WO2002015680A1 - Modele animal permettant d'evaluer l'inflammation allergique de type iii - Google Patents

Modele animal permettant d'evaluer l'inflammation allergique de type iii Download PDF

Info

Publication number
WO2002015680A1
WO2002015680A1 PCT/JP2001/007196 JP0107196W WO0215680A1 WO 2002015680 A1 WO2002015680 A1 WO 2002015680A1 JP 0107196 W JP0107196 W JP 0107196W WO 0215680 A1 WO0215680 A1 WO 0215680A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
type iii
lyn
reaction
human animal
substance
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/007196
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshiyuki Takai
Masao Ono
Takae Yuasa
Takeshi Watanabe
Original Assignee
Japan Science And Technology Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science And Technology Corporation filed Critical Japan Science And Technology Corporation
Priority to CA2420159A priority Critical patent/CA2420159C/en
Priority to EP01958410A priority patent/EP1312259B1/en
Priority to DE60140876T priority patent/DE60140876D1/de
Priority to US10/362,593 priority patent/US7282620B2/en
Publication of WO2002015680A1 publication Critical patent/WO2002015680A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knockout animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0368—Animal model for inflammation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system

Definitions

  • the present invention uses an experimental model animal of type III allergic inflammation, which does not cause anaphylaxis as type I allergy and can specifically induce an Alsace reaction as type III allergy,
  • the present invention relates to a method for screening a substance that promotes or suppresses a type II allergic reaction mediated by FcrRIH.
  • Immunoglobulins are present in the body fluids of all vertebrates, from fish to mammals, are produced by lymphoid cells, and are classified into five classes according to their physicochemical and immunological properties: IgG, Classified into IgM, IgA, IgD and IgE, the basic structure of the molecule is common to each class, and consists of a heavy chain with a molecular weight of 50,000 to 70,000 and a light chain with a molecular weight of 23,000. It is known to have ⁇ chains having structures called a, a, a, 6, and ⁇ chains corresponding to IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE.
  • Fc R The receptor on the surface is called the F c receptor Yuichi (hereinafter “F c R”).
  • Fc R The receptor on the surface.
  • FcRs form a family of hematopoietic cell surface molecules that elicit intracellular signal transduction and cross-link with the ligand antigen-antibody complex to elicit a number of effector responses. It has been known. It also has an affinity for the Ig Fc region. It is known that FcR having sex property and present on the cell surface is involved in an immune response such as an antibody-dependent cytotoxicity reaction and a hypersensitivity reaction.
  • FcR contains Fcr receptor that specifically binds to the IgG ⁇ chain in body fluids, Fc ⁇ receptor that specifically binds to the IgE ⁇ chain, and specific for the IgA chain.
  • Fc ⁇ receptor that specifically binds to the IgE ⁇ chain
  • the Fc receptor of these immunocompetent cells is importantly related to cellular functions, including most lymphocytes, some ⁇ -cell lymphocytes, mononuclear cells, neutrophils, basophils, and macrophages. It is known that it is abundant in mast cells (mast cells) and platelets. In addition, these receptors play a role in antibody-dependent lymphocyte function, but their specific functions remain largely unknown.
  • Fc ⁇ receptor (hereinafter referred to as “FcrR”) is classified into type I (CD64 antigen), type II (CD32 antigen), and type III (CD16 antigen) based on similarity in gene structure.
  • F cr RI is a glycoprotein with a molecular weight of 72 kDa, binds to IgG monomer with high affinity, is expressed on monocytes and macrophages
  • FCTR II is Unlike other FcRs, it has low affinity for IgG monomers and binds to immunocomplexed polyvalent IgG, monocytes, macrophages, and polymorphonuclear leukocytes (PMN) Is widely expressed on hematopoietic stem cells, including mast cells, platelets, some T-cell lymphocytes and some B-cell lymphocytes
  • FcrRIII is a low-affinity FcrR, a natural killer cell It is known to be expressed in macrophages, PMNs and mast cells, respectively. Also, the
  • the present inventors have also produced knockout mice against the FcR r chain, which was isolated and identified as a homodimer molecule that associates with Fc ⁇ RI, a high-affinity receptor for IgE (Cell , 76, 519-529, 1994). It is also known that this FCRT chain knockout mouse has lost at least the expression and function of three types of FcR, FcrRI and FcrR RFcsRI.
  • FcR expressed in the above immune cell group is a molecule that initiates various immune and inflammatory responses in an antibody-dependent manner. Since FcR is expressed in multiple cell types, the role of each FcR has only become apparent after the creation of several mice that are genetically deficient in FcR expression. . At present, the role of FcR is not only in host defense but also in allergy (Cell 75, 969-976, 1993, Cell 76, 519-529, 1994) and the Alsus reaction (Science 265, 1095-1098, 1994, Immunity 5, 387-390), rheumatoid arthritis (J. Exp. Med. 189, 187-194, 1999, J. Exp. Med.
  • FcaRIII on mast cells showed two distinct immune responses, IgG-dependent anaphylaxis (J. Clin. Invest. 99, 915-925, 1997, J. Clin. Invest. 99, 901-914, 1997, J. Exp. Med. 189, 1573-1579, 1999) and passive Alsus reaction (Science 265, 1095-1098, 1994, I accessory unity 5, 387-390, J. Exp. Med. 184, 2385-2392, 1996; Immunity 5, 181-188, 1996; Eur.J. Immunol. 30, 481-490, 2000).
  • These immune response models are distinguished from each other by the stage of disease onset and the histological differences.
  • Anaphylaxis develops skin edema and systemic blood supply failure (shock) shortly after exposure to the antigen, whereas the Alsace reaction is seen several hours after the antigen exposure as a tissue disorder with bleeding.
  • the pathogenesis of models exhibiting these characteristics is based on inflammatory mediators, such as existing substances such as histamine-serotonin, and newly synthesized substances such as arachidonic acid metabolites and cytokines. It is described as the result of a time-limited release.
  • the intracellular mechanisms involved in the pathogenesis of these models are unknown.
  • Lyn belongs to the Src family of kinases and associates with various immune receptors that have the ITAM motif (an amino acid sequence that is recognized and bound by the SH2 region of intracellular tyrosine kinases). It is known to have the function of initiating signal transmission (Int. J. Biochem. Cell. Biol. 29, 397-400, 1997; Annu. Rev. Immunol. 17, 555-592, 1999). Recent studies using Lyn-deficient mice have shown that Lyn plays an essential role in the normal function of B cells and mast cells in individuals (Cell 83, 301-311, 1995, Immunity 3, 549-560, 1995, Immunity 7, 69-81, 1997).
  • Lyn tyrosine kinase belonging to the Src family is functionally associated with various receptors such as FcR and plays an important role in intracellular signal transduction.
  • FcrRIII Activates mast cells via immune complexes and conversely suppresses FcARIIB in studies using knockout mice.
  • FcrRIIB normally acts in a suppressive manner.
  • An object of the present invention is to produce a type I allergy anaphylaxis, specifically induce a type III allergy Alsace reaction, without being affected by a type I allergy, and only a type III allergy inflammation.
  • An object of the present invention is to provide an experimental model animal capable of evaluating the above, and a method of screening a substance that promotes or suppresses a type III allergic reaction mediated by FCTR III using such an experimental model animal.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems, and in order to eliminate FcrRIIB, which acts as an inhibitory agent on the FCTR III-mediated response, Lyn and FcaRIIB Of the role of Lyn downstream of FcrRIII signaling by inducing a double deficient mouse and inducing systemic passive anaphylaxis with IgG-immune complex
  • systemic passive anaphylaxis is Lyn-required
  • the inverse passive Arthus reaction is not Lyn-required, so that FcrRIII-mediated
  • Lyn-dependent and Lyn-independent pathways We focused on the functionality of the Lyn-independent pathway in type III allergic reactions and completed the present invention. . Disclosure of the invention
  • the present invention provides a type III allergic inflammation model non-human animal which does not develop type I allergy anaphylaxis and specifically induces the type III allergy Alsatian reaction (Claim 1)
  • a non-human animal model for allergic inflammation of type III according to claim 1 or 2 wherein the animal is a rodent, or a mouse wherein the rodent is a mouse.
  • the present invention is characterized in that a test substance is administered to a type III allergic inflammation model non-human animal according to any one of claims 1 to 4, and FcrRIII function in the non-human animal is measured and evaluated.
  • the measurement and evaluation of Fc ⁇ RIII function in a non-human animal is the measurement and evaluation of rectal temperature after antigen administration using the intensity of systemic passive anaphylactic response as an index.
  • Bone marrow-derived mast cells derived from bone marrow cells derived from an inflammation model non-human animal are contacted with a test substance in vitro with a test substance, and FcRIII function in the bone marrow-derived mast cells is measured and evaluated.
  • a method for screening for a substance promoting or suppressing a type III allergic reaction (Claim 7), and measuring and evaluating the function of FcaRIII in marrow cells derived from bone marrow include the degranulation ability of mast cells and the cytoplasm of mast cells. 8. The method according to claim 7, which is for measuring and evaluating intracellular calcium kinetics or total protein tyrosine phosphorylation of mast cells.
  • a method for screening a substance that promotes or suppresses a reaction in a type III allergic reaction mediated by FcaRIII according to any one of claims 5 to 8 (claim 9).
  • Item 13 An active ingredient comprising a suppressive substance obtained by a method for screening a substance for promoting or suppressing a type III allergic reaction mediated by FcaRIII according to any one of Items 5 to 9 as an active ingredient.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for a disease caused by a type allergic reaction (claim 10).
  • FIG. 1 shows the results of monitoring the systemic passive anaphylaxis of the double deficient mouse (Lyn-IIB—) and control mouse (IIB_) of the present invention by measuring the temperature in the rectum.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of monitoring the degranulation ability of marrow cells derived from bone marrow of the double deficient mouse (Lyn-IIB—) and control mouse limb (IIB—) of the present invention by serotonin quantification. is there.
  • FIG. 3 shows intracellular Ca 2+ dynamics of bone marrow-derived mast cells of the double deficient mouse (Lyn-IIB—) and control mouse (IIB—) of the present invention induced by FcR cross-linking (A). And tyrosine phosphorylation of whole cell proteins (B) It is a figure showing a measurement result.
  • FIG. 4 shows the results of measurement of cytokine release from marrow cells derived from bone marrow of the double-deficient mouse (Lyn-IIB-) and control mouse (IIB-) of the present invention caused by cross-linking FcrRIII.
  • FIG. 4 shows the results of measurement of cytokine release from marrow cells derived from bone marrow of the double-deficient mouse (Lyn-IIB-) and control mouse (IIB-) of the present invention caused by cross-linking FcrRIII.
  • FIG. 5 shows the MP ⁇ activity (A) of the inflammatory site in the reverse skin passive Alsus reaction of the double deficient mouse (LyTlIB-) and control mouse (IIB-) of the present invention induced by IgG-immunocomplex. ) And histological changes (B).
  • the non-human animal of the type III allergic-inflammation model of the present invention may be any non-human animal that does not develop anaphylaxis, which is a type I allergic disease, and specifically induces an Alsus reaction that is a type ⁇ allergy.
  • non-human animals in which the gene functions of Lyn and Fc " ⁇ are both chromosomally deficient can be specifically exemplified.
  • Non-human animals whose chromosome IIB gene function is both deficient on the chromosome include, for example, disruptions, deletions, substitutions, etc. of some or all of the endogenous genes of non-human animals that encode Lyn or Fc ⁇ .
  • the non-human animals in the present invention include mice, rats and guinea pigs Rodents
  • the method for producing a non-human animal in which both the gene functions of 11 and 11B are deficient on the chromosome is as follows. The following describes an example of a mouse in which both Lyn and Fcr ⁇ B gene functions are chromosomally defective.
  • Lyn knockout mice can be produced by the method described in the literature (I thigh unity 3, 549-560, 1995). Specifically, using a gene fragment obtained from a mouse gene library by a method such as PCR, the Lyn gene is screened, and the screened Lyn gene is transformed by recombinant DNA technology into the Lyn gene. A part or all of the gene is replaced with a gene such as a neomycin-resistant gene, etc., and the diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene or the simple virus thymidine kinase is placed at the 5 'end.
  • DT-A diphtheria toxin A fragment
  • Genes such as the (HSV-tk) gene are introduced to create a targeting vector, and the resulting evening targeting vector is linearized and introduced into ES cells by electroporation (electroporation). Then, homologous recombination is performed, and from the homologous recombinants, ES cells that are resistant to antibiotics such as G418 and gancyclovir (GANC) are selected. It is preferable to confirm whether or not the selected ES cell is the desired recombinant by a Southern blot method or the like.
  • the above-mentioned recombinant ES cells are microinjected into blastocysts of a mouse, and the blastocysts are returned to a foster parent mouse to produce a chimeric mouse.
  • this chimeric mouse is mated with a wild-type mouse, a heterozygous mouse can be obtained, and by mating this heterozygous mouse, a Lyn knockout mouse can be obtained.
  • DNA is separated from a part of the tail end of the mouse obtained by the above method.
  • Methods such as the Southern blot method, isolating RNA from bone marrow cells of this mouse and examining it by the Northern blot method, and examining Lyn expression in this mouse by the Western blot method. Can be mentioned.
  • Lyn knockout mouse a mouse in which the function of the FcrR11B gene is deficient on the chromosome, that is, a FcrRIIB knockout mouse is prepared.
  • the FcaR IIB knockout mouse (FCTR IIB) can be produced by a method described in the literature (Nature 379, 346-349, 1996), a method similar to the above-described method for producing the Lyn knockout mouse, and the like.
  • a double knockout mouse in which both Lyn and Fcr11B gene functions are deficient on the chromosome that is, a mouse in which the deletion mutations of both Lyn and FcaRIIB are homozygous ( LyiTlIB can be produced by crossing the above-mentioned Lyn knockout mouse (Lyn-1) with an FcaRIIB knockout mouse (FcrRIIB-/-) mouse.
  • the above-mentioned FcaRIIB knockout mouse (FcrRIIB-no), preferably a double knockout mouse (Lyn-IIB-) and Lyn + /
  • the method for screening a substance that promotes or suppresses a type III allergic reaction mediated by FcrRIH according to the present invention include the type I of the present invention.
  • a type III allergic inflammation model non-human animal that does not develop the human anaphylaxis and specifically induces the type III allergic Alsace reaction such as the double knockout mouse (Lyn-IIB-)
  • a screening method for administering and administering the substance to measure and evaluate the function of FcaRIII in the non-human animal, and specifically for the Alsace reaction which is a type I allergy without causing the type I allergy anaphylaxis of the present invention A screening method for administering and administering the substance to measure and evaluate the function of FcaRIII in the non-human animal, and specifically for the Alsace reaction which is a type I allergy without causing the type I allergy anaphylaxis of the present invention.
  • a type III allergic inflammation model non-human animal for example, a bone marrow-derived mast cell derived from the above-described bone marrow cell derived from double knockout mouse (LyrrllB-) is contacted with a test substance in vitro
  • the screening method is not particularly limited as long as it is a screening method for measuring and evaluating the function of FcaRIII in However, at the time of screening, the degree of FcRIII function was determined to be non-human animal whose FcrIIB gene function is deficient on the chromosome, such as the FcTRIIB knockout mouse (FcrRIIB-/-). preferably Daburuno click-out mice (LyiTlIB-) littermates of L yn + / - F cr RIIB- / it is preferred to compare evaluation and Ichima mouse (IIB-).
  • Methods for measuring and evaluating the function of FcrRiii in non-human animals include, for example, when the test substance is administered in vivo, the systemic passive anaphylaxis response intensity is used as an index after the antigen administration.
  • Method for measuring and evaluating the rectal temperature of the rat and measuring and evaluating the substances contained in granules released from eosinophils and mast cells in tissues by ELISA, Western plot, etc. When a test substance is brought into contact with bone marrow-derived mast cells in vitro, the degranulation ability of the mast cells, the intracellular calcium dynamics of the mast cells, the phosphorylation of mast cells at all protein tyrosine, etc. are measured. ⁇ Methods for evaluation can be listed.
  • Candidate substances for the reaction promoting or inhibiting substances in the type III allergic reaction via FCTR III obtained by the screening method of the present invention include agonists and antagonists to FcrRIII and signal transduction pathways independent of Lyn. And peptides having an action.
  • the therapeutic agent for a disease caused by a type III allergic reaction of the present invention can be obtained by the method for screening a substance promoting or suppressing a reaction in a type III allergic reaction mediated by FcarRIII according to any of the above. No particular limitation is imposed as long as the active ingredient is a suppressive substance that can be produced.
  • a disease caused by a type III allergic reaction such as a serum disease, can be obtained by administering such a therapeutic agent to a mammal or the like in an appropriate manner.
  • L yn and F cr R II both molecules mice that deletion mutation is in the state of the homozygote of B (Lyn- ⁇ -) is, L yn- ⁇ - (Immunity 3 , 549-560, 1995) And Fc RIIB--(Nature 379, 346-349, 1996) strain mice. Further, littermates L yn + / - F c ⁇ R ⁇ - Bruno _ mice (Paibeta I) the L y ⁇ - ⁇ "F c TR IIB- ⁇ - was used as a control mouse (LyirllB-) .
  • A— 2 (cells and antibodies)
  • Bone marrow-derived mast cells were converted to bone marrow cells with RPMI 164 [final concentration of 5 ng / ml mouse IL-3 (R & D Systems Inc, Minneapolis, MN), 10% non-marrow. Activated fetal serum, non-essential amino acid solution (GIBCO-BRL, Grand Island, NY), 100 U / m1 penicillin, 100 g / m1 streptomycin, 1 OM 2-mercaptoethanol].
  • TNP mouse anti-trinitrophenyl hapten
  • IgE IGELa2; American Type Culture Collection
  • mouse anti-TNP IgG G1 G1; Cell. Immunol. 145, 299-310, 1992
  • Rat anti-mouse FcaR II / III (2.4 G2, PharMigen, San Diego, CA), persimmon IgG anti-ovalbumin (0 VA; Sigma, St Louis, M0), goat anti-rat G F (ab ') 2 fragment of IgG (Im thigh no tech, Cedex, France)
  • BMMC s (5 X 1 0 ce 1 1) a 6. 6 C i Zm 1 5- [l , 2- 3 H] 1 6 hr labeled with -hydroxyiry t amine creatinine sulfate (Amersham Pharmacia Biotech), the remaining 3 0 minutes before, 5 ag / ml of 2.4 G2 or 1 ng nom mouse TNP IgE was added to sensitize these BMM Cs. After removing antibodies that did not bind to B MMCs, 0.3-: goat anti-rat Ig GF (ab ') 2 fragment of L 0 g Zm 1 or 0.03- 30 ng / m One TNP-OVA was added and stimulated for 1 hour.
  • the serotonin release rate (% degranulation) was calculated as previously reported (Cell 76, 519-529, 1994).
  • site force-in release unlabeled BMMCs were stimulated in the same manner as above.
  • the release of IL-14 or TNF- ⁇ was measured using the culture supernatant 12 hours or 6 hours after stimulation, respectively.
  • the release of the site force in was determined by ELISA (Endogen, Inc.,
  • the cytosolic calcium kinetics was measured using a fluorescence spectrophotometer (Hitachi model F4500, Hitachi Ldt., Tokyo, Japan) with excitation at 340 and 36 O nm at an emission wavelength of 51 O nm.
  • the measurement and conversion of the calcium concentration were performed according to the method described in the literature (i. Biol. Cem. 260, 3440-3450).
  • Treatment was performed for 0.5, 1 or 5 minutes under the condition of 37 ° (: The same amount of ice-cold solubilized solution (50 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 1% non-identified solution) P-40, 1 3 7111 ⁇ Bruno ⁇ (: 1, 2mM of EDTA, 5 0 mM of NaF, 2 mM of NaV0 4, 1 mM of phenylmethylsulfonyl 1 OmgZm 1 of aprotinin, 5 mg / 1 of 1 eupept ine> 2 mg /
  • Anti-phosphorylated tyrosine antibody (4G10) was used as an immunoplot. This was performed using
  • a physiological saline solution containing 0, 16 or 80 g of perch anti-OVA IgG was intradermally administered to the back skin of each mouse obtained in Example A-1 in which the trunk was shaved, and immediately thereafter.
  • a physiological saline solution containing 1 mg of OVA was infused intravenously. These mice were sacrificed after 8 hours and the skin on the back was collected.
  • Myeloperoxidase (MPO) Atsushi referred to the method by Bradley et al. (J. Invest. Dermatol. 78, 206-209, 1982).
  • the inflamed area was cut out as a piece of tissue (12.5 mm 2 ), homogenized with 4001 of 50 mM phosphoric acid solution (pH 6.0), and ex decyl trime thy 1 Ammonium bromide (HTAB; Sigma) was added to a concentration of 0.5%, and the mixture was disrupted by ultrasonication for 20 seconds, and then freeze-thawed three times to prepare an extract. These extracts were centrifuged at 14,000 rpm for 15 minutes, and the obtained supernatant was used for measurement of MP ⁇ activity.
  • HTAB decyl trime thy 1 Ammonium bromide
  • Antigen was administered using the systemic passive anaphylaxis response intensity as an index. The decrease in rectal temperature was measured over time from the time point. The result is shown in FIG. It was confirmed that control mice showed a clear response to stimulation with IgG and IgE, whereas the response of the double-deficient mouse was clearly attenuated.
  • the activation of mast cells was induced by stepwise cross-linking of FcarRIII or Fc ⁇ RI, and radiolabeled serotonin released into the culture supernatant was measured (Fig. 2).
  • the degranulation of BMMCs was carried out using 2.42 G2 and goat-bo rat IgGlF (ab ') 2 (Fig. 2 left) or anti-TNPIgE and TNP-OVA (Fig. 2 right).
  • ab ' goat-bo rat IgGlF
  • Fig. 2 right anti-TNPIgE and TNP-OVA
  • BMMCs derived from double-deficient mice were weakly stimulated (1 to 3 g / m1 of anti-rat IgG and 0 Gb by stimulation via FcrR ⁇ and Fc ⁇ RI). It was found that the response to TNP of 3 to 3 ng / m 1 (OVA) was low. On the other hand, it was also found that BMMCs derived from double-deficient mice caused equivalent degranulation with a high degree of stimulation. These differences between the double-deficient mice and the control mice were confirmed by experiments repeated three times, and were confirmed using cultured mast cells independently derived from two individuals.
  • BMMCs were stimulated by the method described in Example A-5, and the intracellular calcium kinetics were measured with a fluorescence absorbance meter at excitation of 50 nm. The result is shown in FIG. 3A.
  • FCTR III or FcsRI the calcium kinetics was reduced by stimulation via FCTR III or FcsRI. This response was affected early ( ⁇ 150 seconds), especially after induction, and late (> 300 seconds). It was found that induction was sufficient.
  • the arrows in the figure indicate that the cells were cross-linked by streptavidin.
  • BMMCs was stimulated by the method described in Example A-5, the reaction was terminated as described in Example A-6, and the cell lysate excluding nuclear fraction (2.5 x 1 lane) 1 0 4 equivalent) anti-phosphotyrosine monoclonal antibody (anti-p Ty r: were immunized plotting with 4 G 1 0).
  • the results are shown in Figure 3B.
  • BMMCs derived from double-deficient mice affected the induction of tyrosine phosphorylation for 5 minutes after stimulation.
  • expression of FcrUKFcsRI and c-kit, proliferation by IL_3, and uptake of serotonin were normal.
  • BMMCs derived from double-deficient mice do not have differentiation abnormalities such as low expression of FcRs but have functional abnormalities (deficiency). .
  • These in vitro results mimic those in vivo, and at least in the immediate stage of mast cell activation, 1 ⁇ 11? It was shown to be important for the activation of the information transmission of 0113.
  • cytokines are newly produced (Nature 339, 64-67, 1989, J. Exp. Med. 170, 245-257, 1989, Nature 346, 274-276, 1990, Int. Arch. Allergy Immunol. 107, 158-159, 1995).
  • TNF-0 a well-known cytokine involved in mast cell activation
  • IL-14 are actually released a few hours or a few hours after FcR-mediated stimulation.
  • Site force release of mast cells is caused by tissue destruction involving mast cells (Blood 94, 3855-3863, 1999, Immunology 77, 422-427, 1992, Science 258, 1957-1959, 1992).
  • Figure 5 (A) shows the degree of neutrophil infiltration in the MPO activity at the inflammatory site 8 hours after antigen administration (average of 5 mice with MP0 activity included in 0.251 as 1 unit). Value standard deviation).
  • Figure 5 (B) shows that 8 Histological changes of hematoxylin-eosin staining over time are shown, along with a control specimen (1) that received saline intradermally (all photographs were observed at 40 ⁇ ). From these results, it was found that the induction of MP0 activity and the histopathological findings were equivalent in both the double deficient mouse and the control mouse. The number of mast cells in the skin has been shown to be normal in double-deficient mice. The Lyn-independent signaling activity of FCTR III was sufficient to trigger an inverse cutaneous passive Alsatian response, indicating that Lyn was not essential for the initiation of late mast cell responses.
  • type III allergic-inflammation model non-human animals, such as Lyn and Fc ⁇ , which does not cause anaphylaxis which is the type I allergy of the present invention and which can specifically induce the Alsace reaction which is the type III allergy
  • Double knockout mice whose offspring functions are deficient on the chromosome are useful as experimental animal models for evaluating only type III allergic inflammation without being affected by type I allergies.
  • Using animals it is possible to screen for substances that promote or inhibit allergic reactions specific to type III allergic reactions mediated by FCTR III.In particular, inhibitors obtained by screening can suppress type III allergic reactions. It may be used as a treatment for the resulting disease.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

明 細 書
III型ァレルギ一炎症モデル動物 技術分野
本発明は、 I型アレルギーであるアナフィラキシーを発症せず、 III 型アレルギーであるアルザス反応を特異的に誘導することができる III 型アレルギー炎症の実験モデル動物や、 かかる実験モデル動物を用いる
F c r RIH を介した ΠΙ 型アレルギー反応における反応促進又は抑制 物質のスクリーニング方法に関する。 背景技術
免疫グロブリン （ I g) は、 魚類から哺乳類に至る全ての脊椎動物の 体液中に存在し、 リンパ系細胞によって産生され、 物理化学的性質や免 疫学的性質によって 5つのクラス、 すなわち I g G， I gM, I g A, I g D及び I g Eに分類され、 分子の基本構造は各クラス共通で、 分子 量 5〜 7万の H鎖と分子量 2. 3万の L鎖とから構成され、 I g G, I gM, I g A, I g D, I g Eに対応してァ， a , a , 6 , ε鎖と呼ば れる構造の Η鎖を有することが知られている。 この I g分子をパパイン で分解して得られるヒンジ部から C末端までの H鎖 2本が S— S結合で 結ばれているものは F cフラグメントと呼ばれ、 この F cフラグメント が結合する細胞表面上の受容体は F c レセプ夕一 （以下 「F c R」 とい う） と呼ばれている。 これら F c Rは、 細胞内のシグナル伝達を導出し て、 リガンドである抗原一抗体複合体によって、 クロスリンクすること で数多くのエフェクターの応答を誘発する造血細胞表面分子のファミリ —を構成することが知られている。 また、 I gの F c領域に対して親和 性をもち細胞表面上に存在している F c Rは、抗体依存性細胞傷害反応、 過敏性反応などの免疫応答に関与することが知られている。
F c Rには、 体液中の I g Gの τ鎖に特異的に結合する F c rレセプ 夕一、 I g Eの ε鎖に特異的に結合する F c ε レセプター、 I gAの 鎖に特異的に結合する F c a R等の種類が知られている。 これら免疫担 当細胞の F c レセプ夕一は細胞機能と重要な関係があり、 大部分のリン パ球、 Τ細胞リンパ球の一部、 単核球、 好中球、 好塩基球、 マクロファ —ジ、 肥満細胞 （マスト細胞） 及び血小板等に多く存在していることが 知られている。 また、 これらのレセプ夕一は抗体に依存したリンパ球機 能に役割を果たすが、 その固有の機能に関しては不明な点が多い。 F c τレセプター （以下 「F c r R」 という） は遺伝子構造の類似性に基づ いてタイプ I (CD 6 4抗原）、 タイプ II (CD 3 2抗原）、 タイプ III (CD 1 6抗原） の 3種に大きく分類され、 F c r R Iは、 分子量 7 2 k D aの糖タンパク質であり、 I g G単量体と高い親和性で結合し、 単 球とマクロファージに発現し、 F C T R IIは、 他の F c Rとは異なり I g G単量体に対して低親和性であり、 免疫複合体となった多価 I g Gと 結合し、 単球、 マクロファージ、 多形核白血球 （PMN)、 マスト細胞、 血小板、 いくつかの T細胞リンパ球及びいくつかの B細胞リンパ球を含 む造血幹細胞に広く発現し、 また F c r RIII は、 低親和性の F c r R で、 ナチュラルキラ一細胞、 マクロファージ、 PMN及びマスト細胞に 発現することが、 それぞれ知られている。 また、 F c ァ RIIには遺伝子 配列が異なる F c ァ RIIA、 F c r 118及び？ c ァ RIICの 3種類の 受容体が存在しており、 いずれの染色体も 1 d 2 3に位置していること も知られている。
最近、 これら F c R分子群に対するノックアウトマウスが次々と作製 され (Cell 75, 969-976, 1993、 Cell 76, 519-529, 1994、 Nature 379, 346-349, 1996、 Immunity 5, 181-188, 1996、 Nature 369, 753-756, 1994, J. Immunol. 152, 3378-3390, 1994、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6835-6839, 1994)、 いくつかの F c Rの生理的機能の理解が進んでいる。 また本発明者らは、 I g Eの高親和性レセプターである F c ε R I に会 合しているホモダイマー分子として単離同定された F c R r鎖に対する ノックアウトマウスを作製している （Cell, 76, 519-529, 1994)。 そし て、 この F C R T鎖ノックアウトマウスは、 少なくとも F c r R I、 F c r R ΠΚ F c s R Iの 3種の F c Rの発現及び機能を失っていること も知られている。
上記免疫細胞群に発現する F c Rは、 抗体依存性に様々な免疫，炎症 反応を開始する分子である。 F c Rは、 複数の細胞種に重複して発現す るため、 個々の F c Rの役割は、 遺伝的に F c R発現を欠損する幾つか のマウスが作出されて始めて明らかとなった。 現在、 F c Rの役割は、 生体防御のみならずアレルギー （Cell 75, 969-976, 1993、 Cell 76, 519-529, 1994)、ァルサス反応（Sc i ence 265， 1095-1098, 1994, Immunity 5, 387-390), リウマチ様関節炎 （J. Exp. Med. 189, 187-194, 1999、 J. Exp. Med. 191, 1611-1616, 2000)、 免疫性糸球体腎炎 (Kidney Int. 54, 1166-1174, 1998、 Eur. J. Immunol. 30, 1182-1190， 2000)、 自己 免疫性血管炎 (Blood 94, 3855-3863, 1999)、 全身性紅斑性狼創 (Science 279, 1052-1054, 1998)、ダットパスチヤ一症候群（Goodpas ture' s； J. Exp. Med. 191, 899-906, 2000) など病気の成立にも関与することが明らかに されている。 また、 上記変異マウスの知見より、 様々な免疫過程におけ る F c Rの不可欠な役割も解明されつつある （Annu. Rev. Immunol. 16, 421-432, 1998、 Annu. Rev. Immunol. 15, 203-234, 1997、 Takai, T.， and J. V. Ravetch. 1998. Fc receptor genetics and the manipulation of genes in the study of FcR biology. In Immunoglobulin Receptors and their Physiological and Pathological Roles in Immunity. J. G. J. van de Winkel nad P. Mark Hogarth, editors. Kluwer Academic Publishers, Netherland, 37-48)。
また、 マスト細胞上の F c ァ RIII が、 2種の区別される免疫応答、 I g G依存性アナフィラキシー （J. Clin. Invest. 99， 915-925, 1997、 J. Clin. Invest. 99, 901-914, 1997、J. Exp. Med. 189, 1573-1579, 1999) と受動的ァルサス反応 （Science 265, 1095-1098, 1994、 I賺 unity 5， 387 - 390、 J. Exp. Med. 184, 2385-2392, 1996、 Immunity 5, 181-188, 1996、 Eur. J. Immunol. 30, 481-490, 2000) の開始に、 中心的な役割を果た していることも報告されている。 これらの免疫応答モデルは、 病気の発 症時期と組織像の違いで互いに区別されている。 アナフィラキシ一は、 皮膚の浮腫や全身性の血液供給不全 （ショック） を抗原暴露直後に発症 するが、 一方アルザス反応は、 出血を伴う組織障害として、 抗原暴露後 数時間を経てから見られる。 現在、 これらの特徴を示すモデルの病態成 立は、 炎症性メデイエ一夕一、 例えば、 ヒスタミンゃセロトニンなどの 既存物質や、 ァラキドン酸代謝物やサイ トカインなどの新たに合成され る物質などの、 時間限定的放出の結果として説明されている。 しかし、 これらのモデルの病態成立に関係する細胞内の機構は不明である。
他方、 L y nは、 S r cファミリーキナーゼに属し、 I TAMモチ一 フ （細胞内チロシンキナーゼの S H 2領域により認識され結合するアミ ノ酸配列） を持つ様々な免疫受容体と会合し、 細胞内シグナル伝達を開 始する機能を有することが知られている （Int. J. Biochem. Cell. Biol. 29, 397-400, 1997、 Annu. Rev. Immunol. 17, 555-592, 1999)。 最近の L y n欠損マウスを使った研究では、 個体内において、 B細胞やマスト 細胞の正常機能に L y nが必須の役割を果たすことが示されている (Cell 83, 301-311, 1995, Immunity 3, 549-560, 1995, Immunity 7, 69-81, 1997)。 実際には、 L y n欠損マウスでは、 I g Eと抗原により惹起され る皮膚のアナフィラキシ一反応が著明に障害されており、 F c ε R I を 介したシグナル伝達には L y ηが重要な役割を果たしている （ J. Immunol. 158, 2350-2355, 1997) D
上記のように、 S r cフアミリーに属する L y nチロシンキナーゼは、 F c R等の様々な受容体に機能的に会合し、 細胞内情報伝達において重 要な役割を果たしている。 一方、 自己免疫疾患やアレルギー反応等の免 疫複合体が関与する炎症反応において、 マス卜細胞等に発現している I g Gの F c ァ Rの役割が注目されており、 例えば F c r RIII は免疫複 合体を介してマスト細胞を活性化し、 逆に F c ァ RIIBは抑制すること がノックアウトマウスを用い研究によって明らかにされている。しかし、 通常は F c r RIIBが抑制的に作用するために III型ァレルギ一炎症の みを評価しうることはできなかった。 本発明の課題は、 I型アレルギー であるアナフィラキシ一を発症せず、 III 型アレルギーであるアルザス 反応を特異的に誘導することができ、 I型アレルギーに影響されること なく、 III 型アレルギー炎症のみを評価しうる実験モデル動物や、 かか る実験モデル動物を用いた F C T R III を介した III 型アレルギー反応 における反応促進又は抑制物質のスクリ一ニング方法を提供することに ある。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究し、 F C T R III を介した応答に対して抑制性の働きをする F c r R II Bを排除するため に、 L y nと F c ァ RIIBの 2重欠損マウスを作製し、 全身性受動アナ フイラキシーを I g G—免疫複合体で誘導することにより、 F c r R III の情報伝達の下流において L y nの役割がどのような意味を持つのか検 討し、 全身性受動アナフィラキシーは L y n要求性であり、 逆受動アル サス反応は L y n非要求性であることから、 F c r RIII を介したァレ ルギ一応答につながる経路には、 L y n依存性と非依存性の 2つの経路 があり、 III 型アレルギー反応における L y n非依存性経路の機能性に 着目し、 本発明を完成するに至った。 発明の開示
すなわち本発明は、 I型アレルギーであるアナフィラキシ一を発症せ ず、 III 型アレルギーであるアルザス反応を特異的に誘導することを特 徴とする III型アレルギー炎症モデル非ヒト動物 （請求項 1 ) や、 L y n及び F c r II Bの遺伝子機能が染色体上で欠損していることを特徴と する請求項 1記載の III型ァレルギ一炎症モデル非ヒト動物（請求項 2 ) や、 非ヒト動物が齧歯目動物であることを特徴とする請求項 1又は 2記 載の III型アレルギー炎症モデル非ヒト動物 （請求項 3) や、 齧歯目動 物がマウスであることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載の ΠΙ 型アレルギ一炎症モデル非ヒト動物 （請求項 4) に関する。
また本発明は、 請求項 1〜4のいずれか記載の III型アレルギー炎症 モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、 該非ヒト動物における F c r R III 機能を測定 ·評価することを特徴とする F c r Rin を介した III 型アレルギ一反応における反応促進又は抑制物質のスクリ一エング方法
(請求項 5 ) や、 非ヒト動物における F c τ RIII機能の測定 ·評価が、 全身性受動アナフィラキシー応答強度を指標とした、 抗原投与時以降の 直腸内温度の測定 ·評価であることを特徴とする請求項 5記載の F c r RIII を介した III 型アレルギー反応における反応促進又は抑制物質の スクリ一二ング方法（請求項 6 )や、請求項 1〜 4のいずれか記載の ΙΠ 型ァレルギ一炎症モデル非ヒト動物由来の骨髄細胞から誘導した骨髄由 来肥満細胞を生体外で被検物質と接触させ、 該骨髄由来肥満細胞におけ る F c ァ RIII機能を測定'評価することを特徴とする F c ァ R III を介 した III型アレルギー反応における反応促進又は抑制物質のスクリー二 ング方法 （請求項 7 ) や、 骨髄由来肥満細胞における F c ァ RIII 機能 の測定 ·評価が、 肥満細胞の脱顆粒能、 肥満細胞の細胞質内カルシウム 動態、 又は肥満細胞の全タンパク質チロシンリン酸化の測定 ·評価であ ることを特徵とする請求項 7記載の F c r R III を介した ΠΙ 型アレル ギー反応における反応促進又は抑制物質のスクリ一二ング方法 （請求項 8) や、 請求項 1〜 4のいずれか記載の III型アレルギー炎症モデル非 ヒト動物と、 F c ァ IIBの遺伝子機能が染色体上で欠損している非ヒト 動物とを用いることを特徴とする請求項 5〜 8のいずれか記載の F c ァ RIII を介した III 型アレルギー反応における反応促進又は抑制物質の スクリーニング方法 （請求項 9) や、 請求項 5〜 9のいずれか記載の F c ァ RIII を介した III 型アレルギー反応における反応促進又は抑制物 質のスクリ一二ング方法により得られた抑制物質を有効成分とすること を特徴とする III型アレルギー反応に起因する疾病の治療薬 （請求項 1 0) に関する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明の 2重欠損マウス （Lyn—IIB—) 及びコントロールマ ウス （IIB_) における全身性受動アナフィラキシーを直腸内温度測定に よりモニターした結果を示す図である。
第 2図は、 本発明の 2重欠損マウス （Lyn—IIB— ) 及びコント口一ルマ ウス （IIB— ) の骨髄由来肥満細胞の脱顆粒能をセロトニン定量によりモ 二ターした結果を示す図である。
第 3図は、 F c Rの架橋により誘導される本発明の 2重欠損マウス (Lyn—IIB—) 及びコントロールマウス （IIB— ) の骨髄由来肥満細胞の細胞 内 C a 2 +動態 （A) と、 細胞全タンパク質のチロシンリン酸化 （B) の 測定結果を示す図である。
第 4図は、 F c rRIII を架橋することにより引き起こされる本発明 の 2重欠損マウス （Lyn—IIB—) 及びコントロールマウス (IIB— ) の骨髄由 来肥満細胞からのサイ トカイン放出の測定結果を示す図である。
第 5図は、 I g G—免疫複合体により誘導した本発明の 2重欠損マウ ス （LyiTlIB—) 及びコントロールマウス （IIB—) の逆皮膚受動ァルサス反 応における炎症部位の MP〇活性 （A) と、 組織学的変化 （B) を示す 図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の III型ァレルギ一炎症モデル非ヒト動物としては、 I型ァレ ルギ一であるアナフィラキシーを発症せず、 ΠΙ 型アレルギーであるァ ルサス反応を特異的に誘導する非ヒト動物であれば、 特に制限されるも のではなく、 例えば、 Ly n及び F c "τΠΒの遺伝子機能が共に染色体 上で欠損している非ヒト動物を具体的に例示することができ、 ここで L y η及び F cァ IIBの遺伝子機能が共に染色体上で欠損している非ヒト 動物とは、 例えば Lynや F c τΠΒをコードする非ヒト動物の内在性 遺伝子の一部もしくは全部が破壊 ·欠損 ·置換等の遺伝子変異により不 活性化され、 野生型において L y η及び F c r 11 Bを発現する機能を失 なった非ヒト動物等をいう。 また本発明における非ヒト動物としては、 マウス、 ラッ ト、 モルモッ ト等の齧歯目動物を具体的に挙げることがで きるが、 これらに限定されるものではない。 以下、 11及び？ じ ァ11 Bの遺伝子機能が共に染色体上で欠損している非ヒト動物の作製方法を- L y n及び F c r Π Bの遺伝子機能が共に染色体上で欠損したマウスを 例にとって説明する。
まず、 L y n遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、 すなわち Ly nノックアウトマウス ( L y n - - ) を作製する。 L y nノックアウト マウスは、 文献 （I腿 un i ty 3, 549-560, 1995) に記載する方法等によつ て作製することができる。 具体的には、 マウス遺伝子ライブラリーから P C R等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、 L y n遺伝子をス クリーニングし、 スクリーニングされた L y n遺伝子を組換え D N A技 術により、 L y n遺伝子の一部又は全部を、 例えばネオマイシン耐性遺 伝子等のマ一力一遺伝子で置換し、 5 ' 末端側にジフテリアトキシン A フラグメント （D T— A ) 遺伝子や単純へルぺスウィルスのチミジンキ ナ一ゼ （H S V— t k ) 遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティングべ クタ一を作製し、この作製された夕ーゲッティングベクターを線状化し、 エレクトロボレ一シヨン （電気穿孔） 法等によって E S細胞に導入し、 相同的組換えを行い、 その相同的組換え体の中から、 G 4 1 8やガンシ クロビア （G A N C )等の抗生物質に抵抗性を示す E S細胞を選択する。 この選択された E S細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロッ ト法等により確認することが好ましい。
上記組換え E S細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクシヨン し、 かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、 キメラマウスを作製する。 こ のキメラマウスを野生型のマウスと交配させると、 ヘテロ接合体マウス を得ることができ、 また、 このへテロ接合体マウスを交配させることに よって、 L y nノックアウトマウスを得ることができる。 そして、 かか る L y nノックアウトマウスにおける L y n遺伝子機能が染色体上で欠 損していることを確認する方法としては、 例えば、 上記の方法により得 られたマウスの尾端の一部から D N Aを分離してサザンブロッ ト法等に より調べたり、 このマウスの骨髄細胞等から R N Aを単離してノーザン プロッ ト法等により調べたり、 またこのマウスの L y nの発現をウェス タンブロッ ト法等により調べる方法を挙げることができる。 L y nノックアウトマウス同様に、 F c r R 11 B遺伝子機能が染色体 上で欠損したマウス、 すなわち F c r RIIBノックァゥトマウスを作製 する。 F c ァ R IIBノックアウトマウス (F C T R IIB ) は、 文献 (Nature 379, 346-349, 1996) に記載する方法や、 上記 L y nノックァ ゥトマウスの作製方法と同様な方法等によって作製することができる。
L y n及び F c r 11 Bの遺伝子機能が共に染色体上で欠損したダブル ノックアウトマウス、 すなわち L y n及び F c ァ R II Bの両分子の欠失 変異がホモ接合体の状態になっているマウス （LyiTlIB は、 上記 L y n ノックアウトマウス (L y n - 一） と F c ァ RIIBノックアウトマウス (F c r RIIB— /— ) 系統のマウスを掛け合わせて作製することができ る。 また、 本発明における F c r ΠΒの遺伝子機能が染色体上で欠損し ているマウスとして、 上記 F c ァ RIIBノックアウトマウス (F c r R IIB—ノ ）、 好ましくはダブルノックアウトマウス （Lyn—IIB—)と同腹子 の L y n +/— F c ァ R IIB ノ—マウス （ΠΒ—) を例示することができる。 本発明における F c r RIH を介した III 型アレルギー反応における 反応促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、 本発明の I型ァ レルギ一であるアナフィラキシ一を発症せず、 III 型ァレルギ一である アルザス反応を特異的に誘導する III型アレルギー炎症モデル非ヒ卜動 物、 例えば上記ダブルノックアウトマウス （Lyn—IIB—)に被検物質を投与 し、 該非ヒト動物における F c ァ RIII 機能を測定 ·評価するスクリ一 ニング方法や、 本発明の I型アレルギーであるアナフィラキシ一を発症 せず、 ΠΙ 型アレルギーであるアルザス反応を特異的に誘導する III 型 アレルギー炎症モデル非ヒト動物、 例えば上記ダブルノックァゥトマウ ス （LyrrllB— ) 由来の骨髄細胞から誘導した骨髄由来肥満細胞を生体外 で被検物質と接触させ、 該骨髄由来肥満細胞における F c ァ RIII 機能 を測定 ·評価するスクリーニング方法であれば特に制限されるものでは ないが、 スクリーニングに際して、 F c ァ R III 機能の程度を F c r II Bの遺伝子機能が染色体上で欠損している非ヒト動物、 例えば前記 F c T RIIBノックアウトマウス （F c r RIIB— /— )、 好ましくはダブルノ ックアウトマウス （LyiTlIB— )と同腹子の L y n+/— F c r RIIB-/一マ ウス （IIB—) と比較評価することが好ましい。
上記非ヒト動物における F c r Riii 機能を測定 ·評価する方法とし ては、 例えば、 被検物質を生体内に投与する場合は、 全身性受動アナフ ィラキシ一応答強度を指標とした、 抗原投与時以降の直腸内温度を測 定 ·評価する方法や、 組織内の好酸球や肥満細胞等から放出される顆粒 内に含まれる物質を、 E L I S Aやウエスタンプロット等により測定 · 評価する方法などを挙げることができ、 被検物質を骨髄由来肥満細胞と 生体外で接触させる場合は、 かかる肥満細胞における脱顆粒能、 肥満細 胞における細胞質内カルシウム動態、 肥満細胞の全夕ンパク質チロシン リン酸化等を測定 ·評価する方法などを挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法により得られる、 F C T R III を介した III 型ァレルギ一反応における反応促進又は抑制物質の候補物質として は、 F c r RIII に対するァゴニスト及びアンタゴニスト、 L y nに依 存しないシグナル伝達経路に対して作用を有するタンパク質 · ペプチド 等を挙げることができる。 また、 本発明の III型アレルギー反応に起因 する疾病の治療薬としては、 前記いずれか記載の F c ァ R III を介した III 型ァレルギ一反応における反応促進又は抑制物質のスクリーニング 方法により得ることができる抑制物質を有効成分とするものであれば特 に制限されるものではなく、 かかる治療薬を哺乳動物等に適宜方法で投 与することにより、 III 型アレルギー反応に起因する疾病、 例えば血清 病、 糸球体腎炎、 ループス腎炎、 過敏性肺臓炎等を治療することができ る。 以下に、 実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、 この発明の技 術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例 A [材料と方法]
A - 1 (マウス）
すべての実験において、 特定の病原体に関して無感染である状況にお いて飼育している 7週齢から 1 2週齢のマウスを使用した。 L y n及び F c r R II Bの両分子の欠失変異がホモ接合体の状態になっているマウ ス （Lyn— ΠΒ-)は、 L y n— κ— (Immunity 3， 549-560, 1995) と F c ァ RIIB— - (Nature 379, 346-349, 1996) 系統のマウスを掛け合わせて 作製した。 また、 同腹子の L y n +/— F c ァ R ΠΒ -ノ_マウス （ΠΒ一） を上記 L y η -Χ" F c T R IIB— κ—マウス （LyirllB—) のコントロールと して用いた。
A— 2 (細胞と抗体）
骨髄由来肥満細胞（BMMC s ) は、 骨髄細胞を R PM I 1 6 4 0 [最 終濃度で、 5 n g /m l のマウス I L — 3 (R&D Systems Inc, Minneapolis, MN) , 1 0 %の非動化ゥシ胎児血清、 非必須アミノ酸溶液 (GIBCO- BRL, Grand Island, NY)、 1 0 0 1 U/m 1 のぺニシリン、 1 0 0 g /m 1 のス卜レプトマイシン、 1 O Mの 2—メルカプトエタ ノールを含有] で培養することにより誘導した。 マウス抗トリニトロフ ェニルハプテン （T N P ) I g E ( I G E L a 2 ； American Type Cul ture Collection) とマウス抗ー TNP I g G 1 (G 1 ； Cell. Immunol. 145, 299-310, 1992) に関しては、 それぞれのハイブリ ドーマ培養上清を D E AE—セル口一スカラムクロマトグラフィーにより精製した。 ラッ 卜抗 マウス F c ァ R II/III ( 2. 4 G 2 , PharMigen, San Diego, CA)、 ゥ サギ I g G抗卵白アルブミン （0 VA ； Sigma, St Louis, M0)、 ャギ抗 ラッ ト I g Gの F (a b ' ) 2フラグメント ( Im腿 no tech, Cedex, France)
2 及び抗リン酸化チロシン抗体 （4 G 1 0 ； upstate Biotechnology, Lake
Placid, NY) は購入したものを使用した。
A— 3 (全身性受動アナフィラキシーの誘導）
2 0 gの抗TN P I g Gまたは 2 0 /X gの抗 TN P I g Eを、 A 一 1で作製したそれぞれのマウス [L y n— /_F c ァ RIIB-/- (Lyn~ IIB") 及び L y n+z_F c r RIIB— — (I IB")] に静脈注射することに より感作した。感作から 3 0分後（ I g G感作） もしくは 24時間後（ I g E感作） に、 l mgの TNP結合 OVAを 1 0 0m 1の P B Sに溶解 した溶液を静脈注射することにより全身性受動アナフィラキシ一を誘導 した。 コントロールは、 誘導時に TN P— OVAの代わりに同量の OV Aにより全身性受動アナフィラキシーを誘導した。 誘導後、 温度センサ 一のプローブがついたデジタル温度計 （Natume Seisakusyo Co. , Osaka, Japan) により経時的に直腸内温度を計測した。
A— 4 (脱顆粒とサイ ト力イン放出）
BMMC s ( 5 X 1 0 c e 1 1 ) を 6. 6 C i Zm 1 の 5-[l, 2- 3H]-hydroxyiry t amine creatinine sulfate ( Amersham Pharmacia Biotech) で 1 6時間ラベルし、 残り 3 0分間前に 5 a g/m 1の 2. 4 G 2又は 1 n gノ m 1 のマウス坊 TNP I g Eを加え、これらの BMM C sを感作した。 B MMC sに結合しなかった抗体を除去した後、 0. 3〜： L 0 g Zm 1 のャギ抗ラッ ト I g G F ( a b ' )2フラグメント 又は 0. 0 3〜 3 0 n g/m 1の TN P— OVAを添加し 1時間刺激さ せた。 セロトニン遊離率 （％脱顆粒） は以前の報告 （Cell 76, 519- 529, 1994) と同様に計算した。 サイ ト力イン放出については、 ラベルしてい ない BMMC s を上記と同様の方法により刺激した。 刺激後、 1 2時間 又は 6時間後の培養上清を用いて、 それぞれ I L一 4又は TN F— αの 放出を測定した。 サイ ト力インの放出量は E L I S A (Endogen, Inc. ,
3 Woburn, MA) を用いて測定した。
A- 5 (細胞質内カルシウム動態）
2 Mの Fur a-2/acetoxymet yl ester (Molecular Probes, Eugene, OR) によりラベルした B MM C sを 2 5 °Cで 1 0分間の条件で 2 n g / m 1のピオチン結合マウス抗 TN P I g Eもしくは 5 g/m 1 のビ ォチン結合 2. 4 G 2により感作した。 結合しなかった抗体を除去した 後、 I mMの C a C 1 2と I mMの Mg C 1 2を含む 2m l の P B S中で 上記感作した細胞を 1 0 g のス ト レプ トアビジン （ Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan) により剌激した。 細胞質内カルシウム動態は、 蛍光吸光度計 （Hitachi model F4500, Hitachi Ldt. , Tokyo, Japan) を 用いて、 3 40と 3 6 O nmの励起を 5 1 O nmのエミッション波長で 測定した。 カルシウム濃度の測定と換算は文献 （： i. Biol. C em. 260, 3440-3450) 記載の方法に準じて行った。
A - 6 (免疫ブロッ ト解析）
2. 4 G 2もしくはピオチン結合マウス I g Eにより感作した B MM C s ( 1 X 1 06) を 1 mMの C a C 1 2及び 1 mMの M g C 1 2を含む 1 0 0 /2 1 の P B Sに懸濁し、 それぞれの懸濁液に 3 0 μ g/m 1のャ ギ抗ラッ ト I g G F ( a b ' ) 2フラグメント又は 5 g /m 1のスト レブトァビジンを添加し、 3 7°(：の条件下で 0. 5、 1又は 5分間処理 した。 これらの処理は、 同量の氷冷した可溶化溶液 （ 5 0mMの Tris- HC1 (pH 7.4)、 1 %の Nonident P-40、 1 3 7111^ の ^(：1、 2mMの EDTA、 5 0mMの NaF、 2mMの NaV04、 1 mMの phenylmethylsulfonyl 1 OmgZm 1 の aprotinin、 5 m g / 1 の 1 eupept ine> 2 m g /m 1 の pepstatin) を加えることにより終了とした。 核分画を取り除いた細 胞溶解液はタンパク質のリン酸化の検討に用いた。 免疫プロッ トには抗 リン酸化チロシン抗体 （ 4 G 1 0 ) を用いて行った。
4 A- 7 (逆皮膚受動アルザス反応）
0、 1 6又は 8 0 gのゥサギ抗 OVA I g Gを含む生理食塩水を、 体幹を除毛した実施例 A— 1で得られたそれぞれのマウスの背部皮内に 投与し、 その直後、 1 mgの OVAを含む生理食塩水 2 0 0 1 を静脈 より注入した。 これらのマウスを 8時間後に屠殺し、 背部の皮膚を採取 した。 Myeloperoxidase (MP O) アツセィは Bradleyらによる方法 （J. Invest. Dermatol. 78, 206-209, 1982) を参考にした。 簡便に、 炎症を 引き起こした部分を組織片 （ 1 2. 5 mm2) として切り出し、 4 0 0 1 の 5 0 mMのリン酸溶液 （pH 6.0) でホモジェナイズし、 さらに、 ex decyl tr ime thy 1 ammonium bromide (HTAB ； Sigma) を 0. 5 %に なるように加え、 2 0秒間超音波により破碎した後、 凍結融解を 3回繰 り返すことにより抽出液を作製した。 これら抽出液を 1 4 , 0 0 0 r p m、 1 5分間遠心した後、得られた上清を MP〇活性の測定に使用した。 これらの上清 2 0 1 を 2 0 0 ^ 1の基質溶液 [ 5 0 mMのリン酸溶液 (, Η 6.0), 0. 1 6 7 m g / m 1 (D o-dianisidine duhydrochlor ide (Sigma), 0. 0 0 0 5 %の過酸化水素 （Wako Pure Chemical) ] と混合 した後、 基質溶液の色の変化を 4 6 0 nmの吸光度で測定した。 なお、 0. 2 5 / 1 のマウス全血から得られた MP O活性を 1ュニッ トとして 計測した。 病理組織学的検討のため、 皮膚断片は 1 0 % (vol/vol) 中性 緩衝ホルマリン溶液により固定し、 パラフィン切片とした後、 へマトキ シリン zェォシン染色を行った。 実施例 B [結果]
B - 1 (L y n—ノ F c r R II B マウスの全身性受動アナフィラキ シ一における F c τ R ΠΙ機能の欠損）
これまでの研究において、 L y n欠損マウスは I g Eによる皮膚受動 アナフィラキシ一を引き起こすことが出来ないことが明らかになつてい る。 このことは肥満細胞上の F c ε R Iの情報伝達の下流において L y nが重要な働きをすることを示している （Cell 83, 301-311, 1995)。 本 発明者らは全身性受動アナフィラキシ一を I g G—免疫複合体で誘導す ることにより、 F c ァ RIII の情報伝達の下流において L y nの役割が どのような意味を持つのか検討するため、 F C T R III を介した応答に 対して抑制性の働きをする F c ァ R IIB (Annu. Rev. Immunol. 15, 203-234, 1997、 J. Exp. Med. 189， 1573-1579, 1999, ature 379, 346-349, 1996) を排除するために、 実施例 A— 1に記載の L y nと F c τ RIIB の 2重欠損マウス （L y n— —F c T R IIB—/-マウス ： LyiTlIB-) の系 統を用いた。
実施例 A— 3記載の方法により、 尾静脈を介してハプテン特異的な抗 体 [抗 TNP I g G 1 (図 1左； n = 4) もしくは抗 TN P I g E (図 1右； n = 6 )] と抗原 （TN P— 0 V A) を投与することにより 2重欠 損マウスとコントロールマウスに全身性受動アナフィラキシ一を誘導し. 全身性受動アナフィラキシ一応答強度を指標として、 抗原を投与した時 点から経時的に直腸内温度の低下を測定した。 この結果を図 1に示す。 I g G及び I g Eによる刺激において、 コントロ一ルマウスは明らかな 応答を示している一方で、 2重欠損マウスはその応答が明らかに減弱し ていることが確認できた。 2重欠損マウスで応答が損なわれることから、 肥満細胞における L y nの活性は F c ε R I を介したアナフィラキシ一 と同様に F C T R III を介したときにも必要であることがわかった。 な お、 コントロール実験 （図 1上段） は、 上記それぞれのマウスに坊体を 投与しないこと以外は上記記載の方法と同様に直腸内温度を測定した。 B— 2 (L y n欠損マウスから誘導された BMMC sにおける F c ァ R III機能の減弱） 次に即時型の応答として、 またアナフィラキシ一を引き起こす主要な 要因として、 肥満細胞の脱顆粒能を検討するため、 培養 BMMC sを用 いてセロトニン放出を検討することにより機能解析を行った。 F c ァ R III もしくは F c ε R I を段階的に架橋することにより肥満細胞の活性 化を誘導し、 培養上清中に放出される放射線ラベルされたセロトニンを 測定した （図 2)。 なお、 BMMC sの脱顆粒は、 2. 42 G 2とャギ坊 ラッ ト I g G l F (a b ' ) 2 (図 2左） 又は抗 TN P I g Eと TN P 一 OVA (図 2右） により F c r RIII 及び F c s R I を架橋すること により誘導した。 脱顆粒は刺激後 1時間の培養上清中に放出されたセロ トニンを実施例 A— 4記載の方法により定量した。 これらの結果から、 F c r R ΙΠ 及び F c ε R I を介した刺激により、 2重欠損マウス由来 の BMMC sは、 弱い剌激 （ 1〜 3 g/m 1 の抗ラッ ト I g Gや 0. 3〜 3 n g /m 1 の TNP— OVA) に対して応答性が低くなつている ことが明らかとなった。 一方、 2重欠損マウス由来の B MMC sで程度 の高い刺激に対しては同等の脱顆粒を引き起こすことも分かった。 2重 欠損マウスとコントロールマウスでのこれらの違いは 3回繰り返した実 験で確認し、 また 2個体から独立に誘導した培養肥満細胞を使用して確 認した。
本発明者らは次に 2重欠損マウス由来の BMMC sの細胞内機能欠如 の特色として細胞質内のカルシウム動態と細胞の全タンパク質チロシン リン酸化について検討した。 実施例 A— 5記載の方法で BMMC sを刺 激し、 細胞質内カルシウム動態を蛍光吸光度計により 5 1 0 nm励起で 測定した。 この結果を図 3 Aに示す。 これらの結果から、 2重欠損マウ ス由来の B MM C sにおいて、 F C T R III もしくは F c s R I を介し た刺激によるカルシウム動態の減弱が見られた。この応答は特に誘導後、 早い段階 （< 1 5 0秒） で影響を受けており、 遅い段階 （> 3 0 0秒） では十分に誘導されていることがわかった。 なお、 図中の矢印はストレ ブトアビジンにより架橋したことを示す。
また、 実施例 A— 5記載の方法で B MM C sを刺激し、 実施例 A— 6 記載のように反応を終了させ、 核分画を除外した細胞溶解液 （ 1 レーン にっき 2. 5 X 1 04に相当） を抗リン酸化チロシンモノクローナル抗 体 （抗 p Ty r ： 4 G 1 0 ) を用いて免疫プロッティングを行った。 結 果を図 3 Bに示す。 この結果からも明らかなように刺激後 5分間は、 2 重欠損マウス由来の B MM C sにおいてチロシンリン酸化の誘導に影響 を及ぼすことがわかった。 また、 2重欠損マウス由来の B MM C sでは、 F c r UK F c s R I及び c— k i tの発現、 I L _ 3による増殖、 またセロトニンの取り込みは通常であった。 このことは 2重欠損マウス 由来の BMMC sでは、 F c R sの発現量が少ないなどの分化異常を起 こしているのではなく、 機能的異常 （欠損） が起きていることを示して いる。 これら in vitroの結果は in vivoの結果を擬態しており、 少なく とも肥満細胞の活性化の即時段階において、 1^ 11は？ 0113の情報伝 達の活性化に重要であることが示された。
B - 3 (2重欠損マウスの B MM C sにおけるサイ トカイン産生に対す る F c ァ RIIIの正常機能）
肥満細胞では F c Rを介した刺激によりサイ トカインは新たに生産さ れることが明らかになつている （Nature 339, 64-67, 1989、 J. Exp. Med. 170, 245-257, 1989、 Nature 346, 274-276, 1990、 Int. Arch. Allergy Immunol. 107, 158-159, 1995)。 肥満細胞の活性化に関連してよく調べ られているサイ トカインである TNF— 0：や I L一 4は F c Rを介した 刺激後、 2 , 3時間もしくは数時間で実際に放出される。 肥満細胞のサ イ ト力イン放出は、 肥満細胞が係わる組織破壊 （Blood 94， 3855-3863, 1999、 Immunology 77, 422-427, 1992、 Science 258, 1957-1959, 1992) やアレルギー （Allergy 50， 851-862, 1995) の発症に重要であることが 示されている。 これらのことから、 F c Rを介した刺激で誘導される B MMC sからの TNF— αと I L一 4の生産量を調べてみた。 F c ァ R III を架橋するために抗 F c r R ΙΙ/ΙΠ抗体 （ 2. 4 G 2 ) と様々な濃 度の 2次抗体が存在する状況で実施例 A— 4記載の方法で B MM C sを 数時間刺激した。 この結果を図 4に示す。 これらの結果は、 図 2や図 3 で示した脱顆粒や生化学的アツセィから得られた結果に反して、 2重欠 損マウス由来の B MM C sにおいて TNF _ «や I L— 4の誘導には影 響が見られなかった。 これらのことは、 F c r RIII の情報伝達の下流 では、 L y nの活性に係わらずサイ ト力イン遺伝子が活性化されること を意味しており、 肥満細胞においてサイ 卜カイン生産誘導に十分なシグ ナル伝達機構の存在が示唆される。
B— 4 (L y n欠損マウスにおける逆皮膚受動アルザス反応に対する F c r RIHの正常機能）
サイ トカイン産生が In vitroで L y nに依存しないという上記の結果 から、 次に、 サイ ト力インがその発現に重要と考えられている逆皮膚受 動ァルサス反応を調べてみた。 この逆皮膚受動アルザス反応は in vivo における免疫複合体が引き起こす炎症モデルで、 肥満細胞上の F c r R III 機能に依存していることが明らかになつている （Science 265, 1095-1098, 1994、 Immunity 5, 387-390、 J. Clin. Invest. 99, 915-925, 1997、 J. Clin. Invest. 99， 901-914, 1997、 Immunity 5, 181-188, 1996)' 上記実施例 A— 7記載の方法により M P〇 (myeloperoxidase)活性を測 定し、 病理組織による検討も行った。 これらの結果を図 5に示す。 図 5 (A) には、 好中球の浸潤度合が抗原投与後 8時間の炎症部位の MP O 活性 （ 1単位を 0. 2 5 1 に含まれる MP 0活性とした 5匹のマウス の平均値土標準偏差） で示されている。 図 5 (B) には、 炎症誘導後 8 時間のへマトキシリン ·ェォシン染色した組織学的変化が、 生理食塩水 を皮内に投与したコントロール標本 （一） と共に示されている （写真は すべて 4 0倍で観察）。 これらの結果から、 2重欠損マウス及びコント口 ールマウスともに MP 0活性の誘導及び病理組織見解は同等なものであ ることがわかった。 皮膚の肥満細胞の数は 2重欠損マウスでは正常であ ることが分かっている。 F C T R III の L y nに依存しない情報伝達の 活性は逆皮膚受動アルザス反応を起こさせるのに十分であり、 L y nは 肥満細胞の後期の反応開始においては必要不可欠なものではないことが わかった。 産業上の利用可能性
本発明の I型アレルギーであるアナフィラキシーを発症せず、 III 型 アレルギーであるアルザス反応を特異的に誘導することができる III型 ァレルギ一炎症モデル非ヒト動物、 例えば L y n及び F c τ ΠΒの遺伝 子機能が染色体上で欠損しているダブルノックァゥトマウスは、 I型ァ レルギ一に影響されることなく、 III 型アレルギー炎症のみを評価しう る実験モデル動物として有用であり、 またかかる実験モデル動物を用い ると、 F C T R III を介した III 型アレルギ一反応に特異的なアレルギ 一反応促進又は抑制物質をスクリ一ニングすることができ、 とりわけス クリーニングにより得られる抑制物質は III型アレルギー反応に起因す る疾病の治療薬として用いることができる可能性がある。

Claims

請 求 の 範 囲
1. I型アレルギ一であるアナフィラキシ一を発症せず、 III 型アレル ギーであるアルザス反応を特異的に誘導することを特徴とする III型ァ レルギ一炎症モデル非ヒト動物。
2. L y n及び F c r II Bの遺伝子機能が染色体上で欠損していること を特徴とする請求項 1記載の III型アレルギー炎症モデル非ヒト動物。
3. 非ヒト動物が齧歯目動物であることを特徴とする請求項 1又は 2記 載の III型アレルギー炎症モデル非ヒト動物。
4. 齧歯目動物がマウスであることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれ か記載の III型ァレルギ一炎症モデル非ヒト動物。
5. 請求項 1〜 4のいずれか記載の III型ァレルギ一炎症モデル非ヒト 動物に被検物質を投与し、 該非ヒト動物における F c r RIH 機能を測 定 ·評価することを特徴とする F C T R III を介した III 型アレルギー 反応における反応促進又は抑制物質のスクリ一二ング方法。
6. 非ヒト動物における F c ァ RIII 機能の測定 ·評価が、 全身性受動 アナフィラキシ一応答強度を指標とした、 抗原投与時以降の直腸内温度 の測定 ·評価であることを特徴とする請求項 5記載の F c r RHI を介 した III型アレルギー反応における反応促進又は抑制物質のスクリ一二 ング方法。
7. 請求項 1〜 4のいずれか記載の III型ァレルギ一炎症モデル非ヒト 動物由来の骨髄細胞から誘導した骨髄由来肥満細胞を生体外で被検物質 と接触させ、 該骨髄由来肥満細胞における F c ァ RIII 機能を測定 '評 価することを特徴とする F c τ ΙΠ を介した ΠΙ 型アレルギー反応に おける反応促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
8. 骨髄由来肥満細胞における F c T R III 機能の測定 '評価が、 肥満 細胞の脱顆粒能、 肥満細胞の細胞質内カルシウム動態、 又は肥満細胞の 全夕ンパク質チロシンリン酸化の測定 ·評価であることを特徴とする請 求項 7記載の F c r RIII を介した III 型アレルギー反応における反応 促進又は抑制物質のスクリ一ニング方法。
9. 請求項 1〜 4のいずれか記載の III型ァレルギ一炎症モデル非ヒト 動物と、 F c ァ ΠΒの遺伝子機能が染色体上で欠損している非ヒト動物 とを用いることを特徴とする請求項 5〜 8のいずれか記載の F c r R III を介した III 型アレルギ一反応における反応促進又は抑制物質のス クリ一ニング方法。
10. 請求項 5〜 9のいずれか記載の F c r R III を介した III 型ァレ ルギ一反応における反応促進又は抑制物質のスクリ一ニング方法により 得られた抑制物質を有効成分とすることを特徴とする III型アレルギ一 反応に起因する疾病の治療薬。
PCT/JP2001/007196 2000-08-24 2001-08-23 Modele animal permettant d'evaluer l'inflammation allergique de type iii WO2002015680A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2420159A CA2420159C (en) 2000-08-24 2001-08-23 Model animal for type iii allergy inflammation
EP01958410A EP1312259B1 (en) 2000-08-24 2001-08-23 Type iii allergic inflammation model animal
DE60140876T DE60140876D1 (de) 2000-08-24 2001-08-23 Tiermodell für typ iii allergische entzündungen
US10/362,593 US7282620B2 (en) 2000-08-24 2001-08-23 Type III allergic inflammation model animal

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000253984A JP3453348B2 (ja) 2000-08-24 2000-08-24 Ｉｉｉ型アレルギー炎症モデル動物
JP2000-253984 2000-08-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002015680A1 true WO2002015680A1 (fr) 2002-02-28

Family

ID=18743006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/007196 WO2002015680A1 (fr) 2000-08-24 2001-08-23 Modele animal permettant d'evaluer l'inflammation allergique de type iii

Country Status (6)

Country Link
US (1) US7282620B2 (ja)
EP (1) EP1312259B1 (ja)
JP (1) JP3453348B2 (ja)
CA (1) CA2420159C (ja)
DE (1) DE60140876D1 (ja)
WO (1) WO2002015680A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100477793B1 (ko) * 2003-04-04 2005-03-21 한국과학기술연구원 분자모델링 컴퓨터시스템의 주변장치 및 그 구성방법
WO2019006330A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 Indiana University Research And Technology Corporation COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING REACTIVITY TO ALS
CN111944756A (zh) * 2020-08-06 2020-11-17 五邑大学 一种raw 264.7细胞炎症模型的建立方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997014791A1 (en) * 1995-10-20 1997-04-24 Ludwig Institute For Cancer Research Animals with targeted gene deletion
US5859314A (en) * 1996-10-18 1999-01-12 Ludwig Institute For Cancer Research Mice with targeted tyrosine kinase, lyn, disruption

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997014791A1 (en) * 1995-10-20 1997-04-24 Ludwig Institute For Cancer Research Animals with targeted gene deletion
US5859314A (en) * 1996-10-18 1999-01-12 Ludwig Institute For Cancer Research Mice with targeted tyrosine kinase, lyn, disruption

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIBBS M.L. ET AL.: "Multiple defects in the immune system of lyn-deficient mice, culminating in autoimmune disease", CELL, vol. 83, 1995, pages 301 - 311, XP002947286 *
OLIVER J.M. ET AL.: "Immunologically mediated signaling in basophils and mast cells: finding therapeutic targets for allergic diseases in the human FcepsilonR1 signaling pathway", IMMUNOPHARMACOLOGY, vol. 48, 25 July 2000 (2000-07-25), pages 269 - 281, XP002947287 *
See also references of EP1312259A4 *
TAKAI T. ET AL.: "Regulation of murine hypersensitive responses by Fc receptors", ALLERGOLOGY INTERNATIONAL, vol. 47, no. 2, 1998, pages 75 - 83, XP002947288 *
TOSHIYUKI TAKAI: "Fc receptor bunshi-gun ni yoru men-eki seigyo", KAREI IGAKU KENKYUSHO ZASSHI, vol. 49, no. 3,4, 1998, pages 107 - 118, XP002947289 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2420159A1 (en) 2002-02-28
US7282620B2 (en) 2007-10-16
EP1312259A1 (en) 2003-05-21
EP1312259B1 (en) 2009-12-23
DE60140876D1 (de) 2010-02-04
EP1312259A4 (en) 2007-05-02
JP3453348B2 (ja) 2003-10-06
US20030182667A1 (en) 2003-09-25
CA2420159C (en) 2010-10-19
JP2002065110A (ja) 2002-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shi et al. The class IV semaphorin CD100 plays nonredundant roles in the immune system: defective B and T cell activation in CD100-deficient mice
Lin et al. Genetic exploration of the role of acid-sensing ion channels
US6992234B2 (en) FcRn-based therapeutics for the treatment of auto-immune disorders
Adya et al. Function of CBFβ/Bro proteins
Fung-Leung et al. Transgenic mice expressing the human high-affinity immunoglobulin (Ig) E receptor alpha chain respond to human IgE in mast cell degranulation and in allergic reactions.
US20230148575A1 (en) Genetically modified non-human animal with human or chimeric il1b and/or il1a
US5750826A (en) Bradykinin B2 receptor modified transgenic non-human animals
WO2002015680A1 (fr) Modele animal permettant d&#39;evaluer l&#39;inflammation allergique de type iii
AU2003233246B2 (en) FcyRIIa transgenic animal model for autoimmune disease
WO2004040969A1 (ja) Ｇａｎｐ導入トランスジェニック哺乳動物及びその利用
JPH10201396A (ja) Ｈ２−ｍ改変トランスジエニツク動物
Ragland et al. Mice hypomorphic for Atr have increased DNA damage and abnormal checkpoint response
JP2001523467A (ja) 炎症性疾患のトランスジェニックモデル
Yamano et al. Human adenosine A3 receptor leads to intracellular Ca2+ mobilization but is insufficient to activate the signaling pathway via phosphoinositide 3-kinase γ in mice
JP2003517273A (ja) 修飾された糖タンパク質ｖ遺伝子を有するトランスジェニック動物
JP2006067944A (ja) シナプス成熟障害モデル動物
CA2375921C (en) Goodpasture&#39;s syndrome model mouse
KR100406484B1 (ko) 타입 ５ 아데닐릴 싸이클라아제가 결실된 형질전환동물,그의 제조방법 및 용도
WO2007144974A1 (ja) 自己免疫性非ヒト動物及びそれを用いたスクリ－ニング方法
福田絵美 Analysis of protocadherin-a in mouse behavioral
JP2000316575A (ja) アナフィラキシー抑制物質のスクリーニング方法
JP2006081512A (ja) フィコリンａ遺伝子機能欠損非ヒト動物
WO2001082688A1 (en) Rab GDI&amp;alpha; KNOCKOUT ANIMALS
WO2007080710A1 (ja) 小胞性ｇａｂａトランスポーター遺伝子欠損マウス
JP2001204297A (ja) 学習・記憶障害モデル動物

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CH DE FR GB

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2420159

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10362593

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001958410

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001958410

Country of ref document: EP