist ein hochaufgelöstes Sequenzgel, das 210 Nukleotide mit ablesbarer Sequenz aus einer Ladung der Sequenzierungsreaktionen ergab.
11. Ein weiterer Teil der Plasmid-DNA aus der obigen Reaktion (ungefähr 1 Mikrogramm) wurde zum Seguenzieren in einen automatischen DNA-Sequenzanalysator von Applied Biosystems (Foster City, CA) Modell 373A gegeben. Das erhaltene maschinelle Ergebnis ermöglichte eine Leselänge von über 530 Nukleotiden mit ungefähr 10 unsicheren Signalen in der Sequenz. Daten nicht gezeigt. Dieses Resultat zeigt, daß die DNA für eine Sequenzierung auf einem automatischen Sequenzierungsgerät rein genug ist.
In Ergänzung zum obigen wurde ein Nanogramm gereinigte Plasmid-DNA in kompetente hochleistungsfähige E. coli transformiert, die von Bethesda Research Laboratories erworben wur den. Eine Kontrollplasmid-DNA (pBR322) wurde gleichzeitig transformiert. Es wurde das mit den kompetenten Zellen gelieferte Transformationsprotokoll verwendet. Das im Instrument gereinigte Bluescript-Plasmid ergab 8,2 x 10&sup5; Kolonien pro Nanogramm (8,2 x 10&sup8; Kolonien/Mikrogramm) an DNA, während die pBR322-DNA 1,2 x 10&sup6; Kolonien pro Nanogramm (1,2 x 10&sup9;) ergab. Die nach dem obigen Verfahren gereinigte Plasmid-DNA kann daher für die Transformation von hochleistungsfähigen E. coli verwendet werden.
Ein optisches Dichtespektrum wurde auf der obigen DNA gelesen, das ein Verhältnis O.D.&sub2;&sub6;&sub0;/O.D.&sub2;&sub8;&sub0; von 2,1 zeigt. Das Spektrenergebnis zeigt, daß die DNA so rein ist wie nach herkömmlichen Methoden isolierte.

Reinigung von Cosmid aus Kulturen von E. coli

Die Reinigung von Cosmiden mit 30 bis 45 Kilobasenpaaren aus Kulturen von E. coli wurden unter Anwendung der vorliegenden Erfindung in derselben Weise durchgeführt wie es oben beschrieben ist, wobei der Lysenpuffer verwendet wurde, mit der Ausnahme, daß die Trennungszeit auf 50 Minuten (oder ein Spannungsprogramm, das eine Migration der DNA mit 30 bis 45 kb nahezu durch das Trennungsgel bewirkt) und die Elutionszeit auf 30 bis 45 Minuten verlängert wurde. Die Herstellung von Cosmid-DNA unter Verwendung des oben beschriebenen Prototypinstruments wurden durchgeführt und die erhaltene DNA wies eine vergleichbare Reinheit auf wie die beschriebene Plasmid-DNA.
Reinigung von Genomid-DNA aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen
Die Reinigung von DNA mit hohem Molekulargewicht aus Bakterien- oder Säugerzellen unter Verwendung des Instruments gemäß der vorliegenden Erfindung wurde in derselben Weise wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Trennungszeit verlängert wurde, um zu bewirken, daß die DNA nahezu durch das Trennungsgel migriert, typischerweise 70 Minuten, und die Elutionszeit auf 30 bis 45 Minuten. Die Herstellung von Genom-DNA unter Verwendung des oben beschriebenen Prototypinstruments wurde durchgeführt und die erhaltene DNA mit vergleichbarer Reinheit wie die Plasmid-DNA beschrieben. Die Vorgehensweise zur Herstellung der Genom-DNA unterscheidet sich von der obigen Verfahrensweise darin, daß das Lysisprotokoll zur Anpassung an den Zelltyp, der lysiert wird, variiert werden muß. Für in Zellkultur gewachsene Säugerzellen ist der oder die obige(n) Lysenpuffer geeignet. Für andere Zellen, Gewebe, Hefen und die meisten Bakterien (außer E. coli) müssen alternative Vorgehensweisen angewendet werden, die üblicherweise zum Aufbrechen dieser Zellwandtypen verwendet werden.
Die Erfindung hier ist auch für die Reinigung anderer Arten von DNA anwendbar, einschließlich, aber nicht beschränkt auf M13 Phagen-DNA und Lambdaphagen-DNA.
Während die Erfindung mittels spezifischer Ausführungsformen erläutert und beschrieben wurde, ist anzumerken, daß zahlreiche Veränderungen und Modifikationen dazu vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Rahmen der Erfindung abzuweichen, wie er in den beigefügten Ansprüchen definiert ist. Die obige Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen enthält eine schriftliche Beschreibung der Erfindung und der Art und des Verfahrens zu ihrer Herstellung und Anwendung in so vollständiger, klarer und präziser Weise und in exakten Begriffen, daß jeder Fachmann des betreffenden Bereichs oder der am meisten damit zu tun hat, sie herstellen und nutzen kann und ferner ist die beste Weise die Erfindung auszuführen angegeben.

Claims

1. Vorrichtung (10) zur Reinigung von DNA und dergleichen umfassend:

ein Gehäuse, das eine Kammer (15) ausbildet, mit einem vorderen Ende (16) und einem hinteren Ende (18), zum Aufnehmen einer Pufferlösung;

Mittel (32, 40, 42, 48) zum Zirkulieren eines Puffers in der Kammer (15);

entfernbare Kassettenmittel (24), positionierbar in der Gehäusekammer (15) mit einem Einlaßende und einem Auslaßende und mit ersten Mitteln mit einem Gel zum Definieren eines ersten Weges, der sich zwischen dem Einlaßende und dem Auslaßende erstreckt, Einlaßmitteln an dem Einlaßende zum Einführen einer Bakterienprobe in den Weg an dessen Einlaßende, ein Auslaßmittel, das mit dem Gel am Auslaßende in Verbindung steht, und zweite Mittel selektiv positionierbar zum Definieren eines zweiten Weges, der sich von dem Auslaßmittel des ersten Weges über eine Elutionskammer (116) am Auslaßende zu einer Sammelkammer (122) erstreckt; und

Mittel (52, 56, 58, 60, 62, 64) zum selektiven Aufbringen eines elektrischen Potentials entlang jedes der Wege zum selektiven Bewegen eines Plasmids zuerst entlang des ersten Weges von der Bakterienprobe zur Schnittstelle des ersten Weges dann entlang des zweiten Weges zu einem Sammelfenster an dessen Ende.

2. Reinigungsvorrichtung nach Anspruch 1, worin:

das entfernbare Kassettenmittel (24) einen ersten Körper umfaßt, der aus einem nicht leitfähigen Material gebildet ist, mit in einem Abstand angeordneten unteren und oberen Platten (80, 82) zum Aufnehmen des Geis zum Definieren des ersten Weges, wobei das Einlaßmittel zum Einführen einer Probe am vorderen Ende eine Öffnung (88) in der oberen Platte (82) umfaßt; und

das zweite Mittel einen zweiten Körper (26) umfaßt mit einem Durchtritt, der die Elutionskammer (116) definiert, und mit einem Einlaß zur Verbindung mit dem Auslaßmittel und selektiv in und aus einer Position in Verbindung mit dem Auslaßmittel beweglich ist.

3. Reinigungsvorrichtung nach Anspruch 2, worin: das Einlaßmittel Mittel (90, 92, 94, 96) umfaßt, die sich vom Umgebungsbereich der Öffnung (88) nach oben erstrecken, um das Einlaßmittel zu definieren, wobei nach oben stehende Wände (106, 108, 110, 112) das Auslaßmittel umgeben, um eine Vertiefung zum Aufnehmen des zweiten Körpers (26) zu definieren.

4. Reinigungsvorrichtung nach Anspruch 3, worin der erste Körper (24) aus einer Vielzahl von ersten wegen (100) gebildet ist und der zweite Körper (26) mit einer Vielzahl von zweiten Wegen gebildet ist.

5. Reinigungsvorrichtung nach Anspruch 4, worin der erste Körper (24) eine allgemein rechteckige kastenartige Konfiguration aufweist und das Gel ein Elektrophoreseagarosegel ist.

6. Reinigungsvorrichtung nach Anspruch 1, worin das erste Mittel ein Körper (24) ist mit einer allgemein rechteckigen kastenartigen Konfiguration und gebildet ist aus einer Vielzahl von ersten Wegen (100) und das zweite Mittel ein Körper (26) ist mit einer Vielzahl von zweiten Wegen.

7. Reinigungsvorrichtung nach Anspruch 1, worin:

das entfernbare Kassettenmittel einen ersten Körper (24) umfaßt, der aus einem nicht leitenden Material mit in einem Abstand angeordneten oberen und unteren Platten (82, 80) gebildet ist, wobei eine Vielzahl von Trennwänden (98) zwischen den oberen und unteren Platten Kanäle zum Aufnehmen des Gels definieren und eine Vielzahl von ersten Wegen (100) definieren, wobei das Einlaßmittel zum Einführen einer Probe am Einlaßende eine Öffnung (88) in der oberen Platte (82) in jeden der Kanäle umfaßt; und

das zweite Mittel einen zweiten Körper (26) umfaßt mit einer Vielzahl von Durchtritten, die eine Vielzahl von Elutionskammern (116) definieren, deren jede einen Einlaß (120) zur Verbindung mit einem Auslaß der Kanäle aufweist, und der zweite Körper selektiv in eine Position in Verbindung mit dem Auslaßmittel bewegbar ist.

8. Reinigungsvorrichtung nach Anspruch 7, worin das Mittel zum selektiven Aufbringen eines elektrischen Potentials (52, 54, 56, 58, 60, 62, 64) entlang jedes Weges eine variable elektrische Stromquelle (56) umfaßt und Mittel zum selektiven Verändern des elektrischen Stroms (52).

9. Reinigungsvorrichtung nach Anspruch 8, worin das Regelungsmittel eine programmierbare Zentraleinheit (52) und Mittel (72) zum Programmieren der Zentraleinheit zur periodischen Einstellung des elektrischen Potentials aufweist.

10. Reinigungsvorrichtung nach Anspruch 1, worin das Mittel zum selektiven Aufbringen eines elektrischen Potentials (52, 54, 56, 58, 60, 62, 64) entlang jedes Weges eine variable elektrische Stromquelle (56) umfaßt und Mittel zum selektiven Verändern des elektrischen Stroms (52).

11. Verfahren zur Reinigung von DNA und dergleichen umfassend die Schritte:

Vorsehen eines Gehäuses mit Wänden (14, 16, 18), die eine Kammer (15) bilden mit einer Vorderseite (16) und einer Rückseite (18) zum Aufnehmen einer Pufferlösung; Vorsehen eines entfernbaren Kassettenmittels (24) mit einem Einlaßende mit Einlaßmitteln und einem Auslaßende mit Auslaßmitteln und einem Gel, das einen ersten Weg definiert, der sich vom Einlaß zum Auslaß erstreckt, und Elutionskammermittel mit einer Elutionskammer (116) und einer Sammelkammer (122), die in eine Position bewegbar ist, zum Definieren eines zweiten Weges, der den ersten Weg am Auslaß kreuzt;

Einführen einer Bakterienprobe in den Weg bei dem Einlaßmittel;

Zirkulieren eines Puffers in die Kammer (15) in Kontakt mit dem Gel; und

selektives Aufbringen eines elektrischen Potentials entlang jedes der Wege zum selektiven Bewegen eines Plasmids entlang des ersten Weges von der Bakterienprobe zum Auslaß, wobei das Elutionsmittel in eine Position bewegt wird, die den ersten Weg kreuzt, Aufbringen eines elektrischen Potentials entlang des zweiten Weges zum Bewegen des Plasmids entlang des zweiten Weges zum Sammelfenster an dessen Ende.

12. Reinigungsverfahren nach Anspruch 11, worin:

das entfembare Kassettenmittel (24) einen ersten Körper umfaßt, der aus einem nicht leitfähigen Material gebildet ist, mit in einem Abstand angeordneten oberen (82) und unteren (80) Platten, einer Vielzahl von Trennwänden zwischen den oberen (82) und unteren (80) Platten, die Kanäle definieren zum Aufnehmen des Gels und eine Vielzahl von ersten Wegen definieren, wobei das Einlaßmittel zum Einführen einer Probe am vorderen Ende eine Öffnung in der oberen Platte (82) in jeden der Kanäle umfaßt; und

das Elutionskammermittel einen zweiten Körper (26) umfaßt mit einer Vielzahl von Durchtritten, die eine Vielzahl von Elutionskammern (116) definieren, deren jede einen Einlaß zur Verbindung mit einem Auslaß der Kanäle aufweist.

13. Reinigungsverfahren nach Anspruch 12, worin das Aufbringen eines elektrischen Potentials entlang jedes der Wege durch Vorsehen einer variablen elektrische Stromquelle (56) und Regelmitteln (54) zum selektiven Verändern des elektrischen Stroms durchgeführt wird.

14. Reinigungsverfahren nach Anspruch 13, worin das Regelmittel (54) eine programmierbare Zentraleinheit und Mittel zum Programmieren der Zentraleinheit zum periodischen Einstellen des elektrischen Potentials umfaßt.