JP2012058168A - バイオセンサ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料中の特定成分についてその濃度等を高感度に測定し、かつ安価に製造可能なバイオセンサ及びその製造方法を提供すること。
【解決手段】本発明のバイオセンサは、絶縁性を有する表面を含む第１の基材と、第１の基材の絶縁性を有する表面上に配置された接着層と、接着層を介して第１の基材に固着された電極系及び配線部と、を備え、電極系は上部電極層と下部電極層と、を含み、下部電極層は上部電極層よりも導電性の高い材料で形成され、電極系は作用極及び対極を含み、作用極上に位置する酵素及び電子受容体を含む酵素反応部を備え、下部電極層と配線部とは一体で構成されている。
【選択図】図１

Description

本発明はバイオセンサに関し、特に試料中の特定成分を高感度に測定するバイオセンサ及びその製造方法に関する。

血液等の生体試料中の特定成分について迅速かつ簡便に濃度等を測定する方法として、電気化学的検出手段によるバイオセンサが実用化されている。このようなバイオセンサの一例として、電気化学的に血液中のグルコースを定量化するグルコースセンサがある。

グルコースセンサでは、作用極と対極を含む電極系、酵素及び電子受容体を基本構成として備えている。酵素は血液中のグルコースを選択的に酸化してグルコン酸を生成し、また同時に電子受容体を還元して還元体を生じる。この還元体に電極系で一定の電圧を印加することで還元体が再び酸化され、その際に電流が発生する。この電流が血液中のグルコース濃度に依存することから、血液中のグルコースを定量化することができる。

従来のバイオセンサでは銀ペーストをスクリーン印刷することでリード配線を形成し、リード配線上に導電性カーボンペーストを印刷して電極系を形成していた（特許文献１、特許文献２参照）。従来のバイオセンサでは電極系を導電性カーボンで形成するため、配線の抵抗が大きなものとなり、電極表面の電位にばらつきが生じやすく、グルコース濃度の測定精度の低下につながっていた。また、銀ペーストは、空気に触れている面は酸化し易く酸化銀となり高抵抗となるため、リード配線の配線抵抗が安定しない。

特許文献３には、絶縁性基板上に導電層を備え、導電層上に設けた第１炭素層と、第１炭素層を覆う第２炭素層を備えた電気化学センサが提案されている。しかし、特許文献３における電気化学センサでは長時間測定、繰り返し測定を目的としており、用いる導電層、特に参照極の材料に貴金属を用いざるを得ない、且つ真空成膜により形成する必要がある等の制約があり、そのような電気化学センサを製造するには材料コスト、工程の増加を招くという問題があった。さらに絶縁性基板と導電層の密着を高めるためにＣｒ、Ｔｉ等の密着性の導電層を形成する必要があり、更なる工程及びコスト増を招くという問題があった。

特開平８−１５２２０号公報 特開平８−５６００号公報 国際公開第ＷＯ２０１０／００４６９０号パンフレット

グルコースセンサ等に代表される医療用のバイオセンサは使い捨てで、患者は次の検査時には新しいバイオセンサを使用する。また、測定時間も数秒〜数十秒と非常に短く、長時間の測定安定性は求められない。このような使い捨て型のバイオセンサにおいては、（１）高感度であること、（２）材料及び製造にかかるコストが低いこと、が主として望まれる。しかし、上述の従来技術ではこれらの要請に応えることは困難であった。

上記の実情を鑑みて、本発明の目的は、試料中の特定成分についてその濃度等を高感度に測定し、かつ安価に製造可能なバイオセンサ及びその製造方法を提供することにある。

本発明の一実施形態によると、絶縁性を有する表面を含む第１の基材と、前記第１の基材の前記絶縁性を有する表面上に配置された接着層と、前記接着層を介して前記第１の基材に固着された電極系及び配線部と、を備え、前記電極系は上部電極層と下部電極層と、を含み、前記下部電極層は前記上部電極層よりも導電性の高い材料で形成され、前記電極系は作用極及び対極を含み、前記作用極上に位置する酵素及び電子受容体を含む酵素反応部を備え、前記下部電極層と前記配線部とは一体で構成されていることを特徴とするバイオセンサが提供される。

上部電極層と、上部電極層よりも導電性の高い、すなわち低抵抗の材料で形成された下部電極層とを積層することにより、従来に比べて電極系の抵抗値を大幅に下げることができ、高感度のバイオセンサを提供することができる。また、下部電極層と配線部とを一体的に構成することにより、さらに高感度のバイオセンサを提供することができ、かつ簡便に製造可能なバイオセンサを提供することができる。

前記バイオセンサにおいて、前記下部電極層と前記配線部は同一の材料から構成されてもよい。これにより、より簡便に製造可能なバイオセンサを提供することができる。

前記バイオセンサにおいて、前記電極系は少なくとも１つの参照極を含み、前記参照極は、上部電極層と下部電極層と、を含み、前記下部電極層は前記上部電極層よりも導電性の高い材料で形成されてもよい。これにより、従来に比べて電極系の抵抗値を大幅に下げることができ、高感度のバイオセンサを提供することができる。

前記バイオセンサにおいて、前記作用極、前記対極及び前記参照極は、前記下部電極層の少なくとも一部に前記上部電極層を被覆して形成されてもよい。上部電極層で被下部電極層を被覆することで、下部電極層の防錆に寄与し、酵素と下部電極層との直接の接触を防止することができる。

前記バイオセンサにおいて、前記上部電極層はカーボンを含み、前記下部電極層及び前記配線部はアルミニウム、銅、鉄のいずれか１種あるいは、アルミニウム、銅、鉄を１種以上の合金を含むようにしてもよい。アルミニウム、銅、鉄のいずれか１種あるいはこれらを１種以上含む合金により形成することで、従来の銀ペーストによる電極層に比して薄く形成することができるため、電極層の抵抗を抑え、感度を高めることができる。また、カーボンを含む上部電極層で下部電極層を被覆することで、下部電極層の防錆に寄与し、酵素と下部電極層との直接の接触を防止する。

前記バイオセンサにおいて、前記上部電極層はカーボン顔料及び有機バインダーを含み、前記上部電極層の厚みが０．３μｍ以上３０μｍ以下であるようにしてもよい。導電性カーボン顔料及び有機バインダーを含有するインキを印刷法により下部電極層に塗布することで、簡便に上部電極層を形成することができる。また、上部電極層の厚みを０．３μｍ以上３０μｍ以下とすることで、上部電極層を挟んだ酵素反応部と下部電極層との隔絶を保証することが可能となり、電極層の物理的、電気的安定性を確保することができる。

前記バイオセンサにおいて、前記第１の基材側上に、第２の基材、第３の基材が順に積層され、前記第２の基材は、前記第２の基材の外縁及び前記作用極に通じる試料供給路を備え、前記第３の基材は前記第２の基材を覆うように前記第１の基材に固着されているように構成してもよい。このように構成されることより、外部から供給される試料を作用極に導くことができ、かつ、第３の基材が第２の基材を覆うように第１の基材に固着されることで、外部から供給される試料や酸素が下部電極層を腐食するのを防ぐことができる。

前記バイオセンサにおいて、前記試料供給路に接続され前記第２の基材の外縁に通じる流路を有していてもよい。このように構成されることより、外部から試料が供給された場合に、試料供給路内の空気が逃げる空気抜き流路として機能する。

本発明の一実施形態によると、第１の基材の絶縁性を有する表面上に接着層を形成し、前記接着層に金属箔を貼合し、該金属箔をパターニングして下部電極層及び該下部電極層に一体で構成された配線部を形成し、前記下部電極層の上部表面にカーボンを含む上部電極層を形成し、作用極及び対極を含む電極系を形成することを特徴とするバイオセンサの製造方法が提供される。

接着層を介して金属箔を第１の基材の表面に貼合して下部電極層を形成することで、従来の銀ペーストを印刷するよりも、厚さを均一にすることができる。また、下部電極層と配線部とを一体的に構成することにより、高感度のバイオセンサを提供することができ、かつ簡便にバイオセンサを製造することができる。

前記バイオセンサの製造方法において、前記上部電極層は、印刷法によりカーボンを前記下部電極層の一部に被覆してもよい。これにより、簡便に上部電極層を形成することができる。

前記バイオセンサの製造方法において、基材の上面及び下面に接着層を形成し、試料供給路及び空気抜き流路を形成して第２の基材を製造し、前記第２の基材と、第３の基材とを貼合し、前記電極系を形成した前記第１の基材の面と、前記第２の基材及び前記第３の基材とを貼合してもよい。これにより、外部から供給される試料を作用極に導くことができ、かつ、第３の基材及び第２の基材が第１の基材に貼合されることで、外部から供給される試料や酸素が下部電極層を腐食するのを防ぐことができる。

本発明によると、試料中の特定成分についてその濃度等の測定を高感度に行うことができる。また、本発明によると、安価に製造可能なバイオセンサ及びその製造方法が提供される。

一実施形態に係る本発明のバイオセンサ１０００を示す模式図であり、（ａ）はバイオセンサ１０００の全体図を示し、（ｂ）はバイオセンサ１０００の分解図である。 一実施形態に係る本発明のバイオセンサの電極系１００について説明する図であり、（ａ）は電極系１００の上面の斜視図であり、（ｂ）は（ａ）におけるＡ−Ａ’断面図を示す。 一実施形態に係る本発明の親水性高分子層１０７を形成したバイオセンサの電極系２００の模式図であり、（ａ）は電極系２００の上面の斜視図であり、（ｂ）は（ａ）におけるＡ−Ａ’断面図を示す。 一実施形態に係る本発明の親水性高分子層１０７を形成したバイオセンサの電極系３００の模式図であり、（ａ）は電極系３００の上面の斜視図であり、（ｂ）は（ａ）におけるＡ−Ａ’断面図を示す。 一実施形態に係る本発明の親水性高分子層１０７を形成したバイオセンサの電極系４００の模式図であり、（ａ）は電極系４００の上面の斜視図であり、（ｂ）は（ａ）におけるＡ−Ａ’断面図を示す。 一実施形態に係る本発明のバイオセンサの電極系の模式図であり、（ａ）は電極系５００を示し、（ｂ）は電極系６００を示す。 一実施形態に係る本発明のバイオセンサ１０００の製造方法について説明する図であり、（ａ）〜（ｅ）はバイオセンサ１０００の製造過程を示し、図２（ａ）のＡ−Ａ’断面に相当する図である。 一実施形態に係る本発明のバイオセンサ１０００の製造方法について説明する図であり、（ａ）〜（ｄ）は、第２の基材１１００及び第３の基材１２００を形成し、第１の基材１７０上に形成した電極系１００を貼付し、バイオセンサ１０００を製造する工程を示す図である。（ａ）〜（ｄ）は、図２（ａ）のＡ−Ａ’断面に相当する図であり、（ｅ）は図２（ａ）のＢ−Ｂ’断面に相当する図である。 一実施例に係る本発明のバイオセンサ１０００のグルコース検出特性を示す図である。

以下、図面を参照して本発明に係るバイオセンサ及びその製造方法について説明する。但し、本発明のバイオセンサは多くの異なる態様で実施することが可能であり、以下に示す実施の形態及び実施例の記載内容に限定して解釈されるものではない。なお、本実施の形態及び実施例で参照する図面において、同一部分又は同様な機能を有する部分には同一の符号を付し、その繰り返しの説明は省略する。

（１．バイオセンサの構造）
本発明の実施形態に係るバイオセンサ１０００の電極構造について説明する。図１は本発明の実施形態に係るバイオセンサ１０００の一例を示す模式図である。バイオセンサ１０００は電極系１００及び配線部１５０の上部に、試料供給路１５１０を形成するためのスペーサである第２の基材１１００、試料供給路１５１０の上部カバーである第３の基材１２００が第２の基材を覆うように、順次に積層され、固着される。図１（ａ）はバイオセンサ１０００の全体図を示し、説明の便宜上、第２の基材１１００及び第３の基材１２００を透過させた透視図としている。また、図１（ｂ）はバイオセンサ１０００の分解図である。

電極系１００は、第１の基材１７０上部表面に形成した作用極１１０、対極１２０及び参照極１３０を含む。作用極１１０、対極１２０及び参照極１３０の表面の一部には、上部電極層１０３がそれぞれ形成され、作用極１１０には上部電極層１０３の上部表面の一部に酵素反応部１０５がさらに形成される。

電極系１００及び配線部１５０の上部に形成された第２の基材１１００は、作用極１１０の酵素反応部１０５、対極１２０及び参照極１３０の上部電極層１０３の上部に、例えば第２の基材１１００の外縁に通じるＴ字状の流路を形成するように配置する。Ｔ字状の流路は、作用極１１０の酵素反応部１０５、対極１２０及び参照極１３０の上部電極層１０３の上部に直線上に配置された空気抜き流路１５３０と、空気抜き流路１５３０に直交し、作用極１１０の酵素反応部１０５の上部を通過する試料供給路１５１０とにより形成される。バイオセンサ１０００は、試料供給路１５１０と、空気抜き流路１５３０とを有することで、試料供給路１５１０から毛細管現象を利用し、測定する試料を作用極１１０、対極１２０及び参照極１３０の上部を通過させ、試料の目的成分を測定することができる。

図２は本発明の実施形態に係るバイオセンサの電極系１００について説明する図であり、図２（ａ）は電極系１００の上面の斜視図であり、図２（ｂ）は図２（ａ）におけるＡ−Ａ’断面図を示す。本発明における電極系１００は、上部電極層１０３、下部電極層１０１が積層した電極を用い、電極が接着層１８０を介して基材１７０に固着される。本発明の実施形態に係るバイオセンサの電極系１００においては、下部電極層１０１と配線部１５０とが一体で構成され、下部電極層１０１の少なくとも一部に上部電極層１０３を配置したことに特徴がある。これにより、簡便に高感度のバイオセンサを得ることができる。以下、本発明の実施形態に係るバイオセンサ１０００の各構成要素について、詳細に説明する。なお、本実施例において、上部電極層１０３を下部電極層１０１の側面にも被覆しているが、上部電極層１０３は下部電極層１０１の上部表面のみに形成してもよい。

（基材）
第１の基材１７０は、電極系１００を支持する基材であり、少なくとも電極系１００が配置される面は絶縁性を有する。第１の基材１７０は、例えば、樹脂基材、セラミック基材、ガラス基材、少なくとも表面が絶縁された半導体基材や金属基材などを用いることができる。第１の基材１７０は、剛体であってもよく、弾性体であってもよい。中でも電気絶縁性を有する弾性体を用いることが好ましく、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリスチレン（ＰＳ）樹脂、ポリプロピレン（ＰＰ）樹脂等のフィルムを好適に用いることができる。第１の基材１７０の形状、大きさ、厚さは、本発明のバイオセンサを接続して使用する装置の接続部の形状等により、適宜設定することができる。

（電極系）
上述したように、電極系１００は、作用極１１０、対極１２０及び参照極１３０を含み、作用極１１０は還元体の電子受容体に電圧を印加するための一方の電極である。作用極１１０は第１の基材１７０上に配置された下部電極層１０１と下部電極層１０１の表面に配置された上部電極層１０３を備える。さらに作用極１１０の上部表面には酵素反応部１０５が配置される。酵素反応部１０５は、酵素と電子受容体とを混合したものであってもよく、酵素と電子受容体とを別々に積層したものであってもよい。本実施形態では、酵素反応部１０５を作用極１１０の上部表面に直接配置した態様を用いて説明しているが、酵素反応部１０５は空間を介して作用極１１０に対向するように配置されてもよい。

対極１２０は電子受容体から作用極１１０に放出された電子によって流れた電流を計測するための一方の電極である。対極１２０は第１の基材１７０の上部表面に配置された下部電極層１０１と下部電極層１０１の表面に配置された上部電極層１０３とを備えている。

参照極１３０は、作用極１１０の電位を決定する際の基準となる電極である。参照極１３０は第１の基材１７０の上部表面に配置された下部電極層１０１と下部電極層１０１の表面に配置された上部電極層１０３とを備える。本発明の実施形態に係るバイオセンサ１０００を使い捨てで使用する場合には、参照極１３０を作用極１１０、対極１２０と同様の構成とし、貴金属を用いずにアルミニウム、銅、鉄のいずれか１種あるいはこれらを１種以上の合金等の安価な金属を利用し、コスト削減を図ることができる。使い捨てで使用する場合には、試料液中での参照極１３０の酸化還元電位の安定性が高いことを特に要しないためである。

本発明の実施形態に係るバイオセンサ１０００に用いる下部電極層１０１は、アルミニウム、銅、鉄のいずれか１種あるいはこれらを１種以上含む合金からなることが好ましい。下部電極層１０１の厚さは０．０２μｍ以上４０μｍ以下の範囲とすることが好ましい。厚さ０．０２μｍ未満であると下部電極層１０１の抵抗値が十分高くなり目的とする電極が得られなくなり、また４０μｍより大きくなると上部電極層１０３との積層や、試料供給路１５１０及び空気抜き流路１５３０の形成に三次元的な高い加工精度が要求され、加工金型の使用数や加工工程・時間が飛躍的に増える。下部電極層１０１は上記の金属材料からなる金属層の単層であってもよく、複数の金属層を積層した態様であってもよい。特に、下部電極層１０１は、金属箔で形成するのが好ましい。金属箔で形成すると、従来の銀ペーストを印刷するよりも、厚さを均一にすることができる。また、金属箔をエッチングによりパターニングすることで、下部電極層１０１の幅を均一にすることができる。本実施形態に係る下部電極層１０１は、アルミニウム、銅、鉄のいずれか１種あるいはこれらを１種以上含む合金により形成されるため、従来の銀ペーストによる電極層に比して薄く形成することができるため、電極層の抵抗を抑え、感度を高めることができる。また、上述の材料を用いることで、下部電極層１０１の表面処理を行うことなく、カーボン顔料を含む上部電極層１０３を形成することができる。

上部電極層１０３は、導電性を有する材料で形成した被覆層であり、下部電極層１０１の表面保護を行うとともに、電極の一部として機能するものである。上部電極層１０３は例えば、カーボン顔料と有機バインダーの混合物により形成することができる。本発明の実施形態に係るバイオセンサ１０００に用いるカーボン顔料としては、例えば、黒鉛、アモルファスカーボン、ダイヤモンドライクカーボン、カーボンファイバー、カーボンブラック、アセチレンブラック、ケッチェンブラック（登録商標）、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、カーボンナノファイバー等を用いることができる。有機バインダーとしてはアクリル樹脂、エステル樹脂、塩ビ樹脂、塩酢ビ樹脂等を用いることができる。

本発明の実施形態に係るバイオセンサ１０００に用いる上部電極層１０３においては、カーボン顔料、有機バインダーはそれぞれ５重量％以上６０重量％以下、１０重量％以上４０重量％以下とすることが好ましい。カーボン顔料が５重量％未満であるとカーボン顔料同士が電気的接続を有する確率が急激に低下して電極層としての導電性が失われる。また、カーボン顔料が６０重量％より多いと顔料間の空隙が多くなり、物理的な賦型強度、接着強度、耐摩擦強度が失われて、要求される構造・機能が保持できなくなる。さらに、カーボン表面の酸化還元状態が安定せず、後工程で添加する酵素や電子受容体も空隙に不均一に吸着するようになる。また、有機バインダーが１０重量％未満であると、上部電極層１０３の塗工特性が低下して塗膜強度も低下することとなり、４０重量％より多いと、同様に上部電極層１０３の塗工特性が低下して導電性も低下することとなる。なお、上部電極層１０３には、後述するような助剤や添加剤等を添加してもよい。

上部電極層１０３の厚さは０．３μｍ以上３０μｍ以下の範囲とすることが好ましい。厚さが０．３μｍ未満であると上部電極層１０３を挟んで酵素反応部１０５と下部電極層１０１の隔絶が製造、保管、酵素反応の各条件、経時安定を保証する上で困難となり、また３０μｍより大きくなると電極層が脆弱になったり、抵抗値が上がったり等の問題が生じる。本実施形態に係る上部電極層１０３は、カーボン顔料で下部電極層１０１を被覆することで、下部電極層１０１の防錆に寄与し、酵素と下部電極層１０１との直接の接触を防止する。防錆を考慮すると、下部電極層１０１はアルミニウム、銅、鉄を１種以上含む合金で形成することが好ましいが、本実施形態に係る下部電極層１０１はアルミニウム、銅、鉄のいずれか１種を用いても、上部電極層１０３で被覆されているため、十分な防錆効果を奏する。

本実施形態に係る上部電極層１０３は、必要に応じて他の導電性顔料、硬化剤や架橋剤のような反応試薬、加工適性改善のための助剤や添加剤等をカーボン顔料と有機バインダーとに混合してもよい。また、上部電極層１０３の表面に機械的研磨やコロナ・プラズマのような放電手法による物理的エッチング等を施して、表面の活性化を向上させてもよい。なお、図２（ｂ）では上部電極層１０３を、電極系１００を構成する全ての電極に配置しているが、このような構成は必ずしも必須ではない。試料の供給方法によっては作用極１１０上にのみ配置することで充分である場合もある。また、試料液と下部電極層１０１との接触具合によっては、上部電極層１０３を下部電極層１０１の上部表面にのみ配置してもよい。

上部電極層１０３の上部には、親水性高分子層を形成することが好ましい。図３は、本発明の実施形態に係る親水性高分子層１０７を形成したバイオセンサの電極系２００の模式図であり、図３（ａ）は電極系２００の上面の斜視図であり、図３（ｂ）は図３（ａ）におけるＡ−Ａ’断面図を示す。対極１２０及び参照極１３０においては、上部電極層１０３の上部に親水性高分子層１０７を形成する。また、作用極１１０においては、上部電極層１０３及び酵素反応部１０５の上部に親水性高分子層１０７を形成する。親水性高分子層１０７を設けることにより、上部電極層１０３に接する血液はゲル状となり応答電流値は若干低下するが、赤血球や他のタンパク質などのセンサ応答への影響を低減することができる。

親水性高分子層１０７の別の配置例を図４及び図５に示す。図４（ａ）は電極系３００の上面の斜視図であり、図４（ｂ）は図４（ａ）におけるＡ−Ａ’断面図を示す。電極系３００は、作用極１１０においては、上部電極層１０３と酵素反応部１０５との間に親水性高分子層１０７を配置した点で電極系２００と異なる。また、図５（ａ）は電極系４００の上面の斜視図であり、図５（ｂ）は図５（ａ）におけるＡ−Ａ’断面図を示す。電極系４００は、作用極１１０においては、上部電極層１０３よりも試料供給路１５１０の開口部側に親水性高分子層１０７を配置した点で電極系２００と異なる。電極系３００及び電極系４００においても、親水性高分子層１０７を設けることにより、血液はゲル状となり応答電流値は若干低下するが、赤血球や他のタンパク質などのセンサ応答への影響を低減することができる。

親水性高分子としては、カルボキシルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニル酢酸、ポリビニルブチラール等、またはこれらの混合物を用いることができる。親水性高分子層１０７の厚さは５０ｎｍ以上２μｍ以下の範囲とすることが好ましい。厚さが５０ｎｍ未満であると親水性高分子層を均一に形成することが困難で、たとえ均一に形成しても上部電極層１０３の表面の凹凸の影響を受け本来の性能を生じなくなり、また２μｍより大きくなると親水性高分子層１０７の溶解に時間が掛かり、正確な測定が出来なくなる。

作用極１１０、対極１２０、参照極１３０にはそれぞれ下部電極層１０１により形成された配線部１５０が電気的に接続されており、電極系１００と配線部１５０とは一体で構成されている。配線部１５０により電極系１００への電圧印加、電気信号の取り出しを行うことができる。作用極１１０、対極１２０を炭素よりも低抵抗の金属材料と炭素材料との積層構造とすることにより、従来に比べて電極系１００の抵抗値を大幅に下げることができ、高感度のバイオセンサを提供することができる。また、配線部１５０と電極系１００を一体的に構成することにより、さらに高感度のバイオセンサを提供することができる。さらに参照極１３０に貴金属を用いる必要がないため、製造コストを低減することができる。

（酵素反応部）
本発明の実施形態に係るバイオセンサ１０００において、酵素反応部１０５は、酵素と電子受容体とを含む。グルコース濃度を測定する場合には酵素としてグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を用いることができる。電子受容体はフェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体、オスミューム誘導体等を用いることができる。酵素と電子受容体は、適宜溶媒で希釈して用いる。本実施形態に係る溶媒としては、例えば、水、アルコール、水−アルコール混合溶媒がある。また、直鎖、環状の炭化水素貧溶媒に均一分散させてもよい。酵素と電子受容体とをそれぞれ１試験体当り０．３ユニット以上１０ユニット以下と０．５μｇ以上２００μｇ以下とすることが好ましい。グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼは、純度の高いものが好ましく、上述の範囲の活性を有するものであれば、特に由来となる生物種は限定されず、例えば、グルコースオキシダーゼとしては、東洋紡社製ＧＬＯ−２０１を用いることができる。酵素反応部１０５の酵素及び電子受容体は、酵素量（力価／ユニット）に準じた反応量が得られるが、酵素反応部１０５の性能を担保する最適重量部の小過剰でよい。

また、酵素反応部１０５は、上部電極層１０３及び試料供給路１５１０より小さい面積で形成ることが好ましい。例えば、酵素反応部１０５は、１００μｍ以上１０００μｍ以下の範囲で幅を狭くする。酵素反応部１０５の厚さは、１μｍ以上１００μｍ以下の範囲が好ましい。酵素反応部１０５はその面積に比例した検出電流が得られるため、酵素反応部１０５の面積は可能な範囲で広く設定することが好ましい。

酵素反応部１０５は上述の親水性高分子と混合したり、あるいは親水性高分子及び界面活性剤と混合したりして構成してもよい。界面活性剤を含有させると粘度の高い試料液であっても、センサの内部へ試料液を容易に導くことができるので、好ましい。酵素反応部１０５に用いる界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、若しくはポリエチレングリコール類等が挙げられる。酵素反応部１０５を形成する場合、酵素は４０℃以上で長時間放置すると活性を失うため、溶媒の乾燥は４０℃以下で行い、乾燥後は速やかに室温にもどすことが好ましい。

（第２の基材）
第２の基材１１００は、第１の基材１７０と第３の基材１２００との間に間隙を設け、外部からバイオセンサ１０００へ試料供給を行うための流路を設けるための基材である。第２の基材１１００には少なくとも１つの試料供給路１５１０を形成する。試料供給路１５１０は、第２の基材１１００を水平方向に貫通して設けられた流路であり、外部から供給される試料を作用極１１０に導く。第２の基材１１００は、剛体であってもよく、弾性体であってもよい。中でも電気絶縁性を有する弾性体を用いることが好ましく、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリスチレン（ＰＳ）樹脂、ポリプロピレン（ＰＰ）樹脂等のフィルムを好適に用いることができる。

試料供給路１５１０の幅は０．５ｍｍ以上５ｍｍ以下の範囲とすることが好ましい。試料供給路１５１０の幅が０．５ｍｍ未満であると、流路への毛細管現象によるに安定した試料供給がされなくなる。また、酵素反応部１０５の電極面積を広く取れないため、感度が低くなる。また５ｍｍより大きくなると、バイオセンサ１０００を第１の基材１７０の電極系１００形成面に対して垂直に切断した際、試料供給路１５１０の幅の中心線へ向かって第１の基材及び第３の基材がアーチ状につぶれ、試料供給路１５１０内の容積が変化し易くなる。試料供給路１５１０の幅は、全体にわたって均一の幅であってもよいし、第２の基材１１００の試料供給路１５１０の導入部である外縁に向かって、幅が広くなるような形状であってもよい。

第２の基材１１００はさらに試料供給路１５１０とは別の空気抜き流路１５３０を備えていてもよい。本実施形態に係るバイオセンサ１０００において、空気抜き流路１５３０は、試料供給路１５１０に接続され、試料供給路１５１０と空気抜き流路１５３０とを合わせてＴ字状の流路を構成している。このような構成とすることで、外部から試料が供給された場合に、試料供給路１５１０内の空気が逃げる空気抜き流路１５３０が機能する。空気抜き流路１５３０の幅は、０．３ｍｍ以上１０ｍｍ以下の範囲とすることが好ましい。空気抜き流路１５３０の幅が０．３ｍｍ未満であると接着剤や基材のバリが空気抜きの邪魔となり、また１０ｍｍより大きくなると基材が変形した際、隣接する供給路にも変形がおよび供給路容積の変動要因となる。第２の基材１１００の厚さは、試料供給路１５１０及び空気抜き流路１５３０の高さとなり、１５μｍ以上５００μｍ以下の範囲とすることが好ましい。第２の基材１１００の厚さが１５μｍ未満であると基材の凹凸の影響で容積変化が生じ易く、毛細管現象による試料供給も安定しなくなる。また５００μｍより大きくなると酵素反応部１０５に均一に試料が流れず、酵素反応部１０５の一部に試料が流れない可能性が出てくる。

（第３の基材）
第３の基材１２００は、蓋材として機能する基材である。第３の基材１２００は例えば、樹脂基材、セラミック基材、ガラス基材、半導体基材、金属基材などを用いることができる。第１の基材１２００は、剛体であってもよく、あるいは弾性体であってもよい。中でも電気絶縁性の弾性体を用いることが好ましく、例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリスチレン（ＰＳ）樹脂、ポリプロピレン（ＰＰ）樹脂等のフィルムを好適に用いることができる。第３の基材１２００の形状は、第１の基材１７０に合わせて採用されるが、配線部１５０が露出するように一部に切欠部を有している。

（接着層）
本実施形態に係る下部電極層１０１は、第１の基材１７０の上部表面にドライラミネート用接着剤を塗布して形成した接着層１８０を介して固着されている。接着層１８０を介して電極系１００が第１の基材１７０に固着されることにより、下部電極層１０１に密着層を配置することなく、密着性を得ることができる。接着層１８０はポリエステル系の２液硬化接着剤等を用いることができる。また、接着層１８０は、金属層を第１の基材１７０の上部表面に固着し、エッチングにより下部電極層１０１を形成するときのストッパーとしても機能する。接着層１８０の厚さは０．１μｍ以上５μｍ以下の範囲とすることが好ましい。厚さが０．１μｍ未満であると接着不良となり、また５μｍより大きくなると接着面の凹凸が目立つようになり、エージング時間が長くなり、エッチング後のタック（エッチングや剥離面の粘着性）が残るからである。

また、第２の基材１１００の下部表面には、接着層１８５ａが形成される。また、第２の基材１１００と第３の基材１２００とを貼り合わせるために、第２の基材１１００の上部表面に接着層１８５ｂをさらに形成する。接着層１８５ｂは、第３の基材１２００の下部表面に形成してもよい。接着層１８５ａ及び接着層１８５ｂの材料としては、例えば、合成接着剤としてはアクリル系接着剤、エステル系接着剤、ビニル系接着剤、シリコン系接着剤等、天然接着剤としてはニカワ、天然ゴム、樹液等の澱粉のり・天然高分子等を用いることができる。接着層１８５ａ及び接着層１８５ｂの厚さは、３μｍ以上５０μｍ以下が好ましい。接着層１８５ａは、下部電極層１０１、上部電極層１０３及び酵素反応部１０５を合わせた厚さ以上、例えば２０μｍ程度で形成すると、第２の基材１１００と第１の基材１７０とが接着層１８０及び接着層１８５ａを介して密着され、試料供給路１５１０から供給される試料が配線部１５０に流入するのを防御することができる。また、接着層１８０と接着層１８５ａとが密着していることで、配線部１５０の下部電極層１０１の防錆を実現することができる。

第３の基材１２００は、接着層１８５ｂを介して第２の基材１１００に固着し、接着層１８０を介して第１の基材１７０に固着する。第３の基材１２００の下部表面に接着層１８５ｂを形成することで、第２の基材１１００、対極１２０及び参照極１３０を接着層１８５ｂで包埋するようにしてもよい。

（試料供給路１５１０及び流路１５３０と電極系１００の位置関係）
図１及び２に示した電極系１００の各電極の配置は一例であって、種々の変形例を採用することができる。ここで図６を用いて試料供給路１５１０及び流路１５３０と電極系１００の好ましい位置関係の別の態様について説明する。図６（ａ）は電極系５００を示し、図６（ｂ）は電極系６００を示す電極系５００と電極系６００とは試料供給路１５１０の幅の中心線で線対称の配置であり、参照極１３０、作用極１１０、対極１２０を試料供給路１５１０の開口部から試料が順次通過するように配置することもできる。このように配置することで、電極系に試料が充たされたことがポテンシオスタットの電圧値、電流値により確認できる。また、作用極１１０を中心にして参照極１３０及び対極１２０で挟むことで、電位の干渉が生じにくくなる。対極１２０に試料が充たされた時には、参照極１３０と作用極１１０とに電位が掛かるため、初期ノイズの影響を受け難くなり、測定を安定させることができる。

なお、本発明の実施形態に係るバイオセンサ１０００は酵素反応部１０５の酵素を変更することで、グルコースセンサのみならず、コレステロールセンサ、アルコールセンサ、スクロールセンサ、乳酸センサ、フルクトースセンサなどの酵素に関与する反応系に広く用いることができる。各バイオセンサに用いる酵素としてはコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ等の反応系に合ったものを適宜用いることができる。

（２．バイオセンサの製造方法）
次に図７及び図８を用いて上述の実施形態において説明したバイオセンサ１０００の製造方法について説明する。図７（ａ）〜図７（ｅ）はバイオセンサ１０００の製造過程を示し、図２（ａ）のＡ−Ａ’断面に相当する図である。

（電極系の製造工程）
第１の基材１７０の上部表面に接着層１８０を配設する（図７（ａ））。接着層１８０は接着剤を塗布してもよいし、接着層１８０を第１の基材１７０に貼合してもよい。接着層１８０を介して第１の基材１７０に金属箔１０２を貼合する（図７（ｂ））。そして、金属箔１０２上にレジスト（図示せず）を塗布法、印刷法等により形成し、所望のレジストパターンを形成する。レジストパターンをエッチングマスクとして金属箔１０２をエッチングして下部電極層１０１を形成する（図７（ｃ））。エッチングはドライ方式、ウェット方式のいずれを用いてもよい。接着層１８０を介して下部電極層１０１と第１の基材１７０が接着しているので、下部電極層１０１に密着層を配置する必要なく、より簡便に下部電極層１０１を製造することができる。また、厚さの均一性の高い金属箔を貼合し、それをパターニングして下部電極層１０１とするので、多面付けした際にチップ間の感度ばらつきが抑えられる。真空成膜法やめっき法を用いて下部電極層１０１を行うことも可能であるが、上述のような成膜法では第１の基材１７０が大きくなる程、下部電極層の面内の厚さばらつきが大きくなるため、チップ間で感度ばらつきが生じるため好ましくない。

その後、印刷法により下部電極層１０１の所定部分に導電性カーボンを含有するインキを塗布する（図７（ｄ））。ピンホールの発生を防ぐために、インキは少なくとも複数回塗布することが好ましい。これにより下部電極層１０１の少なくとも上面を被覆する上部電極層１０３を形成する。より好ましくは上部電極層１０３で下部電極層１０１の上面及び側面を被覆する。

このように形成した電極の１つの上部電極層１０３の上面に、酵素及び電子受容体を含む溶液をディスペンサーで塗布した後、４０℃で乾燥させ、溶媒成分を除去する。このようにして、作用電極１１０を形成し（図７（ｅ））、電極系１００を製造する。

（第２の基材の製造工程）
図８（ａ）〜図８（ｄ）は、第２の基材１１００及び第３の基材１２００を形成し、第１の基材１７０上に形成した電極系１００を貼付し、バイオセンサ１０００を製造する工程を示す図である。第２の基材１１００の第１の基材１７０及び電極系１００を貼付する面と、第３の基材１２００を貼付する面とに、接着層１８５を形成する（図８（ａ））。上面及び下面の両面に接着層１８５が形成された基材１１００に打ち抜き加工を施し、試料供給路１５１０及び空気抜き流路１５３０を形成して第２の基材１１００を製造する（図８（ｂ））。

（第３の基材の製造工程）
基材１２００に所定の打ち抜き加工を施し、配線部１５０の少なくとも一部が露出する切欠部を形成して、第３の基材１２００を製造する。

（貼合工程）
第２の基材１１００の一方の面に第３の基材１２００を貼合する（図８（ｃ））。その後、第２の基材１１００の他方の面に、第２の基材１１００と電極系１００が対向するように配置して第１の基材１７０を貼合する（図８（ｄ）及び（ｅ））。図８（ｄ）は図２（ａ）のＡ−Ａ’断面に相当する図であり、試料供給路１５１０及び空気抜き流路１５３０が形成され、Ａ−Ａ’断面では、空気抜き流路１５３０が外部へ開口している。図８（ｅ）は図２（ａ）のＢ−Ｂ’断面に相当する図であり、第１の基材１７０と第２の基材１１００の両端部は、接着層１８０及び接着層１８５で貼付される。なお、貼合の順序は第２の基材１１００と第１の基材１７０を貼合してから、第２の基材１１００に第３の基材１２００を貼合してもよい。

（断裁工程）
上述の工程は多面付けで行われ、貼合が完了した後、断裁して個々のバイオセンサ１０００を得る。

以下の実施例に、上述した実施形態において説明した本発明に係るバイオセンサ１０００の一例を具体的に説明する。

（実施例１−アルミ下部電極層）
厚さ１００μｍのＰＥＴフィルム（東レ社製ルミラー）の基板１７０の上部表面に、ドライラミネート剤を用いて接着層１８０を形成した。接着層１８０を介して厚さ９μｍのアルミニウムフィルム（東洋アルミ社製）１０２を貼り合せた。アルミニウムフィルム１０２の表面に１．５ｍｍ幅の線状のレジストパターンを印刷法で形成した。揺動式の塩酸槽（２Ｎ）にレジストパターンを形成した上記の積層フィルムを浸漬させてアルミニウムをエッチングした。水洗を行った後、水酸化ナトリウム槽（０．５Ｎ）に積層フィルムを浸漬させてレジストパターンを剥離した。その後、再度水洗を行った後、下部電極層１０１を形成した。

下部電極層１０１のアルミパターンに幅２．１ｍｍ、長さ３ｍｍのスクリーン印刷パターン１５０メッシュを基板１７０の幅方向センター合せで左右０．３ｍｍ程度被る状態にアライメントして、低抵抗カーボンスクリーンインキ（十条インキ社製）を印刷し、９０℃で１時間乾燥した。カーボン被覆により形成した上部電極層１０３とアルミパターンの下部電極層１０１の表面の厚さの差から上部電極層１０３は１１μｍ厚であった。下部電極層１０１の長手方向に対して、上部電極層１０３の先端からアルミ剥き出し部分の下部電極層１０１の長さの総計か３３ｍｍになるよう切り出し、上部電極層１０３の先端から３０ｍｍ離れた下部電極層１０１との間の抵抗値を測定したところ、５０Ωであった。

（実施例２−アルミ下部電極層）
実施例１と同様に下部電極層１０１の１．５ｍｍ幅のアルミパターンに幅２．１ｍｍ、長さ３ｍｍのフイルムマスク（日立化成社製）を基板１７０の幅方向センター合せで左右０．３ｍｍ程度被る状態にアライメントして、カーボングラビアインキ（合同インキ社製）を印刷し、１２０℃で１０分間乾燥した。カーボン被覆により形成した上部電極層１０３とアルミパターンの下部電極層１０１の表面の厚さの差から上部電極層１０３は２μｍ厚であった下部電極層１０１の長手方向に対して、上部電極層１０３の先端からアルミニウム剥き出し部分の下部電極層１０１の長さの総計が３３ｍｍになるよう切り出し、上部電極層１０３の先端から３０ｍｍ離れた下部電極層１０１との間の抵抗値を測定したところ、２０Ωであった。

（実施例３−アルミ以外の金属による下部電極層）
実施例１に対して、本実施例においては、下部電極層１０１の基材を１８μｍ銅箔とし、５０μｍＰＥＴと２３μｍの接着剤で貼り合せたもの（ニッカン工業社製）に変更した。また、薄銅箔用塩化第二鉄のエッチング液でレジストパターンをエッチングした。同様に水洗、レジスト剥離、乾燥して下部電極層１０１を形成した。下部電極層１０１にスクリーン印刷でカーボン被覆による上部電極層１０３を形成した。カーボン被覆により形成した上部電極層１０３と銅パターンの下部電極層１０１の表面の厚さの差から上部電極層１０３は１１μｍ厚であった。下部電極層１０１の長手方向に対して、上部電極層１０３の先端からアルミ剥き出し部分の下部電極層１０１の長さの総計か３３ｍｍになるよう切り出し、上部電極層１０３の先端から３０ｍｍ離れた下部電極層１０１との間の抵抗値を測定したところ、４０Ωであった。

（比較例１）
比較例として、厚さ１００μｍのＰＥＴフィルム（東レ社製ルミラー）に１．５ｍｍ幅の線状のカーボンパターンをスクリーン印刷パターン１５０メッシュ、低抵抗カーボンスクリーンインキ（十条インキ社製）を印刷し、９０℃で１時間乾燥し、電極層を形成した。長さの総計か３３ｍｍになるよう切り出し、３０ｍｍ離れたカーボン表面間の抵抗値を測定したところ１．５ＫΩであった。

（グルコース検出特性）
以上のようにして得た実施例１〜４及び比較例１の電極を用いて、作用極１１０、対極１２０及び参照極１３０をそれぞれ２．４ｍｍピッチになるように配し、長さ３ｍｍの電極層の先端部分の２．４ｍｍを残し、上下０．３ｍｍを耐水性粘着テープでマスクした。この２．４ｍｍ幅のマスク間に酵素としてグルコースオキシダーゼ（東洋紡社製ＧＬＯ−２０１）を１ユニット、電子受容体としてフェリシアン化カリウム７０μｇを蒸留水２μＬに溶解し、均一に滴下して作用極を作製した。これをポテンシオスタット（エービーエス社製ＡＬＤ７６０）の作用極、対極、参照極に配線し、０．５Ｖ電圧印加で被検体２．５μＬ滴下後２秒後の電流を検出した。なお、被検体は生理食塩水にグルコースを０、１００、３００、６００ｍｇ／ｄＬの４濃度に調製した人工標準グルコース液を用いた。図９に示すように、グルコース濃度の測定感度を測定したところ、実施例１及び実施例２は、比較例１に比して同濃度のグルコースに対する検出電流が高く、カーボンで形成した上部電極層１０３に低抵抗の金属層で形成した下部電極層１０１を配置した電極系１００を用いることで、測定感度が優れることが確認された。

１００ 電極系
１０１ 下部電極
１０２ 金属箔
１０３ 上部電極
１０５ 酵素反応部
１０７ 親水性高分子層
１１０ 作用極
１２０ 対極
１３０ 参照極
１５０ 配線部
１７０ 基材
１８０ 接着層
１８５ａ 接着層
１８５ｂ 接着層
２００ 電極系
３００ 電極系
４００ 電極系
５００ 電極系
６００ 電極系
１０００ バイオセンサ
１１００ 第２の基材
１２００ 第３の基材
１５１０ 試料供給路
１５３０ 空気抜き流路

Claims (11)

1. 絶縁性を有する表面を含む第１の基材と、
   前記第１の基材の前記絶縁性を有する表面上に配置された接着層と、
   前記接着層を介して前記第１の基材に固着された電極系及び配線部と、を備え、
   前記電極系は上部電極層と下部電極層と、を含み、前記下部電極層は前記上部電極層よりも導電性の高い材料で形成され、
   前記電極系は作用極及び対極を含み、前記作用極上に位置する酵素及び電子受容体を含む酵素反応部を備え、
   前記下部電極層と前記配線部とは一体で構成されていることを特徴とするバイオセンサ。
2. 前記下部電極層と前記配線部は同一の材料から構成されていることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
3. 前記電極系は少なくとも１つの参照極を含み、
   前記参照極は、上部電極層と下部電極層と、を含み、前記下部電極層は前記上部電極層よりも導電性の高い材料で形成されることを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオセンサ。
4. 前記作用極、前記対極及び前記参照極は、前記下部電極層の少なくとも一部に前記上部電極層を被覆して形成される請求項３に記載のバイオセンサ。
5. 前記上部電極層はカーボンを含み、
   前記下部電極層及び前記配線部はアルミニウム、銅、鉄の何れか１種あるいは、アルミニウム、銅、鉄を１種以上の合金を含むことを特徴とする請求項１乃至４の何れか一に記載のバイオセンサ。
6. 前記上部電極層はカーボン顔料及び有機バインダーを含み、
   前記上部電極層の厚みが０．３μｍ以上３０μｍ以下であることを特徴とする請求項１乃至５の何れか一に記載のバイオセンサ。
7. 前記第１の基材の上部に、第２の基材、第３の基材が順に積層され、
   前記第２の基材は、前記第２の基材の外縁及び前記作用極に通じる試料供給路を備え、
   前記第３の基材は前記第２の基材を覆うように前記第１の基材に固着されていることを特徴とする請求項１乃至６の何れか一に記載のバイオセンサ。
8. 前記試料供給路に接続され前記第２の基材の外縁に通じる流路を有することを特徴とする請求項１乃至７の何れか一に記載のバイオセンサ。
9. 第１の基材の絶縁性を有する表面上に接着層を形成し、
   前記接着層に金属箔を貼合し、該金属箔をパターニングして下部電極層及び該下部電極層に一体で構成された配線部を形成し、
   前記下部電極層の上部表面にカーボンを含む上部電極層を形成し、作用極及び対極を含む電極系を形成することを特徴とするバイオセンサの製造方法。
10. 前記上部電極層は、印刷法によりカーボンを前記下部電極層の一部に被覆することを特徴とする請求項９に記載のバイオセンサの製造方法。
11. 基材の上面及び下面に接着層を形成し、試料供給路及び空気抜き流路を形成して第２の基材を製造し、
    前記第２の基材と、第３の基材とを貼合し、
    前記電極系を形成した前記第１の基材の面と、前記第２の基材及び前記第３の基材とを貼合することを特徴とする請求項９に記載のバイオセンサの製造方法。