JP2006081512A - フィコリンａ遺伝子機能欠損非ヒト動物 - Google Patents
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Abstract
【課題】
本発明は、フィコリンＡ遺伝子を欠損した非ヒト動物を提供し、自然免疫におけるフィコリンＡの役割や未知の生理活性を明らかにすることを目的とする。
【解決手段】
すなわち、本発明は、フィコリンＡ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物および該非ヒト動物を用い、生体防御機能の促進または抑制を測定することを特徴とする、生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーニング方法等を提供する。
【選択図】なし
本発明は、フィコリンＡ遺伝子を欠損した非ヒト動物を提供し、自然免疫におけるフィコリンＡの役割や未知の生理活性を明らかにすることを目的とする。
【解決手段】
すなわち、本発明は、フィコリンＡ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物および該非ヒト動物を用い、生体防御機能の促進または抑制を測定することを特徴とする、生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーニング方法等を提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は、フィコリンＡ遺伝子機能が染色体上で欠損した生体防御機能に欠陥を有する自然免疫異常モデル非ヒト動物および該動物を用いた生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーニング方法等に関する。
補体系は、多くのタンパク質の分解と集合の連鎖反応の結果、病原微生物を破壊する免疫システムである。３種類の補体活性化経路が知られている。抗体に第一成分Ｃ１が結合して活性化される古典的経路、抗体の関与無しに直接微生物上で活性化が起こる第二経路およびレクチン経路である。これらのうち、レクチン経路においては、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）やフィコリンが認識分子として侵入微生物の糖鎖に結合し、活性化されたセリンプロテアーゼＭＡＳＰがＣ３あるいはＣ４を活性化することにより、補体系の活性化が起こり、自然免疫に働いている。
フィコリンはコラーゲン様ドメインとフィブリノーゲン様ドメインからなるタンパク質である。ヒト、げっ歯類、ブタ、ハリネズミなどの哺乳動物でフィコリンは同定されており、組織特異的な分布を示す。また、ホヤなどの無脊椎動物でも見出されており、フィコリンの関与する生理機能が系統発生的に古くから存在していると考えられる。フィコリンのコラーゲン様構造はオリゴマーの形成に、フィブリノーゲン様ドメインは機能ドメインとして働いており、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を認識するレクチン活性を有する。マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）も類似した構造を有しているが、そのＣ末端は糖鎖認識ドメインとして機能し、マンノースおよびＧｌｃＮＡｃを認識することがフィコリンとは異なっている。
現在、ヒトではＬ、Ｍ、Ｈ３種類のフィコリンが知られており、このうち、ＬとＨフィコリンは血清レクチンとして存在し、自然免疫において補体レクチン経路の認識分子として作用する。Ｍフィコリンは血清には存在せず、モノサイトの膜表面にあってレセプターとして働き食作用などを介在するとの報告もあるが、その機能については明らかではない。一方、マウスでは２種類のフィコリンが知られており、フィコリンＡはヒトのＬフィコリンに相当し、自然免疫において非自己の認識分子として作用していると考えられている（非特許文献１：Fujimoriら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 244:796-800 (1998)）。フィコリンＢはＭフィコリンに相当していると考えられているが、その働きについては不明である。
フィコリンＡはまた補体活性化経路の一つであるレクチン経路においてセリンプロテアーゼＭＡＳＰと結合していることが知られている（非特許文献２：松下操ら、第４１回補体シンポジウム抄録集、P29 (2004)）が、その機構の詳細は明らかではない。フィコリンＡあるいはレクチン経路の生理作用を調べる上で、フィコリンＡを合成できない動物を用いることができればよいが、これまでそのような動物を作製したという報告はない。
Fujimoriら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 244:796-800 (1998) 松下操ら、第４１回補体シンポジウム、P29 (2004)
Fujimoriら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 244:796-800 (1998) 松下操ら、第４１回補体シンポジウム、P29 (2004)
本発明は、フィコリンＡ遺伝子を欠損した非ヒト動物を提供し、自然免疫におけるフィコリンＡの役割や未知の生理活性を明らかにすることを目的とする。
本発明者らは、マウスのフィコリンＡ遺伝子を特定のベクターと相同組換えを起こさせることにより、フィコリンＡ遺伝子を欠損した非ヒト動物を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）フィコリンＡ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物；
（２）フィコリンＡ遺伝子の全部または一部が欠損または他の遺伝子により置換された、上記（１）に記載の非ヒト動物；
（３）非ヒト動物がげっ歯目動物である、上記（１）または（２）に記載の非ヒト動物；
（４）げっ歯目動物がマウスである、上記（１）から（３）のいずれかに記載の非ヒト動物；
（５）自然免疫異常モデルである、上記（１）から（４）のいずれかに記載の非ヒト動物；
（６）以下の工程を含む上記（１）から（５）のいずれかに記載の非ヒト動物の作製法：（ｉ）フィコリンＡ遺伝子におけるコード領域が改変されているＤＮＡ分子を得る工程、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＤＮＡ分子をマウス胚性幹細胞内でフィコリンＡ遺伝子と相同的組換えをおこさせる工程、および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）により相同的組換えをおこさせたマウス胚性幹細胞を発生させマウス個体を得る工程；
（７）上記（６）に記載の非ヒト動物の作製法の作出方法において、工程（ｉｉｉ）で得られるマウス個体が、相同的組換えをおこした細胞を体内の一部に含むキメラマウスであって、該工程（ｉｉｉ）に引き続く以下の工程をさらに含む上記（６）に記載の非ヒト動物の作製法：（ａ）雄性キメラマウスと雌性野生型マウスを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスを産出させる工程、及び（ｂ）工程（ａ）で得られた雄性及び雌性のヘテロ接合体マウスを交配して、Ｆ２世代の、破壊されたフィコリンＡ遺伝子のホモ接合体マウスを得る工程；
（８）上記（５）に記載の非ヒト動物を用い、生体防御機能の促進または抑制を測定することを特徴とする、生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーニング方法；を提供する。
（１）フィコリンＡ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物；
（２）フィコリンＡ遺伝子の全部または一部が欠損または他の遺伝子により置換された、上記（１）に記載の非ヒト動物；
（３）非ヒト動物がげっ歯目動物である、上記（１）または（２）に記載の非ヒト動物；
（４）げっ歯目動物がマウスである、上記（１）から（３）のいずれかに記載の非ヒト動物；
（５）自然免疫異常モデルである、上記（１）から（４）のいずれかに記載の非ヒト動物；
（６）以下の工程を含む上記（１）から（５）のいずれかに記載の非ヒト動物の作製法：（ｉ）フィコリンＡ遺伝子におけるコード領域が改変されているＤＮＡ分子を得る工程、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＤＮＡ分子をマウス胚性幹細胞内でフィコリンＡ遺伝子と相同的組換えをおこさせる工程、および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）により相同的組換えをおこさせたマウス胚性幹細胞を発生させマウス個体を得る工程；
（７）上記（６）に記載の非ヒト動物の作製法の作出方法において、工程（ｉｉｉ）で得られるマウス個体が、相同的組換えをおこした細胞を体内の一部に含むキメラマウスであって、該工程（ｉｉｉ）に引き続く以下の工程をさらに含む上記（６）に記載の非ヒト動物の作製法：（ａ）雄性キメラマウスと雌性野生型マウスを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスを産出させる工程、及び（ｂ）工程（ａ）で得られた雄性及び雌性のヘテロ接合体マウスを交配して、Ｆ２世代の、破壊されたフィコリンＡ遺伝子のホモ接合体マウスを得る工程；
（８）上記（５）に記載の非ヒト動物を用い、生体防御機能の促進または抑制を測定することを特徴とする、生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーニング方法；を提供する。
本発明の非ヒト動物は、非自己認識の異常、レクチン経路の異常などにより生じる疾患の研究に有用であり、実験動物として生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーニング等に利用できる。
本発明は、フィコリンＡ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に関するものである。本発明におけるフィコリンＡ遺伝子とは、フィコリンＡをコードするｍＲＮＡに対応する、イントロンを含む染色体上の領域を意味する。本発明が提供するフィコリンＡ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物は、染色体上のひとつの遺伝子座にあるフィコリンＡ遺伝子が活性あるフィコリンＡを発現しないように破壊されてなるものである。この発明が対象とするフィコリンＡ遺伝子は、上記の定義にしたがって、フィコリンＡをコードするｍＲＮＡに対応する、イントロンを含む染色体上の領域であり、特定の構造、例えば、特定の塩基配列やイントロン−エクソン構造に限定されるものではない。
本発明が対象とするフィコリンＡ遺伝子としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列をコード領域として含むものが挙げられる。また、配列番号：１のアミノ酸配列と相同でありながら、一部のアミノ酸の置換、欠失および／または付加によって配列番号：１とは完全には一致しないアミノ酸配列を有する場合もフィコリンＡ遺伝子に含まれる。具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を示すポリペプチドをコードするものも含まれる。
本発明が対象とするフィコリンＡ遺伝子のより詳細な具体例としては、配列番号：２に示す塩基配列を含有するものが挙げられる。この塩基配列は、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの塩基配列である。本発明が対象とするフィコリンＡ遺伝子は通常、この配列番号：２の塩基配列を含有し、かつ、この塩基配列がイントロンにより分断された構造、すなわちイントロン−エクソン構造を有している。配列番号：２に対応するフィコリンＡ遺伝子上の個々の領域を、５’末端から順に「エクソン１」、「エクソン２」、「エクソン３」等と称することとする。
本発明におけるフィコリンＡ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、フィコリンＡをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化され、フィコリンＡを発現する機能を失った非ヒト動物をいい、また非ヒト動物とは、ヒト以外の哺乳動物、特にマウス、ラット等のげっ歯目動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明における野生型の非ヒト動物とは、上記フィコリンＡ遺伝子機能が欠損した非ヒト動物と同種の動物を意味し、同腹の動物が好ましい。そして、フィコリンＡ遺伝子機能が欠損した非ヒト動物としては、メンデルの法則に従い出生してくるものが、フィコリンＡ欠損型と同腹の野生型を得ることができ、これらを用いて正確な比較実験をすることができる点で好ましい。そして、フィコリンＡノックアウトマウスを、野生型マウスとしては該ノックアウトマウスと同腹の野生型マウスを、それぞれ具体的に挙げることができる。以下、非ヒト動物がマウスの場合を例にとって説明する。
フィコリンＡノックアウトマウスの作製法としては、フィコリンＡを発現する機能を失ったノックアウトマウスを作製することができるものであればどのような作製法でもよい。フィコリンＡ遺伝子の破壊の様式は、該遺伝子が活性あるフィコリンＡを発現するという本来の機能を消失している限り特に制限はなく、例えば該遺伝子における塩基の置換、欠失および／または付加による塩基配列の変化が挙げられる。塩基配列の変化の部位についても、該遺伝子本来の機能の消失に至るものである限り特に制限はないが、エクソンの塩基配列に変化を有するものが望ましい。具体的には、フィコリンＡをコードするｃＤＮＡをプローブとして、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ゲノムＤＮＡのフィコリンＡ遺伝子を単離し、いくつかのエクソン部分とその周囲のイントロンを、例えば抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子に置換してターゲットベクターを作製し、作製されたターゲットベクターをエレクトロポレーション法によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択し、このＥＳ細胞系を用いて生殖系列のキメラマウスを作製し、野生型マウスと交配させることによって得られるヘテロ接合体マウス（Ｆ１：雑種第一代）同士を交配させることによって、メンデルの法則に従い産生するフィコリンＡノックアウトマウスと同腹の野生型マウスを作製することができる。
遺伝子の破壊を確認するには、染色体上の該当部分（フィコリンＡ遺伝子座）の物理的解析、例えば、ＰＣＲによる増幅断片の鎖長の測定、サザンブロッティング、塩基配列の解読などによる結果を、野生型の遺伝子型を有するマウスの場合と比較すればよい。また、フィコリンＡに関する表現型の解析、例えば、血清試料をウェスタンブロットや免疫沈降法で測定し、所期の活性が検出されないことによりフィコリンＡ遺伝子の破壊を確認することもできる。
以下、さらに詳細にフィコリンＡノックアウトマウスの作製法を説明する。
本発明のノックアウトマウスの作製法は、基本としては（１）塩基の置換、欠失および／または付加により、フィコリンＡ遺伝子におけるコード領域が改変されているＤＮＡ分子を得る工程、（２）工程（１）により変異させたＤＮＡ分子をマウス胚性幹細胞内（以下、「胚性幹細胞」を「ＥＳ細胞」という）でフィコリンＡ遺伝子と相同的組換えをおこさせる工程、および（３）工程（２）により相同的組換えをおこさせたマウスＥＳ細胞を発生させマウス個体を得る工程、を含むことを特徴とする。
本発明のノックアウトマウスの作製法は、基本としては（１）塩基の置換、欠失および／または付加により、フィコリンＡ遺伝子におけるコード領域が改変されているＤＮＡ分子を得る工程、（２）工程（１）により変異させたＤＮＡ分子をマウス胚性幹細胞内（以下、「胚性幹細胞」を「ＥＳ細胞」という）でフィコリンＡ遺伝子と相同的組換えをおこさせる工程、および（３）工程（２）により相同的組換えをおこさせたマウスＥＳ細胞を発生させマウス個体を得る工程、を含むことを特徴とする。
上記の工程（１）を実施するには、先ず、この発明が開示するフィコリンＡ遺伝子の構造に関する情報をもとにして、該遺伝子の全部又はその断片を含むＤＮＡ分子を単離する。該ＤＮＡ分子の単離は、ＰＣＲや遺伝子ライブラリーのスクリーニングなど、公知の方法にしたがえばよい。工程（２）における相同的組換えを目的通りに達成するためには通常、２ケ所（１ケ所は６ｋｂ以上、もう１ケ所は１−２ｋｂ程度）の鎖長のＤＮＡ分子を単離することが望ましい。次に、得られたＤＮＡ分子におけるコード領域の塩基配列を、塩基の置換、欠失および／または挿入により改変したＤＮＡ分子を調製する。塩基配列の改変は、ＰＣＲによる増幅ＤＮＡ分子の連結や、部位特異的変異など公知の組換えＤＮＡ技術によればよい。本発明は、以上のようにして調製される、コード領域の塩基配列が改変された、単離されたＤＮＡ分子をも提供する。
相同的組換えによって所期の遺伝子を破壊するためのＤＮＡ分子は一般に「ターゲティングベクター」と呼ばれる。ターゲティングベクターとしては、次の工程（２）におけるＥＳ細胞の選択をより容易にするために、陽性選択マーカーおよび／または陰性選択マーカーとしての配列をさらに含んでいるものが望ましい。陽性選択マーカーとしてはネオマイシン耐性遺伝子やβ−ガラクトシダーゼ遺伝子などが、陰性選択マーカーとしては単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子やジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子などがそれぞれ具体例として挙げられる。なお、以上のようなターゲティングベクターを構築する際に、ターゲティングベクター構築用として市販されているプラスミドベクターを利用することもできる。
上記の工程（２）を実施するには、上記のターゲティングベクターをエレクトロポレーション法やリポフェクション法等の動物細胞への慣用のＤＮＡ導入法によりマウスのＥＳ細胞に導入する。ターゲティングベクターが導入された細胞内で相同的組換えが起こると、該細胞が本来有するフィコリンＡ遺伝子は、その一部が、ターゲティングベクターにおける改変された塩基配列と置換され、破壊されることとなる。ターゲティングベクター導入後の細胞を、細胞内での相同的組換えを確認するサザンブロッティング、ＰＣＲ法等の常法により検索すれば、所期の相同的組換えをおこしたＥＳ細胞（以下、「組換えＥＳ細胞」という。）が得られる。
そして次に、上記の工程（３）として、得られた組換えＥＳ細胞を発生させてマウス個体を得る。組換えＥＳ細胞を発生させるには、公知のマイクロインジェクション法や凝集法にしたがって正常なマウス胚とともに、擬妊娠状態にある雌性マウスの子宮内に移植し、該移植マウスを通常通り飼育してマウス仔を出産させ、個体にまで飼育すればよい。このようにして得られるマウスは、通常、生体を構成する細胞として、組換えＥＳ細胞由来の細胞とともに正常細胞を含むキメラマウスである。このようなキメラマウスを、引き続いて、下記の工程にしたがって交配すれば、本発明のノックアウトマウスを作出することができる。なお、キメラマウスを以下の工程にしたがって交配させて所期のノックアウトマウスを作出するためには、キメラマウスにおける生殖系列に組換えＥＳ細胞由来の細胞が含まれる必要がある。このようなキメラマウスを得る効率を高めるために、組換えＥＳ細胞と発生をともにする正常なマウス細胞との組合わせを考慮する必要がある。例えば、組換えＥＳ細胞の起源マウスとは異なる体毛色のマウスからの正常細胞を組み合わせれば、生まれたキメラマウスの体毛色を観察することにより、生体における組換えＥＳ細胞の占める割合の高いキメラマウスの選択が容易となり、結果として、生殖系列に組換えＥＳ細胞由来の細胞を含むキメラマウスの獲得の効率を高めることができる。
上記のようにして得られたキメラマウスから本発明のノックアウトマウスを得るには、雄性キメラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスを産出させ、生まれた雄性及び雌性のヘテロ接合体マウスを交配して、Ｆ２世代の、破壊されたフィコリンＡ遺伝子のホモ接合体マウスを選択すればよい。Ｆ１及びＦ２の各世代において所期の遺伝子型が達成されているか否かは、組換えＥＳ細胞の検索と同様に、サザンブロッティング、ＰＣＲ、塩基配列の解読等の常法によればよい。
このようにして作出した本発明のノックアウトマウスを、雄性・雌性の組合わせとして一旦得ておけば、それ以降は、必要に応じて適宜繁殖させることにより、容易に同じ遺伝子型のノックアウトマウスを必要数得ることができる。本発明のノックアウトマウスは、哺乳類の生体内でのフィコリンＡの生理学的役割を個体レベルで解析するためのモデル動物や、フィコリンＡの欠損ないしは不全に関連する疾患の発症や進行のメカニズムの解析のための実験動物、また、このような疾患に対する治療・予防・診断剤の検索用の動物などとしてとりわけ有用である。
本発明はまた、生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーニング方法を提供する。本発明の生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーニング方法における生体防御機能の促進または抑制剤とは、感染症予防治療剤、免疫抑制剤、抗ウィルス剤、抗細菌剤、表面にGlcNAcを有する病原体などを挙げることができるが、これらに限定されるものではなく、生体防御機能の促進または抑制剤は、フィコリンＡノックアウトマウスに試験化合物を投与し、感染症などの症状の有無、致死率等を同腹の野生型マウスの場合と比較評価することによりスクリーニングすることができる。
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
フィコリンＡノックアウトマウスの作出
野生型のフィコリンＡ遺伝子を図１に示す。ターゲッティングベクターを用いて、相同組み換えにより第１から第３エクソン（図中、ＦｃｎＡの領域の黒のバーで示す部分がエクソンであり、５’末端から順に「エクソン１」、「エクソン２」、「エクソン３」とする）をネオマイシン耐性遺伝子と置き換えることによって遺伝子を改変した（targeted allele：改変遺伝子）。ターゲティングベクターの構築は、まずｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩプラスミドのなかで、ネオマイシン耐性遺伝子の３’側に１．７ Ｋｂ、５’側に３．４ ＫｂのフィコリンＡ遺伝子ＤＮＡを連結した。さらに、１．７ ＫｂゲノムＤＮＡの５’側に逆向きにジフテリアトキシンＡフラグメントを連結した。この全体のプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩで切断して、直鎖ＤＮＡとした。このターゲティングベクターをマウス１２９系統由来のＥＳ細胞に導入し、得られたネオマイシン耐性クローンをさらにＰＣＲ法により選択した。その結果、５個のＥＳクローンを得た。
野生型のフィコリンＡ遺伝子を図１に示す。ターゲッティングベクターを用いて、相同組み換えにより第１から第３エクソン（図中、ＦｃｎＡの領域の黒のバーで示す部分がエクソンであり、５’末端から順に「エクソン１」、「エクソン２」、「エクソン３」とする）をネオマイシン耐性遺伝子と置き換えることによって遺伝子を改変した（targeted allele：改変遺伝子）。ターゲティングベクターの構築は、まずｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩプラスミドのなかで、ネオマイシン耐性遺伝子の３’側に１．７ Ｋｂ、５’側に３．４ ＫｂのフィコリンＡ遺伝子ＤＮＡを連結した。さらに、１．７ ＫｂゲノムＤＮＡの５’側に逆向きにジフテリアトキシンＡフラグメントを連結した。この全体のプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩで切断して、直鎖ＤＮＡとした。このターゲティングベクターをマウス１２９系統由来のＥＳ細胞に導入し、得られたネオマイシン耐性クローンをさらにＰＣＲ法により選択した。その結果、５個のＥＳクローンを得た。
遺伝子改変によって得られた５個の組換えＥＳクローンに対してサザンブロット解析を行い、図２に示したように、予想されるサイズのバンドを示したクローン２と５を選択し、卵細胞（マウスC５７BL／６系統由来）へのインジェクションに用いた。その結果、１ｎと２ｎと命名した２系統のマウスを得た。
ノックアウトマウスの解析
実施例１で得られた子マウスの遺伝子型を解析した。１ｎの系統ではホモマウスは生まれていないので、２ｎの系統を用いた。ヘテロとヘテロの交配から生まれた子マウス遺伝子型は＋／＋：＋／−：−／−が２７：４６：２０（約１：２：１）の割合であった。２ｎのホモマウスの表現型は、野生型マウスと比較し、外観や体重に差はないように見えた。しかし組織学的には脾臓に異常が観察された。
実施例１で得られた子マウスの遺伝子型を解析した。１ｎの系統ではホモマウスは生まれていないので、２ｎの系統を用いた。ヘテロとヘテロの交配から生まれた子マウス遺伝子型は＋／＋：＋／−：−／−が２７：４６：２０（約１：２：１）の割合であった。２ｎのホモマウスの表現型は、野生型マウスと比較し、外観や体重に差はないように見えた。しかし組織学的には脾臓に異常が観察された。
血清を用いたノックアウトマウスの生化学的解析
自然免疫に働くとされる補体レクチン経路の異常について、血清を用いた生化学的解析を行った。対照として野生型マウスを用い、ホモマウスについてフィコリンＡの発現を調べた。図３に示すように、肝臓のノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲさらに血清のウェスタンブロット解析においてホモマウスにフィコリンＡのバンドは全く観察されなかった。
自然免疫に働くとされる補体レクチン経路の異常について、血清を用いた生化学的解析を行った。対照として野生型マウスを用い、ホモマウスについてフィコリンＡの発現を調べた。図３に示すように、肝臓のノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲさらに血清のウェスタンブロット解析においてホモマウスにフィコリンＡのバンドは全く観察されなかった。
ホモマウスにおける補体レクチン経路成分の分布
ヒトＬおよびＨフィコリンは補体レクチン経路の認識分子として働き、セリンプロテアーゼＭＡＳＰやその短縮型タンパク質であるｓＭＡＰと複合体を形成していることが報告されている。そこで実施例２で得られたホモマウスにおいてこれら補体レクチン経路の成分がどのように分布しているかをウェスタンブロット解析により調べた。ＭｂｌとフィコリンＡの画分を分離するために、マウス血清をＧｌｃＮＡｃアガロースとインキュベートし、その後遠心して結合しなかった素通り画分を分け、さらに結合画分をマンノースで溶出し、次にＧｌｃＮＡｃで溶出した。野生型マウスではＧｌｃＮＡｃ分画にほとんどのフィコリンＡが溶出されるが、ホモマウスではどの画分にもフィコリンＡは検出されなかった。一方、マンナンとＧｌｃＮＡｃ両者に親和性のあるＭｂｌはマンノース画分に溶出された。マンノース画分にはＭｂｌと複合体を形成していると考えられるＭａｓｐ−１、Ｍａｓｐ−２、およびｓＭＡＰが多量存在するが、その量はホモマウスと野生型マウスでほとんど差はなかった。さらに、野生型マウスのＧｌｃＮＡｃ画分には少量のＭａｓｐおよびｓＭＡＰが確認できたが、ホモマウスのＧｌｃＮＡｃ画分にはＭａｓｐおよびｓＭＡＰは全く検出できなかった。この結果は、野生型マウスではフィコリンＡがＭａｓｐおよびｓＭＡＰと複合体を形成しているのに対し、ホモマウスではこれらの複合体が存在しないことを示している。
ヒトＬおよびＨフィコリンは補体レクチン経路の認識分子として働き、セリンプロテアーゼＭＡＳＰやその短縮型タンパク質であるｓＭＡＰと複合体を形成していることが報告されている。そこで実施例２で得られたホモマウスにおいてこれら補体レクチン経路の成分がどのように分布しているかをウェスタンブロット解析により調べた。ＭｂｌとフィコリンＡの画分を分離するために、マウス血清をＧｌｃＮＡｃアガロースとインキュベートし、その後遠心して結合しなかった素通り画分を分け、さらに結合画分をマンノースで溶出し、次にＧｌｃＮＡｃで溶出した。野生型マウスではＧｌｃＮＡｃ分画にほとんどのフィコリンＡが溶出されるが、ホモマウスではどの画分にもフィコリンＡは検出されなかった。一方、マンナンとＧｌｃＮＡｃ両者に親和性のあるＭｂｌはマンノース画分に溶出された。マンノース画分にはＭｂｌと複合体を形成していると考えられるＭａｓｐ−１、Ｍａｓｐ−２、およびｓＭＡＰが多量存在するが、その量はホモマウスと野生型マウスでほとんど差はなかった。さらに、野生型マウスのＧｌｃＮＡｃ画分には少量のＭａｓｐおよびｓＭＡＰが確認できたが、ホモマウスのＧｌｃＮＡｃ画分にはＭａｓｐおよびｓＭＡＰは全く検出できなかった。この結果は、野生型マウスではフィコリンＡがＭａｓｐおよびｓＭＡＰと複合体を形成しているのに対し、ホモマウスではこれらの複合体が存在しないことを示している。
ホモマウスの補体活性化能
実施例２で得られたホモマウスの補体活性化能をＧｌｃＮＡｃ結合プレート上でのＣ４沈着により検討した。マウス血清をＧｌｃＮＡｃアガロースとインキュベート後、マンノース溶出画分とＧｌｃＮＡｃ溶出画分に分け、それぞれの画分の活性を測定した。マンノース溶出画分はＭｂｌ／Ｍａｓｐ／ｓＭＡＰ複合体を含んでいたが、ホモマウスと野生型マウスで有為な差はなかった。一方、ＧｌｃＮＡｃ画分の活性は、野生型マウスと比較し、ホモマウスで有為に低下している結果を示した。
実施例２で得られたホモマウスの補体活性化能をＧｌｃＮＡｃ結合プレート上でのＣ４沈着により検討した。マウス血清をＧｌｃＮＡｃアガロースとインキュベート後、マンノース溶出画分とＧｌｃＮＡｃ溶出画分に分け、それぞれの画分の活性を測定した。マンノース溶出画分はＭｂｌ／Ｍａｓｐ／ｓＭＡＰ複合体を含んでいたが、ホモマウスと野生型マウスで有為な差はなかった。一方、ＧｌｃＮＡｃ画分の活性は、野生型マウスと比較し、ホモマウスで有為に低下している結果を示した。
組換え型フィコリンの製造
レクチン経路の再構成を行うために、組換え型フィコリンをショウジョウバエの発現システムを用いて作成した。ｃＤＮＡをベクターに組み込み、ショウジョウバエＳ２細胞で分泌型タンパク質として発現させた。培地中に分泌された組換え型フィコリンをＧｌｃＮＡｃアガロースを用いて精製した。
レクチン経路の再構成を行うために、組換え型フィコリンをショウジョウバエの発現システムを用いて作成した。ｃＤＮＡをベクターに組み込み、ショウジョウバエＳ２細胞で分泌型タンパク質として発現させた。培地中に分泌された組換え型フィコリンをＧｌｃＮＡｃアガロースを用いて精製した。
組換え型フィコリンのレクチン活性を調べた結果、組換え型フィコリンはＧｌｃＮＡｃにのみ結合することが明らかとなった。この結果に基づいて、ＧｌｃＮＡｃアガロースカラムを用いて組換え型フィコリンを精製した。
フィコリンＡ複合体の再構築と補体活性化能の回復
ホモマウスにおけるフィコリンＡ／Ｍａｓｐ／ｓＭａｐ複合体の再構築を試みた。図４に示したように、血清に組換え型フィコリンＡを添加後、４℃で一晩放置し、その後ＧｌｃＮＡｃアガロースに吸着させ、マンノース溶出画分とＧｌｃＮＡｃ画分に分けた。フィコリンＡの添加量が増えるにつれてＧｌｃＮＡｃ画分にＭａｓｐおよびｓＭａｐが出現した。
この結果は、フィコリンＡ／Ｍａｓｐ／ｓＭａｐ複合体がホモマウス血清中で再構築されたことを示している。また、これとともにＧｌｃＮＡｃ画分のＣ４沈着活性も回復し、この実験では過剰量（約２５倍量）のフィコリンＡ添加により、野生型マウスよりも高い活性が観察された。組換え型フィコリンＡの代わりに組換え型フィコリンＢを用いた検討では、再構成の効果はなかった。これらの結果は、フィコリンＡが、レクチン経路の認識分子として特異的に作用し、補体の活性化に働いていることを示している。
ホモマウスにおけるフィコリンＡ／Ｍａｓｐ／ｓＭａｐ複合体の再構築を試みた。図４に示したように、血清に組換え型フィコリンＡを添加後、４℃で一晩放置し、その後ＧｌｃＮＡｃアガロースに吸着させ、マンノース溶出画分とＧｌｃＮＡｃ画分に分けた。フィコリンＡの添加量が増えるにつれてＧｌｃＮＡｃ画分にＭａｓｐおよびｓＭａｐが出現した。
この結果は、フィコリンＡ／Ｍａｓｐ／ｓＭａｐ複合体がホモマウス血清中で再構築されたことを示している。また、これとともにＧｌｃＮＡｃ画分のＣ４沈着活性も回復し、この実験では過剰量（約２５倍量）のフィコリンＡ添加により、野生型マウスよりも高い活性が観察された。組換え型フィコリンＡの代わりに組換え型フィコリンＢを用いた検討では、再構成の効果はなかった。これらの結果は、フィコリンＡが、レクチン経路の認識分子として特異的に作用し、補体の活性化に働いていることを示している。
本発明の非ヒト動物は、非自己認識の異常、レクチン経路の異常などにより生じる疾患の研究に有用であり、実験動物として上記疾患の予防・治療物質のスクリーニング等に利用できる。
Claims (8)
- フィコリンＡ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物。
- フィコリンＡ遺伝子の全部または一部が欠損または他の遺伝子により置換された、請求項１に記載の非ヒト動物。
- 非ヒト動物がげっ歯目動物である、請求項１または２に記載の非ヒト動物。
- げっ歯目動物がマウスである、請求項１から３のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 自然免疫異常モデルである、請求項１から４のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 以下の工程を含む請求項１から５のいずれかに記載の非ヒト動物の作製法：（１）フィコリンＡ遺伝子におけるコード領域が改変されているＤＮＡ分子を得る工程、（２）工程（１）で得られたＤＮＡ分子をマウス胚性幹細胞内でフィコリンＡ遺伝子と相同的組換えをおこさせる工程、および（３）工程（２）により相同的組換えをおこさせたマウス胚性幹細胞を発生させマウス個体を得る工程。
- 請求項６に記載の非ヒト動物の作製法の作出方法において、工程（３）で得られるマウス個体が、相同的組換えをおこした細胞を体内の一部に含むキメラマウスであって、該工程（３）に引き続く以下の工程をさらに含む請求項６に記載の非ヒト動物の作製法：（ａ）雄性キメラマウスと雌性野生型マウスを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスを産出させる工程、及び（ｂ）工程（ａ）で得られた雄性及び雌性のヘテロ接合体マウスを交配して、Ｆ２世代の、破壊されたフィコリンＡ遺伝子のホモ接合体マウスを得る工程。
- 請求項５に記載の非ヒト動物を用い、生体防御機能の促進または抑制を測定することを特徴とする、生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーニング方法。
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| JP2004272403A JP2006081512A (ja) | 2004-09-17 | 2004-09-17 | フィコリンａ遺伝子機能欠損非ヒト動物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006081512A true JP2006081512A (ja) | 2006-03-30 |
Family
ID=36060205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004272403A Pending JP2006081512A (ja) | 2004-09-17 | 2004-09-17 | フィコリンａ遺伝子機能欠損非ヒト動物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2006081512A (ja) |
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-
2004
- 2004-09-17 JP JP2004272403A patent/JP2006081512A/ja active Pending
-
2005
- 2005-09-15 WO PCT/JP2005/017440 patent/WO2006030970A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2006030970A1 (ja) | 2006-03-23 |
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