Amifostin-Monohydrat und Verfahren zu seiner Herstellung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Trihydrats, eines Monohydrats und der amorphen Form von Amifostin (AF), insbesondere die reproduzierbare Herstellung des Monohydrats von AF.
Hintergrund der Erfindung
Amifostin (AF) ist S-[2-(3-Aminopropylamino)ethyl]-dihydrogenphosphorothioat (Anhydrat: CAS-Nr. 20537-88-6, C5H15N203PS, Nr. 214.22). Es wird in der Tumortherapie als Zyto- protektivum verwendet. Durch die alkalische Phosphatase wird AF (Prodrug) zum freien Thiol (Wirkform) dephosphoryliert. AF schützt daher selektiv nichttumorbefallene Zellen vor Strahlung und Zystostatika, weil die Konzentration der alkalischen Phosphatase in gesün-deren Zellen wesentlich höher ist als in Tumorzellen. Die übliche Dosis beträgt 0,910 g/m2 Körperoberfläche bei Erwachsenen (15-minütige Infusion) (Hunnius Pharmazeutisches Wörterbuch; 8. Aufl., A. Burger u. H. Wächter; Berlin, New York: de Gruyter, 1998).
Die Synthese von AF wird erstmals von Piper J.R. et al. im Journal of Med. Chem. 12, 236-243 (1969) bei der Suche nach potentiellen Schutzmitteln gegenüber radioaktiver Strahlung beschrieben. Die Synthese verläuft über mehrere Stufen, wobei im letzten Schritt eine Fällung einer wassrigen Lösung von AF durch Zugabe von Methanol angegeben wird. Über die Konzentration der wassrigen Lösung sowie eine genaue Beschreibung der Zugabe finden sich keine Angaben. Als Produkt der Synthese wird AF- Monohydrat (wahrscheinlich aufgrund der Elementaranalyse) mit einem Schmelzpunkt von 160 bis 161 °C (Kofler-Heizbank) angeführt. Die analytischen Untersuchungen werden von Piper et al. nicht näher ausgeführt. Es wurde (ausgenommen der Bestimmung des Schmelzpunktes) keine thermoanalytische, morphologische oder kristallographische Charakterisierung des Monohydrats vorgenommen.
In dem US Patent Nr. US 3892824 wird die Synthese erneut beschrieben. Zusätzlich werden die experimentellen Werte einer Elementaranalyse angeführt. Der experimentell bestimmte Wasserstoffgehalt von 7,27 % liegt etwas unterhalb des theoretischen Wertes
eines Monohydrats (7,33 %) und über dem theoretischen Wert eines Anhydrats (7,00 %). Weitere analytische Untersuchungen gehen aus dem US Patent Nr. 3892824 nicht hervor.
Karle, M., Karle, I. L. in Acta Cryst. C44, 135 (1988) beschreiben das aus Ethanol/Wasser kristallisierte, orthorhombische AF-Trihydrat, das über Einkristallstrukturanalyse bestimmt wird.
Durch Gefriertrocknung hergestelltes amorphes AF wird von Zadeii, J. M. et al. in Pharm. Res. 8, 172 (1991) kristallinem AF gegenübergestellt, ohne jedoch auf den Wassergehalt von AF einzugehen.
In den DDR-Patenten DD-289448 und DD-289449 wird als Syntheseprodukt AF-Trihydrat angeführt, welches sich durch Zugabe von Ethanol zu einer wassrigen Lösung von AF bildet.
In den US-Patenten Nr. US 5424471 und US 5591731 wird die Herstellung, Charakterisierung und der Einsatz von amorphem AF als Radio- und Zytoprotektivum beschrieben. Zur Charakterisierung des Trihydrats wird die Einkristallstruktur angegeben, wobei die genannten Parameter praktisch identisch mit denjenigen sind, die bereits durch Karle, M. und Karle, I. L. in Acta Cryst. C44, 135 (1988) veröffentlicht wurden. Der beanspruchte Gegenstand der beiden Schutzrechte findet sich auch zusammengefasst in einer europäischen Patentanmeldung EP 93918555.6 (hervorgegangen aus WO94/03179, entsprechend PCT/US93/07222) wieder.
Das Trihydrat von Amifostin (Schmelzpunkt 85 - 88°C unter Zersetzung; DSC, 5 K/min) fällt im allgemeinen durch Kristallisation aus wassrigen Lösungsmitteln oder durch Rühren der Suspension einer beliebigen Form von AF in wassrigen Lösungmitteln an.
Obgleich Monohydrate in der Literatur genannt werden, können diese bisher nicht reproduzierbar hergestellt werden.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung ist es, das Monohydrat von Amifostin und ein reproduziertes Verfahren zu seiner Herstellung bereitzustellen.
Es werden ein Trihydrat, ein Monohydrat und die amorphe Form von Amifostin (AF) quantitativ und reproduzierbar hergestellt.
AF-Trihydrat (Schmelzpunkt 85 - 88°C unter Zersetzung; DSC, 5 K min), das durch Kristallisation aus wassrigen Lösungsmitteln oder durch Rühren der Suspension einer beliebigen Form von AF in wassrigen Lösungsmitteln ausfällt, ist bei 25°C zwischen 13 bis 43 % relativer Feuchte (RF) im Untersuchungszeitraum von 13 Tagen stabil. Bei Lagerung über 13 Tage bei 35°C und 13 % r.F. tritt aber bereits ein Wasserverlust auf.
Die PCT/US93/07222 hat als Ziel die Herstellung von Amifostin, das bei Kühlschranklagerung (4°C) mindestens 2 Jahre stabil ist. Das amerikanische Arzneibuch schreibt für Amifostin Trihydrat eine Kühlschranklagerung vor (USP 24, S. 2790). Dies hat wohl seinen Grund in dem obigen Instabilitätsverhalten.
Amorphes AF kann in einfacher Weise durch Lagerung des Trihydrats über Phosphorpentoxid hergestellt werden.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass auch das Monohydrat durch ein spezielles Kristallisationsverfahren reproduzierbar hergestellt werden kann. Die Herstellung des Monohydrats von AF (Schmelzpunkt ca. 134 bis 136°C unter Zersetzung; DSC, 5 K min"1) gelingt durch kontinuierliche Zugabe einer auf 10 - 60 % (G/G) konzentrierten wassrigen Lösung von AF (in Bezug auf wasserfreie Substanz) zu einem 2-20-fachen Überschuss von Methanol innerhalb von 2 - 20 Minuten. Bevorzugt ist die Lösung auf 10 - 30 % konzentriert, der Überschuß von Methanol beträgt 2 - 10 fach und die Zugabe erfolgt bevorzugt innerhalb von 10 - 20 Minuten. Für eine quantitative und reproduzierbare Gewinnung kommt dabei dem Mengenverhältnis Wasser/Methanol, sowie der Art der Durchführung eine entscheidende Rolle zu. AF-Monohydrat ist bei 25°C zwischen 13 und 62 % relativer Feuchte im Untersuchungszeitraum von 9 Tagen stabil.
Die von Piper et al. (Piper J. R. et al., J. Med. Chem. 12, 236 - 243 (1969)) beschriebene Kristallisation des Monohydrats (Zugabe eines ca. 6-fachen Überschusses von Methanol zu einer wassrigen Lösung) führte hingegen ausschließlich nur zum Trihydrat und nicht zum Monohydrat.
Die drei hergestellten Ferstkörperformen wurden thermoanalytisch, röntgendiffraktometrisch und schwingungsspektroskopisch charakterisiert und identifiziert. Der DSC-Methode und der Röntgendiffraktometrie ist der Vorzug zu geben, da Beimengungen anderer Formen damit am leichtesten erkannt werden können.
Durch mehrtätige Lagerung des Monohydrats über Phosphorpentoxid bei 25°C wird das Wasser vollständig entzogen. Bei anschließender Lagerung bei 13 % relativer Feuchte bildet sich innerhalb 1 Stunde erneut das Monohydrat.
Bei der Lagerung des Trihydrats über Phosphorpentoxid bildet sich bei 25°C hingegen innerhalb von weniger als 2 Tagen bereits die amorphe Form, die chemisch wenig stabil ist und die sich je nach Herstellung des verwendeten Trihydrats unterschiedlich gegenüber feuchter Luft verhält. Eine wasserfreie, kristalline Form ist bislang nicht bekannt. Insbesondere konnte keine direkte Umwandlung von Trihydrat zu Monohydrat beobachtet werden. Eine Umwandlung von Monohydrat zu Trihydrat konnte erst bei relativen Feuchten ab 75 % festgestellt werden. Interessant ist das Verhalten von Monohydrat und Trihydrat nach vollständigem Wasserentzug. Das getrocknete Monohydrat nimmt nach anschließendem Aussetzen bei geringer relativer Feuchte (13 %) sofort unter erneuter Ausbildung eines Monohydrats Wasser auf. Im Gegensatz dazu kann beim Trihydrat nach dem Wasserentzug eine amorphe Phase festgestellt werden, deren Sorptionseigenschaften in Abhängigkeit vom ursprünglichen Trihydrat-Produkt unterschiedlich sind.
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass Trihydrat, Monohydrat und amorphe Form von Amifostin quantitativ und reproduzierbar gewonnen werden können.
Während beim Trihydrat die Herstellungsbedingungen stark variiert werden können, besteht beim Monohydrat ein wesentlich geringerer Spielraum. Insbesondere reichen die Syntheseangaben von Piper et al. (J. Med. Chem. 12, 236 - 243 (1969)) nicht aus, um
AF-Monohydrat quantitativ und reproduzierbar herzustellen. Die Herstellung des Monohydrates durch langsame Zugabe einer konzentrierten wassrigen Lösung von AF zu im großen Übeschuss vorliegenden Methanol ist von Piper et al. nicht beschrieben. Die quantitative Herstellung von AF-Monohydrat durch gezielte Sorption bzw. Desorption sowie durch Zugabe von Lösungsmitteln (z.B. Methanol) zu wassrigen Lösungen von AF gelingt im Gegensatz zum erfindungsgemäßen Verfahren nur selten.
Die erfindungsgemäße reproduzierbar herstellbare AF-Kristallform zeichnet sich durch eine besondere Stabilität gegenüber bekannten Zusammensetzungen aus und benötigt keinen zusätzlichen Stabilisator, wie z.B. Mannitol.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass bei der Verarbeitung von Amifostin zu sterilen Produkten zur Rekonstitution das chemisch und physikalisch sehr stabile Monohydrat vorteilhaft ist gegenüber dem Trihydrat. Letzteres ist bei Kühlschrankbedingungen zu lagern, da es sich bereits bei Temperaturen ab 35°C aufwärts in die amorphe Form umlagert. Die Herstellung des Trihydrats erfordert einen erheblichen Validierungsaufwand, um zu einem reproduzierbaren Produkt zu gelangen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Abb. 1 DSC-Kurve von AF-Trihydrat (E), perforierte Kapsel,
Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 2 DSC-Kurve von AF-Trihydrat (aus Ethanol 20 % kristallisiert), perforierte
Kapsel, Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 3 DSC-Kurve von AF-Monohydrat (S1), perforierte Kapsel, Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 4 DSC-Kurve von AF-Trihydrat (SN 40.1 ), Hochdruckkapsel,
Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 5 DSC-Kurve von AF-Monohydrat (S1), Hochdruckkapsel, Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 6 DSC-Kurven von AF-Trihydrat (E), Vergleich verschiedener Probenkapseln,
Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 7 DSC-Kurven von AF, Vergleich der drei Feststoffformen, perforierte
Probenkapsel, Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 8 TGA-Kurven von Monohydrat (S1) und Trihydrat (aus Ethanol 20 %-ig umkristallisiert und mit E angeimpft), Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 9 FTIR-Spektren (KBr-Presstechnik) der AF-Formen. T: Trihydrat (E),
M: Monohydrat (S1), a: amorphe Form.
Abb. 10 FT-Raman-Spektren der AF-Formen. T: Trihydrat (E), M: Monohydrat (S1), a: amorphe Form.
Abb. 11 Pulverröntgendiffraktogramme der AF-Formen. T: Trihydrat (E), M: Monohydrat (S1 ), a: amorphe Form
Abb. 12 Wasserdampfsorption (Massenänderung Wt bezogen auf die Trockensubstanz) der amorphen Form, gewonnen aus dem Trihydrat E, zwischen 13 und 84 % RF bei 25°C.
Abb 13 Wasserdampfsorption (Massenänderung Wt bezogen auf die Trockensubstanz) des Monohydrats (S1), bei unterschiedlichen Feuchten über 14 Tage.
Abb. 14 Wasserdampfdesorption und -sorption des Monohydrats (S1) (Massenänderung Wf bezogen auf die hydratisierte Substanz) bei 0 und 13 % relative Feuchte (25°C).
Abb. 15 Wasserdampfdesorption (Massenänderung Wf bezogen auf die hydratisierte Substanz) des Trihydrats (E und SN 40.1) sowie des Monohydrats (S1) über Phosphorpentoxid (0 % RF) bei 25°C.
Abb. 16 Wasserdampfdesorption (Massenänderung Wf bezogen auf die hydratisierte Substanz) des Trihydrats SN 40.1 bei 25°C und relativen Feuchten von 13 bis 43 %; zum Vergleich auch Desorptionsverlauf bei 0 % RF.
Abb. 17 Wasserdampfdesorption (Massenänderung Wf bezogen auf die hydratisierte Substanz) des Trihydrats SN 40.1 bei 35°C und 13 % RF im Vergleich zum Monohydrat (S1).
Nachfolgend wird die Erfindung detaillierter in den Beispielen beschrieben.
Beispiele
Die folgenden Verfahren wurden erfindungsgemäß angewendet:
Thermoanalyse
Thermomikroskopie mit Kofler-Heiztisch (Reichert, Wien), montiert auf einem mit einer Videoanlage ausgestatteten Olympus-Mikroskop BH-2 bzw. mit einem Kofler- Heiztischmikroskop Thermovar® (Reichert, Wien); beide Mikroskope mit Polarisationseinrichtung.
Differenzkalorimetrie mit DSC-7 (Perkin-Elmer, Norwalk, Ct., USA), Pyris-Software für Windows-NT; Al-Probenkapseln (25 μl), bzw. Hochdruckkapseln aus Stahl (vergoldet), Probeneinwaagen jeweils ca. 1 ,5 mg in perforierten Al-Probenkapseln sowie ca. 2, 7,5 und 11 ,5 mg in Hochdruckkapseln (Ultramikrowaage UM 3, Mettler, CH-Greifensee, Schweiz). Stickstoff 5,0 als Spülgas (20 ml min"1). Die Aufheizgeschwindigkeit der Proben betrug größtenteils 5 K/min. Kalibrierung der Temperaturanzeige über die Schmelzpunkte von Benzophenon (Schmp. 48,0°C, perforierte Probenkapsel) und Coffein-Anhydrat (Schmp. 236,2°C, dicht verschlossene Probenkapsel); Kalibrierung der Ordinate (DSC- Signal) über die Schmelzwärme von Indium 99,999 % (Perkin-Elmer, Norwalk, Ct., USA).
Thermogravimetrie mit Thermogravimetrie-System TGA-7, Pyris-Software für Windows NT, (Perkin-Elmer, Nowalk, Ct., USA), Probenmengen ca. 2 bis 3 mg, Platin- Probenbehälter (50 μl), Stickstoff als Spülgas (sample purge: 20 ml min"1, balance purge: 40 ml min"1), Aufheizgeschwindigkeit 5 bzw. 0,5 K min"1.
Spektroskopie
FTIR-Spektroskopie und FTIR-Mikroskopie mit Bruker IFS 25 FTIR-Spektrometer (Bruker Analytische Messtechnik GmbH, Karlsruhe, Deutschland), Bruker FTIR-Mikroskop (15 x Cassegrain-Objektive mit Polarisationseinrichtung für das Sichtbare). Im allgemeinen wurde die KBr-Methode (ca. 1 ,2 mg Probe auf ca. 275 mg KBr) angewandt. Die Spektren werden im Transmissionsmodus im Bereich von 4000 bis 600 cm~1 aufgenommen. Auflösung: 2 cm"1 (Spektrometer, 50 Interferogramme) oder 4 cm"1 (Mikroskop, 100 Interferogramme):
FT-Raman-Spektroskopie mit Bruker RFS 100 FTR-Raman-Spektrometer (Bruker Analytische Messtechnik GmbH, Karlsruhe, Deutschland), ausgestattet mit einem Diodengepumpten Nd: YAG Laser (1064 nm) und einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten, hochempfindlichen Detektor. Die pulverförmigen Proben wurden in kleine Aluminiumhalterungen hineingedrückt; die Spektren wurden bei einer Ausgangsleistung von 100 mW aufgenommen; Auflösung: 4 cm"1 (50 Interferogramme).
Pulverröntgendiffraktometrie
Mit Siemens Röntgendiffraktometer D-5000, Diffrac/AT mit Θ/Θ-Geniometer (Siemens AG, Karlsruhe, Deutschland), CuKα-Strahlung (Beschleunigungsspannung 40 kV, Röhrenstrom 40 mA), Nickelfilter zur Monochromatisierung, Göbel-Spiegel, Szintillationszähler, Winkelbereich 2° bis 40° (2Θ), Schrittweite 0.01 ° (2Θ), Messzeit 2 s. Kalibrierung der d-Werte (CuKαι) mit Silizium NBS-Standard.
Klimatisierbare Probenkammer: bestehend aus Tieftemperaturkammer, TTK (Anton Paar KG, A-Graz), in Verbindung mit Befeuchtungssystem SYCOS-H (asynco, D-Karlsruhe).
Bestimmung des Trocknungsverlustes
a) Nach Ph.Eur. im Trockenschrank Heraeus (W.C. Heraeus GmbH Produktbereich Elektrowärme, D-Hanaus 1)
b) Nach Ph.Eur. im Trockenofen Büchi TO-50 (Büchi, Laboratoriumstechnik AG, CH-Flawil/Schweiz)
c) Mit Hilfe des Mettler Infrarottrockners LP16 (Mettler Waage PM100 mit Mettler Infrarottrockner LP16-Aufsatz, Ausdruck der Protokolle mittels Mettler Toledo Drucker LC-P45, Mettler-Toledo AG, CH-Greifensee, Schweiz)
d) In den Probenhalterungen der Halbmikrohygrostaten.
Wasserdampfsorptionskurven
Allgemeine Bedingungen
Die Sorptionsmessungen erfolgten bei 25°C und 13, 31 , 43, 62, 75 und 84 % relativer Luft-feuchtigkeit, die Desorptionsmessungen bei 25°C und 0 % sowie bei 35°C und 13 % relativer Feuchte. Die Abgabe bzw. Aufnahme von Wasser durch die Untersuchungssubstanz wurde in Abhängigkeit von der Zeit (ab 2 Stunden bis zu 16 Tagen) gravimetrisch bestimmt. Zu diesem Zweck wurden spezielle Halbmikrohygrostaten (U.J. Griesser und A. Burger, Int. J. Pharm. 120, 83 - 93 (1995)) verwendet, deren Konstruktion es nicht erforderlich machte, die Probe zum Abwiegen aus den Hygrostaten zu nehmen (Unterflurwägung mit Mettler Semi-mikrowaage AT 261 , Mettler Instruments AG, CH-Greifensee). Die Probeneinwaagen be-trugen bei Ethyol® etwa 40 bis 50 mg bzw. ca. 180 mg bei Amifostin-Trihydrat (SN 35,6 und SN 40.1) und erfolgten auf ± 0,02 mg genau.
Konditionierung der Proben
Die Einstellung der relativen Luftfeuchtigkeit (RF) in den thermostatisierten Halbmikrohygrostaten erfolgte mit Phosphorpentoxid (RF 0 %) und gesättigten
Salzlösungen von Lithiumchlorid (RF 13 %), Calciumchlorid (RF 31 %) und Kaliumcarbonat (RF 43 %), Ammoniumnitrat (RF 62 %), Natriumchlorid (RF 75 %) und Kaliumchlorid (RF 84 %). Vor den eigentlichen Messungen an der Untersuchungssubstanz bei 25 bzw. 35°C wurde die Einstellung der Luftfeuchtigkeit in den Halbmikrohygrostaten bestimmt. Die Feuchtemessungen wurden mit einem Luftfeuchtemessgerät Lufft GTL (G. Lufft Mess- und Regeltechnik GmbH, D-Stuttgart) gemessen bzw. überprüft. Die Kalibrierung dieses Luftfeuchtemessgerätes erfolgte mit gesättigten Lösungen von Lithiumchlorid und Magnesiumchlorid. Die Thermostatisierung der Hygrostaten erfolgte durch ihre Aufstellung in einem auf 25 bzw. 35°C thermostatisierten Brutschrank, die ihren Standplatz in dem auf 15°C thermostatisierten Kühlraum haben. Die Temperatur dieser Standorte der Hygrostaten wurde mit einem registrierenden Thermometer über die Zeit kontrolliert. Sie war auf +0,5 K konstant.
Sorptions-Desorptionskurven
Ethyol® (Ch. 98D16-17), AF-Trihydrat (SN 35,6 und SN 40,1 ), AF amorph (SN 35,6 UK nach Trocknungsversuchen) sowie Amifostin S1 (SN 35/3 UK) wurden in das Probengefäß der Halbmikrohygrostaten eingewogen und unmittelbar danach in die konditionierten Hygrostaten gegeben.
Proben
Für die Untersuchungen wurden selbst hergestellte Formen (Trihydrat, Monohydrat und amorphe Form) und Produkte der Fa. U.S. Bioscience, Inc. (Handelspräparat Ethyol®, ein steriles Lyophilisat zur Rekonstitution) sowie diverse selber hergestellte Chargen herangezogen (Tab. 1 ). Bei der Ethyol®-Charge 98D16-17 handelt es sich um reines AF- Trihydrat, nach Angaben des Herstellers ohne Hilfsstoffe. Offensichtlich ist dieses Produkt seit neuestem anstelle des amorphen, aber chemisch wenig stabilen Wirkstoffs, der zusammen mit Mannitol in Trockenstechampullen abgefüllt war, im Handel.
Die Untersuchungen der 2 Produkte (Chargen) von U.S. Bioscience und die der 18 Chargen selber hergestelltes Amifostin zeigen entweder das Vorliegen von AF als Monohydrat, Trihydrat, amorphe Form oder Mischungen davon (Tab. 1). Alle 20 aufgelisteten Chargen wurden zumindest mittels DSC untersucht.
Tab. 1 : Untersuchte Proben von U.S. Bioscience (Ethyol®) und durch Eigensynthese hergestelltes Amifostin
Ethyol® 500 mg, Trockenstechampullen
Herstellung von Trihydrat, Monohydrat und amorpher Form
Das Trihydrat kann z.B. durch Suspendieren einer beliebigen Mischung aus Trihydrat, Mono-hydrat und amorpher Form in Wasser oder Methanol, sowie durch Umkristallisation aus Ethanol/Wasser (z.B. 20 % V/V) oder tert.-Butylalkohol/Wasser (z.B. 20 % V/V), anschließendem Filtrieren mittels Wasserstrahlvakuum (ca. 10 mbar, ca. 10 min) und Trocknen bei Raumtemperatur hergestellt werden. Die Verwendung von Impfkristallen kann bei diesem Verfahren von Vorteil sein. Besonders zielführend ist die Ausfällung mit Ethanol (96 %) oder mit tert.-Butyl-alkohol aus einer wassrigen Lösung bei Raumtemperatur. Das entsprechende Fällungsmittel soll nicht zu schnell bis zu einem Maximalgehalt von 20 % in die wässrige Lösung getropft werden. Bei anschließender Lagerung im Eisfach bildet sich ein weißer Niederschlag.
Das Monohydrat kann auf folgende Weise reproduzierbar herstellt werden: Es werden z.B. 200 mg Trihydrat (z.B. SN 40.1 , s. Tab. 1) in 0,5 ml Wasser durch ca. 1-minütiges Erwärmen auf 40°C gelöst. 4 ml Methanol werden in einem 50 ml Rundkolben vorgelegt und mit einem Magnetrührstäbchen bei Raumtemperatur gerührt (ca. 300 U min"1). Die wässrige Lösung wird mit einer Pasteurpipette langsam zugetropft, wobei sich ein weißer Niederschlag bildet. Die Suspension wird mind. 10 min gerührt und anschließend mit einer Mikroglasfiltemutsche (G4) über Wasserstrahlvakuum abfiltriert, mit 4 ml Ethanol (96 %) gewaschen und auf einem Filterpapier luftgetrocknet.
Die amorphe Form (wasserfrei) wird erhalten, indem das Trihydrat über Phosphorpentoxid bis zur Gewichtskonstanz gelagert wird, was mit ca. 20 % Masseverlust verbunden ist. Die dafür notwendige Zeit hängt von der Herstellung des Trihydrats und der Temperatur ab. Bei ca. 50°C dauert der Prozess einige Stunden, bei 25°C ein bis einige Tage.
Identifizierung und Charakterisierung
Thermomikroskopie
Das durch Lyophilisation gewonnene Trihydrat (E) liegt in Form von weißen Stäbchen und kleinen unregelmäßigen Plättchen sowie auch Körnern vor. Im polarisierten Licht zeigt die Probe praktisch keine Interferenzfarben. Beim Aufheizen werden die Kristalle bereits ab
ca. 50°C infolge der Dehydratisierung dunkler. Ab 70°C sind die Kristalle deutlich dunkler. Die noch verbleibenden Kristalle zeigen keinen ausgeprägten Schmelzbeginn, sondern fließen ab ca. 110°C ineinander. Das Schmelzende liegt bei ca. 130°C. Die Probe schmilzt unter Zersetzung.
In Silgel (ein geeignetes Silikonöl zur thermomikroskopischen Untersuchung) weist der Großteil der Stäbchen und Stängel ebenfalls niedrige Interferenzfarben auf, nur einige wenige größere Plättchen fallen durch höhere Interferenzfarben auf. Je nach Aufheizgeschwindigkeit kann man ab 73°C eine Änderung der Interfrerenzfarben infolge der Dehydratisierung beobachten. Gleichzeitig kommt es bei dieser Temperatur zur Glasblasen-bildung, die ab 80°C stärkt zunimmt. In Silgeleinbettung zerfließen die Kristalle zwischen 138 und 155°C unter Zersetzung.
Die weißen Kristalle des Monohydrats (S1) weisen einen kleinkörnigen Habitus auf und schmelzen (zerfließen) beim Erwärmen am Thermomikroskop ab 145°C unter Zersetzung.
Differenzkalorimetrie (DSC)
In Abb. 1 ist die DSC-Kurve von E (durch Lyophilisation hergestelltes Trihydrat) dargestellt. Abb. 2 zeigt die DSC-Kurve eines Trihydrats, das durch Umkristallisation aus Ethanol 20 % (V/V) hergestellt wurde.
Beide Trihydrate zeigen einen scharfen Schmelzpeak zwischen ca. 85 und 88°C mit einer deutlichen Schulter, die durch das freiwerdende Wasser hervorgerufen wird. Der ab ca. 120°C aufgezeichnete, breite endotherme Peak entspricht dem Schmelzen (unter Zersetzung) des Monohydrats, was IR-spektroskopisch bewiesen werden kann. Das FTIR-Spektrum der mit DSC (5K min"1) auf 100°C aufgeheizten Probe E zeigte das Vorliegen des Monohydrats.
Beim Schmelzen von E (Abb. 1) wird zusätzlich ein kleiner endothermer Peak registriert, der beim Trihydrat, das aus Wasser/Ethanol bei Raumtemperatur kristallisiert wurde, nicht auf-taucht. Dieser Peak könnte auf eine geringere chemische Reinheit der Substanz zurückge-führt werden. Das würde im Einklang mit dem bei E deutlich tieferen Schmelzpunkt des Monohydrats (127°C) stehen, das sich bei der DSC-Untersuchung aus
dem Trihydrat bildet. Außerdem wurde als chemische Reinheit lediglich 98,5 % bestimmt. Bei dem durch Umkristallisation gewonnenen Trihydrat wird der Schmelzpunkt des sich daraus gebildeten Monohydrats bei 136°C ermittelt und seine chemische Reinheit beträgt ca. 99,5 %.
Der mittels DSC bestimmte Schmelzpunkt des Monohydrats (S1) liegt zwischen 134 und 136°C (Abb. 3). Der jeweils sehr breite Schmelzpeak des Monohydrats ist in Übereinstimmung mit den thermomikroskopischen Untersuchungen und kann auf die Zersetzlichkeit der Probe zurückgeführt werden. Das ist auch die Erklärung dafür, dass bei Bestimmung des Schmelzpunktes mit der Kofler-Heizbank (Bestimmung des Sofortschmelzpunktes), wie bei zersetzlichen Substanzen üblich, ein wesentlich höherer Wert (160 bis 161°C) gefunden wird. Wird bei den DSC-Untersuchungen die Aufheizgeschwindigkeit von 5 K/min auf 0,5 K/min gesenkt, wird das Schmelzen bereits bei 120°C realisiert.
Die Schmelzpunkte beider Hydrate wurden auch mit Hilfe von Stahlmantel-Hochdruckkapseln bestimmt. Die Messwerte sind jedoch stark abhängig von der Probeneinwaage. Bei ca. 7,5 mg Einwaage beträgt der Schmelzpunkt des Trihydrats 76°C (Abb. 4), der des Monohydrats 147°C (Abb. 5).
Abb. 6 zeigt die mittels unterschiedlicher DSC-Probenkapseln aufgenommenen DSC- Kurven von E. Der unter Verwendung einer dicht geschlossenen Aluminium-Probenkapsel ermittelte Schmelzpunkt des Trihydrats (E) liegt bei 87°C.
Eine Übersicht der mit perforierten Aluminium-Probenkapseln aufgenommenen DSC- Kurven der 3 Kristallformen von AF präsentiert Abb. 7.
Thermogravimetrie
Das mittels Thermogravimetrie untersuchte Trihydrat (E) sowie die durch Umkristallisation aus Ethanol erhaltenen Produkte weisen eine sehr ausgeprägte Stufe bei 55°C auf. Die Massenverluste liegen dabei zwischen 16,6 und 19 %. Ab 140°C fallen die Kurven aufgrund der schon thermomikroskopisch beobachteten Zersetzung ab.
Die thermogravimetrische Untersuchung von S1 zwischen 23 und 180°C zeigt einen Massenverlust von 8,0 %. Dies kommt dem theoretischen Massenverlust von 7,7 % für ein Monohydrat sehr nahe. Das Vorliegen eines Monohydrats kann daher daraus abgeleitet werden. Ab ca. 150°C fällt die Kurve aufgrund von Zersetzung ab.
Abb. 8 zeigt die unter den gleichen Bedingungen aufgenommenen TGA-Kurven von Monohydrat und Trihydrat. Deutlich ist auch hier die größere thermische Belastbarkeit des Monohydrats zu erkennen, bei dem ein signifikanter Massenverlust erst ab ca. 100°C einsetzt, beim Trihydrat aber schon ab ca. 60°C.
FTIR-Spektroskopie
Die mit Hilfe der KBr-Presstechnik erhaltenen FTIR-Spektren von E, S1 und der amorphen Form von AF weisen erheblich Unterschiede auf und können daher zur Identifizierung heran-gezogen werden (Abb. 9). Der Vergleich der 3 IR-Spektren zeigt besonders signfikante Bandenverschiebungen zwischen 3300 und 3500 cm und zwischen 1750 und 1300 cm.
FT-Raman-Spektroskopie
In Analogie zu den IR-Spektren können die 3 Kristallformen von AF auch mittels FT- Raman-Spektroskopie charakterisiert werden (Abb. 10). Zur Identifizierung sind besonders die Bereiche 2800 bis 3100 cm"1, 1350 bis 1500 cm"1 und 900 bis 1100 cm"1 geeignet.
Pulverröntgendiffraktometrie
Die Pulverröntgendiffraktogramme (Abb. 11) der beiden Hydrate von Amifostin weisen markante Unterschiede in den Netzebenenabständen und Reflexintensitäten auf. Die amorphe Form zeigt einen entsprechenden Absorptionsrücken. Dadurch lassen sich diese 3 Fest-körperformen eindeutig charakterisieren. Das mit Hilfe der in der Literatur publizierten Atomkoordination berechnete Pulverröntgendiffraktogramm (Kraus, W. und Nolze, G., Powder Cell. (1 ,8), Computerprogramm, Federal Institute for Materials
Research and Testing, Berlin (1995)) des Trihydrats entspricht dem experimentell ermittelten Diffraktogramm des untersuchten Trihydrats.
Die in Abhängigkeit von der Temperatur aufgenommenen Röntgendiffraktogramme zeigen bei 100°C das Vorliegen des reinen Monohydrats, wenn geringe Mengen Trihydrat (E und SN 40.1) eingesetzt werden. Bei den entsprechenden Aufnahmen größerer Mengen liegt das Monohydrat nicht mehr quantitativ vor (Tab. 3).
Verhalten gegenüber unterschiedlicher Luftfeuchtigkeit
Versuchsplan
Eine Übersicht (Versuchsplan) über die zeitabhängigen Sorptions- und Desorptionsversuche findet sich in Tab. 2.
Tab. 2: Übersicht der zeitabhängigen, bei verschiedenen relativen
Luftfeuchtigkeiten durchgeführten Versuchsreihen unterschiedlicher Amifostin-Proben
Abb. 12 zeigt die in Abhängigkeit von der Zeit und Lagerbedingung gemessene prozentuale Wasseraufnahme der aus dem Trihydrat nach Trocknung gewonnenen amorphen Form bei 25°C bei verschiedenen relativen Luftfeuchtigkeiten (RF).
Abb. 13 zeigt die Sorption von S1 (Monohydrat) bei 25°C und unterschiedlichen relativen Luftfeuchten.
Wird das Monohydrat bei 25°C relativen Feuchten von 13 bis 75 % ausgesetzt, so findet bei Lagerung über 14 Tage bis zur Feuchte von 62 % keine Sorption statt. Bei 75 % r.F. nimmt die Probe circa 15 % Wasser auf, was circa 2 mol Wasser entspricht. Aus Abb. 12 kann man eine rasche Wasseraufnahme der amorphen Form innerhalb von 5 Stunden erkennen. Je nach Umgebungszustand bilden sich unterschiedliche Hydratzustände heraus.
Abb. 14 zeigt die Wasserdampfdesorption und -sorption des Monohydrats (S1) bei 0 und 13 % relativer Feuchte. Im Gegensatz zum Trihydrat dauert die Dehydratisierung über 2 Wochen. Andererseits ist bereits nach 1 Stunde bei 13 % relativer Feuchte die erneute Bildung des Monohydrats abgeschlossen. Die wiederholte Lagerung des Monohydrats bei 0 % RF zeigt aber, dass dann zur Dehydratisierung nur noch ca. 1 Woche benötigt wird.
Das Desorptionsverhalten des Trihydrats (E und SN 40.1) sowie des Monohydrats (S1) über Phosphorpentoxid (0 % RF) zeigt Abb. 15 im Vergleich. Die Desorption des Trihydrats verläuft innerhalb von weniger als 2 Tagen unter Bildung der amorphen Form. Die beiden Trihydrat-Kristallisate E und SN 40.1 unterscheiden sich praktisch nicht im aufgezeichneten Dehydratisierungsprozess. Der hierbei, ermittelte Massenverlust beträgt jeweils ca. 20 %. Der berechnete Massenverlust für ein Trihydrat beträgt 20,13 % (bezogen auf die wasserhaltige Substanz), wenn das Anhydrat gebildet wird. Die Desorption des Monohydrats (theoretischer Massenverlust 7,75 %) verläuft deutlich langsamer und ist erst nach 10 Tagen abgeschlossen. Dabei beträgt der gemessene Massenverlust 7,5 %.
Wird das Trihydrat (SN 40.1) bei 25°C relativen Feuchten von 13 bis 43 % ausgesetzt (Abb. 16), desorbiert bzw. sorbiert das Trihydrat innerhalb von 12 Wagen praktisch kein Wasser, die Massenänderungen bewegen sich innerhalb der Fehlerbreite der Methode. Wird das Monohydrat (S1) bei 25°C relativen Feuchten von 13 bis 75 % ausgesetzt, so findet bei Lagerung über 14 Tage bis zur Feuchte von 62 % keine Sorption statt. Bei 75 % r.F. nimmt die Probe circa 15 % Wasser auf, was ca. 2 mol Wasser entspricht. In der Folge wurde auch der Trocknungsverlauf von Trihydrat und Monohydrat bei 35°C und 13 % RF verfolgt (Abb. 17). Dabei kommt es innerhalb von 8 Tagen beim Trihydrat zu einem Massenverlust, der beim Monohydrat nicht auftritt.
Weitere Untersuchungen
Bestimmung des Trocknungsverlustes
Die Bestimmung des Trocknungsverlustes von Amifostin-Trihydrat erfolgte mit unterschiedlichen Bedingungen. In Tab. 3 ist eine Übersicht über die durchgeführten Versuche sowie deren differentialkalorimetrischen Ergebnisse dargestellt. Bereits eine Lagerung des Trihydrats über 3 h bei 50°C führt unter vollständigem Wasserverlust zum amorphen Produkt.
Bestimmung der chemischen Reinheit
SN 40.1 (Trihydrat) und S1 (Monohydrat) wurden in der Glasflasche 6 Wochen bei 40°C ein-gelagert. Mittels der Vorschrift des amerikanischen Arzneibuches wurde der Ausgangsgehalt berechnet auf die wasserfreie Substanz mit größer 95 % ermittelt. Während das Trihydrat bei 6-wöchiger Lagerung einen Restgehalt von größer 95 % zeigte, fiel der Gehalt des Trihydrats unter 80 %.
Tab. 3: Zusammenfassung der Untersuchungen zur Bestimmung des
Trocknungsverlustes von Amifostin-Trihydrat
Kristallisations- und Stabilitätsuntersuchungen
Die Bedingungen und Ergebnisse der Untersuchungen sind in Tab. 4 zusammengefasst.
Tab. 4a: Übersicht A der durchgeführten Kristallisations- und
Stabilitätsuntersuchungen von Amifostin
UK = Umkristallisation, T = Trihydrat, M = Monohydrat
Tab. 4b: Übersicht B der durchgeführten Kristallisations- und
Stabilitätsuntersuchungen von Amifostin
UK = Umkristallisation, T = Trihydrat, M = Monohydrat