WO2002018627A1

WO2002018627A1 - Procede d'examen de maladies a erreurs innees du metabolisme, et appareil d'examen concu a cet effet

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Publication number: WO2002018627A1
Application number: PCT/JP2000/005788
Authority: WO
Inventors: Toru Yokoyama; Naoki Shinozuka; Kenji Nakamura
Original assignee: Sapporo Immuno Diagnostic Laboratory
Priority date: 2000-08-28
Filing date: 2000-08-28
Publication date: 2002-03-07
Also published as: EP1314786A4; AU2000267323A1; EP1314786A1; CN1461347A

Description

明細書

先天性代謝異常症の検査方法および検査装置発明の分野

本発明は、生体試料に含まれる D—ガラクト一ス、 L一口イシンを含む分岐鎖アミノ酸および L一フエ二ルァラニンを煩雑な前処理を必要とせずに簡便でしかも迅速に定量が可能な測定方法および測定装置に関する。

特に先天性代謝異常症であるガラクト一ス血症、メープルシロップ尿症およびフエ二ルケトン尿症の 3'疾患において、早期発見のための新生児スクリーニング、あるいは当患者のベッドサイド検査、. 日常生活におけるモニタリング等について利用可能な検査方法および検査装置である。発明の ·背景

先天性代謝異常症の早期発見を目的とする新生児スクリーニングの世界的な普及は、フエ二ルケトン尿症（phenylketonuria； P K U ) の治療法の発見と乾燥濾紙血液中の L—フエ二ルァラニン（L一 P h e ) の半定量法が開発されたことに始まる。

先天性代謝異常症がスクリーニングの対象疾患となった最大の理由は、早期発見により患児に正常な発達が期待されるなどの医学的なメリットと、その経済的効率が有効であることが明らかにされたためである。発見が遅れて障害児となり、収容施設を整備し、患児のケアのために高額な医療費を支払う場合と、早期に発見し治療することにより健全な成人と.して生育した場合とを比較すると、後者の方が極めて経済効率が高く患児の Q 0 Lも向上する。

そのため、各国では先天性代謝異常症による精神遅滞や発達障害の予防が、公衆衛生領域の課題と認識され、国家レベルや行政的支持のもと新生児スクリー二ングが展開されている。

ここで、先天性代謝異常症を代表する P K Uとは、必須アミノ酸である L一 P h eをチロジンに転換する L一 P h e水酸化酵素の先天的欠損により生じる疾患で、体内には L一 P h eが蓄積され、尿中には L一 P h eのほか多量のフエニルピルビン酸が排泄される。臨床症状としては、精神薄弱などの知能障害、神経障害、メラニン色素欠乏症が認められる。本症の治療には、 L— P h e量を制限した食事療法を必要とし、少なくとも成年期まで、好ましくは生涯にわたり、治療を継続しなければならない。なお、 L一 P h eは人体にとって必須アミノ酸の一つであることから、摂取量は、脳障害等を引き起こさない最大量と、身体発育に必要な最小量の範囲で厳密に維持しなければならない。

また、母性 P K Uは、 P K Uの女性が妊娠すると母体の血液中 L一 P h e濃度が高いために、胎児に発育障害、知能障害、小頭症、心奇形などを発生する。しかし、妊娠前から血液中濃度をコント'ロールすることで予防が可能となる。

ここで、診断のためのスクリーニング検査方法は、新生児の足かかとを穿刺し採血濾紙へ染み込ませた乾燥濾紙血液を検体として、枯草菌と代謝拮抗阻害剤を用いた細菌成長阻止法 ( bacterial inhibition assay； B I A )が Guthrieら (Pediatrics, Vol.32, p.338 (1963))·により開発されスクリ一ニングが開始された。さらに Guthrie は B I A法の原理を用いて、 L一ヒスチジン、 L一メチォニン、 L一口イシン（L - L e u ) を、また大腸菌を用いて、 D—ガラクトース（D— G a l ) も定量可能であることを発見し、ヒスチジン血症、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿；!正、 maple syrup urine disease； M S U D )、ガラク卜ース血症 ( galactosemia； υ· Ε ) のスクリーニングも開始した。

現在のマルチプルスクリーニングのシステムは、 B I Α法あるいは大腸菌とファ一ジを用いた Paigen法（Journal of Lab. Clin. Med.， Vol.99, ρ·895(1982)) により、 1 9 6 0年代に基礎が確立されたものである。これらの検査方法は、乾燥濾紙血液を検体として、パンチヤーにより打ち抜いた血液ディスクを寒天培地上に並べ一晩培養した後、細菌生育円の大きさを判定する非常に簡便な方法であり、高価な機器を必要とせずに試薬コストにも優れ、大量検体の多項目検査処理が可能な方法である。

しかし、最終的な検査結果は目視による判定のため、判定結果の客観性や記録化が困難である。その改善としてカメラによる画像化（日本マス 'スクリ一ニング学会誌， Vol.6, ρ·23(1996)) が挙げられ、定量化と記録化を試みているが、変動の大きい細菌の生育の定量化は困難を極め、さらに簡便性も損なわれている。一方、高速液体クロマトグラフィ（Journal of Chromatography, Vol.274, p.318 (1983) , 日本マス ' スクリーニング学会誌， Vol.5, p.86(1995) ) や自動分析装置 (Clinical Chemistry, Vol.30, p.287(1984)) の応用もあるが、対象疾患がアミノ酸代謝異常症のみであることや、高額な測定装置を用いること、簡便性、迅速性についても問題がある。

そのような中、最近、酵素法（Screening, VoL l，p.63(1992), 医学と薬学， Vol.31, ρ.1237(1994) ) あるいはマイクロプレート蛍光法（Clinical Chemistry, Vol.35, ρ.1962(1989))と呼ばれる酵素反応とそれに続く蛍光反応をマイクロプレー卜で行い蛍光強度から検体中の D— G a 1、 L— L e uを^む分岐鎖アミノ酸、 L— P h e、 L 一メチォニンを定量するキットが開発された（医学と薬学， Vol.37， ρ.1211(1997)) ₀ 当キットは検体処理能力の高さに加え、従来の方法では困難であつた検査結果の客観的判定である定量化や、記録化が実現されている。さらに 3 時間程で検査結果を得ることが可能であり迅速性も大幅に向上している。

以上新生児スクリ一ニングにおける大量検体処理方法については確立されつつあるが、糖尿病患者の血糖モニタリングに代表されるポイントォブケア検査 (point-of-care testing； P O C T ) 方法を例に挙げると、簡便性おょぴ迅速性については改善の余地が多分に残されている。

P O C Tは、診療および看護現場での臨床検査として緊急検査やべッドサイドでのリアルタイムモニタリングが、簡易、迅速、小型機器により実現されている。現在、血糖測定に関しては、数マイクロリットルの全血を検体として 3 0秒から 1分ほどで検査結果を得ることができる（例えば W099/51974(1999))。測定方法は、酵素反応とそれに続く電気化学反応（例えば Analytical Chemistry, Vol.56, p.667(1984), ) もしくは酵素反応とそれに続く呈色反応のどちらかであり（例えば医学と薬学， Vol.39, p.357(1998))、試薬を含有する試験紙を小型測定機器に装着し、検体を試験紙に点着させるか、もしくは検体を試験紙に点着させ測定機器に装着するだけの至って簡便な操作である。

特に先天性代謝異常症は、早期発見、早期治療が最も効果的であるが、中でも 0 £ゃ1^ S U Dは緊急性の高い疾患であり、患児の予後を左右するケースも想定される。そのため、採血現場において検査結果が得られる新規検査システムが確立されれば莫大な需要に対する供給であることは明白である。

また、 P K Uおよび母性 P K U検査用として自己測定方法の確立も同様に望まれている。発明の要旨

本発明は上記の課題を解決するために、先天性代謝異常症である G E、 M S U D、 P K Uの 3疾患において、生体試料中のそれぞれの測定対象物質である、 D 一 G a l 、 L— L e uを含む分岐鎖アミノ酸、 L— P h eを、簡便 ίこ迅速に検査結果を提示できる検査方法おょぴ検査装置を提供する。

なお、生体試料は全血、血清、血漿と血液に限定せず、尿、唾液などの広範な体液を用いることが可能である。また、生体試料のみならず食品中の D— G a 1 、 L— L e uを含む分岐鎖アミノ酸、 L一 P h eの測定も可能である。

本発明の測定原理は、基質となる D— G a l 、 L一 L e uを含む分岐鎖ァミノ酸、 L一 P h eに特異的なそれぞれの脱水素酵素と補酵素による酵素反応と、それに続く電子メデイエ一夕とテトラゾリゥム塩による酸化還元反応によって、基質濃度に依存した化学的に安定な最終生成物であるホルマザンを検出するものである。その検出方法は、ホルマザン生成にあたり呈色反応と、電子授受による酸化還元反応を有する特徴を生かし、光学的手法および電気化学的手法の双方もしくはどちらか一方を利用するものである。

また、本発明の検査方法は、測定に必要とする反応試薬をあらかじめ固定化しておくことで、利用時には試薬調製を不要とし検査実施者の操作を出来る限り簡略化する。

さらに、本発明の検査システムは、上記検査方法を用いた反応試薬を固定化した試験紙（センサチップ）と、光学的および電気化学的検出回路を有する小型測定装置 (ポータブルメータ) からなり、その試験紙を測定機器に装着して、生体試料である検体を試験紙に点着させるだけで測定が数分で終了し、検査結果を表示するものである。

これより、生体試料の採取現場で検査が実施可能となり、簡易操作で迅速に検査結果を得られる検査システムが実現される。

発明の説明

本発明によれば、先天性代謝異常症である G E、 M S U D、 P K Uの 3疾患において、生体試料中のそれぞれの測定対象物質である、 D— G a l、 L - L e u を含む分岐鎖アミノ酸、 L一 P h eを、少なくとも基質である対象物質に特異的な脱水素酵素と補酵素、電子メディエー夕とテトラゾリゥム塩を反応試薬として用い、基質濃度に依存する最終生成物であるホルマザンを光学的検出および電気化学的検出の双方もしくはどちらか一方を利用し、基質濃度に換算する検査方法および検査装置を提供することである。

本発明の 3疾患に対する簡便かつ迅速な検査方法は、反応試薬をあらかじめ反応の場、例えばキュベット、チューブ、ゥエル、カセット等、に固定化することにより、検体である生体試料を点着するだけで、それら固定化試薬が溶解し混合されて、酵素反応と酸化還元反応が順次進行する手順を特徴とするものである。その後、最終生成物であるホルマザンを光学的検出および電気化学的検出の双方もしくはどちらか一方を用いる検査方法である。

さらに本発明の 3疾患に対する検査装置は、上記検査方法を用いて作製した反応試薬固定化試験紙（センサチップ）と、光学的および電気化学的検出回路を有する携帯可能な小型測定装置（ポータブルメータ）からなる。

反応試薬固定化試験紙は、検体の点着にあたり、迅速な吸収性と固定化した反応試薬の溶解性を高めた構造を特徴とする。検体の展開方向を上方から下方へ向け、さらに層状構造とし、吸収層、展開層、反応層を設けてそれぞれの用途に適した素材を選定した。また、この層状構造により検体の分離能も優れたものを作製でき、全血に関しては、血球と思われる有色成分が最下層には現れないことが挙げられる。

小型測定装置における光学的検出回路は、ホルマザンの吸光度を指標に定量するものである（特開平 9-286784(1997), Analyst, Vol.120, p.113(1995)) ₀ 装置構成は本発明において新規に考案し、具体的には、ホルマザンの特異的な吸収波長を照射する光源と、光源からの入射光に対するホルマザン照射後の反射光を受光する素子とで構成され、ホルマザン濃度に反比例する反射光量を測定する。なお、光源には発光ダイォードゃレーザダイォ一ドを、受光素子にはフォトダイォードやフォトトランジスタを利用することで比較的安価な半導体素子で光学的検出回路を構築できる。

次に、電気化学的検出回路は、ホルマザンの特異的な酸化電位を電極系により印加することで、その際に発生する電気分解酸化電流を測定するものである。構成は、一定電圧を印加する回路と、電流を測定する回路からなり、こちらも半導体素子により安価に小型化が可能である。

' 光学的および電気化学的な 2種類の検出方法 ¾備えることで、双方の利点を生かすことができる。検体中に夾雑物質である酸化還元物質が多量に含まれる場合、電気化学的なバックグラウンド応答を高めてしまい、本来求めるべき応答を妨害する。このような時には、光学的検出方法が適している。逆に、濃色や濁度が著しい場合、電気化学的検出方法が有利である。本発明の検出には、以上の 2法を採用することで、測定における短所を補いあい、測定および検査結果に対する信頼性を格段に向上させたことが大きな特徴である。

なお、反応試薬固定化試験紙の基本構造をなす電極系は、既に我々が発明した反応原理や作製技術（特開 2000-35413(2000) , WO00/04378(2000) , PCT/JP99/01392(1999)) を応用しており、導電性材料を用いて形成された少なくとも作用極と対極からなる。その電極反応部分の上面に、反応試薬を固定化した層状構造体を配置する。

以上、本発明における先天性代謝異常症の検査方法および検査装置を用いることにより得られる利点を以下に記す。あらかじめ反応試薬を固定化しておくことで、検査実施者の試薬調製を必要としない。前処理が不要である。反応試薬固定化試験紙および測定装置を利用することで、大がかりな設備を必要としない。操作は、測定装置に試験紙を装着し、試験紙に検体を付着させるだけで測定が自動スタートし結果が自動表示されるため、熟練した技術を必要とすることなく誰にでも実施できる。

具体的な用途としては、世界的に普及している新生児スクリ一二ングの検査システムにおいて、検体採取、採血濾紙等の検体の郵送、スクリー二での検査、検査結果の報告、以上約 1週間の所要時間を一切省き、検体採取現場での検査を実現する。人件費、設備投資や維持管理等を考慮すると、計り知れない経済効果が期待できる。一部の国については、新生児スクリーニングシステムが整備されていないこともあり、特殊な施設や設備を必要としない本検査システムの導入により、即座に検査を開始することができる。

また、現在の新生児スクリーニングにおける検査機器に比べると、本検査システムは非常に小型で安価であり、そのため産科、婦人科および小児科に配備することも、さらには個人による在宅使用や携帯使用も可能である。

緊急性を要す'る疾患である G Eや M S U Dは、迅速に検査結桌を提示することで、即座に適切な治療を施し患児の予後を最適に導くことができる。

以上、 1台の測定装置（ポータブルメータ）と 3種類の専用試験紙（センサチップ）の組み合わせにより、全世界へ普及が図れる新生児スクリーニング用として、また先天性代謝異常症の患児や患者の簡便かつ迅速な検査用として、本検査システムを提供する。図面の簡単な説明

図 1は本発明の反応模式図であり；

図 2は一実施例におけるセンサチップの主要構成部分の分解斜視図であり；図 3は図 2におけるセンサチップの断面図であり；

図 4はセンサチップとポー夕プルメータおよびポー夕ブルメータ内部回路の構成図である。上記図中の符号は次のように説明される：

1は絶縁性（透明）基板； 2はリード； 3は絶縁層； 4は作用極； 5は対極； 6 は反応試薬固定化層； 7は吸収層； 8は展開層； 9は反応層； 1 0はスぺ一サ； 1 1はカバー； 1 2は試料供給口； 1 3は検体； 1 4は光源； 1 5は光学的検出用窓； 1 6は受光 *子； 1 7はセンサチップ； 1 8はポータブルメータ； 1 9はチップ揷入口； 2 0は液晶表示画面； 2 1はスィッチ； 2 2はマイクロコンピュ一夕； 2 3は光源 1 4および電圧印加回路； 2 4は受光素子' 1 6および電流測定回路； 2 5はタイマ； 2 6はブザ一； 2 7はパッテリである。好適具体例の説明

本発明において、検査方法に関する内容および検査装置に関する内容の順に記す。まず検査方法における反応試薬について以下に説明する。

本発明に用いられる脱水素酵素としては、 D— G a l、 L— L e uを含む分岐鎖アミノ酸、 L一 P h eを基質として、さらに還元型補酵素を生成する酵素であれば特に制限はなく、また由来についても特に限定されることはない。

電子メディェ一夕としては、'還元型補酵素およびテトラゾリゥム塩とすみや'かに酸化還元反応を行う物質であれば特に限定はない。例えばキノン類、ジァホラーゼ、シトクロム類、ピオロゲン類、フエナジン類、フエノキサジン類、フエノチアジン類、フェリシアン化物、フェレドキシン類、フエ口センおよびその誘導体等を用いることができる。その中でもフエナジン類がここでは応答の安定性が見られ、特に 1—メトキシ P M Sは保存安定性が良いことや還元型補酵素およびテトラゾリゥム塩との反応性も優れることから、本発明における電子メデイエ一夕として好ましいことを見出した。

テトラゾリゥム塩としては、ホルマザンを生成するものであれば特に限定はなく、その中でも 2— ( 4—ョードフエニル）一 3— ( 4—二トロフエニル）一 5 一（2， 4 一ジスルホフエニル) 一 2 H—テトラゾリゥム， 1ナトリウム塩 (W S T - 1 ) は還元したときに生成されるホルマザンが水溶性で化学的に安定であり、また生成したホルマザンが本発明の光学的および電気化学的検出方法において良好な応答を示すことから、本発明におけるテトラゾリゥム塩として好ましいことを見出した。

以上の反応試薬をあらかじめ固定化することで、生体試料を接触させるだけで溶解、混合し一連の反応が進行して最終的にホルマザンが生成される方法を構築できる。反応試薬溶液を反応の場に塗布、乾燥することで実現でき、固定化した後、遮光と除湿を行うことで保存安定性が向上する。

次に、検査装置に関する内容を以下に説明する。

本発明に用いられる上記反応試薬を固定化した層状構造体を有する試験紙（センサチップ）は、生体試料との反応により最終的に生成されるホルマザンを、光学的および電気化学的検出の双方もしくはどちらか一方の手法を組み合わせ利用する。

本発明の電気化学的検出に用いられる電極系としては、導電性物質であり、電気化学的に安定であれば特に限定はなく、材料については力一ボン、金、銀、銀

Z塩化銀、ニッケル、白金、白金黒およびパラジウム等、ならびにそれらの合金を使用することができる。その中でも種々の材料を検討した結果、カーボン材料が安価で化学的に安定しており、本発明における電極系の作用極として好ましいことを見出した。

ここでの力一ボン材料とは、カーボンを含む材料全般を意味する。利用できるカーボン材料は特に限定されるものではなく、従来のカーボン電極において使用されているものであれば良く、例えばカーボンファイバ、カーボンブラック、力一ポンぺ一スト、グラッシ一力一ボン、グラフアイト等を使用することができる。このような力一ボン材料は常套の方法によって絶縁性の基板上に電極部分として形成される。通常、カーボン材料を樹脂パインダ一等によりペースト状にしたものをスクリーン印刷し、それを加熱乾燥することにより形成できる。

印刷方法としては、スクリーン印刷に限定されることは特になく、その他、グラビア印刷、オフセット印刷、インクジェット印刷等が応用できる。

対極は、参照極も兼ねる 2電極系を前提としているため、ここでは銀塩化銀を選択し、また電極反応部分と電気化学的検出回路との接続部分であるリ一ドは、最も導電性の優れた銀をここでは選択し、スクリーン印刷により形成した。

絶縁性基板としては、ガラス、ガラスエポキシ、セラミックス、プラスチック等が挙げられるが、電極部分の印刷形成の際や試料の添加の際に侵されない物質であれば特に限定はない。例えばポリエステル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレ一ト（P E T )、ポリスチレン、ポリプロピレン等のプラスチックフィルムが安価であり、さらに導電性インクとの密着性や加工性の良さから、ここでは P E Tフィルムが好ましいことを見出した。

なお、光学的検出に際してはホルマザンの呈色反応を比色定量するため、前記絶縁性基板は無色透明である材料を選択し、測定波長における吸収がないことと、光源光照射用の窓を必要とする。

カバ一とスぺーサおよびそれらを接着する材料は、検体である生体試料に侵されることなく、反応試薬固定化層を保持し、一連の反応への阻害がなく、反応部分への外部からの接触を保護できれば、形状、材質等の限定は特にない。

反応試薬固定化層は、吸収層、展開層、反応層の 3層からなり材質はそれぞれポリプロピレン、ニトロセルロース、ポリエーテルスルホンである。なお、単層構造でも構わず、反応試薬の劣化も見られなく、検体の分離能も高く、生体試料との親和性も高ければ、特に限定はない。

センサチ'ップを利用して定量する際の小型で携帯性を有する測定装置（ポー夕ブルメータ）を以下に記す。

. ポータブルメータは、センサチップとの接続ができ、光学的検出回路および電気化学的検出回路を有し、ホルマザン濃度を検出したのち、生体試料に含まれる各基質の濃度に換算して、検査結果を表示する機能を有する。

光学的検出回路には、ホルマザンの吸収波長を照射する光源と、反射光の受光素子を必要とする。

電気化学的検出回路には、一定電圧を印加する回路と、電流検査回路を必要とする。

スィツチは、電源用としてまた各種設定時に使用する。なお図中に記載したが、自動化を行えば特に必要はない。実施例

以下に本発明の実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例 1 センサチップの作製

図 1は、センサチップの一作製例を示したもので、主要構成部分の分解斜視図である。なお、センサチップは、光学的検出用の透明な窓 1 5と、スクリーン印刷により形成された電極系と、反応試薬が固定化された層状構造体 6と、スぺーサ 1 0およびカバー 1 1とからなる。まず電極系は、 P ETフィルム（東レ（株）製）の絶縁性基板 1に導電性銀ィンク（日本アチソン（株）製）をスクリーン印刷後、加熱乾燥（ 1 20^ 1 5 分間）してリード 2を形成した。次に作用極 4、対極 5への各接続部分を残し絶縁性インク（日本アチソン（株）製）を用いて絶縁層 3を形成（紫外線照射により硬化）した。その上に、導電性グラフアイトインク（日本アチソン（株）製）を用いて作用極 4を、導電性銀 Z塩化銀インク（日本アチソン（株）製）を用いて対極 5をスクリーン印刷し加熱乾燥（ 1 2 0で， 1 5分間）して電極系を印刷により積層形成した。

続いて反応試薬固定化詹 6について、酵素反応の至適 p Hを調整するた'めの緩衝成分は、吸収層 7であるポリプロピレン製メンブレン（日本ミリポア（株）製）に溶液状で吸収、乾燥（40°C, 1 5分間）させ固定化した。

電子メディェ一夕である 1ーメトキシ PMS ((株）同仁化学研究所製）は、超純水に溶解させたのち、展開層 8であるニトロセルロース製メンブレン（日本ミリポア（株）製）に吸収、乾燥（40°C， 1 5分間）させ固定化した。

テトラゾリゥム塩である WS T— 1 ((株）同仁化学研究所製）と各基質に対応する脱水素酵素および補酵素である酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+) (オリエンタル酵母（株）製）は、リン酸緩衝液（pH 7. 4, 2 0 mM) に溶解させたのち、反応層 9であるポリエーテルスルホン製メンブレン (日本ポール（株）製）に吸収、乾燥（40^, 1 5分間）させ固定化した。以上必要とする反応試薬を固定化した層状構造体である反応試薬固定化層 6を、印刷形成した電極上にスぺーサ 1 0を介して配置し、カバ一 1 1により被覆してセンサチップ 1 7 とした。実施例 2 センサチップの基本応答

実施例 1における作製手順に従い GE、 MS UD、 PKU検査用の専用センサチップを作製した。なお、 D— G a 1、 L一 L e uを含む分岐鎖アミノ酸、 L一 P h eの各基質に特異的な脱水素酵素のみを変更し、他の反応試薬は全て同一とした。

GE検査用センサチップには、 D— G a 1脱水素酵素（E C 1. 1. 1. 4 8 , ロシュ · ダイァグノスティックス（株）製）を使用した。

なお、リン酸化された G a l (ガラクト一ス— 1一リン酸）も併せて定量する際は、アルカリフォスファターゼ（E C 3. 1. 3. 1 ) を共存させることで可能となる。

M S UD検査用センサチップには、 L一 L e u脱水素酵素（E C 1. 4. 1. 9，東洋紡績（株）製）を、 P KU検査用センサチップには、 L— P h e脱水素酵素（E C 1. 4. 1. 2 0, ュニチカ（株）製）を用いた。

3種類のセンサチップの基本応答を、種々の濃度に調製した各基質の標準溶液を用いて求めた。 '

光学的検出は、光源（安藤電気（株）製）から任意の波長の可視光を光フアイパにより絶縁性基板上に配置された反応試薬固定化層の最下面に照射し、その反射光量を測定した（（株）アドバンテスト製）。検体を点着後、ここでは酵素反応および酸化還元反応に要する時間として 1 2 0秒間静置し、ホルマザンの呈色反応を比色測定した。

ホルマザンの呈色反応は p Hにより極大吸収波長がシフトする。本発明の利用 p H領域ではおよそ 4 5 0 nmから 6 0 0 n mの波長領域に極大吸収波長が確認された。

電気化学的検出は前記同様に、検体を点着後、酵素反応および酸化還元反応に要する時間として 1 2 0秒間静置し、ホルマザンの酸化電位である + 5 0 0 mV を対極を基準に印加してその際に発生したホルマザンの酸化電流を測定した（北斗電工（株）製）。

2 mMまでの濃度領域において、 2種類の検出方法および各センサチップは、基質濃度に依存的な応答を示した。実施例 3 ポータブルメータの製作

G E、 M S UDおよび P KU検査用センサチップを用いた測定装置であるポー夕ブルメータを図 4に示し、測定手順を以下に説明する。

各センサチップ 1 7を、チップ揷入口 1 9よりポータブルメータ 1 8に装着する。このとき、スィッチ 2 1によりメータを作動させるか、もしくは自動作動なのかは特に限定されない。

検体 1 3をセンサチップ 1 7に点着させ測定を開始する。この際もスィッチ 2 1により開始させるか、自動開始なのかは特に限定されない。

タイマ 2 5により酵素反応および酸化還元反応をある一定時間進行させて、その後光学的および電気化学的検出を行う。

光学的検出方法は、絶縁性基板上 1の反応試薬固定化層 6の最下面（光学的検出用窓 1 5 ) に光源光をある一定時間照射して（図 4の 2 3に相当）、その際の反射光量を受光素子で測定する（図 4の 2 4に相当）。

電気ィ'匕学的検出方法は、センサチップ電極系に対して新定の電圧を印加する（図 4の 2 3に相当）。その際に生じた応答電流値を測定する（図 4の 2 4に相当）。それらの測定値を電流—電圧変換おょぴアナログ—デジタル変換等の種々の変換を行いマイクロコンピュータ 2 2により基質濃度を換算して、液晶表示画面 2 0に結果表示する。

また、ブザー 2 6を搭載し操作性を向上させ、パッテリ 2 7駆動により携帯性を高めた。

なお、本ポータブルメータは、 3種類の専用チップを自動識別し、一連の測定を実行してそれぞれの結果表示を行う。また、複数項目を検査する際、検体採取の煩雑さや、 1項目毎に測定終了を待つなど検査時間の短縮等の改善を目的として、全 3項目をほぼ同時に検査可能とするためにチップ揷入口を 3チャンネル化することも可能である。実施例 4 センサチップとポータブルメータの基本応答

実施例 1で作製した G E、 M S U Dおよび P K U検査用の 3種類のセンサチップと実施例 3で製作したポー夕プルメータを用いて基本応答を測定した。

測定手順は実施例 3に従い、各専用チップを装着後、それぞれの基質標準溶液を点着させた。ここでは一連の反応時間を 1 2 0秒間とし、その後光学的検出を行い電気化学的検出の順に連続的に実施した。電気化学的検出では、ホルマザンを電解酸化させるため、変化を生じさせない光学的検出を先に行った。

続いて、光学的および電気化学的な各応答を比較し、その差がある基準内であれば、' 基質濃度への換算を行い結果表示を行い、基準外であればエラー表示とする。

なお、光学的検出回路における構成は、ここでは光源にピーク波長 5 9 0 n m の高輝度発光ダイオード（日本ヒューレット ·パッカ一ド（株）製）と、受光素子にフォトダイオード（日本テキサス ·ィンスツルメンッ（株）製）を利用した。また、電気化学的検出回路は、種々の半導体素子により構成した。

上記実施例では、センサチップに関して特定の形状を図示したが、電極形状、電極、リードおよび絶縁層の配置、反応試薬固定化層の形状や配置、力パーおよびスぺーサの形状や配置、外形^は限定されるものではない。 ' また、ポ一夕プルメ一夕に関しても特定の形状を図示したが、それに限定されるものではない。

さらなる高精度検出を実現するには、光学的検出に閧しては測定波長に加え参照波長用に光源を増やした 2波長測定があり、電気化学的検出に関しては参照電極を加えた 3電極系測定がある。

Claims

請求の範囲

1 . 先天性代謝異常症であるガラク卜一ス血症、メ一プルシロップ尿症、フエ二ルケトン尿症の 3疾患に対して、同時検査を可能とする検査方法。

2 . 前記ガラクト一ス血症、メープルシロップ尿症、フエ二ルケトン尿症の測定対象物質である D—ガラクト一ス、 L一口イシンを含む分岐鎖アミノ酸、 Lーフェニルァラニンを同時に定量することによって、同時検査を可能とする請求項 1 記載の検査方法。

3 . 前記 D—ガラクトース、 L一口イシンを含む分岐鎖アミノ酸、 L —フエニルァラニンの定量において、少なくとも D—ガラクトース脱水素酵素、 L一口イシン脱水素酵素、 L一フエ二ルァラニン脱水素酵素の各脱水素酵素と捕酵素と電子メディエー夕およびテトラゾリゥム塩からなる反応試薬と、前記生体試料による酵素反応および酸化還元反応により、生成したホルマザンの濃度を定量することによって、同時検査を可能とする請求項 1または 2に記載の検査方法。

4 . 前記反応試薬を試験紙に固定化することで、前記生体試料を接触させるだけで前記反応試薬が溶解し混合されて、前記酵素反応および前記酸化還元反応を経て前記ホルマザンが生成されることを特徴とする請求項 1から 3のいずれかに記載の検査方法。

5 . 前記ホルマザンは、光学的手法および電気化学的手法の双方もしくはどちらか一方を用いることによって定量が可能となることを特徴とする請求項 1から 4 のいずれかに記載の検査方法。

6 . 前記光学的手法とは、前記ホルマザンの吸収波長を照射することによる反射光量を測定することを特徴とする請求項 1から 5のいずれかに記載の検査方法。

7 . 前記電気化学的手法とは、前記ホルマザンに電極系によりある一定電圧を印加することで発生した電流を測定することを特徴とする請求項 1から 6のいずれかに記載の検査方法。

8 . 先天性代謝異常症であるガラクト一ス血症、メープルシロップ尿症、フエ二ルケトン尿症の 3疾患に対する同時検査が可能な手段を有する検査装置。

9 . 前記ガラクトース血症、メ一プルシロップ尿症、フエ二ルケトン尿症の測定対象物質であ'る D—ガラクト一ス、 L—ロイシンを含む分岐鑌アミノ酸、 Lーフェニルァラニンを同時に定量し、同時検査が可能な手段を有する請求項 8記載の検査装置。

1 0 . 前記ガラクト一ス血症、メ一プルシロップ尿症、フエ二ルケトン尿症の 3 疾患に対する同時検査は、試験紙と測定装置を用いることを特徴とする請求項 8 または 9 .に記載の検査装置。

1 1 . 前記試験紙は、前記 D—ガラクト一ス、 L一口イシンを含む分岐鎖ァミノ酸、 L一フエ二ルァラニンの定量において、少なくとも D —ガラクトース脱水素酵素、 L一口イシン脱水素酵素、 L一フエ二ルァラニン脱水素酵素の各脱水素酵素と補酵素と電子メディエータおよびテトラゾリゥム塩からなる反応試薬を固定化したことを特徴とする請求項 8から 1 0のいずれかに記載の検査装置。

1 2 . 前記試験紙は、光学的検出用の窓と電気化学的検出用の電極系を有することを特徴とする請求項 8から 1 1のいずれかに記載の検査装置。

1 3 . 前記電極系は、少なくとも作用極と対極からなることを特徴とする請求項 8から 1 2のいずれかに記載の検査装置。

1 4 . 前記測定装置は、前記試験紙を装着して使用し、光学的検出回路および電気化学的検出回路の双方もしくはどちらか一方を有することを特徴とする請求項

8から 1 3のいずれかに記載の検査装置。

1 5 . 前記光学的検出回路は、光源と受光素子からなることを特徴とする請求項 8から 1 4のいずれかに記載の検査装置。

1 6 . 前記電気化学的検出回路は、電圧印加回路と電流検出回路からなることを特徴とする請求項 8から 1 5のいずれかに記載の検査装置。

1 7 . 前記測定装置は、前記装置の装着部に装着されたものを自動識別する機能を有することを特徵とする請求項 8から 1 6のいずれかに記載の検査装置。

1 8 . 前記 D—ガラクト一ス、 L—ロイシンを含む分岐鎖アミノ酸、 L一フエ二ルァラニンの定量における測定対象は、血漿、血清、全血、唾液、尿等の生体試料および食品試料等、さらに液状化が可能な試料も利用可能であることを特徴とする請求項 8から 1 7のいずれかに記載の検査装置。