WO2002018396A1 - Amifostin-monohydrat und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

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WO2002018396A1
WO2002018396A1 PCT/EP2001/009902 EP0109902W WO0218396A1 WO 2002018396 A1 WO2002018396 A1 WO 2002018396A1 EP 0109902 W EP0109902 W EP 0109902W WO 0218396 A1 WO0218396 A1 WO 0218396A1
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WO
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monohydrate
amifostine
trihydrate
water
methanol
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PCT/EP2001/009902
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Arnim Laicher
Martin Auer
Elisabeth Gstrein
Artur Burger
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Klinge Pharma Gmbh
BURGER, Renate
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/16—Esters of thiophosphoric acids or thiophosphorous acids
    • C07F9/165—Esters of thiophosphoric acids
    • C07F9/1651—Esters of thiophosphoric acids with hydroxyalkyl compounds with further substituents on alkyl

Definitions

  • the invention relates to the production of a trihydrate, a monohydrate and the amorphous form of amifostine (AF), in particular the reproducible production of the monohydrate of AF.
  • AF amifostine
  • Amifostin is S- [2- (3-aminopropylamino) ethyl] dihydrogen phosphorothioate (anhydrate: CAS No. 20537-88-6, C5H15N203PS, No. 214.22). It is used as a cytoprotective agent in tumor therapy. AF (prodrug) is dephosphorylated to free thiol (active form) by the alkaline phosphatase. AF therefore selectively protects non-tumor-infested cells from radiation and cystostatics, because the concentration of alkaline phosphatase in healthy cells is much higher than in tumor cells. The usual dose is 0.910 g / m 2 body surface area in adults (15-minute infusion) (Hunnius Pharmaceutical Dictionary; 8th edition, A. Burger and H. Wamba; Berlin, New York: de Gruyter, 1998).
  • AF is first synthesized by Piper J.R. et al. in the Journal of Med. Chem. 12, 236-243 (1969) in the search for potential protective agents against radioactive radiation.
  • the synthesis proceeds over several stages, the final step being a precipitation of an aqueous solution of AF by adding methanol. There is no information about the concentration of the aqueous solution and a precise description of the addition.
  • AF monohydrate (probably based on elemental analysis) with a melting point of 160 to 161 ° C (Kofler heating bench) is mentioned as the product of the synthesis.
  • the analytical investigations are carried out by Piper et al. not detailed. No thermoanalytical, morphological or crystallographic characterization of the monohydrate was carried out (except for the determination of the melting point).
  • Freeze-drying amorphous AF is described by Zadeii, J.M. et al. in Pharm. Res. 8, 172 (1991) contrasted crystalline AF without, however, addressing the water content of AF.
  • AF trihydrate is mentioned as a synthesis product, which is formed by adding ethanol to an aqueous solution of AF.
  • the trihydrate of amifostine (melting point 85-88 ° C. with decomposition; DSC, 5 K / min) is generally obtained by crystallization from aqueous solvents or by stirring the suspension of any form of AF in aqueous solvents.
  • the object of the invention is to provide the monohydrate of amifostine and a reproduced process for its production.
  • a trihydrate, a monohydrate and the amorphous form of amifostine (AF) are produced quantitatively and reproducibly.
  • AF trihydrate (melting point 85-88 ° C with decomposition; DSC, 5 K min), which precipitates out by crystallization from aqueous solvents or by stirring the suspension of any form of AF in aqueous solvents, is between 13 and 43 at 25 ° C % relative humidity (RF) stable in the investigation period of 13 days.
  • RF relative humidity
  • Amorphous AF can be easily produced by storing the trihydrate over phosphorus pentoxide.
  • the monohydrate of AF (melting point approx. 134 to 136 ° C. with decomposition; DSC, 5 K min "1 ) is achieved by continuously adding an aqueous solution of AF (with respect to anhydrous substance) to a 2-20-fold excess of methanol within 2-20 minutes, the solution is preferably concentrated to 10-30%, the excess of methanol is 2-10 times and the addition is preferably carried out within 10-20
  • the quantity ratio water / methanol as well as the type of implementation play a decisive role for a quantitative and reproducible recovery AF monohydrate is stable at 25 ° C between 13 and 62% relative humidity in the investigation period of 9 days.
  • the three solid shapes produced were characterized and identified using thermal analysis, X-ray diffractometry and vibration spectroscopy.
  • the DSC method and X-ray diffractometry should be given preference, since it is the easiest way to recognize admixtures of other forms.
  • the water is completely removed by storing the monohydrate over phosphorus pentoxide at 25 ° C. for several days. When subsequently stored at 13% relative humidity, the monohydrate forms again within 1 hour.
  • the amorphous form is formed within less than 2 days.
  • An anhydrous, crystalline form is not yet known. In particular, no direct conversion from trihydrate to monohydrate was observed. A conversion from monohydrate to trihydrate was only found at relative humidities from 75%. The behavior of monohydrate and trihydrate after complete water removal is interesting. After subsequent exposure to low relative humidity (13%), the dried monohydrate immediately absorbs water again with the formation of a monohydrate. In contrast, an amorphous phase can be found in the trihydrate after water removal, the sorption properties of which differ depending on the original trihydrate product.
  • the present invention shows that trihydrate, monohydrate and amorphous form of amifostine can be obtained quantitatively and reproducibly.
  • the reproducible AF crystal form according to the invention is distinguished by a particular stability compared to known compositions and does not require an additional stabilizer, such as e.g. Mannitol.
  • the chemically and physically very stable monohydrate is advantageous over the trihydrate when amifostine is processed into sterile products for reconstitution.
  • the latter must be stored under refrigerator conditions, since it is already converted into the amorphous form at temperatures above 35 ° C.
  • the production of the trihydrate requires considerable validation effort in order to arrive at a reproducible product.
  • Fig. 3 DSC curve of AF monohydrate (S1), perforated capsule, heating rate 5 K min "1 .
  • Fig. 5 DSC curve of AF monohydrate (S1), high pressure capsule, heating rate 5 K min "1 .
  • Fig. 6 DSC curves of AF trihydrate (E), comparison of different sample capsules,
  • Fig. 8 TGA curves of monohydrate (S1) and trihydrate (recrystallized from 20% ethanol and inoculated with E), heating rate 5 K min "1 .
  • M monohydrate (S1), a: amorphous form.
  • Fig. 12 Water vapor sorption (mass change Wt based on dry matter) of the amorphous form, obtained from trihydrate E, between 13 and 84% RH at 25 ° C.
  • Fig. 14 Water vapor desorption and sorption of the monohydrate (S1) (mass change Wf based on the hydrated substance) at 0 and 13% relative humidity (25 ° C).
  • Fig. 15 Water vapor desorption (mass change Wf based on the hydrated substance) of the trihydrate (E and SN 40.1) and the monohydrate (S1) over phosphorus pentoxide (0% RH) at 25 ° C.
  • Fig. 16 Water vapor desorption (mass change Wf based on the hydrated substance) of the trihydrate SN 40.1 at 25 ° C and relative humidity of 13 to 43%; for comparison also the desorption curve at 0% RH.
  • Thermomicroscopy with Kofler heating table (Reichert, Vienna), mounted on an Olympus microscope BH-2 equipped with a video system or with a Kofler heating table microscope Thermovar® (Reichert, Vienna); both microscopes with polarization device.
  • Siemens X-ray diffractometer D-5000 Diffrac / AT with ⁇ / ⁇ geniometer (Siemens AG, Düsseldorf, Germany), CuK ⁇ radiation (acceleration voltage 40 kV, tube current 40 mA), nickel filter for monochromatization, Göbel mirror, scintillation counter, angular range 2 ° to 40 ° (2 ⁇ ), step size 0.01 ° (2 ⁇ ), measuring time 2 s. Calibration of the d values (CuK ⁇ ⁇ ) with silicon NBS standard.
  • Air-conditioned sample chamber consisting of low-temperature chamber, TTK (Anton Paar KG, A-Graz), in conjunction with the SYCOS-H humidification system (asynco, D-Karlsruhe). Determination of drying loss
  • the sorption measurements were carried out at 25 ° C and 13, 31, 43, 62, 75 and 84% relative air humidity, the desorption measurements at 25 ° C and 0% and at 35 ° C and 13% relative humidity.
  • the release or absorption of water by the test substance was determined gravimetrically depending on the time (from 2 hours to 16 days).
  • special semi-micro hygrostats UJ Griesser and A. Burger, Int. J. Pharm. 120, 83-93 (1995)
  • the sample weights for Ethyol® were approx. 40 to 50 mg and approx. 180 mg for amifostine trihydrate (SN 35.6 and SN 40.1) and were carried out to an accuracy of ⁇ 0.02 mg.
  • the relative humidity (RF) in the thermostatted semi-micro hygrostats was adjusted with phosphorus pentoxide (RF 0%) and saturated Saline solutions of lithium chloride (RF 13%), calcium chloride (RF 31%) and potassium carbonate (RF 43%), ammonium nitrate (RF 62%), sodium chloride (RF 75%) and potassium chloride (RF 84%).
  • RF relative humidity
  • the moisture measurements were measured or checked with an air humidity measuring device Lufft GTL (G. Lufft Mess- und Regeltechnik GmbH, D-Stuttgart). This air humidity measuring device was calibrated with saturated solutions of lithium chloride and magnesium chloride.
  • the thermostats of the hygrostats were thermostatted in an incubator thermostatted at 25 or 35 ° C, which is located in the cooling room thermostatted at 15 ° C. The temperature of these locations of the hygrostats was checked over time with a registering thermometer. It was constant at +0.5 K.
  • Ethyol® (Ch. 98D16-17), AF trihydrate (SN 35.6 and SN 40.1), AF amorphous (SN 35.6 UK after drying tests) and Amifostin S1 (SN 35/3 UK) were added to the sample vessel of the semi-micro hygrostat weighed in and immediately afterwards placed in the conditioned hygrostat.
  • the trihydrate can e.g. by suspending any mixture of trihydrate, monohydrate and amorphous form in water or methanol, and by recrystallization from ethanol / water (for example 20% v / v) or tert-butyl alcohol / water (for example 20% v / v), subsequent filtration using a water jet vacuum (approx. 10 mbar, approx. 10 min) and drying at room temperature.
  • ethanol / water for example 20% v / v
  • tert-butyl alcohol / water for example 20% v / v
  • the use of seed crystals can be beneficial in this procedure.
  • Precipitation with ethanol (96%) or with tert-butyl alcohol from an aqueous solution at room temperature is particularly useful.
  • the appropriate precipitant should not be dropped too quickly into the aqueous solution up to a maximum content of 20%.
  • a white precipitate forms.
  • the monohydrate can be produced reproducibly in the following way: For example, 200 mg of trihydrate (for example SN 40.1, see Table 1) are dissolved in 0.5 ml of water by heating to 40 ° C. for about 1 minute. 4 ml of methanol are introduced into a 50 ml round bottom flask and stirred with a magnetic stirring at room temperature (about 300 U min "1). The aqueous solution is slowly added dropwise with a Pasteur pipette, forming a white precipitate. The suspension is min. 10 min stirred and then filtered with a microglass filter (G4) over a water jet vacuum, washed with 4 ml of ethanol (96%) and air-dried on a filter paper.
  • a microglass filter G4
  • the amorphous form (anhydrous) is obtained by storing the trihydrate over phosphorus pentoxide to constant weight, which is associated with approx. 20% mass loss. The time required for this depends on the production of the trihydrate and the temperature. The process takes a few hours at approx. 50 ° C, and one to a few days at 25 ° C.
  • the trihydrate (E) obtained by lyophilization is in the form of white rods and small irregular platelets, as well as grains.
  • the sample shows practically no interference colors in polarized light.
  • the crystals are already removed approx. 50 ° C darker due to dehydration. From 70 ° C the crystals are much darker. The remaining crystals show no pronounced onset of melting, but flow into one another at approx. 110 ° C. The melting end is approx. 130 ° C.
  • the sample melts with decomposition.
  • Silgel a suitable silicone oil for thermomicroscopic examination
  • the majority of the rods and stems also show low interference colors, only a few larger plates show higher interference colors.
  • a change in the interference colors due to dehydration can be observed from 73 ° C.
  • glass bubbles form at this temperature, which increases sharply above 80 ° C.
  • the crystals flow between 138 and 155 ° C with decomposition.
  • the white crystals of the monohydrate (S1) have a small-grained habit and melt (melt) when heated on a thermal microscope from 145 ° C with decomposition.
  • DSC Differential calorimetry
  • Fig. 1 shows the DSC curve of E (trihydrate produced by lyophilization).
  • Fig. 2 shows the DSC curve of a trihydrate, which was produced by recrystallization from ethanol 20% (V / V).
  • the melting point of the monohydrate (S1) determined by DSC is between 134 and 136 ° C (Fig. 3).
  • the very broad melting peak of the monohydrate is in accordance with the thermomicroscopic examinations and can be attributed to the fragility of the sample. This is also the explanation for the fact that when the melting point is determined with the Kofler heating bench (determination of the instant melting point), as is customary with decomposable substances, a much higher value (160 to 161 ° C) is found. If the heating-up speed is reduced from 5 K / min to 0.5 K / min in the DSC examinations, the melting is already carried out at 120 ° C.
  • Fig. 6 shows the DSC curves of E recorded using different DSC sample capsules.
  • the melting point of the trihydrate (E) determined using a tightly closed aluminum sample capsule is 87 ° C.
  • Fig. 7 presents an overview of the DSC curves of the 3 crystal forms of AF recorded with perforated aluminum sample capsules.
  • the mass losses are between 16.6 and 19%.
  • Fig. 8 shows the TGA curves of monohydrate and trihydrate recorded under the same conditions.
  • the greater thermal load capacity of the monohydrate can be clearly seen, in which a significant loss of mass only begins at around 100 ° C, but in the case of the trihydrate at around 60 ° C.
  • the FTIR spectra of E, S1 and the amorphous form of AF obtained using the KBr pressing technique show considerable differences and can therefore be used for identification (Fig. 9).
  • the comparison of the 3 IR spectra shows particularly significant band shifts between 3300 and 3500 cm and between 1750 and 1300 cm.
  • the 3 crystal forms of AF can also be characterized by means of FT Raman spectroscopy (Fig. 10).
  • the areas 2800 to 3100 cm “1 , 1350 to 1500 cm “ 1 and 900 to 1100 cm “1 are particularly suitable for identification.
  • the powder X-ray diffractograms (Fig. 11) of the two hydrates of amifostine show marked differences in the interplanar spacing and reflection intensities.
  • the amorphous shape shows a corresponding absorption ridge.
  • the powder X-ray diffractogram calculated using the atomic coordination published in the literature (Kraus, W. and Nolze, G., Powder Cell. (1, 8), computer program, Federal Institute for Materials Research and Testing, Berlin (1995)) of the trihydrate corresponds to the experimentally determined diffractogram of the trihydrate investigated.
  • the X-ray diffractograms recorded as a function of the temperature show the presence of pure monohydrate at 100 ° C when small amounts of trihydrate (E and SN 40.1) are used. The monohydrate is no longer available quantitatively in the corresponding recordings of larger quantities (Tab. 3).
  • Fig. 12 shows the percentage of water absorption of the amorphous form obtained from the trihydrate after drying, measured as a function of time and storage conditions, at 25 ° C at various relative air humidities (RF).
  • Fig. 13 shows the sorption of S1 (monohydrate) at 25 ° C and different relative humidity.
  • Fig. 14 shows the water vapor desorption and sorption of the monohydrate (S1) at 0 and 13% relative humidity. In contrast to trihydrate, dehydration lasts over 2 weeks. On the other hand, the re-formation of the monohydrate is complete after 1 hour at 13% relative humidity. However, the repeated storage of the monohydrate at 0% RH shows that it only takes about 1 week to dehydrate.
  • Fig. 15 shows a comparison of the desorption behavior of the trihydrate (E and SN 40.1) and the monohydrate (S1) over phosphorus pentoxide (0% RH).
  • the desorption of the trihydrate takes less than 2 days to form the amorphous form.
  • the two trihydrate crystals E and SN 40.1 practically do not differ in the recorded dehydration process.
  • the mass loss determined here is approximately 20% in each case.
  • the calculated mass loss for a trihydrate is 20.13% (based on the water-containing substance) when the anhydrate is formed.
  • the desorption of the monohydrate (theoretical mass loss 7.75%) is significantly slower and is only completed after 10 days.
  • the mass loss measured is 7.5%.

Abstract

Amifostin-Monohydrat ist durch ein Verfahren umfassend den Schritt der kontinuierlichen Zugabe einer wässrigen Lösung von Amifostin mit einer Konzentration von 10 bis 60 Gewichts-% (bezogen auf die wasserfreie Substanz) zu einem 2 bis 20-fachen Volumenüberschuss von Methanol innerhalb von 2 bis 20 Minuten reproduzierbar herstellbar. Eine Dosierungsform enthaltend kristallines und steriles Amifostin-Monohydrat ist bei 20 °C für einen Zeitraum von mindestens 6 Monaten thermisch stabil.

Description

Amifostin-Monohydrat und Verfahren zu seiner Herstellung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Trihydrats, eines Monohydrats und der amorphen Form von Amifostin (AF), insbesondere die reproduzierbare Herstellung des Monohydrats von AF.
Hintergrund der Erfindung
Amifostin (AF) ist S-[2-(3-Aminopropylamino)ethyl]-dihydrogenphosphorothioat (Anhydrat: CAS-Nr. 20537-88-6, C5H15N203PS, Nr. 214.22). Es wird in der Tumortherapie als Zyto- protektivum verwendet. Durch die alkalische Phosphatase wird AF (Prodrug) zum freien Thiol (Wirkform) dephosphoryliert. AF schützt daher selektiv nichttumorbefallene Zellen vor Strahlung und Zystostatika, weil die Konzentration der alkalischen Phosphatase in gesün-deren Zellen wesentlich höher ist als in Tumorzellen. Die übliche Dosis beträgt 0,910 g/m2 Körperoberfläche bei Erwachsenen (15-minütige Infusion) (Hunnius Pharmazeutisches Wörterbuch; 8. Aufl., A. Burger u. H. Wächter; Berlin, New York: de Gruyter, 1998).
Die Synthese von AF wird erstmals von Piper J.R. et al. im Journal of Med. Chem. 12, 236-243 (1969) bei der Suche nach potentiellen Schutzmitteln gegenüber radioaktiver Strahlung beschrieben. Die Synthese verläuft über mehrere Stufen, wobei im letzten Schritt eine Fällung einer wassrigen Lösung von AF durch Zugabe von Methanol angegeben wird. Über die Konzentration der wassrigen Lösung sowie eine genaue Beschreibung der Zugabe finden sich keine Angaben. Als Produkt der Synthese wird AF- Monohydrat (wahrscheinlich aufgrund der Elementaranalyse) mit einem Schmelzpunkt von 160 bis 161 °C (Kofler-Heizbank) angeführt. Die analytischen Untersuchungen werden von Piper et al. nicht näher ausgeführt. Es wurde (ausgenommen der Bestimmung des Schmelzpunktes) keine thermoanalytische, morphologische oder kristallographische Charakterisierung des Monohydrats vorgenommen.
In dem US Patent Nr. US 3892824 wird die Synthese erneut beschrieben. Zusätzlich werden die experimentellen Werte einer Elementaranalyse angeführt. Der experimentell bestimmte Wasserstoffgehalt von 7,27 % liegt etwas unterhalb des theoretischen Wertes eines Monohydrats (7,33 %) und über dem theoretischen Wert eines Anhydrats (7,00 %). Weitere analytische Untersuchungen gehen aus dem US Patent Nr. 3892824 nicht hervor.
Karle, M., Karle, I. L. in Acta Cryst. C44, 135 (1988) beschreiben das aus Ethanol/Wasser kristallisierte, orthorhombische AF-Trihydrat, das über Einkristallstrukturanalyse bestimmt wird.
Durch Gefriertrocknung hergestelltes amorphes AF wird von Zadeii, J. M. et al. in Pharm. Res. 8, 172 (1991) kristallinem AF gegenübergestellt, ohne jedoch auf den Wassergehalt von AF einzugehen.
In den DDR-Patenten DD-289448 und DD-289449 wird als Syntheseprodukt AF-Trihydrat angeführt, welches sich durch Zugabe von Ethanol zu einer wassrigen Lösung von AF bildet.
In den US-Patenten Nr. US 5424471 und US 5591731 wird die Herstellung, Charakterisierung und der Einsatz von amorphem AF als Radio- und Zytoprotektivum beschrieben. Zur Charakterisierung des Trihydrats wird die Einkristallstruktur angegeben, wobei die genannten Parameter praktisch identisch mit denjenigen sind, die bereits durch Karle, M. und Karle, I. L. in Acta Cryst. C44, 135 (1988) veröffentlicht wurden. Der beanspruchte Gegenstand der beiden Schutzrechte findet sich auch zusammengefasst in einer europäischen Patentanmeldung EP 93918555.6 (hervorgegangen aus WO94/03179, entsprechend PCT/US93/07222) wieder.
Das Trihydrat von Amifostin (Schmelzpunkt 85 - 88°C unter Zersetzung; DSC, 5 K/min) fällt im allgemeinen durch Kristallisation aus wassrigen Lösungsmitteln oder durch Rühren der Suspension einer beliebigen Form von AF in wassrigen Lösungmitteln an.
Obgleich Monohydrate in der Literatur genannt werden, können diese bisher nicht reproduzierbar hergestellt werden. Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung ist es, das Monohydrat von Amifostin und ein reproduziertes Verfahren zu seiner Herstellung bereitzustellen.
Es werden ein Trihydrat, ein Monohydrat und die amorphe Form von Amifostin (AF) quantitativ und reproduzierbar hergestellt.
AF-Trihydrat (Schmelzpunkt 85 - 88°C unter Zersetzung; DSC, 5 K min), das durch Kristallisation aus wassrigen Lösungsmitteln oder durch Rühren der Suspension einer beliebigen Form von AF in wassrigen Lösungsmitteln ausfällt, ist bei 25°C zwischen 13 bis 43 % relativer Feuchte (RF) im Untersuchungszeitraum von 13 Tagen stabil. Bei Lagerung über 13 Tage bei 35°C und 13 % r.F. tritt aber bereits ein Wasserverlust auf.
Die PCT/US93/07222 hat als Ziel die Herstellung von Amifostin, das bei Kühlschranklagerung (4°C) mindestens 2 Jahre stabil ist. Das amerikanische Arzneibuch schreibt für Amifostin Trihydrat eine Kühlschranklagerung vor (USP 24, S. 2790). Dies hat wohl seinen Grund in dem obigen Instabilitätsverhalten.
Amorphes AF kann in einfacher Weise durch Lagerung des Trihydrats über Phosphorpentoxid hergestellt werden.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass auch das Monohydrat durch ein spezielles Kristallisationsverfahren reproduzierbar hergestellt werden kann. Die Herstellung des Monohydrats von AF (Schmelzpunkt ca. 134 bis 136°C unter Zersetzung; DSC, 5 K min"1) gelingt durch kontinuierliche Zugabe einer auf 10 - 60 % (G/G) konzentrierten wassrigen Lösung von AF (in Bezug auf wasserfreie Substanz) zu einem 2-20-fachen Überschuss von Methanol innerhalb von 2 - 20 Minuten. Bevorzugt ist die Lösung auf 10 - 30 % konzentriert, der Überschuß von Methanol beträgt 2 - 10 fach und die Zugabe erfolgt bevorzugt innerhalb von 10 - 20 Minuten. Für eine quantitative und reproduzierbare Gewinnung kommt dabei dem Mengenverhältnis Wasser/Methanol, sowie der Art der Durchführung eine entscheidende Rolle zu. AF-Monohydrat ist bei 25°C zwischen 13 und 62 % relativer Feuchte im Untersuchungszeitraum von 9 Tagen stabil. Die von Piper et al. (Piper J. R. et al., J. Med. Chem. 12, 236 - 243 (1969)) beschriebene Kristallisation des Monohydrats (Zugabe eines ca. 6-fachen Überschusses von Methanol zu einer wassrigen Lösung) führte hingegen ausschließlich nur zum Trihydrat und nicht zum Monohydrat.
Die drei hergestellten Ferstkörperformen wurden thermoanalytisch, röntgendiffraktometrisch und schwingungsspektroskopisch charakterisiert und identifiziert. Der DSC-Methode und der Röntgendiffraktometrie ist der Vorzug zu geben, da Beimengungen anderer Formen damit am leichtesten erkannt werden können.
Durch mehrtätige Lagerung des Monohydrats über Phosphorpentoxid bei 25°C wird das Wasser vollständig entzogen. Bei anschließender Lagerung bei 13 % relativer Feuchte bildet sich innerhalb 1 Stunde erneut das Monohydrat.
Bei der Lagerung des Trihydrats über Phosphorpentoxid bildet sich bei 25°C hingegen innerhalb von weniger als 2 Tagen bereits die amorphe Form, die chemisch wenig stabil ist und die sich je nach Herstellung des verwendeten Trihydrats unterschiedlich gegenüber feuchter Luft verhält. Eine wasserfreie, kristalline Form ist bislang nicht bekannt. Insbesondere konnte keine direkte Umwandlung von Trihydrat zu Monohydrat beobachtet werden. Eine Umwandlung von Monohydrat zu Trihydrat konnte erst bei relativen Feuchten ab 75 % festgestellt werden. Interessant ist das Verhalten von Monohydrat und Trihydrat nach vollständigem Wasserentzug. Das getrocknete Monohydrat nimmt nach anschließendem Aussetzen bei geringer relativer Feuchte (13 %) sofort unter erneuter Ausbildung eines Monohydrats Wasser auf. Im Gegensatz dazu kann beim Trihydrat nach dem Wasserentzug eine amorphe Phase festgestellt werden, deren Sorptionseigenschaften in Abhängigkeit vom ursprünglichen Trihydrat-Produkt unterschiedlich sind.
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass Trihydrat, Monohydrat und amorphe Form von Amifostin quantitativ und reproduzierbar gewonnen werden können.
Während beim Trihydrat die Herstellungsbedingungen stark variiert werden können, besteht beim Monohydrat ein wesentlich geringerer Spielraum. Insbesondere reichen die Syntheseangaben von Piper et al. (J. Med. Chem. 12, 236 - 243 (1969)) nicht aus, um AF-Monohydrat quantitativ und reproduzierbar herzustellen. Die Herstellung des Monohydrates durch langsame Zugabe einer konzentrierten wassrigen Lösung von AF zu im großen Übeschuss vorliegenden Methanol ist von Piper et al. nicht beschrieben. Die quantitative Herstellung von AF-Monohydrat durch gezielte Sorption bzw. Desorption sowie durch Zugabe von Lösungsmitteln (z.B. Methanol) zu wassrigen Lösungen von AF gelingt im Gegensatz zum erfindungsgemäßen Verfahren nur selten.
Die erfindungsgemäße reproduzierbar herstellbare AF-Kristallform zeichnet sich durch eine besondere Stabilität gegenüber bekannten Zusammensetzungen aus und benötigt keinen zusätzlichen Stabilisator, wie z.B. Mannitol.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass bei der Verarbeitung von Amifostin zu sterilen Produkten zur Rekonstitution das chemisch und physikalisch sehr stabile Monohydrat vorteilhaft ist gegenüber dem Trihydrat. Letzteres ist bei Kühlschrankbedingungen zu lagern, da es sich bereits bei Temperaturen ab 35°C aufwärts in die amorphe Form umlagert. Die Herstellung des Trihydrats erfordert einen erheblichen Validierungsaufwand, um zu einem reproduzierbaren Produkt zu gelangen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Abb. 1 DSC-Kurve von AF-Trihydrat (E), perforierte Kapsel,
Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 2 DSC-Kurve von AF-Trihydrat (aus Ethanol 20 % kristallisiert), perforierte
Kapsel, Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 3 DSC-Kurve von AF-Monohydrat (S1), perforierte Kapsel, Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 4 DSC-Kurve von AF-Trihydrat (SN 40.1 ), Hochdruckkapsel,
Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 5 DSC-Kurve von AF-Monohydrat (S1), Hochdruckkapsel, Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1. Abb. 6 DSC-Kurven von AF-Trihydrat (E), Vergleich verschiedener Probenkapseln,
Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 7 DSC-Kurven von AF, Vergleich der drei Feststoffformen, perforierte
Probenkapsel, Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 8 TGA-Kurven von Monohydrat (S1) und Trihydrat (aus Ethanol 20 %-ig umkristallisiert und mit E angeimpft), Aufheizgeschwindigkeit 5 K min"1.
Abb. 9 FTIR-Spektren (KBr-Presstechnik) der AF-Formen. T: Trihydrat (E),
M: Monohydrat (S1), a: amorphe Form.
Abb. 10 FT-Raman-Spektren der AF-Formen. T: Trihydrat (E), M: Monohydrat (S1), a: amorphe Form.
Abb. 11 Pulverröntgendiffraktogramme der AF-Formen. T: Trihydrat (E), M: Monohydrat (S1 ), a: amorphe Form
Abb. 12 Wasserdampfsorption (Massenänderung Wt bezogen auf die Trockensubstanz) der amorphen Form, gewonnen aus dem Trihydrat E, zwischen 13 und 84 % RF bei 25°C.
Abb 13 Wasserdampfsorption (Massenänderung Wt bezogen auf die Trockensubstanz) des Monohydrats (S1), bei unterschiedlichen Feuchten über 14 Tage.
Abb. 14 Wasserdampfdesorption und -sorption des Monohydrats (S1) (Massenänderung Wf bezogen auf die hydratisierte Substanz) bei 0 und 13 % relative Feuchte (25°C).
Abb. 15 Wasserdampfdesorption (Massenänderung Wf bezogen auf die hydratisierte Substanz) des Trihydrats (E und SN 40.1) sowie des Monohydrats (S1) über Phosphorpentoxid (0 % RF) bei 25°C. Abb. 16 Wasserdampfdesorption (Massenänderung Wf bezogen auf die hydratisierte Substanz) des Trihydrats SN 40.1 bei 25°C und relativen Feuchten von 13 bis 43 %; zum Vergleich auch Desorptionsverlauf bei 0 % RF.
Abb. 17 Wasserdampfdesorption (Massenänderung Wf bezogen auf die hydratisierte Substanz) des Trihydrats SN 40.1 bei 35°C und 13 % RF im Vergleich zum Monohydrat (S1).
Nachfolgend wird die Erfindung detaillierter in den Beispielen beschrieben.
Beispiele
Die folgenden Verfahren wurden erfindungsgemäß angewendet:
Thermoanalyse
Thermomikroskopie mit Kofler-Heiztisch (Reichert, Wien), montiert auf einem mit einer Videoanlage ausgestatteten Olympus-Mikroskop BH-2 bzw. mit einem Kofler- Heiztischmikroskop Thermovar® (Reichert, Wien); beide Mikroskope mit Polarisationseinrichtung.
Differenzkalorimetrie mit DSC-7 (Perkin-Elmer, Norwalk, Ct., USA), Pyris-Software für Windows-NT; Al-Probenkapseln (25 μl), bzw. Hochdruckkapseln aus Stahl (vergoldet), Probeneinwaagen jeweils ca. 1 ,5 mg in perforierten Al-Probenkapseln sowie ca. 2, 7,5 und 11 ,5 mg in Hochdruckkapseln (Ultramikrowaage UM 3, Mettler, CH-Greifensee, Schweiz). Stickstoff 5,0 als Spülgas (20 ml min"1). Die Aufheizgeschwindigkeit der Proben betrug größtenteils 5 K/min. Kalibrierung der Temperaturanzeige über die Schmelzpunkte von Benzophenon (Schmp. 48,0°C, perforierte Probenkapsel) und Coffein-Anhydrat (Schmp. 236,2°C, dicht verschlossene Probenkapsel); Kalibrierung der Ordinate (DSC- Signal) über die Schmelzwärme von Indium 99,999 % (Perkin-Elmer, Norwalk, Ct., USA). Thermogravimetrie mit Thermogravimetrie-System TGA-7, Pyris-Software für Windows NT, (Perkin-Elmer, Nowalk, Ct., USA), Probenmengen ca. 2 bis 3 mg, Platin- Probenbehälter (50 μl), Stickstoff als Spülgas (sample purge: 20 ml min"1, balance purge: 40 ml min"1), Aufheizgeschwindigkeit 5 bzw. 0,5 K min"1.
Spektroskopie
FTIR-Spektroskopie und FTIR-Mikroskopie mit Bruker IFS 25 FTIR-Spektrometer (Bruker Analytische Messtechnik GmbH, Karlsruhe, Deutschland), Bruker FTIR-Mikroskop (15 x Cassegrain-Objektive mit Polarisationseinrichtung für das Sichtbare). Im allgemeinen wurde die KBr-Methode (ca. 1 ,2 mg Probe auf ca. 275 mg KBr) angewandt. Die Spektren werden im Transmissionsmodus im Bereich von 4000 bis 600 cm~1 aufgenommen. Auflösung: 2 cm"1 (Spektrometer, 50 Interferogramme) oder 4 cm"1 (Mikroskop, 100 Interferogramme):
FT-Raman-Spektroskopie mit Bruker RFS 100 FTR-Raman-Spektrometer (Bruker Analytische Messtechnik GmbH, Karlsruhe, Deutschland), ausgestattet mit einem Diodengepumpten Nd: YAG Laser (1064 nm) und einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten, hochempfindlichen Detektor. Die pulverförmigen Proben wurden in kleine Aluminiumhalterungen hineingedrückt; die Spektren wurden bei einer Ausgangsleistung von 100 mW aufgenommen; Auflösung: 4 cm"1 (50 Interferogramme).
Pulverröntgendiffraktometrie
Mit Siemens Röntgendiffraktometer D-5000, Diffrac/AT mit Θ/Θ-Geniometer (Siemens AG, Karlsruhe, Deutschland), CuKα-Strahlung (Beschleunigungsspannung 40 kV, Röhrenstrom 40 mA), Nickelfilter zur Monochromatisierung, Göbel-Spiegel, Szintillationszähler, Winkelbereich 2° bis 40° (2Θ), Schrittweite 0.01 ° (2Θ), Messzeit 2 s. Kalibrierung der d-Werte (CuKαι) mit Silizium NBS-Standard.
Klimatisierbare Probenkammer: bestehend aus Tieftemperaturkammer, TTK (Anton Paar KG, A-Graz), in Verbindung mit Befeuchtungssystem SYCOS-H (asynco, D-Karlsruhe). Bestimmung des Trocknungsverlustes
a) Nach Ph.Eur. im Trockenschrank Heraeus (W.C. Heraeus GmbH Produktbereich Elektrowärme, D-Hanaus 1)
b) Nach Ph.Eur. im Trockenofen Büchi TO-50 (Büchi, Laboratoriumstechnik AG, CH-Flawil/Schweiz)
c) Mit Hilfe des Mettler Infrarottrockners LP16 (Mettler Waage PM100 mit Mettler Infrarottrockner LP16-Aufsatz, Ausdruck der Protokolle mittels Mettler Toledo Drucker LC-P45, Mettler-Toledo AG, CH-Greifensee, Schweiz)
d) In den Probenhalterungen der Halbmikrohygrostaten.
Wasserdampfsorptionskurven
Allgemeine Bedingungen
Die Sorptionsmessungen erfolgten bei 25°C und 13, 31 , 43, 62, 75 und 84 % relativer Luft-feuchtigkeit, die Desorptionsmessungen bei 25°C und 0 % sowie bei 35°C und 13 % relativer Feuchte. Die Abgabe bzw. Aufnahme von Wasser durch die Untersuchungssubstanz wurde in Abhängigkeit von der Zeit (ab 2 Stunden bis zu 16 Tagen) gravimetrisch bestimmt. Zu diesem Zweck wurden spezielle Halbmikrohygrostaten (U.J. Griesser und A. Burger, Int. J. Pharm. 120, 83 - 93 (1995)) verwendet, deren Konstruktion es nicht erforderlich machte, die Probe zum Abwiegen aus den Hygrostaten zu nehmen (Unterflurwägung mit Mettler Semi-mikrowaage AT 261 , Mettler Instruments AG, CH-Greifensee). Die Probeneinwaagen be-trugen bei Ethyol® etwa 40 bis 50 mg bzw. ca. 180 mg bei Amifostin-Trihydrat (SN 35,6 und SN 40.1) und erfolgten auf ± 0,02 mg genau.
Konditionierung der Proben
Die Einstellung der relativen Luftfeuchtigkeit (RF) in den thermostatisierten Halbmikrohygrostaten erfolgte mit Phosphorpentoxid (RF 0 %) und gesättigten Salzlösungen von Lithiumchlorid (RF 13 %), Calciumchlorid (RF 31 %) und Kaliumcarbonat (RF 43 %), Ammoniumnitrat (RF 62 %), Natriumchlorid (RF 75 %) und Kaliumchlorid (RF 84 %). Vor den eigentlichen Messungen an der Untersuchungssubstanz bei 25 bzw. 35°C wurde die Einstellung der Luftfeuchtigkeit in den Halbmikrohygrostaten bestimmt. Die Feuchtemessungen wurden mit einem Luftfeuchtemessgerät Lufft GTL (G. Lufft Mess- und Regeltechnik GmbH, D-Stuttgart) gemessen bzw. überprüft. Die Kalibrierung dieses Luftfeuchtemessgerätes erfolgte mit gesättigten Lösungen von Lithiumchlorid und Magnesiumchlorid. Die Thermostatisierung der Hygrostaten erfolgte durch ihre Aufstellung in einem auf 25 bzw. 35°C thermostatisierten Brutschrank, die ihren Standplatz in dem auf 15°C thermostatisierten Kühlraum haben. Die Temperatur dieser Standorte der Hygrostaten wurde mit einem registrierenden Thermometer über die Zeit kontrolliert. Sie war auf +0,5 K konstant.
Sorptions-Desorptionskurven
Ethyol® (Ch. 98D16-17), AF-Trihydrat (SN 35,6 und SN 40,1 ), AF amorph (SN 35,6 UK nach Trocknungsversuchen) sowie Amifostin S1 (SN 35/3 UK) wurden in das Probengefäß der Halbmikrohygrostaten eingewogen und unmittelbar danach in die konditionierten Hygrostaten gegeben.
Proben
Für die Untersuchungen wurden selbst hergestellte Formen (Trihydrat, Monohydrat und amorphe Form) und Produkte der Fa. U.S. Bioscience, Inc. (Handelspräparat Ethyol®, ein steriles Lyophilisat zur Rekonstitution) sowie diverse selber hergestellte Chargen herangezogen (Tab. 1 ). Bei der Ethyol®-Charge 98D16-17 handelt es sich um reines AF- Trihydrat, nach Angaben des Herstellers ohne Hilfsstoffe. Offensichtlich ist dieses Produkt seit neuestem anstelle des amorphen, aber chemisch wenig stabilen Wirkstoffs, der zusammen mit Mannitol in Trockenstechampullen abgefüllt war, im Handel.
Die Untersuchungen der 2 Produkte (Chargen) von U.S. Bioscience und die der 18 Chargen selber hergestelltes Amifostin zeigen entweder das Vorliegen von AF als Monohydrat, Trihydrat, amorphe Form oder Mischungen davon (Tab. 1). Alle 20 aufgelisteten Chargen wurden zumindest mittels DSC untersucht. Tab. 1 : Untersuchte Proben von U.S. Bioscience (Ethyol®) und durch Eigensynthese hergestelltes Amifostin
Figure imgf000012_0001
Ethyol® 500 mg, Trockenstechampullen Herstellung von Trihydrat, Monohydrat und amorpher Form
Das Trihydrat kann z.B. durch Suspendieren einer beliebigen Mischung aus Trihydrat, Mono-hydrat und amorpher Form in Wasser oder Methanol, sowie durch Umkristallisation aus Ethanol/Wasser (z.B. 20 % V/V) oder tert.-Butylalkohol/Wasser (z.B. 20 % V/V), anschließendem Filtrieren mittels Wasserstrahlvakuum (ca. 10 mbar, ca. 10 min) und Trocknen bei Raumtemperatur hergestellt werden. Die Verwendung von Impfkristallen kann bei diesem Verfahren von Vorteil sein. Besonders zielführend ist die Ausfällung mit Ethanol (96 %) oder mit tert.-Butyl-alkohol aus einer wassrigen Lösung bei Raumtemperatur. Das entsprechende Fällungsmittel soll nicht zu schnell bis zu einem Maximalgehalt von 20 % in die wässrige Lösung getropft werden. Bei anschließender Lagerung im Eisfach bildet sich ein weißer Niederschlag.
Das Monohydrat kann auf folgende Weise reproduzierbar herstellt werden: Es werden z.B. 200 mg Trihydrat (z.B. SN 40.1 , s. Tab. 1) in 0,5 ml Wasser durch ca. 1-minütiges Erwärmen auf 40°C gelöst. 4 ml Methanol werden in einem 50 ml Rundkolben vorgelegt und mit einem Magnetrührstäbchen bei Raumtemperatur gerührt (ca. 300 U min"1). Die wässrige Lösung wird mit einer Pasteurpipette langsam zugetropft, wobei sich ein weißer Niederschlag bildet. Die Suspension wird mind. 10 min gerührt und anschließend mit einer Mikroglasfiltemutsche (G4) über Wasserstrahlvakuum abfiltriert, mit 4 ml Ethanol (96 %) gewaschen und auf einem Filterpapier luftgetrocknet.
Die amorphe Form (wasserfrei) wird erhalten, indem das Trihydrat über Phosphorpentoxid bis zur Gewichtskonstanz gelagert wird, was mit ca. 20 % Masseverlust verbunden ist. Die dafür notwendige Zeit hängt von der Herstellung des Trihydrats und der Temperatur ab. Bei ca. 50°C dauert der Prozess einige Stunden, bei 25°C ein bis einige Tage.
Identifizierung und Charakterisierung
Thermomikroskopie
Das durch Lyophilisation gewonnene Trihydrat (E) liegt in Form von weißen Stäbchen und kleinen unregelmäßigen Plättchen sowie auch Körnern vor. Im polarisierten Licht zeigt die Probe praktisch keine Interferenzfarben. Beim Aufheizen werden die Kristalle bereits ab ca. 50°C infolge der Dehydratisierung dunkler. Ab 70°C sind die Kristalle deutlich dunkler. Die noch verbleibenden Kristalle zeigen keinen ausgeprägten Schmelzbeginn, sondern fließen ab ca. 110°C ineinander. Das Schmelzende liegt bei ca. 130°C. Die Probe schmilzt unter Zersetzung.
In Silgel (ein geeignetes Silikonöl zur thermomikroskopischen Untersuchung) weist der Großteil der Stäbchen und Stängel ebenfalls niedrige Interferenzfarben auf, nur einige wenige größere Plättchen fallen durch höhere Interferenzfarben auf. Je nach Aufheizgeschwindigkeit kann man ab 73°C eine Änderung der Interfrerenzfarben infolge der Dehydratisierung beobachten. Gleichzeitig kommt es bei dieser Temperatur zur Glasblasen-bildung, die ab 80°C stärkt zunimmt. In Silgeleinbettung zerfließen die Kristalle zwischen 138 und 155°C unter Zersetzung.
Die weißen Kristalle des Monohydrats (S1) weisen einen kleinkörnigen Habitus auf und schmelzen (zerfließen) beim Erwärmen am Thermomikroskop ab 145°C unter Zersetzung.
Differenzkalorimetrie (DSC)
In Abb. 1 ist die DSC-Kurve von E (durch Lyophilisation hergestelltes Trihydrat) dargestellt. Abb. 2 zeigt die DSC-Kurve eines Trihydrats, das durch Umkristallisation aus Ethanol 20 % (V/V) hergestellt wurde.
Beide Trihydrate zeigen einen scharfen Schmelzpeak zwischen ca. 85 und 88°C mit einer deutlichen Schulter, die durch das freiwerdende Wasser hervorgerufen wird. Der ab ca. 120°C aufgezeichnete, breite endotherme Peak entspricht dem Schmelzen (unter Zersetzung) des Monohydrats, was IR-spektroskopisch bewiesen werden kann. Das FTIR-Spektrum der mit DSC (5K min"1) auf 100°C aufgeheizten Probe E zeigte das Vorliegen des Monohydrats.
Beim Schmelzen von E (Abb. 1) wird zusätzlich ein kleiner endothermer Peak registriert, der beim Trihydrat, das aus Wasser/Ethanol bei Raumtemperatur kristallisiert wurde, nicht auf-taucht. Dieser Peak könnte auf eine geringere chemische Reinheit der Substanz zurückge-führt werden. Das würde im Einklang mit dem bei E deutlich tieferen Schmelzpunkt des Monohydrats (127°C) stehen, das sich bei der DSC-Untersuchung aus dem Trihydrat bildet. Außerdem wurde als chemische Reinheit lediglich 98,5 % bestimmt. Bei dem durch Umkristallisation gewonnenen Trihydrat wird der Schmelzpunkt des sich daraus gebildeten Monohydrats bei 136°C ermittelt und seine chemische Reinheit beträgt ca. 99,5 %.
Der mittels DSC bestimmte Schmelzpunkt des Monohydrats (S1) liegt zwischen 134 und 136°C (Abb. 3). Der jeweils sehr breite Schmelzpeak des Monohydrats ist in Übereinstimmung mit den thermomikroskopischen Untersuchungen und kann auf die Zersetzlichkeit der Probe zurückgeführt werden. Das ist auch die Erklärung dafür, dass bei Bestimmung des Schmelzpunktes mit der Kofler-Heizbank (Bestimmung des Sofortschmelzpunktes), wie bei zersetzlichen Substanzen üblich, ein wesentlich höherer Wert (160 bis 161°C) gefunden wird. Wird bei den DSC-Untersuchungen die Aufheizgeschwindigkeit von 5 K/min auf 0,5 K/min gesenkt, wird das Schmelzen bereits bei 120°C realisiert.
Die Schmelzpunkte beider Hydrate wurden auch mit Hilfe von Stahlmantel-Hochdruckkapseln bestimmt. Die Messwerte sind jedoch stark abhängig von der Probeneinwaage. Bei ca. 7,5 mg Einwaage beträgt der Schmelzpunkt des Trihydrats 76°C (Abb. 4), der des Monohydrats 147°C (Abb. 5).
Abb. 6 zeigt die mittels unterschiedlicher DSC-Probenkapseln aufgenommenen DSC- Kurven von E. Der unter Verwendung einer dicht geschlossenen Aluminium-Probenkapsel ermittelte Schmelzpunkt des Trihydrats (E) liegt bei 87°C.
Eine Übersicht der mit perforierten Aluminium-Probenkapseln aufgenommenen DSC- Kurven der 3 Kristallformen von AF präsentiert Abb. 7.
Thermogravimetrie
Das mittels Thermogravimetrie untersuchte Trihydrat (E) sowie die durch Umkristallisation aus Ethanol erhaltenen Produkte weisen eine sehr ausgeprägte Stufe bei 55°C auf. Die Massenverluste liegen dabei zwischen 16,6 und 19 %. Ab 140°C fallen die Kurven aufgrund der schon thermomikroskopisch beobachteten Zersetzung ab. Die thermogravimetrische Untersuchung von S1 zwischen 23 und 180°C zeigt einen Massenverlust von 8,0 %. Dies kommt dem theoretischen Massenverlust von 7,7 % für ein Monohydrat sehr nahe. Das Vorliegen eines Monohydrats kann daher daraus abgeleitet werden. Ab ca. 150°C fällt die Kurve aufgrund von Zersetzung ab.
Abb. 8 zeigt die unter den gleichen Bedingungen aufgenommenen TGA-Kurven von Monohydrat und Trihydrat. Deutlich ist auch hier die größere thermische Belastbarkeit des Monohydrats zu erkennen, bei dem ein signifikanter Massenverlust erst ab ca. 100°C einsetzt, beim Trihydrat aber schon ab ca. 60°C.
FTIR-Spektroskopie
Die mit Hilfe der KBr-Presstechnik erhaltenen FTIR-Spektren von E, S1 und der amorphen Form von AF weisen erheblich Unterschiede auf und können daher zur Identifizierung heran-gezogen werden (Abb. 9). Der Vergleich der 3 IR-Spektren zeigt besonders signfikante Bandenverschiebungen zwischen 3300 und 3500 cm und zwischen 1750 und 1300 cm.
FT-Raman-Spektroskopie
In Analogie zu den IR-Spektren können die 3 Kristallformen von AF auch mittels FT- Raman-Spektroskopie charakterisiert werden (Abb. 10). Zur Identifizierung sind besonders die Bereiche 2800 bis 3100 cm"1, 1350 bis 1500 cm"1 und 900 bis 1100 cm"1 geeignet.
Pulverröntgendiffraktometrie
Die Pulverröntgendiffraktogramme (Abb. 11) der beiden Hydrate von Amifostin weisen markante Unterschiede in den Netzebenenabständen und Reflexintensitäten auf. Die amorphe Form zeigt einen entsprechenden Absorptionsrücken. Dadurch lassen sich diese 3 Fest-körperformen eindeutig charakterisieren. Das mit Hilfe der in der Literatur publizierten Atomkoordination berechnete Pulverröntgendiffraktogramm (Kraus, W. und Nolze, G., Powder Cell. (1 ,8), Computerprogramm, Federal Institute for Materials Research and Testing, Berlin (1995)) des Trihydrats entspricht dem experimentell ermittelten Diffraktogramm des untersuchten Trihydrats.
Die in Abhängigkeit von der Temperatur aufgenommenen Röntgendiffraktogramme zeigen bei 100°C das Vorliegen des reinen Monohydrats, wenn geringe Mengen Trihydrat (E und SN 40.1) eingesetzt werden. Bei den entsprechenden Aufnahmen größerer Mengen liegt das Monohydrat nicht mehr quantitativ vor (Tab. 3).
Verhalten gegenüber unterschiedlicher Luftfeuchtigkeit
Versuchsplan
Eine Übersicht (Versuchsplan) über die zeitabhängigen Sorptions- und Desorptionsversuche findet sich in Tab. 2.
Tab. 2: Übersicht der zeitabhängigen, bei verschiedenen relativen
Luftfeuchtigkeiten durchgeführten Versuchsreihen unterschiedlicher Amifostin-Proben
Figure imgf000017_0001
Sorption von Wasserdampf
Abb. 12 zeigt die in Abhängigkeit von der Zeit und Lagerbedingung gemessene prozentuale Wasseraufnahme der aus dem Trihydrat nach Trocknung gewonnenen amorphen Form bei 25°C bei verschiedenen relativen Luftfeuchtigkeiten (RF).
Abb. 13 zeigt die Sorption von S1 (Monohydrat) bei 25°C und unterschiedlichen relativen Luftfeuchten.
Wird das Monohydrat bei 25°C relativen Feuchten von 13 bis 75 % ausgesetzt, so findet bei Lagerung über 14 Tage bis zur Feuchte von 62 % keine Sorption statt. Bei 75 % r.F. nimmt die Probe circa 15 % Wasser auf, was circa 2 mol Wasser entspricht. Aus Abb. 12 kann man eine rasche Wasseraufnahme der amorphen Form innerhalb von 5 Stunden erkennen. Je nach Umgebungszustand bilden sich unterschiedliche Hydratzustände heraus.
Abb. 14 zeigt die Wasserdampfdesorption und -sorption des Monohydrats (S1) bei 0 und 13 % relativer Feuchte. Im Gegensatz zum Trihydrat dauert die Dehydratisierung über 2 Wochen. Andererseits ist bereits nach 1 Stunde bei 13 % relativer Feuchte die erneute Bildung des Monohydrats abgeschlossen. Die wiederholte Lagerung des Monohydrats bei 0 % RF zeigt aber, dass dann zur Dehydratisierung nur noch ca. 1 Woche benötigt wird.
Das Desorptionsverhalten des Trihydrats (E und SN 40.1) sowie des Monohydrats (S1) über Phosphorpentoxid (0 % RF) zeigt Abb. 15 im Vergleich. Die Desorption des Trihydrats verläuft innerhalb von weniger als 2 Tagen unter Bildung der amorphen Form. Die beiden Trihydrat-Kristallisate E und SN 40.1 unterscheiden sich praktisch nicht im aufgezeichneten Dehydratisierungsprozess. Der hierbei, ermittelte Massenverlust beträgt jeweils ca. 20 %. Der berechnete Massenverlust für ein Trihydrat beträgt 20,13 % (bezogen auf die wasserhaltige Substanz), wenn das Anhydrat gebildet wird. Die Desorption des Monohydrats (theoretischer Massenverlust 7,75 %) verläuft deutlich langsamer und ist erst nach 10 Tagen abgeschlossen. Dabei beträgt der gemessene Massenverlust 7,5 %. Wird das Trihydrat (SN 40.1) bei 25°C relativen Feuchten von 13 bis 43 % ausgesetzt (Abb. 16), desorbiert bzw. sorbiert das Trihydrat innerhalb von 12 Wagen praktisch kein Wasser, die Massenänderungen bewegen sich innerhalb der Fehlerbreite der Methode. Wird das Monohydrat (S1) bei 25°C relativen Feuchten von 13 bis 75 % ausgesetzt, so findet bei Lagerung über 14 Tage bis zur Feuchte von 62 % keine Sorption statt. Bei 75 % r.F. nimmt die Probe circa 15 % Wasser auf, was ca. 2 mol Wasser entspricht. In der Folge wurde auch der Trocknungsverlauf von Trihydrat und Monohydrat bei 35°C und 13 % RF verfolgt (Abb. 17). Dabei kommt es innerhalb von 8 Tagen beim Trihydrat zu einem Massenverlust, der beim Monohydrat nicht auftritt.
Weitere Untersuchungen
Bestimmung des Trocknungsverlustes
Die Bestimmung des Trocknungsverlustes von Amifostin-Trihydrat erfolgte mit unterschiedlichen Bedingungen. In Tab. 3 ist eine Übersicht über die durchgeführten Versuche sowie deren differentialkalorimetrischen Ergebnisse dargestellt. Bereits eine Lagerung des Trihydrats über 3 h bei 50°C führt unter vollständigem Wasserverlust zum amorphen Produkt.
Bestimmung der chemischen Reinheit
SN 40.1 (Trihydrat) und S1 (Monohydrat) wurden in der Glasflasche 6 Wochen bei 40°C ein-gelagert. Mittels der Vorschrift des amerikanischen Arzneibuches wurde der Ausgangsgehalt berechnet auf die wasserfreie Substanz mit größer 95 % ermittelt. Während das Trihydrat bei 6-wöchiger Lagerung einen Restgehalt von größer 95 % zeigte, fiel der Gehalt des Trihydrats unter 80 %. Tab. 3: Zusammenfassung der Untersuchungen zur Bestimmung des
Trocknungsverlustes von Amifostin-Trihydrat
Figure imgf000020_0001
Kristallisations- und Stabilitätsuntersuchungen
Die Bedingungen und Ergebnisse der Untersuchungen sind in Tab. 4 zusammengefasst. Tab. 4a: Übersicht A der durchgeführten Kristallisations- und
Stabilitätsuntersuchungen von Amifostin
UK = Umkristallisation, T = Trihydrat, M = Monohydrat
Figure imgf000021_0001
Tab. 4b: Übersicht B der durchgeführten Kristallisations- und
Stabilitätsuntersuchungen von Amifostin
UK = Umkristallisation, T = Trihydrat, M = Monohydrat
Figure imgf000022_0001

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Amifostin-Monohydrat umfassend den Schritt der kontinuierlichen Zugabe einer wassrigen Lösung von Amifostin mit einer Konzentration von 10 bis 60 Gewichts-% (bezogen auf die wasserfreie Substanz) zu einem 2 bis 20-fachen Volumenüberschuss von Methanol innerhalb von 2 bis 20 Minuten.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , worin die Konzentration der Amifostinlösung 10 bis 30 Gewichts-% beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Volumenüberschuss von Methanol 2 bis 10-fach ist.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, worin die Zugabe der Amifostinlösung innerhalb von 10 bis 20 Minuten erfolgt.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, umfassend die Schritte:
(a) Herstellen einer wassrigen Lösung durch Auflösen von Amifostin-Trihydrat in Wasser,
(b) Zugeben der w ssrigen Amifostinlösung zu Methanol unter Bildung eines weißen Niederschlags und Rühren der Suspension bei Raumtemperatur, und anschließend
(c) Abfiltrieren, Waschen und Lufttrocknen.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei in Schritt (a) das Auflösen des Amifostin- Trihydrats in Wasser durch 1-minütiges Erwärmen auf 40°C erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei in Schritt (b) die Suspension mindestens 10 min gerührt wird.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 7, wobei in Schritt (c) mit Ethanol (96%) gewaschen und auf einem Filterpapier luftgetrocknet wird.
9. Amifostin-Monohydrat, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
10. Amifostin-Monohydrat nach Anspruch 9, mit Schmelzpunkt von ca. 134 bis 136°C unter Zersetzung.
11. Amifostin-Monohydrat nach einem der Ansprüche 9 oder 8 mit einem DSC von 5 K min"1 .
12. Dosierungsform aus sterilem kristallinen Amifostin-Monohydrat nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 11 und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger zur parenteralen Verabreichung.
13. Dosierungsform nach Anspruch 12, wobei die Dosierungsform bei 20°C für einen Zeitraum von mindestens 6 Monaten thermisch stabil ist.
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