WO2002024949A1 - Procede d'analyse d'acide nucleique - Google Patents

Procede d'analyse d'acide nucleique Download PDF

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WO2002024949A1
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internal standard
extraction
detection
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PCT/JP2000/006526
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Shinichi Fukuzono
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Hitachi, Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a nucleic acid, and a kit for performing the method.
  • the method of the present invention includes an extraction step, a detection step, and, in some cases, an amplification step for a nucleic acid to be analyzed, and in each step, the number of internal standard nucleic acids that can be identified and detected from the nucleic acid to be analyzed is reduced.
  • At least one type is processed simultaneously with the nucleic acid to be analyzed, and the success or failure of each step is determined based on the detection result of the internal standard nucleic acid, and reanalysis is performed based on the determination result.
  • genes have been isolated and identified from living organisms and tissues for gene function analysis.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Science: Vol. 239, pp. 487-491 (1988) has been developed, and it is possible to isolate and detect genes with very low abundance. became.
  • human genome analysis is progressing rapidly, and attention has been focused on the association between gene mutations such as single nucleotide polymorphisms and diseases or drug responses.
  • Such polymorphisms are expected to be used not only in molecular biology and genetics but also in order-made therapy or medicine in the field of medical diagnosis.
  • a typical gene analysis step includes a step of extracting a nucleic acid to be analyzed from a sample and a detection step, and may further include a nucleic acid amplification step between the extraction step and the detection step.
  • a widely known method for extracting nucleic acids is a protein such as protease K.
  • Add white matter-degrading enzymes and detergents to break down cells and degrade proteins to release nucleic acids add phenolic nocroform and centrifuge to disperse the nucleic acid into the aqueous phase, and then collect water Solubilization of nucleic acids by adding ethanol, isopropanol, etc. to the phase, the so-called proteases K / pheno method, Molecular cloning: A Laooratory manual Appendix E3 to E4 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory ⁇ 1989) is there.
  • Methods used in the nucleic acid detection step include, for example, single-stranded DNA higher-order polymorphism (SSCP) using gel electrophoresis or restriction fragment length polymorphism. (RFLP), a single-stranded nucleic acid immobilized on a glass silicon wafer or various beads, and a microarray method, a DNA chip method, a bead array method for detecting hybridization with the target nucleic acid, a pi mouth sequencing method, One-by-one, mass spectrometry, and HPLC methods have been developed and widely used.
  • SSCP single-stranded DNA higher-order polymorphism
  • RFLP restriction fragment length polymorphism.
  • nucleic acid amplification methods include polymerase chain reaction (PCR) (US Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202), nucleic acid sequence-based amplification (NASB A) (European patents 0, 329) , 822) are known and used. Furthermore, nucleic acid quantification methods using competitive amplification or co-amplification are generally known. Have been.
  • PCR polymerase chain reaction
  • NNB A nucleic acid sequence-based amplification
  • nucleic acid quantification methods using competitive amplification or co-amplification are generally known. Have been.
  • Such conventional techniques mainly determine the amount of the target nucleic acid by simultaneously amplifying a certain amount of detectable nucleic acid at the same time as the nucleic acid to be analyzed by discriminating from the nucleic acid to be analyzed, which is generally referred to as an internal standard nucleic acid, in the nucleic acid amplification step. It is premised that nucleic acids to be analyzed are normally prepared (Tokuhei 8-107798, Tokuhyo 11-123095, Tokuhyo 11-506613). On the other hand, Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • 8-501222 describes a method for reflecting the extraction efficiency of the target nucleic acid in the extraction step and a method for detecting cross-contamination between samples, but it is essential to include a nucleic acid amplification step. Therefore, it was difficult to determine the success or failure of a series of nucleic acid analysis steps and / or in which step an abnormality occurred.
  • the present invention provides a method for assuring or improving the reliability of analysis results in nucleic acid analysis.
  • An object of the present invention is to provide a target nucleic acid analysis method. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a method for analyzing a nucleic acid to be analyzed and another step in a nucleic acid analysis method, which further comprises a step of extracting and detecting a nucleic acid to be analyzed, and optionally an amplification step between the extraction step and the detection step.
  • a nucleic acid analysis method which further comprises a step of extracting and detecting a nucleic acid to be analyzed, and optionally an amplification step between the extraction step and the detection step.
  • one or more types of internal standard nucleic acids that can be identified and detected from the internal standard nucleic acid to be detected are added to the sample, and then each step is performed in the same container as the target nucleic acid to detect nucleic acids.
  • a method for judging the success or failure of each step from the detection result of each internal standard nucleic acid in the step is provided.
  • the present invention provides a nucleic acid analysis method including a nucleic acid analysis target extraction step and a detection step, wherein the nucleic acid is extracted after adding one or more types of internal standard nucleic acids for extraction that can be identified and detected from the nucleic acid to be analyzed. And determining the success or failure of the extraction step from the detection result of the internal standard nucleic acid in the detection step.
  • a nucleic acid analysis method including a nucleic acid analysis target extraction step and a detection step, wherein the nucleic acid is extracted after adding one or more types of internal standard nucleic acids for extraction that can be identified and detected from the nucleic acid to be analyzed. And determining the success or failure of the extraction step from the detection result of the internal standard nucleic acid in the detection step.
  • the present invention relates to a nucleic acid analysis method including an extraction step and a detection step of a nucleic acid to be analyzed,
  • Performing the extraction step and the detection step after adding the nucleic acid to be analyzed and at least one kind of internal standard nucleic acid for extraction and the internal standard nucleic acid for detection, which are mutually distinguishable and detectable; and the internal standard nucleic acid obtained by the detection step Provided is a method for analyzing a nucleic acid, comprising determining the success or failure of an extraction step and a detection step from the detection results of the above.
  • the present invention relates to a nucleic acid analysis method including an extraction step, an amplification step and a detection step of a nucleic acid to be analyzed,
  • the present invention provides a nucleic acid analysis method comprising an extraction step and a detection step of a nucleic acid to be analyzed
  • step (b) After adding at least one or more types of internal standard nucleic acids for detection, which can be detected and distinguished from the nucleic acid to be analyzed and the internal standard nucleic acids for extraction, to the sample containing the nucleic acids extracted in the above step (a) A nucleic acid detection step of detecting nucleic acid, and
  • a nucleic acid analysis method is provided.
  • the present invention relates to a nucleic acid analysis method including an extraction step, an amplification step and a detection step of a nucleic acid to be analyzed, (a) A sample containing the nucleic acid to be analyzed can be amplified at the same time as the nucleic acid to be analyzed, but after adding at least one internal standard nucleic acid for extraction that can be identified and detected from the nucleic acid to be analyzed, the nucleic acid is added to the sample. Nucleic acid extraction step to be extracted,
  • the sample containing the nucleic acid extracted in the step (a) can be amplified simultaneously with the nucleic acid to be analyzed and the internal standard nucleic acid for extraction, but the nucleic acid to be analyzed and the internal standard nucleic acid for extraction
  • nucleic acid detection step of detecting the nucleic acid after adding the detection internal standard nucleic acid
  • a nucleic acid analysis method is provided.
  • the nucleic acid analysis method of the present invention is characterized in that the analysis is performed again from one of the steps based on the result of the success / failure determination of the extraction step, the amplification step, or the detection step.
  • a fixed amount of an internal standard nucleic acid for extraction having at least one base sequence different from that of the nucleic acid to be analyzed is added to the sample containing the nucleic acid to be analyzed, and then the nucleic acid extraction step is performed.
  • a known amount of the internal standard nucleic acid for extraction is added to the obtained nucleic acid extract by adding a certain amount of the internal standard nucleic acid for detection having at least one base sequence different from that of the extracted nucleic acid, and then discriminating and detecting nucleic acids having one or more base sequence difference A nucleic acid detection step is performed.
  • the success or failure of each process is determined as shown in Fig. 1, and reanalysis is determined based on the determination results.
  • Case 3 (When the detection result of the internal standard nucleic acid for extraction is abnormal or not detected, and the detection result of the internal standard nucleic acid for detection is normal): It is considered that the nucleic acid extraction process was not performed normally, and the Judge and execute again from "Re-execution 1" shown in Fig. 2. In particular, when no nucleic acid to be analyzed is detected, the possibility of false negative is considered to be extremely high. Further, when the nucleic acid to be analyzed is detected in the sample to be analyzed, the mechanism of adding the internal standard nucleic acid for extraction and the internal standard nucleic acid for extraction may be abnormal. Replace or check the addition mechanism of the internal standard nucleic acid for extraction, or perform both of them, and repeat from “Re-execution 1” shown in FIG.
  • the nucleic acid extraction step used in the present invention includes the above-described protease K-phenol method, a method utilizing the characteristic of nucleic acid adsorption to a solid phase, such as magnetic silica particles, silica particles, silica fibers or filters, and the like.
  • a known method such as a nucleic acid extraction method using a spin column or a microplate or the like can be used as appropriate, but is not particularly limited thereto.
  • known methods include single-stranded DNA higher-order structure polymorphism (SSCP) or restriction fragment length polymorphism (RFLP) using gel electrophoresis, microarray method, DNA Chip method, bead array method, pi-mouth sequence method, incubator method, mass spectrometry method, HPLC method, etc. are available as long as they can identify and detect nucleic acids having at least one base sequence or more.
  • the detection signal of the internal standard nucleic acid for extraction or the internal standard nucleic acid for detection may be used for various data processing such as determination of the success or failure of each step, quantification of the target nucleic acid, base length measurement or correction of the detection signal. It is also possible.
  • the nucleic acid detection step includes a pretreatment of a sample necessary for nucleic acid detection, for example, a heat modification treatment, various labeling treatments, a solvent exchange, and the like.
  • a pretreatment of a sample necessary for nucleic acid detection for example, a heat modification treatment, various labeling treatments, a solvent exchange, and the like.
  • the addition of the internal standard nucleic acid for detection to the nucleic acid extract is not necessary. It is desirable to be performed before processing.
  • a sample containing the nucleic acid to be analyzed can be amplified simultaneously with the nucleic acid to be analyzed,
  • a nucleic acid extraction step is performed by adding one or more kinds of internal standard nucleic acids for extraction, each having a sequence different from each other by at least one base.
  • amplification can be performed at the same time as the nucleic acid to be analyzed, but a certain amount of amplification that differs from the nucleic acid to be analyzed and the internal standard nucleic acid for extraction by at least one base or more.
  • One or more kinds of internal standard nucleic acids are added to the obtained nucleic acid extract, and then a nucleic acid amplification step is performed. Next, at least one kind of a certain amount of a detection internal standard nucleic acid having a sequence different from the nucleic acid to be analyzed, the extraction internal standard nucleic acid, and the amplification internal standard nucleic acid by at least one base is added to the obtained nucleic acid amplification product. Thereafter, a known nucleic acid detection step capable of discriminating and detecting a nucleic acid having one or more bases different in sequence is carried out. ⁇
  • the success or failure of each step is determined in the same manner as described above, and reanalysis is determined based on the determination result. Also, by simultaneously processing a blank (control sample) containing no nucleic acid to be analyzed with the nucleic acid to be analyzed, false positives due to contamination can be monitored and used for determination of reanalysis. In this case, contamination occurs when the target nucleic acid is detected in the blank, and it is necessary to perform the analysis again after the washing operation regardless of the results of the internal standard nucleic acid for extraction and the internal standard nucleic acid for detection. .
  • PCR polymerase chain reaction
  • NASBA nucleic acid sequence standard amplification
  • the amounts of the internal standard nucleic acid for extraction and the internal standard nucleic acid for amplification that are amplified simultaneously with the nucleic acid to be analyzed can be made small compared to the internal standard nucleic acid for detection, but it is preferable. Relative ratios differ and are not specified depending on the amplification and detection methods used.
  • the nucleic acid analysis operation of the nucleic acid to be analyzed is determined to be “successful”.
  • nucleic acid to be analyzed If the nucleic acid to be analyzed is not detected as a blank, it is highly likely that the nucleic acid analysis operation for the nucleic acid to be analyzed was performed normally. There is a possibility that the nucleic acid addition mechanism is abnormal. Therefore, the internal standard nucleic acid for amplification is replaced, or the addition mechanism of the internal standard nucleic acid for amplification is checked, or both are performed, and the process is performed again from “re-execution 2” shown in FIG.
  • the nucleic acid to be analyzed is not detected as a blank, it is highly likely that the nucleic acid analysis operation on the nucleic acid to be analyzed was performed normally.
  • the internal standard nucleic acid for amplification and / or the internal standard nucleic acid for amplification There is a possibility that the addition mechanism and the addition mechanism of the internal standard nucleic acid for detection and the internal standard nucleic acid for detection or the internal standard nucleic acid for detection may be abnormal. Therefore, the addition mechanism of the internal standard nucleic acid for amplification and Z or the internal standard nucleic acid for amplification and the addition mechanism for the internal standard nucleic acid for detection and / or the internal standard nucleic acid for detection are exchanged or inspected. Re-execute from “Re-execute 2” shown in 2.
  • the extraction internal standard There is a possibility that the addition mechanism of the nucleic acid and / or the internal standard nucleic acid for extraction is abnormal, and the exchange of the internal standard nucleic acid for extraction is checked, or the addition mechanism of the internal standard nucleic acid for extraction is checked, or both are checked. And re-execute from “Re-execution 1” shown in Figure 2.
  • the mechanism for adding the internal standard nucleic acid for extraction and / or the internal standard nucleic acid for extraction and the addition of the internal standard nucleic acid for detection and z or the internal standard nucleic acid for detection There is a possibility that the mechanism may be abnormal.
  • Case 7 (When the detection result of the internal standard nucleic acid for extraction and the internal standard nucleic acid for amplification is abnormal or undetected, and the detection result of the internal standard nucleic acid for detection is normal): The amplification step and the nucleic acid extraction step It was not performed normally, and it was judged as “extracted amplification failure”, and the process was repeated from “Re-execution 1J” shown in Fig. 2. If the nucleic acid to be analyzed was detected in the sample to be analyzed, the internal standard nucleic acid for the extraction was used. And / or the mechanism for adding the internal standard nucleic acid for extraction and the mechanism for adding the internal standard nucleic acid for amplification and Z or the internal standard nucleic acid for amplification may be abnormal.
  • the internal standard nucleic acid is added in a fixed amount, that is, at a known concentration, various data processing such as quantification of the target nucleic acid and base length measurement / correction of the detection signal are performed based on the amount of the detection signal of the internal standard nucleic acid. It is possible to do.
  • a method including a primer sequence identical to the nucleic acid to be analyzed, which is widely known as a common primer pair, is included in the internal standard nucleic acid.
  • a primer sequence identical to the nucleic acid to be analyzed which is widely known as a common primer pair
  • the present invention can be practiced using a plurality of independent individual primer pairs.
  • the nucleotide sequence of the internal standard nucleic acid must differ from the target nucleic acid by at least one base.However, when the amplification step is included or when a DNA chip using hybridization is used for the detection step, the target nucleic acid differs from the target nucleic acid. The higher the similarity, the easier it is for the amplification efficiency and the coupling efficiency to become the same, so that the reproducibility is excellent and it is suitable.
  • the present invention also provides a kit for performing the above-described nucleic acid analysis method of the present invention
  • a detection reagent containing the internal standard nucleic acid for detection and Z or the internal standard nucleic acid for detection Provide a kit characterized by including:
  • the present invention further provides a kit for performing the above nucleic acid analysis method
  • each internal standard nucleic acid may be included alone in the kit, or may be included together with other reagents required in each step, such as a solvent, a labeling reagent, and a primer. good.
  • reagents such as a solvent, a labeling reagent, and a primer. good.
  • Each component that can be included in the reagent can be easily recognized by those skilled in the art, and is not particularly limited.
  • the internal standard nucleic acid for extraction is a fixed amount of nucleic acid having a sequence different from the nucleic acid to be analyzed by at least one base
  • the internal standard nucleic acid for detection is It is characterized in that each of the internal standard nucleic acids for use is a certain amount of nucleic acid having a sequence different from at least one base.
  • the kit includes an amplification internal standard nucleic acid and an amplification reagent containing an internal standard nucleic acid for amplification or amplification
  • the internal standard nucleic acid for extraction can be amplified simultaneously with the nucleic acid to be analyzed.
  • a certain amount of nucleic acid having a sequence at least one base or more different from the nucleic acid to be analyzed, and the internal standard nucleic acid for amplification can be simultaneously amplified with the nucleic acid to be analyzed, but the nucleic acid to be analyzed and the internal standard nucleic acid for extraction At least one nucleotide whose sequence differs by at least one base, and wherein the internal standard nucleic acid for detection is at least one base relative to each of the nucleic acid to be analyzed, the internal standard nucleic acid for extraction, and the internal standard nucleic acid for amplification. It is characterized by a certain amount of nucleic acid having a different upper sequence.
  • the nucleic acid analysis method of the present invention is carried out using the kit of the present invention, it is possible to use a detection method capable of discriminating a nucleic acid having a sequence different from one or more bases. From the detection results of the standard nucleic acid, it becomes possible to perform various data processing such as quantification of the nucleic acid to be analyzed, base length measurement, and correction of the detection signal.
  • FIG. 1 shows a success / failure determination table for each step in the method of the present invention including an extraction step and a detection step.
  • FIG. 2 shows a flowchart of the nucleic acid analysis method of the present invention.
  • FIG. 3 shows a success / failure determination table of each step in the method of the present invention including an extraction step, an amplification step, and a detection step.
  • FIG. 4 shows an example of the internal standard nucleic acid for extraction and the internal standard nucleic acid for detection of the present invention.
  • FIG. 5 shows an example of the internal standard nucleic acid for extraction, the internal standard nucleic acid for amplification, and the internal standard nucleic acid for detection of the present invention.
  • FIG. 6 shows an example of a detection result in the method of the present invention which is performed to detect a single-stranded DNA higher-order structural polymorphism using gel electrophoresis in the detection step of the present invention.
  • FIG. 7 shows an example showing, as a quantitative analysis, a detection result in the method of the present invention using a DNA chip in the detection step.
  • FIG. 8 shows an example of data processing for detecting a single-stranded DNA higher-order structural polymorphism using gel electrophoresis in the detection step in the method of the present invention.
  • FIG. 2 shows a flowchart illustrating an embodiment of the present invention.
  • samples containing nucleic acids to be analyzed such as human blood or other body fluids, tissues or cells, bacteria, viruses, etc.
  • Extraction test containing internal standard nucleic acid for extraction and Z or internal standard nucleic acid for extraction After the drug is added to the sample, a step of simultaneously extracting the nucleic acid to be analyzed and the internal standard nucleic acid for extraction is performed,
  • the nucleic acid to be analyzed, the internal standard nucleic acid for extraction, and the internal standard nucleic acid for detection are respectively identified. Then, the success or failure of each step is determined in accordance with the above-mentioned case from the detection result of each internal standard nucleic acid, and the re-execution is performed from the extraction step or the nucleic acid detection step based on the determination result.
  • a step of simultaneously amplifying the nucleic acid to be analyzed, the internal standard nucleic acid for extraction, and the internal standard nucleic acid for amplification is performed.
  • the nucleic acid to be analyzed After adding an internal standard nucleic acid for detection and / or a detection reagent containing the internal standard nucleic acid for detection to the amplified nucleic acid, the nucleic acid to be analyzed, the internal standard nucleic acid for extraction, the internal standard nucleic acid for detection, and the internal standard nucleic acid for amplification are added. Implement the process of identifying and detecting
  • each step is determined from the detection results of each internal standard nucleic acid according to the above-mentioned case, and the extraction step, amplification step, or detection step is performed again based on the determination results.
  • FIG. 4 shows an example of the internal standard nucleic acid used in the present invention. Specifically, a fixed amount of an internal standard nucleic acid for extraction having a sequence different from the nucleic acid to be analyzed by at least one base is added to a sample containing the nucleic acid to be analyzed, and then the nucleic acid extraction step is performed. A certain amount of the internal standard nucleic acid for detection, which differs from the internal standard nucleic acid for extraction by at least one base, is added to the obtained nucleic acid extract. It is an example of the internal standard nucleic acid used at the time of carrying out the output step.
  • the nucleotide length of the nucleic acid to be analyzed, the internal standard nucleic acid for extraction, and the internal standard nucleic acid for detection are the same, and the thymine (T) at a specific position in the nucleotide sequence of the nucleic acid to be analyzed is adenine (A);
  • the nucleic acid was used as an internal standard nucleic acid for detection (IC for detection).
  • the extraction IC and the detection IC are nucleic acids having base sequences that differ by two bases, and are detected as different signals by a detector capable of discriminating and detecting one or more bases having different sequences.
  • FIG. 5 shows an example of an internal standard nucleic acid used in a nucleic acid analysis method including a nucleic acid amplification step between the extraction step and the detection step.
  • the method of the present invention can amplify simultaneously with the nucleic acid to be analyzed, but a certain amount of the internal standard nucleic acid for extraction is different from the nucleic acid to be analyzed by at least one base or more. And then perform a nucleic acid extraction step.
  • a certain amount of the internal standard nucleic acid for amplification which can be amplified simultaneously with the nucleic acid to be analyzed and differs from the nucleic acid to be analyzed and the internal standard nucleic acid for extraction by at least one base, is added to the obtained nucleic acid extract. Then, a nucleic acid amplification step is performed. Then, a certain amount of the internal standard nucleic acid for detection, which differs from the nucleic acid to be analyzed, the internal standard nucleic acid for extraction, and the internal standard nucleic acid for amplification by at least one nucleotide, is added to the obtained nucleic acid amplification product, and then one or more nucleotides are added.
  • a nucleic acid detection step capable of discriminating and detecting nucleic acids having different sequences is performed. Furthermore, in the amplification step, a method was used in which the internal standard nucleic acid includes a primer sequence identical to the nucleic acid to be analyzed, which is widely known as a means for amplifying the internal standard nucleic acid simultaneously with the target nucleic acid, which is known as a common primer pair. It is an example.
  • a nucleic acid having a base sequence in which T at a specific position in the nucleic acid base sequence to be analyzed is different from A by one base is defined as an internal standard nucleic acid for extraction (IC for extraction), and A nucleic acid having a base sequence in which A at another specific position differs from C by one base is defined as an internal standard nucleic acid for amplification (IC for amplification), A nucleic acid having a base sequence in which C at another specific position in the nucleic acid base sequence to be analyzed differs from A by one base is defined as an internal standard nucleic acid for detection (IC for detection).
  • the extraction IC, the amplification IC, and the detection IC each have a nucleic acid having a base sequence different from each other by two bases, and different signals are detected by a detector capable of discriminating and detecting a nucleic acid having one or more bases different in sequence.
  • a detector capable of discriminating and detecting a nucleic acid having one or more bases different in sequence.
  • the primer—region A and primer region B present on both sides of the region having a difference in the nucleotide sequence described above have the same nucleotide sequence as the nucleic acid to be analyzed and each internal standard nucleic acid, so that one kind of primer pair Can amplify each base sequence.
  • FIG. 6 shows an example of the results obtained when the nucleic acid analysis method of the present invention is performed.
  • Figure 6 shows that the sample containing the nucleic acid to be analyzed has a certain amount of the internal standard nucleic acid for extraction, which differs in sequence by at least one base from the nucleic acid to be analyzed, and that the nucleic acid to be analyzed and the internal standard nucleic acid for extraction have at least one base or more.
  • Single-stranded DNA higher-order structural polymorphism using gel electrophoresis as a nucleic acid detection process that can identify and detect nucleic acids with one or more base sequences using different fixed amounts of internal standard nucleic acid for detection
  • the extraction IC, the target nucleic acid, and the detection IC each have a predetermined peak intensity, and an example of the chromatogram when the analysis process is performed normally. It is.
  • the case of “abnormal 1” is an example of case 3 shown in FIG.
  • the fluorescence peak of the extraction IC is extremely small and the extraction IC is abnormal, and the fluorescence peak of the detection IC shows the same fluorescence intensity at the same detection time as in the normal case, so it is normal. Therefore, it is determined that the extraction is defective, and re-execution 1 shown in Fig. 2 is performed.
  • the case of “abnormal 2” is an example of case 4 shown in FIG.
  • the fluorescence peaks of extraction I and detection IC broaden, and extraction IC and detection IC are not undetected but abnormal.
  • the fluorescence of the nucleic acid to be analyzed is Since the peak is also broadened, it is considered that the ability to separate nucleic acids by electrophoresis has been reduced.
  • FIG. 7 shows an example of the results obtained when the nucleic acid analysis method of the present invention is performed using a DNA chip. Specifically, it can be amplified at the same time as the nucleic acid to be analyzed, but can be amplified at the same time as a certain amount of the internal standard nucleic acid for extraction and the nucleic acid to be analyzed, the sequence of which differs from the nucleic acid to be analyzed by at least one base or more.
  • a certain amount of the internal standard nucleic acid for amplification which differs in sequence by at least one base from the nucleic acid to be analyzed and the internal standard nucleic acid for extraction, and at least one base from the nucleic acid to be analyzed, the internal standard nucleic acid for extraction, and the internal standard nucleic acid for amplification
  • a DNA chip is implemented as a nucleic acid detection step capable of discriminating and detecting a nucleic acid having one or more bases different in sequence by using a certain amount of an internal standard nucleic acid for detection having a different sequence.
  • Probes containing base sequences complementary to the extraction IC 1, the extraction IC 2, the extraction IC 3, the amplification IC, the detection IC, and the target nucleic acid A are immobilized on the DNA chip, respectively.
  • extraction IC1, extraction IC2, extraction IC3, amplification IC, detection IC and target nucleic acid A, each labeled with a fluorescent dye were hybridized, and the fluorescence spectrum was measured. Tol was detected with a measurable DNA chip reader.
  • the case of “normal” indicates that the peak intensity (0.5, 1.0) for the extraction IC1, extraction IC2, extraction IC3, amplification IC, and detection IC is shown in the table. Or 1.5) was obtained, and the analysis process was performed successfully. Furthermore, when quantifying the target nucleic acid based on the detection signal amount of the internal standard nucleic acid, the nucleic acid concentration is determined based on the fluorescence intensity of the extraction IC1, the extraction IC2, and the extraction IC3 and the known nucleic acid amount. A calibration curve is prepared, and the amount of the target nucleic acid can be determined to be 2.4 ng based on the fluorescence intensity of the target nucleic acid A.
  • the case of “abnormal” is an example shown in case 5 of FIG.
  • the fluorescence intensity of each of the extraction IC 1, the extraction IC 2, and the extraction IC 3 is 0.1, which is lower than the predetermined fluorescence intensity of 0.5, 1.0, or 1.5, respectively, and the extraction IC is abnormal.
  • Other amplification ICs and detection ICs The fluorescence peak is normal because it shows the same intensity as the predetermined fluorescence intensity
  • FIG. 8 shows an example of data processing in which the detection signal is corrected based on the detection signal amount of each internal standard nucleic acid. Similar to Fig. 6, this is an example of an electrophoresis micrograph of SSCP using a capillary electrophoresis apparatus as a nucleic acid detection step capable of discriminating and detecting nucleic acids having one or more bases different in sequence.
  • the chromatogram shown before the data processing shows a difference in the detection time of the internal nucleic acid in each lane.
  • the chromatogram corrected so that the extraction ICs or detection ICs in each lane have the same detection time is the result of the closed mouth mattogram after data processing. is there.

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Description

明 細 書 核酸解析方法 技術分野
本発明は核酸の核酸解析方法、 及び該方法を実施するためのキッ トに 関する。 詳細には、 本発明の方法は、 解析対象核酸の抽出工程、 及び検 出工程、 場合によっては更に増幅工程を含み、 それぞれ各工程において 解析対象核酸と識別して検出可能な内部標準核酸を少なく とも一種類 以上、 解析対象核酸と同時に処理し、 該内部標準核酸の検出結果から、 各工程の成否を判定し、 さらには該判定結果に基づき再解析を実施する
背景技術
生物試料から遺伝子を単離し解析することは、 分子生物学的研究にと つて非常に有効な手段であるばかリでなく、 医療分野においても盛んに 利用されつつある。 これまでにも遺伝子機能解析のため多くの遺伝子が 生物個体、 組織から単離、 同定されている。 また遺伝子増幅法として、 ポリメラーゼ · チェイン · リアクション（PCR)法（Science :Vol.239、 pp . 487-491(1988))が開発され、 存在量が非常に少ない遺伝子の単離や検出 が可能となった。 さらに、 ヒ トゲノム解析が急速に進展し、 一塩基多型 など遺伝子の変異と疾病または薬剤反応との関連付けが注目されてい る。 このような遺伝子多型は分子生物学や遺伝学に留まらず、 医学診断 分野におけるオーダ一メイ ド治療または投薬での利用が期待されてい る。
代表的な遺伝子の解析工程は、 試料からの解析対象核酸の抽出工程及 び検出工程から構成され、 さらに該抽出工程と該検出工程の間に核酸増 幅工程を含む場合もある。
核酸の抽出方法として広く知られているのは、 プロテア一ゼ K等の蛋 白質分解酵素や界面活性剤を加えて細胞を破壊および蛋白質を分解し て核酸を遊離させ、 フエノールノクロ口ホルムを添加し、 遠心分離で核 酸を水相に分配させた後、 分取した水相にエタノールやイソプロパノ一 ル等を添加して核酸を不溶化させる、 いわゆるプロテア一ゼ K/フエノ 一ノレ法 、 Molecular cloning ： A Laooratory manual Appendix E3 〜E4(New York ： Cold Spring Harbor Laboratory ^ 1989)である。 し かし、 本法は遠心分離を含むなど自動化には必ずしも適してはおらず、 このような問題に対して、 核酸の固体相への吸着特性を利用した方法が提案され ており、 例えばカオトロピック塩の存在下で核酸がガラスに結合することが、 プ ロシ一ディング ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス ·ォブ ·ザ • ユーエスエイ、 第 7 6巻、 6 1 5〜 6 1 9頁 （1 979年） （P r o c . N a t 1. Ac a d. S c i . U SA7 6、 6 1 5 - 6 1 9 ( 1 9 79) ) に記載さ れている。 この核酸がある条件下において珪素酸化物 （シリカ） に結合する特性 を応用して、 磁性シリカ粒子、 シリカ粒子、 シリカ繊維またはフィルタ一、 およ びこれらを含むスピンカラムまたはマイクロプレートなどによる核酸抽出キット や核酸抽出自動化装置が開示 （特表平 1 0— 504834、 特表平 9一 50 57 24、 特開平 8— 320274、 特開平 9— 304385、 特公 2807 0 90 ) されている。
核酸検出工程に用いられる方法、 特に一塩基以上の配列が異なる核酸 を検出する方法としては、 例えばゲル電気泳動を用いた一本鎖 DNA高 次構造多型 （SSCP) または制限酵素断片長多型 （RFLP)、 ガラスゃシ リ コンウェハまたは各種ビーズに一本鎖核酸を固定化し、 対象核酸との ハイブリダイゼ一シヨンを検出するマイクロアレイ法、 DNAチップ法、 ビーズアレイ'法さらにパイ口シーケンス法、 インべ一ダ一法、 質量分析 法、 HPLC法などが、 開発され広く利用されている。
核酸増幅方法としては、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) (米国特許 4 6 8 3 1 9 5号および 4 6 8 3 2 0 2号） 、 核酸配列基準増幅 （NASB A) (欧州特許 0、 3 2 9、 8 2 2号） などが公知であり利用されてい る。 さらに、 競合増幅または共増幅を利用した核酸の定量法が一般に知 られている。 この方法では、 解析対象核酸と同一のプライマ一と反応す る数種類の内部標準核酸を同一容器内で増幅反応させ、 既知量の該内部 標準核酸を基準に対象核酸量を定量するものである （特表平 8-107798 、 特表平 8-501222、 特表平 11- 123095、 特表平 11-506613) 。
かかる従来技術は主に核酸増幅工程に内部標準核酸などと一般に称 される解析対象核酸とは識別して検出可能な一定量の核酸を解析対象 核酸と同時に増幅することによる、 対象核酸量の定量に専ら利用されて おり、 あく までも解析対象核酸が正常に準備されていることを前提とし ている （特表平 8- 107798、 特表平 11- 123095、 特表平 11-506613) 。 一 方、 特表平 8-501222では抽出工程における対象核酸の抽出効率を反映 させる方法や試料間の相互汚染を検出する方法が記載されているが、 核 酸増幅工程を含むことが必須であリ、 一連の核酸解析工程全体の成否お よび/またはどの工程で異常が生じたかを判定することは困難であった したがって、 本発明は核酸の解析において、 解析結果の信頼性の保証 または向上を目的とした核酸解析方法を提供することを目的とする。 発明の開示
本発明は、 解析対象核酸の抽出工程、 及び検出工程、 場合によっては 該抽出工程と該検出工程の間に更に増幅工程を含む、 核酸解析方法にお いて、 解析対象核酸および他の工程で使用される内部標準核酸とは識別 して検出可能な一種類以上の内部標準核酸をそれぞれ各工程の実施前 に試料に添加した後、 対象核酸と同一容器内で各工程を実施し、 核酸検 出工程における各内部標準核酸の検出結果から各工程の成否を判定す る方法を提供する。
すなわち、 本発明は、 解析対象核酸の抽出工程及び検出工程を含む核酸 解析方法において、 解析対象核酸と識別して検出可能な 1種類以上の抽出 用内部標準核酸を添加した後に核酸を抽出すること、 及び上記検出工程に よる上記内部標準核酸の検出結果から抽出工程の成否を判定することを含 む、 核酸解析方法を提供する。
更に本発明は、 解析対象核酸の抽出工程及び検出工程を含む核酸解析方 法において、
解析対象核酸及び相互に識別して検出可能な 1種類以上の抽出用内部標準 核酸及び検出用内部標準核酸を添加した後に上記抽出工程及び検出工程を 行うこと、 そして上記検出工程による上記内部標準核酸の検出結果から抽 出工程及び検出工程の成否を判定することを含む、 核酸解析方法を提供す る。
更にまた本発明は、 解析対象核酸の抽出工程、 増幅工程及び検出工程を 含む核酸解析方法において、
解析対象核酸及び相互に識別して検出可能な 1種類以上の抽出用内部標準 核酸、 増幅用内部標準核酸及び検出用内部標準核酸を添加した後に上記抽 出工程及び検出工程を行うこと、 そして上記検出工程による上記内部標準 核酸の検出結果から抽出工程及び検出工程の成否を判定することを含む、 核酸解析方法を提供する。
また、 本発明は、 解析対象核酸の抽出工程及び検出工程を含む核酸解 析方法において、
( a )解析対象核酸を含有する試料に、 該解析対象核酸と識別して検出 可能な 1種類以上の抽出用内部標準核酸を添加した後に核酸を抽出す る核酸抽出工程、
( b ) 上記工程 （ a ) において抽出された核酸を含有する試料に、 上記 解析対象核酸及び抽出用内部標準核酸と識別して検出可能な 1種類以 上の検出用内部標準核酸を添加した後に核酸を検出する核酸検出工程 、 及び
( c )核酸検出工程における上記の各内部標準核酸の検出結果から上記 各工程の成否を判定する工程、
を含むことを特徴とする、 核酸解析方法を提供する。
また、 本発明は、 解析対象核酸の抽出工程、 増幅工程及び検出工程を 含む核酸解析方法において、 ( a )解析対象核酸を含有する試料に、 解析対象核酸と同時に増幅可能 であるが、 該解析対象核酸と識別して検出可能な 1種類以上の抽出用内 部標準核酸を添加した後に核酸を抽出する核酸抽出工程、
( b ) 上記工程 （ a ) において抽出された核酸を含有する試料に、 上記 解析対象核酸及び上記抽出用内部標準核酸と同時に増幅可能であるが 、 上記解析対象核酸及び上記抽出用内部標準核酸と識別して検出可能な 1種類以上の増幅用内部標準核酸を添加した後に核酸を増幅する核酸 増幅工程、
( c ) 上記工程 （ b ) において増幅された核酸を含有する試料に、 上記 解析対象核酸、 抽出用内部標準核酸、 及び検出用内部標準核酸のいずれ とも互いに識別して検出可能な 1種類以上の検出用内部標準核酸を添 加した後に核酸を検出する核酸検出工程、 及び
( d )核酸検出工程における上記の各内部標準核酸の検出結果から上記 各工程の成否を判定する工程、
を含むことを特徴とする、 核酸解析方法を提供する。
さらに、 本発明の核酸解析方法は、 前記抽出工程、 増幅工程または検 出工程の成否判定結果に基づき、 再度いずれかの工程から解析を実施す ることを特徴とする。
さらに、 具体的には解析対象核酸を含む試料に解析対象核酸とは少な く とも一塩基以上配列の異なる一定量の抽出用内部標準核酸を添加し 、 その後核酸抽出工程を実施し、 解析対象核酸及び抽出用内部標準核酸 とは少なく とも一塩基以上配列の異なる一定量の検出用内部標準核酸 を得られた核酸抽出物に添加し、 その後一塩基以上配列の異なる核酸を 識別検出可能な公知の核酸検出工程を実施する。 その結果、 図 1 に示す ように各工程の成否を判定し、 さらには該判定結果に基づき再解析を決 定する。 また、 対象核酸を全く含まない試料 （ブランク） を対象試料と 同時処理することにより、 試料の汚染 （コンタミ） による偽陽性を監視 し、 再解析の判定に利用することもできる。 この場合、 ブランクで対象 核酸が検出された場合はコンタミを生じており、 抽出用内部標準核酸お よび検出用内部標準核酸の検出結果に係らず、 除洗作業後再度、 解析を やり直す。
以下、 抽出用内部標準核酸及び検出用内部標準核酸の検出結果が正常 であった場合及び正常でなかった場合の判定、 及び正常でなかった場合 に再実施の必要な工程について、 図 1 を参照しながら説明する。
ケース 1 (抽出用内部標準核酸及び検出用内部標準核酸の検出結果が 共に正常の場合） ： 各工程は正常に実施され、 解析対象核酸の核酸解析 操作は、 「成功」 と判定する。
ケース 2 (抽出用内部標準核酸の検出結果が正常で、 検出用内部標準 核酸の検出結果が異常又は未検出の場合） ：解析対象核酸がブランクで 検出されなかった場合、 解析対象核酸の核酸解析操作は正常に実施され た可能性が高いと考えられるが、 該検出用内部標準核酸及び/又は該検 出用内部標準核酸の添加機構が異常である可能性があり、 「保留」 と判 定する。 したがって、 該検出用内部標準核酸を交換するか、 該検出用内 部標準核酸の添加機構を点検し、 あるいはその双方を行い、 図 2に示す 「再実施 3」 から再度実施する。
ケース 3 (抽出用内部標準核酸の検出結果が異常又は未検出で、 検出 用内部標準核酸の検出結果が正常の場合） ：核酸抽出工程が正常に実施 されなかったと考えられ、 「抽出不良」 と判定し、 図 2に示す 「再実施 1」 から再度実施する。 特に、 解析対象核酸が検出されなかった場合、 偽陰性の可能性が極めて高いと考えられる。 また、 解析対象核酸が解析 対象試料で検出された場合、 該抽出用内部標準核酸及びノ又は該抽出用 内部標準核酸の添加機構が異常である可能性があリ、 該抽出用内部標準 核酸を交換するか、 該抽出用内部標準核酸の添加機構を点検し、 あるい はその双方を行い、 図 2に示す 「再実施 1」 から再度実施する。
ケース 4 (抽出用内部標準核酸及び検出用内部標準核酸の検出結果が 共に異常又は未検出の場合） ： 抽出用内部核酸及び検出用内部標準核酸 が共に未検出の場合、 核酸抽出工程および核酸検出工程が正常に実施さ れなかったと考えられ、 「不良」 と判定し、 図 2に示す 「再実施 1」 か ら再度実施する。 抽出用内部核酸が未検出ではない異常の場合、 核酸検 出工程が正常に実施されなかったと考えられ、 「不良」 と判定し、 図 2 に示す 「再実施 3」 から再度実施する。 この再実施において 「成功」 の 判定ができない場合は 「再実施 1」 から再度実施する。
さらに、 ケース 2〜 4において、 再実施後、 ケース 1の 「成功」 と判 定できない場合は、 その判定結果に基づいて再実施を繰リ返す。
本発明に用いられる核酸抽出工程には、 上記プロテア一ゼ Kノフエノ —ル法、 核酸の固体相への吸着特性を利用した方法、 例えば磁性シリカ粒子、 シリカ粒子、 シリカ繊維またはフィルタ一、 およびこれらを含むスピンカラムま たはマイクロプレートなどによる核酸抽出方法等の公知の方法を適宜使用するこ とができるが、 特にこれらに限定するものではない。
本発明に用いられる核酸検出工程には、 公知の方法であるゲル電気泳 動を用いた一本鎖 DNA高次構造多型 （SSCP) または制限酵素断片長多 型 （RFLP)、 マイクロアレイ法、 DNAチップ法、 ビーズァレイ法さらに パイ口シーケンス法、 インべ一ダ一法、 質量分析法、 HPLC法などがあ リ、 少なく とも一塩基以上配列の異なる核酸を識別して検出可能であれ ば、 利用できる。 また、 該抽出用内部標準核酸または該検出用内部標準 核酸の検出信号は、 各工程の成否の判定の他、 該対象核酸の定量、 塩基 長測定または検出信号の補正など各種データ処理に用いることも可能 である。
該核酸検出工程には、 核酸検出に必要な試料の前処理、 例えば、 熱変 性処理や各種標識処理や溶媒交換などを含み、 検出用内部標準核酸の核 酸抽出物への添加は該前処理前に実施されることが望ましい。
次に、 該抽出工程と該検出工程の間に核酸増幅工程を含む核酸解析方 法において、 解析対象核酸を含む試料に、 解析対象核酸と同時に増幅可 能であるが、 該解析対象核酸と少なく とも一塩基以上配列が異なる一定 量の抽出用内部標準核酸を一種類以上添加し、 核酸抽出工程を実施する 。 次に解析対象核酸と同時に増幅可能であるが、 該解析対象核酸及び抽 出用内部標準核酸と少なく とも一塩基以上配列が異なる一定量の増幅 用内部標準核酸を一種類以上、 得られた核酸抽出物に添加し、 その後核 酸増幅工程を実施する。 次いで、 解析対象核酸、 抽出用内部標準核酸、 及び増幅用内部標準核酸と少なく とも一塩基以上配列が異なる一定量 の検出用内部標準核酸を一種類以上、 得られた核酸増幅物に添加し、 そ の後一塩基以上配列の異なる核酸を識別検出可能な公知の核酸検出ェ 程を実施する。 ·
その結果、 図 3に示すように、 上記と同様に各工程の成否を判定し、 さらには該判定結果に基づき再解析を決定する。 また、 解析対象核酸を 含まないブランク （対照試料） を解析対象核酸と同時処理することによ リ、 コンタミによる偽陽性を監視し、 再解析の判定に利用することがで きる。 この場合、 ブランクで対象核酸が検出された場合コンタミを生じ ており、 抽出用内部標準核酸および検出用内部標準核酸の結果に係らず 、 除洗作業後再度、 解析をやり直す必要があることになる。
核酸増幅方法としては、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) 、 核酸配列基 準増幅 （NASBA) 等の公知の方法を適宜用いれば良く、 特に限定される ものではない。 尚、 増幅工程を含む場合、 解析対象核酸と同時に増幅さ れる抽出用内部標準核酸及び増幅用内部標準核酸の量は、 検出用内部標 準核酸と比較して少量にすることができるが、 好ましい相対的量比は、 使用する増幅方法及び検出方法に応じて異なリ、 特定されるものではな い
以下、 抽出用内部標準核酸、 増幅用内部標準核酸、 及び検出用内部標 準核酸の検出結果と、 各工程の成否判定の関係を、 図 3を参照しながら 説明する。
ケース 1 (抽出用内部標準核酸、 増幅用内部標準核酸及び検出用内部 標準核酸の検出結果がいずれも正常の場合） ： 各工程は正常に実施され
、 解析対象核酸の核酸解析操作は、 「成功」 と判定する。
ケース 2 (抽出用内部標準核酸及び増幅用内部標準核酸の検出結果が 正常であリ、 検出用内部標準核酸の検出結果が異常又は未検出の場合） ： 解析対象核酸がブランクで検出されなかった場合、 解析対象核酸の核 酸解析操作は正常に実施された可能性が高いと考えられるが、 該検出用 内部標準核酸及び z又は該検出用内部標準核酸の添加機構が異常であ る可能性があり、 「保留」 と判定する。 したがって、 該検出用内部標準 核酸を交換するか、 該検出用内部標準核酸の添加機構を点検し、 あるい はその双方を行い、 図 2に示す 「再実施 3」 から再度実施する
ケース 3 (抽出用内部標準核酸及び検出用内部標準核酸の検出結果が 正常であり、 増幅用内部標準核酸の検出結果が異常又は未検出の場合）
： 解析対象核酸がブランクで検出されなかった場合、 解析対象核酸の核 酸解析操作は正常に実施された可能性が高いと考えられるが、 該増幅用 内部標準核酸及びノ又は該増幅用内部標準核酸の添加機構が異常であ る可能性があり、 「保留」 と判定する。 したがって、 該増幅用内部標準 核酸を交換するか、 該増幅用内部標準核酸の添加機構を点検し、 あるい はその双方を行い、 図 2に示す 「再実施 2」 から再度実施する。
ケース 4 (抽出用内部標準核酸の検出結果が正常であり、 増幅用内部 標準核酸及び検出用内部標準核酸の検出結果が異常又は未検出の場合
) ： 解析対象核酸がブランクで検出されなかった場合、 解析対象核酸の 核酸解析操作は正常に実施された可能性が高いと考えられるが、 該増幅 用内部標準核酸及び 又は該増幅用内部標準核酸の添加機構および該 検出用内部標準核酸及びノ又は該検出用内部標準核酸の添加機構が異 常である可能性があり、 「保留」 と判定する。 したがって、 該増幅用内 部標準核酸及び Z又は該増幅用内部標準核酸の添加機構および該検出 用内部標準核酸及び/又は該検出用内部標準核酸の添加機構の交換ま たは点検を行い、 図 2に示す 「再実施 2」 から再度実施する。
ケース 5 (抽出用内部標準核酸の検出結果が異常又は未検出で、 増幅 用内部標準核酸及び検出用内部標準核酸の検出結果が正常の場合） ： 核 酸抽出工程が正常に実施されなかったと考えられ、 「抽出不良」 と判定 し、 図 2に示す 「再実施 1」 から再度実施する。 特に、 解析対象核酸が 検出されなかった場合、 偽陰性の可能性が極めて高いと考えられる。 ま た、 解析対象核酸が解析対象試料で検出された場合、 該抽出用内部標準 核酸及び 又は該抽出用内部標準核酸の添加機構が異常である可能性 がぁリ、 該抽出用内部標準核酸を交換するか、 該抽出用内部標準核酸の 添加機構を点検し、 あるいはその双方を行い、 図 2に示す 「再実施 1」 から再度実施する。
ケース 6 (抽出用内部標準核酸及び検出用内部標準核酸の検出結果が 異常又は未検出であリ、 増幅用内部標準核酸の検出結果が正常の場合） ： 核酸抽出工程が正常に実施されなかったと考えられ、 「抽出不良」 と 判定し、 さらに該検出用内部標準核酸及び Z又は該検出用内部標準核酸 の添加機構が異常である可能性があリ、 該検出用内部標準核酸を交換す るか、 該検出用内部標準核酸の添加機構を点検し、 あるいはその双方を 行い、 図 2に示す 「再実施 1」 から再度実施する。 また、 解析対象核酸 が解析対象試料で検出された場合、 該抽出用内部標準核酸及びノ又は該 抽出用内部標準核酸の添加機構および検出用内部標準核酸及び z又は 該検出用内部標準核酸の添加機構が異常である可能性があリ、 該抽出用 内部標準核酸及びノ又は該抽出用内部標準核酸の添加機構および検出 用内部標準核酸及び 又は該検出用内部標準核酸の添加機構の交換ま たは点検を行い、 図 2に示す 「再実施 1」 から再度実施する。
ケース 7 (抽出用内部標準核酸及び増幅用内部標準核酸の検出結果が 異常ノ又は未検出であリ、 検出用内部標準核酸の検出結果が正常の場合 ) ：増幅工程及びノ又は核酸抽出工程が正常に実施されず、 「抽出ノ増 幅不良」 と判定し、 図 2に示す 「再実施 1J から再度実施する。 解析対 象核酸が解析対象試料で検出された場合、 該抽出用内部標準核酸及び 又は該抽出用内部標準核酸の添加機構および増幅用内部標準核酸及び Z又は該増幅用内部標準核酸の添加機構が異常である可能性があリ、 該 抽出用内部標準核酸及び 又は該抽出用内部標準核酸の添加機構およ び増幅用内部標準核酸及び Z又は該増幅用内部標準核酸の添加機構の 交換または点検を行い、 図 2に示す 「再実施 1」 から再度実施する。
ケース 8 (抽出用内部標準核酸、 増幅用内部標準核酸及び検出用内部 標準核酸の検出結果がいずれも異常又は未検出の場合） ：抽出用内部標 準核酸、 増幅用内部標準核酸および検出用内部標準核酸とも未検出の場 合、 核酸抽出工程、 核酸増幅工程および核酸検出工程が正常に実施され なかったと考えられ、 「不良」 と判定し、 図 2に示す 「再実施 1」 から 再度実施する。 抽出用内部核酸および増幅用内部標準核酸とも未検出で はない異常の場合、 核酸検出工程が正常に実施されなかったと考えられ 、 「不良」 と判定し、 図 2に示す 「再実施 3」 から再度実施する。 この 再実施において 「成功」 の判定ができない場合は 「再実施 1」 から再度 実施する。
さらに、 ケース 2〜 8において、 再実施後、 ケース 1の 「成功」 と判 定できない場合は、 その判定結果に基づいて再実施を繰リ返す。
また、 該内部標準核酸は一定量、 つまり既知濃度で添加されることか ら、 内部標準核酸の検出信号量に基づいて、 対象核酸の定量や塩基長測 定ゃ検出信号の補正など各種データ処理を行うことが可能である。
増幅工程において、 内部標準核酸を解析対象核酸と同時に増幅させる 手段としては、 広く知られている共通プライマ一ペアと呼ばれる解析対 象核酸と同一のプライマ一配列を内部標準核酸に包含する方法が、 経済 的かつ増幅安定性に優れているが、 独立した複数の個別プライマ一ペア を用いても本発明は実施可能である。
さらに、 内部標準核酸の塩基配列は対象核酸と少なく とも一塩基以上 異なる必要があるが、 増幅工程を含む場合やハイプリダイゼ一ションを 利用した DNAチップなどを検出工程に利用する場合は、 対象核酸と類 似性が高い方が増幅効率や結合効率が同等になリ易いため、 再現性に優 れておリ好適である。
本発明はまた、上記の本発明の核酸解析方法を実施するためのキッ トで あって、
( i)抽出用内部標準核酸及び Z又は抽出用内部標準核酸を含む抽出用試 薬、 及び
( ii) 検出用内部標準核酸及び Z又は検出用内部標準核酸を含む検出用 試薬、 を含むことを特徴とするキッ トを提供する。
本発明は更に、 上記の核酸解析方法を実施するためのキッ トであって
( i)抽出用内部標準核酸及び 又は抽出用内部標準核酸を含む抽出用試 薬、
( ii ) 検出用内部標準核酸及びノ又は検出用内部標準核酸を含む検出用 試薬、 及び
( iii) 増幅用内部標準核酸及び 又は増幅用内部標準核酸を含む増幅用 試薬、
を含むことを特徴とするキッ トを提供する。
上記キッ トにおいて、 各内部標準核酸は、 単独でキットに含まれていて も良いが、 溶媒、 標識用試薬、 プライマ一等の、 各工程において必要とさ れる他の試薬と共に含まれていても良い。 試薬に含むことができる各成分 については、 当業者であれば容易に認識できるものであり、 特に限定する ものではない。
また、 本発明に係るキットは、 上記抽出用内部標準核酸が解析対象核酸 と少なく とも 1塩基以上配列の異なる一定量の核酸であリ、 上記検出用 内部標準核酸が該解析対象核酸及び上記抽出用内部標準核酸のいずれ とも少なく とも 1塩基以上配列の異なる一定量の核酸であるこ とを特 徴とする。
また、 上記キットが増幅用内部標準核酸及びノ又は増幅用内部標準核 酸を含む増幅用試薬を含む場合には、 上記抽出用内部標準核酸が解析対 象核酸と同時に増幅可能であるが、 該解析対象核酸と少なく とも 1塩基 以上配列が異なる一定量の核酸であリ、 上記増幅用内部標準核酸が該解 析対象核酸と同時に増幅可能であるが該解析対象核酸及び上記抽出用 内部標準核酸と少なく とも 1塩基以上配列が異なる一定量の核酸であ り、 上記検出用内部標準核酸が解析対象核酸、 上記抽出用内部標準核酸 及び上記増幅用内部標準核酸のいずれとも互いに少なく とも 1塩基以 上配列が異なる一定量の核酸であることを特徴とする。 これにより、 本発明のキッ トを使用して本発明の核酸解析方法を実施 する際に、 1塩基以上配列の異なる核酸を識別可能な検出方法を使用す ることが可能であり、 また、 内部標準核酸の検出結果から、 解析対象核 酸の定量や塩基長測定や検出信号の補正など各種データ処理を行うこ とも可能となる。 図面の簡単な説明
図 1 は、 抽出工程及び検出工程を含む本発明の方法における各工程の 成否判定表を示す。
図 2は、 本発明の核酸解析方法のフローチャートを示す。
図 3は、 抽出工程、 増幅工程、 及び検出工程を含む本発明の方法にお ける各工程の成否判定表を示す。
図 4は、 本発明の抽出用内部標準核酸および検出用内部標準核酸の一 例を示す。
図 5は、 本発明の抽出用内部標準核酸、 増幅用内部標準核酸、 及び検 出用内部標準核酸の一例を示す。
図 6は、 本発明の検出工程にゲル電気泳動を用いて一本鎖 DNA高次 構造多型を検出するために実施する本発明の方法における検出結果の 一例を示す。
図 7は、 検出工程に DNAチップを用いた本発明の方法における検出 結果を定量解析として示す一例を示す。
図 8は、 本発明の方法において検出工程にゲル電気泳動を用いて一本 鎖 DNA高次構造多型を検出するためのデータ処理の一例を示す。 発明を実施するための形態
本発明の実施形態を表すフローチヤ一トを図 2に示す。
人の血液やその他の体液、 組織または細胞、 細菌、 ウィルスなどの解 析対象核酸を含む試料に、
抽出用内部標準核酸及び Z又は抽出用内部標準核酸を含む抽出用試 薬を試料に添加した後、 解析対象核酸および抽出用内部標準核酸を同時 に抽出する工程を実施し、
次に、 検出用内部標準核酸及び 又は検出用内部標準核酸を含む検出 用試薬を得られた核酸に添加した後、 解析対象核酸、 抽出用内部標準核 酸、 及び検出用内部標準核酸をそれぞれ識別して検出する工程を実施し 各内部標準核酸の検出結果から前述のケースに従って各工程の成否 を判定し、 判定結果に基づいて該抽出工程又は核酸検出工程から、 再実 施を行う。 '
あるいはまた、 上記解析対象核酸を含む試料に、
抽出用内部標準核酸及び Z又は抽出用内部標準核酸を含む抽出用試 薬を試料に添加した後、 解析対象核酸および抽出用内部標準核酸を同時 に抽出する工程を実施し、
増幅用内部標準核酸及び 又は増幅用内部標準核酸を含む増幅用試 薬を核酸抽出物に添加した後、 解析対象核酸、 抽出用内部標準核酸、 及 び増幅用内部標準核酸を同時に増幅する工程を実施し、
検出用内部標準核酸及び 又は検出用内部標準核酸を含む検出用試 薬を核酸増幅物に添加した後、 解析対象核酸、 抽出用内部標準核酸、 検 出用内部標準核酸、 及び増幅用内部標準核酸をそれぞれ識別して検出す る工程を実施し、
各内部標準核酸の検出結果から前述のケースに従って各工程の成否 を判定し、 判定結果に基づいて該抽出工程、 増幅工程又は検出工程から 再実施を行う。
本発明に用いられる内部標準核酸の一例を図 4に示す。 具体的には、 解析対象核酸を含む試料に、 解析対象核酸とは少なく とも一塩基以上配 列の異なる一定量の抽出用内部標準核酸を添加し、 その後核酸抽出工程 を実施し、 解析対象核酸及び抽出用内部標準核酸とは少なく とも一塩基 以上配列の異なる一定量の検出用内部標準核酸を得られた核酸抽出物 に添加し、 その後一塩基以上配列の異なる核酸を識別検出可能な核酸検 出工程を実施する時に用いられる内部標準核酸の例である。 解析対象核 酸、 抽出用内部標準核酸、 及び検出用内部標準核酸の塩基長は同一であ リ、 解析対象核酸塩基配列中の特定位置のチミン （T ) がアデニン （A ) であり、 一塩基だけ異なる塩基配列を持つ核酸を抽出用内部標準核酸 (抽出用 I C ) とし、 解析対象核酸塩基配列中の別の特定位置の Aがシ トシン （C ) であり、 一塩基だけ異なる塩基配列を持つ核酸を検出用内 部標準核酸 （検出用 I C ) としたものである。 この場合、 抽出用 I Cと 検出用 I Cは二塩基だけ異なる塩基配列を持つ核酸となり、 一塩基以上 配列の異なる核酸を識別検出可能な検出器によリ、 異なる信号として検 出される。
さらに、 該抽出工程と該検出工程の間に核酸増幅工程を含む核酸解析 方法において用いられる内部標準核酸の一例を図 5に示す。 この場合、 本発明の方法は、 具体的には解析対象核酸と同時に増幅可能であるが、 該解析対象核酸と少なく とも一塩基以上配列が異なる、 一定量の抽出用 内部標準核酸を解析対象核酸を含む試料に添加し、 核酸抽出工程を実施 する。 次いで、 解析対象核酸と同時に増幅可能であるが、 該解析対象核 酸及び抽出用内部標準核酸と少なく とも一塩基以上配列が異なる一定 量の増幅用内部標準核酸を得られた核酸抽出物に添加し、 核酸増幅工程 を実施する。 その後、 解析対象核酸、 抽出用内部標準核酸、 及び増幅用 内部標準核酸と少なく とも一塩基以上配列が異なる一定量の検出用内 部標準核酸を得られた核酸増幅物に添加し、 一塩基以上配列の異なる核 酸を識別検出可能な核酸検出工程を実施する。 さらに、 増幅工程におい て、 内部標準核酸を対象核酸と同時に増幅させる手段として広く知られ ている共通プライマ一ペアと呼ばれる解析対象核酸と同一のプライマ 一配列を内部標準核酸に包含する方法を用いた例である。
図 5に示すように、 解析対象核酸塩基配列中の特定位置の Tが Aに一 塩基だけ異なる塩基配列を持つ核酸を抽出用内部標準核酸 （抽出用 I C ) とし、 解析対象核酸塩基配列中の別の特定位置の Aが Cに一塩基だけ 異なる塩基配列を持つ核酸を増幅用内部標準核酸 （増幅用 I C ) とし、 解析対象核酸塩基配列中のさらに別の特定位置の Cが Aに一塩基だけ 異なる塩基配列を持つ核酸を検出用内部標準核酸 （検出用 I C ) とした ものである。 この場合、 抽出用 I Cと増幅用 I Cと検出用 I Cはそれぞ れニ塩基ずつ異なる塩基配列を持つ核酸となり、 一塩基以上配列の異な る核酸を識別検出可能な検出器によリ、 異なる信号として検出される。 さらに上記の塩基配列に差異を有する領域の両側に存在するプライマ —領域 A、 プライマー領域 Bは、 解析対象核酸、 及び各内部標準核酸と 同一の塩基配列であることから、 一種類のプライマ一ペアでそれぞれの 塩基配列を増幅することが可能である。
本発明の核酸解析方法を実施したときに得られる結果の一例を図 6 に示す。 図 6は、 解析対象核酸を含む試料に解析対象核酸と少なく とも 一塩基以上配列が異なる一定量の抽出用内部標準核酸と、 解析対象核酸 及び抽出用内部標準核酸と少なく とも一塩基以上配列が異なる一定量 の検出用内部標準核酸を用いて、 一塩基以上配列の異なる核酸を識別検出可 能な核酸検出工程としてゲル電気泳動を用いた一本鎖 DNA高次構造多型
( SSCP) を実施した時の電気泳動ク口マトグラムの例である。 SSCPは キヤビラリ一電気泳動装置を用いて、 それぞれ蛍光標識した対象核酸、 抽出用 I Cと検出用 I Cをレーザ一で励起し、 C C Dカメラで蛍光スぺ ク トルを測定した。
図 6に示すように、 「正常」 のケースは、 それぞれ抽出用 I C、 対象 核酸、 検出用 I Cとも所定のピーク強度が得られており、 解析工程が正 常に実施されたときのクロマトグラムの例である。 一方、 「異常 1」 の ケースは、 図 1 に示すケース 3の一例である。 抽出用 I Cの蛍光ピーク が極めて小さく抽出用 I Cは異常であり、 検出用 I Cの蛍光ピークは正 常のケースと同じ検出時間に同等の蛍光強度を示しているので正常で ある。 したがって、 抽出不良と判断し、 図 2に示す再実施 1 を行う。 Γ 異常 2」 のケースは、 図 1 に示すケース 4の一例である。 抽出用 I じお よび検出用 I Cの蛍光ピークが広がり、 抽出用 I Cおよび検出用 I Cは 未検出ではないが異常である。 特に、 本ケースでは解析対象核酸の蛍光 ピークも広がっているため、 電気泳動による核酸分離能が低下している と考えられ、 図 2に示す再実施 3を行う。
次に、 本発明の核酸解析方法を DNAチップを用いて実施したときに 得られる結果の一例を図 7に示す。 具体的には解析対象核酸と同時に増 幅可能であるが、 該解析対象核酸と少なく とも一塩基以上配列が異なる 一定量の抽出用内部標準核酸、 解析対象核酸と同時に増幅可能であるが 、 該解析対象核酸及び抽出用内部標準核酸と少なく とも一塩基以上配列 が異なる一定量の増幅用内部標準核酸、 および解析対象核酸、 抽出用内 部標準核酸、 及び増幅用内部標準核酸と少なく とも一塩基以上配列が異 なる一定量の検出用内部標準核酸を用いて、 一塩基以上配列の異なる核 酸を識別検出可能な核酸検出工程として DNAチップを実施したときの 例である。
DNAチップ上には、 それぞれ抽出用 I C 1、 抽出用 I C 2、 抽出用 I C 3、 増幅用 I C、 検出用 I Cおよび対象核酸 Aと相補的な塩基配列を 含有するプローブが固定化されている。 この DNAチップ上で、 それぞ れ蛍光色素を標識した抽出用 I C 1、 抽出用 I C 2、 抽出用 I C 3、 増 幅用 I C、 検出用 I Cおよび対象核酸 Aをハイプリダイズさせ、 蛍光ス ぺク トルを測定可能な DNAチップリ一ダ一で検出した。
図 7に示すように 「正常」 のケースはそれぞれ抽出用 I C 1、 抽出用 I C 2、 抽出用 I C 3、 増幅用 I C、 検出用 I Cのいずれも表に示した 所定のピーク強度 （0.5、 1.0又は 1.5) が得られ、 解析工程が正常に実 施された例である。 さらに、 内部標準核酸の検出信号量に基づいて、 対 象核酸を定量する場合には、 抽出用 I C 1、 抽出用 I C 2、 抽出用 I C 3の蛍光強度と既知の核酸量より、 核酸濃度の検量線を作成し、 対象核 酸 Aの蛍光強度から対象核酸の核酸量は 2.4ngであると定量できる。 一方、 「異常」 のケースは図 3のケース 5に示した一例である。 抽出 用 I C 1、 抽出用 I C 2、 及び抽出用 I C 3の蛍光強度がそれぞれ 0.1 であり、 それぞれの所定の蛍光強度である 0.5、 1.0又は 1.5を下回って おり、 抽出用 I Cは異常である。 その他の増幅用 I C及び検出用 I Cの 蛍光ピークは所定の蛍光強度と同じ強度を示しているので正常である
。 このとき対象核酸 Aが検出されていないのは偽陰性の可能性が高いと 考えられる。 したがって、 抽出不良と判断し、 図 2に示す再実施 1 を行 Ό。
各内部標準核酸の検出信号量に基づいて、 検出信号の補正を行ったデ ータ処理の一例を図 8に示す。 図 6 と同様、 一塩基以上配列の異なる核 酸を識別検出可能な核酸検出工程としてキヤビラリ一電気泳動装置を 用いた SSCPを実施した時の電気泳動ク口マトグラムの例である。
データ処理前に示したクロマトグラムは各レーンで内部核酸の検出 時間にずれを生じている。 このような時、 対象核酸 Aと A，または A"が同 一ピークであるか、 また対象核酸 B と B，または B"が同一ピークであるか を一目で判定することは困難である。 そこで、 本来既知の内部核酸は同 じ検出時間になることからそれぞれのレーンの抽出用 I Cまたは検出用 I Cが同じ検出時間になるようにクロマトグラムを補正した結果がデータ 処理後のク口マトグラムである。 このようなデータ処理をすると対象核 酸 Aと A'および A"は同一ピークであリ、 対象核酸 B と B"は同一ピーク であるが B，は異なるピークであることが一目瞭然に判定できる。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 核酸解析を構成する抽出、 増幅、 及び検出の各工程 での操作の成否を判定することが可能となリ、 得られる解析結果の信頼 性を高めると共に、 再検査を自動化することも可能となる。 本効果は特 に医療分野において遺伝子解析に基づいて実施される検査'診断の信頼 性の向上に寄与する。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考 として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 解析対象核酸の抽出工程及び検出工程を含む核酸解析方法において、 解析対象核酸と識別して検出可能な 1種類以上の抽出用内部標準核酸を添 加した後に核酸を抽出すること、 及び上記検出工程による上記内部標準核 酸の検出結果から抽出工程の成否を判定することを含む、 核酸解析方法。
2 . 解析対象核酸の抽出工程及び検出工程を含む核酸解析方法において、 解析対象核酸及び相互に識別して検出可能な 1種類以上の抽出用内部標準 核酸及び検出用内部標準核酸を添加した後に上記抽出工程及び検出工程を 行うこと、 そして上記検出工程による上記内部標準核酸の検出結果から抽 出工程及び検出工程の成否を判定することを含む、 核酸解析方法。
3 . 解析対象核酸の抽出工程、 増幅工程及び検出工程を含む核酸解析方 法において、
解析対象核酸及び相互に識別して検出可能な 1種類以上の抽出用内部標準 核酸、 増幅用内部標準核酸及び検出用内部標準核酸を添加した後に上記抽 出工程及び検出工程を行うこと、 そして上記検出工程による上記内部標準 核酸の検出結果から抽出工程及び検出工程の成否を判定することを含む、 核酸解析方法。
4 . 解析対象核酸の抽出工程及び検出工程を含む核酸解析方法におい て、
( a ) 解析対象核酸を含有する試料に、 該解析対象核酸と識別して検出 可能な 1種類以上の抽出用内部標準核酸を添加した後に核酸を抽出す る核酸抽出工程、
( b ) 上記工程 （ a ) において抽出された核酸を含有する試料に、 上記 解析対象核酸及び抽出用内部標準核酸と識別して検出可能な 1種類以 上の検出用内部標準核酸を添加した後に核酸を検出する核酸検出工程 、 及び
( C ) 核酸検出工程における上記の各内部標準核酸の検出結果から上記 各工程の成否を判定する工程、
を含むことを特徴とする、 核酸解析方法。
5 . 解析対象核酸の抽出工程、 増幅工程及び検出工程を含む核酸解析 方法において、
( a ) 解析対象核酸を含有する試料に、 解析対象核酸と同時に増幅可能 であるが、 該解析対象核酸と識別して検出可能な 1種類以上の抽出用内 部標準核酸を添加した後に核酸を抽出する核酸抽出工程、
( b ) 上記工程 （ a ) において抽出された核酸を含有する試料に、 上記 解析対象核酸及び上記抽出用内部標準核酸と同時に増幅可能であるが 、 上記解析対象核酸及び上記抽出用内部標準核酸と識別して検出可能な
1種類以上の増幅用内部標準核酸を添加した後に核酸を増幅する核酸 増幅工程、
( c ) 上記工程 （b ) において増幅された核酸を含有する試料に、 上記 解析対象核酸、 抽出用内部標準核酸、 及び検出用内部標準核酸のいずれ とも互いに識別して検出可能な 1種類以上の検出用内部標準核酸を添 加した後に核酸を検出する核酸検出工程、 及び
( d ) 核酸検出工程における上記の各内部標準核酸の検出結果から上記 各工程の成否を判定する工程、
を含むことを特徴とする、 核酸解析方法。
6 . 請求項 4又は 5に記載の核酸解析方法において、'上記核酸抽出工程、 核酸増幅工程、 及び核酸検出工程の成否判定結果に基づき、 いずれかのェ 程から再度解析を実施することを特徴とする、 核酸解析方法。
7 . 請求項 4又は 5に記載の核酸解析方法において、 解析対象核酸を含 まない対照試料を同時に処理し、 その検出結果に基づいて判定を行うこと を特徴とする、 核酸解析方法。
8 . 請求項 4から 7に記載の核酸解析方法を実施するためのキッ トであ つて、
( i)抽出用内部標準核酸及び 又は抽出用内部標準核酸を含む抽出用試 薬、 及び
( ii ) 検出用内部標準核酸及び/又は検出用内部標準核酸を含む検出用 試薬、
を含むことを特徴とするキッ ト。
9 . 請求項 4から 7記載の核酸解析方法を実施するためのキッ トであ つて、
( i)抽出用内部標準核酸及びノ又は抽出用内部標準核酸を含む抽出用試
( ii ) 検出用内部標準核酸及び 又は検出用内部標準核酸を含む検出用 試薬、 及び
( iii) 増幅用内部標準核酸及び 又は増幅用内部標準核酸を含む増幅用 試 5^、
を含むこ とを特徴とするキッ ト。
1 0 . 上記抽出用内部標準核酸が解析対象核酸と少なく とも 1塩基以 上配列の異なる一定量の核酸であリ、 上記検出用内部標準核酸が該解析 対象核酸及び上記抽出用内部標準核酸のいずれとも少なく とも 1塩基 以上配列の異なる一定量の核酸であることを特徴とする、 請求項 8又は 9に記載のキッ ト。
1 1 . 上記抽出用内部標準核酸が解析対象核酸と同時に増幅可能であ るが、 該解析対象核酸と少なく とも 1塩基以上配列が異なる一定量の核 酸であり、 上記増幅用内部標準核酸が該解析対象核酸と同時に増幅可能 であるが該解析対象核酸及び上記抽出用内部標準核酸と少なく とも 1 塩基以上配列が異なる一定量の核酸であリ、 上記検出用内部標準核酸が 解析対象核酸、 上記抽出用内部標準核酸及び上記増幅用内部標準核酸の いずれとも互いに少なく とも 1塩基以上配列が異なる一定量の核酸で ある、 請求項 9に記載のキッ ト。
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005180983A (ja) * 2003-12-17 2005-07-07 Hitachi High-Technologies Corp 化学分析装置および化学分析用構造体
US7217542B2 (en) 2002-10-31 2007-05-15 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Microfluidic system for analyzing nucleic acids
US20110039303A1 (en) * 2007-02-05 2011-02-17 Stevan Bogdan Jovanovich Microfluidic and nanofluidic devices, systems, and applications
US9121058B2 (en) 2010-08-20 2015-09-01 Integenx Inc. Linear valve arrays
US9663819B2 (en) 2009-06-05 2017-05-30 Integenx Inc. Universal sample preparation system and use in an integrated analysis system
US9752185B2 (en) 2004-09-15 2017-09-05 Integenx Inc. Microfluidic devices
US10191071B2 (en) 2013-11-18 2019-01-29 IntegenX, Inc. Cartridges and instruments for sample analysis
US10208332B2 (en) 2014-05-21 2019-02-19 Integenx Inc. Fluidic cartridge with valve mechanism
JP2019509051A (ja) * 2016-03-24 2019-04-04 バイオファイア・ダイアグノスティクス，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 定量的増幅方法
US10525467B2 (en) 2011-10-21 2020-01-07 Integenx Inc. Sample preparation, processing and analysis systems
US10690627B2 (en) 2014-10-22 2020-06-23 IntegenX, Inc. Systems and methods for sample preparation, processing and analysis
US10865440B2 (en) 2011-10-21 2020-12-15 IntegenX, Inc. Sample preparation, processing and analysis systems

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2502549C (en) * 2004-04-23 2016-02-16 Becton, Dickinson And Company Use of an extraction control in a method of extracting nucleic acids
US7981606B2 (en) 2005-12-21 2011-07-19 Roche Molecular Systems, Inc. Control for nucleic acid testing
CN113388605A (zh) 2011-09-26 2021-09-14 凯杰有限公司 用于分离细胞外核酸的快速方法
WO2014063051A2 (en) * 2012-10-18 2014-04-24 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic acid amplification controls and kits and methods of use thereof
WO2014072367A1 (en) * 2012-11-07 2014-05-15 Qiagen Gmbh Control for diagnostic assay
AU2016277476B2 (en) 2015-06-10 2022-07-21 Qiagen Gmbh Method for isolating extracellular nucleic acids using anion exchange particles
US11185863B2 (en) 2016-09-30 2021-11-30 Koninklijke Philips N.V. System for applying a reagent to a sample
WO2019163064A1 (ja) * 2018-02-22 2019-08-29 学校法人 慶應義塾 Ｐｃｒ成否判定法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0466479A1 (en) 1990-07-11 1992-01-15 Genetype Ag Internal standard for electrophoretic separations
EP0714988A2 (de) * 1994-09-26 1996-06-05 IMMUNO Aktiengesellschaft Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsaüren
WO1999014371A1 (en) 1997-09-18 1999-03-25 Oligotrail, Llc. Dna bracketing locus compatible standards for electrophoresis

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3594598B2 (ja) 1993-07-09 2004-12-02 アクゾ・ノベル・エヌ・ベー 改良された核酸定量方法
AT401270B (de) * 1994-09-26 1996-07-25 Immuno Ag Verfahren zur quantifizierung von genomischer dna
WO1998004741A1 (en) * 1996-07-26 1998-02-05 Univera Pharmaceuticals, Inc. Method of identifying aloe using pcr
WO1999002728A1 (en) 1997-07-11 1999-01-21 Brax Group Limited Characterising nucleic acids
US5888740A (en) * 1997-09-19 1999-03-30 Genaco Biomedical Products, Inc. Detection of aneuploidy and gene deletion by PCR-based gene- dose co-amplification of chromosome specific sequences with synthetic sequences with synthetic internal controls
US6258536B1 (en) * 1998-12-01 2001-07-10 Jonathan Oliner Expression monitoring of downstream genes in the BRCA1 pathway
WO2000075377A2 (en) * 1999-06-03 2000-12-14 Jacques Schrenzel Non-cognate hybridization system (nchs)

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0466479A1 (en) 1990-07-11 1992-01-15 Genetype Ag Internal standard for electrophoretic separations
EP0714988A2 (de) * 1994-09-26 1996-06-05 IMMUNO Aktiengesellschaft Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsaüren
WO1999014371A1 (en) 1997-09-18 1999-03-25 Oligotrail, Llc. Dna bracketing locus compatible standards for electrophoresis

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H. IWAHANA ET AL.: "Multiple fluoresence-based PCR-SSCP analysis", BIOTECHNIQUES, vol. 16, no. 2, February 1994 (1994-02-01), pages 296 - 302
J. ELLISON ET AL.: "Efficacy of fluorescence- based PCR-SSCP for detection of point mutations", BIOTECHNIQUES, vol. 15, no. 4, January 1993 (1993-01-01), pages 684 - 691
See also references of EP1319716A4

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7217542B2 (en) 2002-10-31 2007-05-15 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Microfluidic system for analyzing nucleic acids
JP2005180983A (ja) * 2003-12-17 2005-07-07 Hitachi High-Technologies Corp 化学分析装置および化学分析用構造体
US9752185B2 (en) 2004-09-15 2017-09-05 Integenx Inc. Microfluidic devices
US20110039303A1 (en) * 2007-02-05 2011-02-17 Stevan Bogdan Jovanovich Microfluidic and nanofluidic devices, systems, and applications
US8557518B2 (en) 2007-02-05 2013-10-15 Integenx Inc. Microfluidic and nanofluidic devices, systems, and applications
US9663819B2 (en) 2009-06-05 2017-05-30 Integenx Inc. Universal sample preparation system and use in an integrated analysis system
US9121058B2 (en) 2010-08-20 2015-09-01 Integenx Inc. Linear valve arrays
US9731266B2 (en) 2010-08-20 2017-08-15 Integenx Inc. Linear valve arrays
US10525467B2 (en) 2011-10-21 2020-01-07 Integenx Inc. Sample preparation, processing and analysis systems
US11684918B2 (en) 2011-10-21 2023-06-27 IntegenX, Inc. Sample preparation, processing and analysis systems
US10865440B2 (en) 2011-10-21 2020-12-15 IntegenX, Inc. Sample preparation, processing and analysis systems
US10191071B2 (en) 2013-11-18 2019-01-29 IntegenX, Inc. Cartridges and instruments for sample analysis
US10989723B2 (en) 2013-11-18 2021-04-27 IntegenX, Inc. Cartridges and instruments for sample analysis
US10961561B2 (en) 2014-05-21 2021-03-30 IntegenX, Inc. Fluidic cartridge with valve mechanism
US10208332B2 (en) 2014-05-21 2019-02-19 Integenx Inc. Fluidic cartridge with valve mechanism
US11891650B2 (en) 2014-05-21 2024-02-06 IntegenX, Inc. Fluid cartridge with valve mechanism
US10690627B2 (en) 2014-10-22 2020-06-23 IntegenX, Inc. Systems and methods for sample preparation, processing and analysis
JP2019509051A (ja) * 2016-03-24 2019-04-04 バイオファイア・ダイアグノスティクス，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 定量的増幅方法

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