WO2006030970A1 - フィコリンａ遺伝子機能欠損非ヒト動物 - Google Patents

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Teizo Fujita
Yuichi Endo
Minoru Takahashi
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    • A01K2267/0368—Animal model for inflammation

Definitions

  • the present invention relates to an innate immune abnormality model non-human animal having a ficolin A gene function deficient on the chromosome and having a defect in the biological defense function. It relates to methods. Background art
  • the complement system is an immune system that destroys pathogenic microorganisms as a result of many protein degradation and assembly chain reactions.
  • three types of complement activation pathways are known. That is, the classical pathway in which the first component C 1 is activated by binding to the antibody, and the second pathway, the lectin pathway, in which activation occurs directly on the microorganism without the involvement of the antibody.
  • the lectin pathway mannose-binding lectin (MB L) is bound as a recognition molecule to the strands of invading microorganisms, and activated serine protease MASP activates C3 or C4.
  • Ficollin is a protein composed of a collagen-like domain and a fibrinogen-like domain. Ficollin has been identified in mammals such as humans, rodents, pigs, and hedgehogs, and shows a tissue-specific distribution. It has also been found in invertebrates such as squirts, and it is thought that the physiological functions involved in ficolin exist phylogenically for a long time.
  • the collagen-like structure of ficollin acts as a functional domain for the formation of oligomers and the fibrinogen-like domain, and has a lectin activity that recognizes and recognizes N-acetyltilcosamine (G 1 c N A c).
  • Mannose-binding lectin MBL
  • MBL Mannose-binding lectin
  • MBL Mannose-binding lectin
  • MBL Mannose-binding lectin
  • MBL also has a similar structure, but its C-terminus functions as a sugar chain recognition domain and is different from
  • L and H ficolin exist as serum lectins.
  • M ficolin does not exist in serum, and it has been reported that it acts on the membrane surface of monocytes and acts as a receptor to mediate phagocytosis, but its function is not clear.
  • ficolin A is equivalent to human L-ficolin and is thought to act as an unrecognized recognition molecule in innate immunity (Fuj imori et al., Biochem .
  • Ficollin B is thought to correspond to M phycoline, but its function is unknown.
  • Ficollin A is also known to bind to serine protease MA SP in the lectin pathway, which is one of the complement activation pathways (Matsushita et al., 41st Complement Symposium Abstracts, P29 (2004) ) Force The details of the mechanism are not clear. In order to investigate the physiological effects of ficolin A or the lectin pathway, it would be sufficient if animals that could not synthesize ficolin A could be used, but there has been no report that such animals have been produced. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a non-human animal deficient in the ficolin A gene, and to clarify the role of ficolin A in innate immunity and unknown physiological activities.
  • the present inventors have found that a non-human animal deficient in the ficolin A gene can be produced by causing homologous recombination of the mouse ficolin A gene with a specific vector, and have completed the present invention.
  • the present invention provides:
  • a method for producing a non-human animal according to any one of (1) to (5) including the following steps: (i) a step of obtaining a DNA molecule in which the coding region in the ficolin A gene is modified; ii) the step of homologous recombination of the DNA molecule obtained in step (i) with the ficollin A gene in mouse embryonic stem cells; and (iii) the step of homologous recombination according to step (ii). Generating mouse embryonic stem cells to obtain a mouse individual;
  • the mouse individual obtained in step (iii) is a chimeric mouse comprising a part of the body that has undergone homologous recombination.
  • the method for producing a non-human animal according to (6) further comprising the following steps following the step (iii): (a) mating a male chimeric mouse and a female wild-type mouse, And (b) the male and female heterozygous mice obtained in step (a) are mated to produce the F2 generation of disrupted ficollin A gene. Obtaining a homozygous mouse;
  • a method for screening an agent for promoting or suppressing a host defense function comprising measuring the promotion or suppression of the host defense function using the non-human animal described in (5) above.
  • the non-human animal of the present invention is useful for studying diseases caused by non-self recognition abnormality, lectin pathway abnormality and the like, and can be used as an experimental animal for promoting a defense function of a living body or screening for an inhibitor.
  • Figure 1 shows the procedure for deleting the ficolin A gene.
  • Upper wild-type phycoline A gene; middle: targeting vector; lower: modified gene.
  • Figure 2 shows the results of Southern plot analysis of ES clones knocked out of the ficolin A gene.
  • Fig. 3 shows the results of Northern plot analysis and RT-PCR for ficolin A gene-deficient mice. 5017440
  • Fig. 4 shows the results of EL I SA and Western plot analysis on the serum of ficolin A gene-deficient mice.
  • FIG. 5 shows the results of examining the complement activation ability of homozygous mice by C4 deposition on G 1 cNA c binding plates.
  • Fig. 6 shows the results of Western blot analysis of components of the complement lectin pathway in homo mice.
  • FIG. 7 shows the results of examining the complement activation ability of homomouse serum fractions by C 4 deposition on G 1 cNAc-binding plates.
  • FIG. 8 shows the effect of recombinant ficolin on the lectin pathway in homomouse serum.
  • FIG. 9 shows the binding between ficolin A and Ma s p-2 sMap.
  • FIG. 10 shows the protective effect of ficollin A against bacteria.
  • the present invention relates to a non-human animal deficient in the ficollin A gene function on the chromosome.
  • the ficolin A gene in the present invention means a region on a chromosome containing introns corresponding to mRNA encoding ficolin A.
  • the non-human animal deficient in the chromosome of the ficolin A gene function provided by the present invention is one in which the ficolin A gene at one locus on the chromosome is disrupted so as not to express active ficolin A. is there.
  • the ficollin A gene targeted by the present invention is a region on a chromosome containing an intron corresponding to mRNA encoding ficoline A according to the above definition, and has a specific structure, for example, a specific base sequence It is not limited to the intron-exon structure.
  • ficollin A gene targeted by the present invention for example, a gene containing a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a coding region can be cited.
  • the ficollin A gene also includes an amino acid sequence that does not completely match SEQ ID NO: 1 due to substitution, deletion and / or addition.
  • SEQ ID NO: A polypeptide having a homology of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more with the amino acid sequence represented by 1. This is also included in the “Ficolin A gene”.
  • a more specific example of the ficoline A gene targeted by the present invention includes one containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • This base sequence is the base sequence of cDNA corresponding to mRNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the ficollin A gene targeted by the present invention usually contains the base sequence of SEQ ID NO: 2, and has a structure in which this base sequence is divided by an intron, that is, an intron-exon structure.
  • the individual regions on the ficoline A gene corresponding to SEQ ID NO: 2 are referred to as “Exon 1”, “Exon 2”, “Exon 3”, etc. in order from the end.
  • non-human animal deficient in the chromosome of the ficolin A gene function in the present invention is inactivated by the disruption, deletion, replacement, etc. of the endogenous gene of the non-human animal encoding ficolin A
  • Non-human animals that have lost their function to be expressed, and non-human animals can specifically include mammals other than humans, especially rodents such as mice and rats. It is not limited to these.
  • the wild-type non-human animal in the present invention means an animal of the same species as the above-mentioned non-human animal deficient in the ficollin A gene function, and preferably an abdominal animal. And as non-human animals deficient in phycoline A gene function, those born according to Mendel's law can obtain wild-types that are the same as ficollin A deficient and can be used for accurate comparison. This is preferable in that an experiment can be performed. Specific examples of ficollin A knockout mice and wild type mice that are the same as the knockout mice and wild type mice can be mentioned. In the following, the case where the non-human animal is a mouse is described as an example.
  • Any method can be used to produce a ficolin A knockout mouse as long as it can produce a knockout mouse that has lost the function of expressing ficolin A.
  • base substitution, deletion and Z or Modification of base sequence by addition Can be mentioned.
  • the site of the base sequence change is not particularly limited as long as it leads to the loss of the original function of the gene, but preferably has a change in the base sequence of Exon.
  • the mouse genomic DNA library was screened, the ficollin A gene of genomic DNA was isolated, and several exons and surrounding introns were isolated.
  • a marker gene such as an antibiotic resistance gene
  • the target vector thus prepared was introduced into ES cells by electroporation, and homologous recombination occurred.
  • germline chimera mice are created and mated with wild-type mice, and heterozygous mice (F 1: hybrid first generation) obtained by mating with each other.
  • F 1 hybrid first generation
  • chromosome In order to confirm gene disruption, physical analysis of the relevant part on the chromosome (Ficoline A locus), for example, measurement of the length of the amplified fragment by PCR, Southern blotting, decoding of the base sequence, etc. May be compared to that of a mouse having a wild type genotype.
  • phenotypic analysis of ficolin A for example, serum samples can be measured by Western blotting and immunoprecipitation, and the disruption of ficolin A gene can be confirmed by the absence of the desired activity.
  • the method for producing the knockout mouse of the present invention basically comprises (1) a step of obtaining a DNA molecule in which the coding region in the ficolin A gene is modified by base substitution, deletion and Z or addition, (2) step A step of homologous recombination of the DNA molecule mutated in (1) with the phycorin A gene in mouse embryonic stem cells (hereinafter referred to as “B ⁇ live stem cells” as “ES cells”); and (3) Generating mouse ES cells that have undergone homologous recombination in step (2) to obtain mouse individuals.
  • step (1) first, based on the information on the structure of the ficoline A gene disclosed in the present invention, DN containing all or a fragment of the gene
  • a molecule is isolated. Isolation of the DNA molecule can be accomplished by PCR or gene library scoring. Any known method such as Leeung may be used. In order to achieve homologous recombination as intended in step (2), DNA molecules with a chain length of 2 sites (1 site is 6 kb or more, and the other site is about 1 to 2 kb) are usually used. It is desirable to separate.
  • a DNA molecule is prepared by modifying the base sequence of the coding region in the obtained DNA molecule by base substitution, deletion and / or insertion. The base sequence can be modified by known recombinant DNA techniques such as ligation of amplified DNA molecules by PCR and site-specific mutation.
  • the present invention also provides an isolated DNA molecule prepared as described above, wherein the base sequence of the coding region is altered.
  • a DNA molecule for disrupting a desired gene by homologous recombination is commonly referred to as a “targeting vector”.
  • a targeting vector in order to facilitate selection of ES cells in the next step (2), it is desirable to further include a positive selection marker and a sequence as a negative selection marker.
  • positive selection markers include neomycin resistance gene and / 3-galatatosidase gene
  • negative selection markers include simple herpesvirus thymidine kinase gene and diphtheria toxin A fragment gene.
  • a plasmid vector that is commercially available for constructing a targeting vector can also be used.
  • the above-mentioned targeting vector is introduced into mouse ES cells by a conventional method for introducing DNA into animal cells, such as the electroporation method or the ribofection method.
  • a conventional method for introducing DNA into animal cells such as the electroporation method or the ribofection method.
  • homologous recombination occurs in the cell into which the targeting vector has been introduced, a part of the ficollin A gene that the cell originally has is replaced with the modified base sequence in the targeting vector and destroyed. .
  • cells after introduction of the targeting vector are searched by conventional methods such as Southern blotting and PCR to confirm homologous recombination in cells, ES cells that have undergone the desired homologous recombination (hereinafter “ Recombinant ES cells ”)).
  • a mouse individual is obtained by generating the obtained recombinant ES cell.
  • the transplanted mouse is bred as usual, and the mouse offspring is born. Good.
  • the mouse thus obtained is usually a chimeric mouse containing normal cells as well as cells derived from recombinant ES cells as cells constituting the living body. If such a chimeric mouse is subsequently bred according to the following steps, the knockout mouse of the present invention can be produced.
  • the germ line in the chimeric mouse must contain cells derived from recombinant ES cells.
  • a male chimeric mouse and a female wild type mouse are mated to produce an F1 generation heterozygous mouse,
  • F2 generation homozygous mice with the disrupted ficolin A gene can be selected.
  • Whether or not the desired genotype has been achieved in each generation of F 1 and F 2 can be determined according to conventional methods such as Southern blotting, PCR, and decoding of the nucleotide sequence, as in the search for recombinant ES cells. Good.
  • the knockout mouse of the present invention produced in this way is once obtained as a combination of male and female threads, and thereafter, if necessary, it can be easily propagated as necessary so that the same genotype knockout mouse can be easily produced. You can get as many as you need.
  • the knockout mouse of the present invention is a model animal for analyzing the physiological role of ficollin A in a mammalian body at the individual level, and the mechanism of the onset and progression of diseases related to ficolin A deficiency or failure. Laboratory animals for analysis, also like this It is particularly useful as an animal for searching for prophylactic / diagnostic agents.
  • the present invention also provides a method for screening an agent for promoting or suppressing a host defense function.
  • the method of promoting or suppressing the host defense function is the agent for preventing or treating infectious diseases, immunosuppressive agent, antiviral agent, antibacterial agent, and G 1 on the surface. Examples include, but are not limited to, pathogens that have NAc, and the host defense function promoter or inhibitor is administered by administering a test compound to Ficollin A knockout mice, such as infectious diseases. Screening can be done by evaluating the presence of symptoms, mortality, etc. in comparison with wild-type mice.
  • the SEQ ID NOs in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • Example 3 The base sequence of the primer used in Example 3 is shown.
  • Example 1 the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
  • Example 1 the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
  • Ficollin A knockout mouse creation The wild-type ficollin A gene is shown in the upper part of FIG.
  • the first to third exons by homologous recombination (in the figure, the part indicated by the black bar in the region of F c nA is the exon. 5, exon 1 in order from the end, exon 2
  • the gene was modified (targeted allele) by substituting “exon 3” with a neomycin resistance gene.
  • the targeting vector was constructed by first ligating 1.76 Kb of ficolin A gene DNA of 3.76 Kb on the 3 'side and 5.50 Kb of 5' side of the neomycin resistance gene in the pBluescript II plasmid.
  • diphtheria toxin A fragment (DT-A) was ligated in the reverse direction to the 5th, 1.76 Kb genomic DNA. The entire plasmid was cleaved with the restriction enzyme Not I to obtain linear DNA.
  • This targeting vector was introduced into ES cells derived from 129 mouse strains, and the resulting neomycin resistant clones were further selected by the PCR method. As a result, 5 ES clones were obtained.
  • the genotypes of the pups obtained in Example 1 were analyzed. Of the two lines obtained, homozygous mice were not born in the 1n line, so the 2n line was used for the analysis.
  • the offspring mouse genotype born from the heterozygous cross is + / + (wild type): +
  • the ratio of / 1 (hetero):-/-(homo) was 27:46:20 (about 1: 2: 1).
  • the phenotype of 2 n homo mice was not observed in appearance or body weight compared to wild type mice, and histologically obvious abnormalities in the examined range (lung, thymus, spleen, liver) was not recognized. Furthermore, since pups are born normally by crossing homozygous mice, their reproductive ability is considered normal.
  • EL I SA was performed as follows: anti-ficolin A antibody was bound to mycoloplate, and 10 ⁇ L of mouse serum was added to 100 / i L of PB S (0.15 M N a C 1 In 10 mM phosphate buffer, pH 7.4), and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing, peroxidase-labeled anti-ficoline AF ab ′ was added and allowed to react for another hour. After washing, ABT S and hydrogen peroxide were added, and color development at 405 nm was measured.
  • Complement activation ability of the homomus obtained in Example 2 was examined by C4 deposition on a G1c NAc-binding plate. Specifically, G 1 c NA c-BSA was bound to a microplate, mouse serum or serum components were added thereto, and the mixture was allowed to react at 37 ° C for 10 minutes in 100 ⁇ L PBS. . After washing, human complement C4 was added and allowed to react for 30 minutes on ice. After further washing, the substrate TMB was added and reacted. After 10 minutes, 1M phosphoric acid was added to stop the reaction, and the absorbance at a wavelength of 4500 ⁇ was measured. As shown in Fig. 5, large individual differences in activity were observed even in mice of the same genotype.
  • Example 5 The mean values showed a decreasing trend in the order of wild type, heterozygous, and homozygous, and there was a statistically significant difference between wild type and homozygous. Since the activity examined here includes the activity of both MBL and buicoline A, they were examined separately (see Example 6).
  • Example 5 The activity examined here includes the activity of both MBL and buicoline A, they were examined separately (see Example 6).
  • the fraction that passed through without binding was separated, and the bound fraction was eluted with mannose and then with G 1 cNAc. This was dialyzed against TBS (50 mM Tris—HC 1 buffer, pH 8.0 containing 0.15 M NaCl) and used for Western plot analysis. The result is shown in FIG. In wild-type mice, most of the ficolin A is eluted in the GlcNAc fraction, whereas in homozygous mice, ficollin A is detected in any fraction. There wasn't. On the other hand, MBL, which has affinity for both mannan and GlcNAc, was eluted in the mannose fraction.
  • the mannose fraction contains a large amount of Ma sp-1, Ma sp-2, and s MAP that are thought to form a complex with MBL, but there is little difference between homozygous and wild type mice. It was. In addition, a small amount of Ma sp and s MAP were confirmed in the G 1 c NAc fraction of wild-type mice, but no Ma sp and s MAP were detected in the homologous G 1 c NAc fraction. It was. This result indicates that ficolin A forms a complex with Masp and sMAP in wild-type mice, whereas these complexes do not exist in homozygous mice.
  • Example 7 Complement activation ability of the homo mice obtained in Example 2 was examined by C 4 deposition on G 1 c NAc binding plates.
  • mouse serum was incubated with GlcNAc agarose, and then divided into a mannose-eluting fraction and a GlcNAc-eluting fraction, and the activity of each fraction was measured.
  • the mannose-eluted fraction contained Mb 1 / Mass MAP complex as a result of timestamp lot analysis (see Example 5).
  • Force As shown in Figure 7, there was a significant difference between homozygous and wild-type mice. There was no.
  • the activity of the GlcNAc fraction was significantly lower in homozygous mice than in wild-type mice. This suggests that homo mice lack the lectin pathway through ficollin A.
  • Example 7 Example 7
  • recombinant ficoline was generated using the Drosophila expression system.
  • c DNA was integrated into the vector and expressed as a secreted protein in Drosophila S2 cells.
  • the thread-replaceable ficoline secreted into the medium was purified using GlcNAc agarose.
  • GlcNAc agarose As a result of examining the lectin activity of recombinant ficolin, it was found that recombinant ficolin binds to G 1 cNAc. Based on this result, recombinant ficoline was purified using a GlcNAc agarose column.
  • the non-human animal of the present invention is useful for studying diseases caused by non-self-recognition abnormality, lectin pathway abnormality, and the like, and can be used as an experimental animal for screening of the above-mentioned disease prevention / treatment substances.

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Abstract

本発明は、フィコリンＡ遺伝子を欠損した非ヒト動物を提供し、自然免疫におけるフィコリンＡの役割や未知の生理活性を明らかにすることを目的とする。すなわち、本発明は、フィコリンＡ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物および該非ヒト動物を用い、生体防御機能の促進または抑制を測定することを特徴とする、生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーニング方法等を提供する。

Description

明細書
フィコリン A遺伝子機能欠損非ヒト動物 技術分野
本発明は、 フィコリン A遺伝子機能が染色体上で欠損した生体防御機能に欠陥 を有する自然免疫異常モデル非ヒト動物おょぴ該動物を用いた生体防御機能の促 進または抑制剤のスクリ一二ング方法等に関する。 背景技術
補体系は、 多くのタンパク質の分解と集合の連鎖反応の結果、 病原微生物を破 壊する免疫システムである。 これまでに 3種類の補体活性化経路が知られている 。 すなわち、 抗体に第一成分 C 1が結合して活性化される古典的経路、 抗体の関 与無しに直接微生物上で活性化が起こる第二経路おょぴレクチン経路である。 こ れらのうち、 レクチン経路においては、 マンノース結合レクチン （MB L ) ゃフ ィコリンが認識分子として侵入微生物の糠鎖に結合し、 活性化されたセリンプロ テアーゼ M A S Pが C 3あるいは C 4を活性化することにより、 補体系の活性化 が起こり、 自然免疫に働いている。
フィコリンはコラーゲン様ドメインとフイブリノーゲン様ドメインからなるタ ンパク質である。 ヒト、 げっ歯類、 ブタ、 ハリネズミなどの哺乳動物でフィコリ ンは同定されており、 組織特異的な分布を示す。 また、 'ホヤなどの無脊椎動物で も見出されており、 フィコリンの関与する生理機能が系統発生的に古くから存在. していると考えられる。 フィコリンのコラーゲン様構造はオリゴマーの形成に、 フイブリノ一ゲン様ドメインは機能ドメインとして働いており、 N—ァセチルダ ルコサミン （G 1 c N A c ) を認、識するレクチン活性を有する。 マンノース結合 レクチン （M B L ) も類似した構造を有しているが、 その C末端は糖鎖認識ドメ インとして機能し、 マンノースおょぴ G 1 c NA cを認識することがフィコリン とは異なっている。
現在、 ヒトでは L、 M、 H 3種類のフィコリンが知られており、 このうち、 L と Hフィコリンは血清レクチンとして存在し、 自然免疫において補体レクチン経 40
路の認識分子として作用する。 Mフィコリンは血清には存在せず、 単球の膜表面 にあってレセプターとして働き食作用などを介在するとの報告もあるが、 その機 能については明らかではない。 一方、 マウスでは 2種類のフィコリンが知られて おり、 フィコリン Aはヒ トの Lフィコリンに相当し、 自然免疫において非自已の 認識分子として作用していると考えられている （Fuj imoriら、 Biochem.
Biophys. Res. Commun. , 244： 796-800 (1998) ) 。 フィコリン Bは Mフィコリ ンに相当していると考えられているが、 その働きについては不明である。
フィコリン Aはまた補体活性化経路の一つであるレクチン経路においてセリン プロテアーゼ MA S Pと結合していることが知られている （松下操ら、 第 4 1回 補体シンポジウム抄録集、 P29 (2004) ) 力 その機構の詳細は明らかではない 。 フィコリン Aあるいはレクチン経路の生理作用を調べる上で、 フィコリン Aを 合成できない動物を用いることができればよいが、 これまでそのような動物を作 製したという報告はない。 発明の開示
本発明は、 フィコリン A遺伝子を欠損した非ヒト動物を提供し、 自然免疫にお けるフィコリン Aの役割や未知の生理活性を明らかにすることを目的とする。 本発明者らは、 マウスのフィコリン A遺伝子を特定のベクターと相同組換えを 起こさせることにより、 フィコリン A遺伝子を欠損した非ヒト動物を作製できる ことを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 .
( 1 ) フィコリン A遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物；
( 2 ) フィコリン A遺伝子の全部または一部が欠損または他の遺伝子により置換 された、 上記 （1 ) に記載の非ヒト動物；
( 3 ) 非ヒト動物がげつ歯目動物である、 上記 （1 ) または （2 ) に記載の非ヒ ト動物；
( 4 ) げっ歯目動物がマウスである、 上記 （1 ) から （3 ) のいずれかに記載の 非ヒト動物； (5) 自然免疫異常モデルである、 上記 (1) から （4) のいずれかに記載の非 ヒト動物；
(6) 以下の工程を含む上記 （1) から （5) のいずれかに記載の非ヒト動物の 作製法： （i ) フィコリン A遺伝子におけるコード領域が改変されている DNA 分子を得る工程、 （i i) 工程 （i) で得られた DNA分子をマウス胚性幹細胞 内でフィコリン A遺伝子と相同的組換えをおこさせる工程、 および （i i i) ェ 程 （i i) により相同的組換えをおこさせたマウス胚性幹細胞を発生させマウス 個体を得る工程；
(7) 上記 (6) に記載の非ヒト動物の作製法の作出方法において、 工程 （i i i ) で得られるマウス個体が、 相同的組換えをおこした細胞を体内の一部に含む キメラマウスであって、 該工程 （i i i) に引き続く以下の工程をさらに含む上 記 （6) に記載の非ヒト動物の作製法： （a) 雄性キメラマウスと雌性野生型マ ウスを交配して、 F 1世代のへテロ接合体マウスを産出させる工程、 及び （b) 工程 （a) で得られた雄性及び雌性のへテロ接合体マウスを交配して、 F 2世代 の、 破壊されたフィコリン A遺伝子のホモ接合体マウスを得る工程；
(8) 上記 （5) に記載の非ヒト動物を用い、 生体防御機能の促進または抑制を 測定することを特徴とする、 生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーニング 方法；を提供する。
本発明の非ヒト動物は、 非自己認識の異常、 レクチン経路の異常などにより生 じる疾患の研究に有用であり、 実験動物として生体防御機能の促進または抑制剤 のスクリーニング等に利用できる。 図面の簡単な説明
図 1は、 フィコリン A遺伝子を欠損させる手順を示す。 上段：野生型フィコリ ン A遺伝子；中段：ターゲティングベクター；下段：改変遺伝子。
図 2は、 フィコリン A遺伝子をノックァゥトした E Sクローンのサザンプロッ ト解析の結果を示す。
図 3は、 フィコリン A遺伝子欠損マウス f臓に対するノーザンプロット解析お よび RT— P CRの結果を示す。 5017440
図 4は、 フィコリン A遺伝子欠損マウス血清に対する EL I SAおよびウェス タンプロット解析の結果を示す。
図 5は、 ホモマウスの補体活性化能を G 1 cNA c結合プレート上での C4沈 着により検討した結果を示す。
図 6は、 ホモマウスにおける補体レクチン経路の成分についてのウェスタンプ ロットによる解析結果を示す。
図 7は、 ホモマウス血清の分画成分による補体活性化能を G 1 c NAc結合プ レート上での C 4沈着により検討した結果を示す。
図 8は、 ホモマウス血清におけるレクチン経路への組換え型フィコリンの効果 を示す。
図 9は、 フィコリン Aと Ma s p- 2ノ sMa pとの結合を示す。
図 1 0は、 フィコリン Aのバクテリァに対する防御作用を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 フィコリン A遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に関する ものである。 本発明におけるフィコリン A遺伝子とは、 フィコリン Aをコードす る mRNAに対応する、 イントロンを含む染色体上の領域を意味する。 本発明が 提供するフィコリン A遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物は、 染色体上 のひとつの遺伝子座にあるフィコリン A遺伝子が活性あるフィコリン Aを発現し ないように破壌されてなるものである。 この発明が対象とするフィコリン A遺伝 子は、 上記の定義にしたがって、 フィコリン Aをコードする mRNAに対応する 、 イントロンを含む染色体上の領域であり、 特定の構造、 例えば、 特定の塩基配 列ゃィントロンーェクソン構造に限定されるものではない。
本発明が対象とするフィコリン A遺伝子としては、 例えば、 配列番号： 1で表 されるアミノ酸配列をコードする塩基配列をコード領域として含むものが拳げら れる。 また、 配列番号： 1のアミノ酸配列と相同でありながら、 一部 （例えば、 1〜20個、 1〜1 0個、 1〜数個 （例えば 6個） 、 1〜2個など） のアミノ酸 の置換、 欠失および/または付加によって配列番号： 1とは完全には一致しない ァミノ酸配列を有する場合もフィコリン A遺伝子に含まれる。 例えば、 配列番号 ： 1で表されるァミノ酸配列と 8 0 %以上、 好ましくは 8 5 %以上、 より好まし くは 9 0 %以上、 さらに好ましくは 9 5 %以上の相同性を示すポリぺプチドをコ ードするものもここでいう 「フィコリン A遺伝子」 に含まれる。
本発明が対象とするフィコリン A遺伝子のより詳細な具体例としては、 配列番 号： 2に示す塩基配列を含有するものが挙げられる。 この塩基配列は、 配列番号 ： 1のアミノ酸配列をコードする m R NAに対応する c D NAの塩基配列である 。 本発明が対象とするフィコリン A遺伝子は通常、 この配列番号： 2の塩基配列 を含有し、 かつ、 この塩基配列がイントロンにより分断された構造、 すなわちィ ントロンーェクソン構造を有している。 配列番号： 2に対応するフィコリン A遺 伝子上の個々の領域を、 5， 末端から順に 「ェクソン 1」 、 「ェクソン 2」 、 「 ェクソン 3」 等と称することとする。
本発明におけるフィコリン A遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒ ト動物とは 、 フィコリン Aをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子が破壌 ·欠損 ·置換等に より不活性化され、 フィコリン Aを発現する機能を失った非ヒ ト動物をいい、 ま た非ヒ ト動物とは、 ヒ ト以外の哺乳動物、 特にマウス、 ラット等のげつ歯目動物 を具体的に挙げることができるが、 これらに限定されるものではない。
本発明における野生型の非ヒ ト動物とは、 上記フィコリン A遺伝子機能が欠損 した非ヒト動物と同種の動物を意味し、 同腹の動物が好ましい。 そして、 フィコ リン A遺伝子機能が欠損した非ヒ ト動物としては、 メンデルの法則に従い出生し てくるものが、 フィコリン A欠損型と同腹の野生型を得ることができ、 これらを 用いて正確な比較実験をすることができる点で好ましい。 そして、 フィコリン A ノックアウトマウスを、 野生型マウスとしては該ノックアウトマウスと同腹の野 生型マウスを、 それぞれ具体的に挙げることができる。 以下、 非ヒ ト動物がマウ スの場合を例にとって説明する。
フィコリン Aノックアウトマウスの作製法としては、 フィコリン Aを発現する 機能を失ったノックァゥトマウスを作製することができるものであればどのよう な作製法でもよい。 フィコリン A遺伝子の破壌の様式は、 該遺伝子が活性あるフ ィコリン Aを発現するという本来の機能を消失している限り特に制限はなく、 例 えば該遺伝子における塩基の置換、 欠失および Zまたは付加による塩基配列の変 化が挙げられる。 塩基配列の変化の部位についても、 該遺伝子本来の機能の消失 に至るものである限り特に制限はないが、 ェクソンの塩基配列に変化を有するも のが望ましい。 具体的には、 フィコリン Aをコードする c D NAをプローブとし て、 マウスのゲノム D NAライブラリーをスクリーニングし、 ゲノム D N Aのフ ィコリン A遺伝子を単離し、 いくつかのェクソン部分とその周囲のイントロンを 、 例えば抗生物質耐性遺伝子等のマーカ一遺伝子に置換してタ一ゲットベクター を作製し、 作製されたターゲットベクターをエレクトロポレーション法によって E S細胞に導入し、 相同的組換えを起こした E S細胞を選択し、 この E S細胞系 を用いて生殖系列のキメラマウスを作製し、 野生型マウスと交配させることによ つて得られるヘテロ接合体マウス （F 1 ：雑種第一代） 同士を交配させることに よって、 メンデルの法則に従い産生するフィコリン Aノックァゥトマウスと同腹 の野生型マウスを作製することができる。
遺伝子の破壊を確認、するには、 染色体上の該当部分 （フィコリン A遺伝子座） の物理的解析、 例えば、 P C Rによる増幅断片の鎖長の測定、 サザンブロッティ ング、 塩基配列の解読などによる結果を、 野生型の遺伝子型を有するマウスの場 合と比較すればよい。 また、 フィコリン Aに関する表現型の解析、 例えば、 血清 試料をウェスタンブロットゃ免疫沈降法で測定し、 所期の活性が検出されないこ とによりフィコリン A遺伝子の破壌を確認することもできる。
以下、 さらに詳細にフィコリン Aノックァゥトマウスの作製法を説明する。 本発明のノックアウトマウスの作製法は、 基本としては （1 ) 塩基の置換、 欠 失および Zまたは付加により、 フィコリン A遺伝子におけるコード領域が改変さ れている D N A分子を得る工程、 （2 ) 工程 （1 ) により変異させた D N A分子 をマウス胚性幹細胞内 （以下、 「B^生幹細胞」 を 「E S細胞」 という） でフィコ リン A遺伝子と相同的組換えをおこさせる工程、 および （3 ) 工程 （2 ) により 相同的組換えをおこさせたマウス E S細胞を発生させマウス個体を得る工程、 を 含むことを特徴とする。
上記の工程 （1 ) を実施するには、 先ず、 この発明が開示するフィコリン A遺 伝子の構造に関する情報をもとにして、 該遺伝子の全部又はその断片を含む D N
A分子を単離する。 該 D N A分子の単離は、 P C Rや遺伝子ライブラリーのスク リーユングなど、 公知の方法にしたがえばよい。 工程 （2 ) における相同的組換 えを目的通りに達成するためには通常、 2ケ所 （1ケ所は 6 k b以上、 もう 1ケ 所は 1一 2 k b程度） の鎖長の D N A分子を単離することが望ましい。 次に、 得 られた D N A分子におけるコード領域の塩基配列を、 塩基の置換、 欠失および/ または挿入により改変した D NA分子を調製する。 塩基配列の改変は、 P C Rに よる増幅 D N A分子の連結や、 部位特異的変異など公知の組換え D N A技術によ ればよい。 本発明は、 以上のようにして調製される、 コード領域の塩基配列が改 変された、 単離された D NA分子をも提供する。
相同的組換えによって所期の遺伝子を破壊するための D N A分子は一般に 「タ ーゲティングベクター」 と呼ばれる。 ターゲティングべクターとしては、 次のェ 程 （2 ) における E S細胞の選択をより容易にするために、 陽性選択マーカーお ょぴ Zまたは陰性選択マーカーとしての配列をさらに含んでいるものが望ましい 。 陽性選択マーカーとしてはネオマイシン耐性遺伝子や /3—ガラタ トシダーゼ遺 伝子などが、 陰性選択マーカーとしては単純へルぺスウィルスのチミジンキナー ゼ遺伝子やジフテリァ毒素 Aフラグメント遺伝子などがそれぞれ具体例として挙 げられる。 なお、 以上のようなターゲティングベクターを構築する際に、 ターゲ ティングベクター構築用として市販されているプラスミ'ドベクターを利用するこ ともできる。
上記の工程 （2 ) を実施するには、 上記のターゲテイングベクターをエレクト 口ポレーション法ゃリボフヱクション法等の動物細胞への慣用の D N A導入法に よりマウスの E S細胞に導入する。 ターゲティングベクターが導入された細胞内 で相同的組換えが起こると、 該細胞が本来有するフィコリン A遺伝子は、 その一 部が、 ターゲティングベクターにおける改変された塩基配列と置換され、 破壊さ れることとなる。 ターゲティングベクター導入後の細胞を、 細胞内での相同的組 換えを確認するサザンブロッテイング、 P C R法等の常法により検索すれば、 所 期の相同的組換えをおこした E S細胞 （以下、 「組換え E S細胞」 という。 ） が 得ら^^る。
そして次に、 上記の工程 （3 ) として、 得られた組換え E S細胞を発生させて マウス個体を得る。 組換え E S細胞を発生させるには、 公知のマイクロインジヱ クション法ゃ凝集法にしたがって正常なマウス胚とともに、 擬妊娠状態にある雌 性マウスの子宮内に移植し、 該移植マウスを通常通り飼育してマウス仔を出産さ せ、 個体にまで飼育すればよい。 このようにして得られるマウスは、 通常、 生体 を構成する細胞として、 組換え E S細胞由来の細胞とともに正常細胞を含むキメ ラマウスである。 このようなキメラマウスを、 引き続いて、 下記の工程にしたが つて交配すれば、 本発明のノックアウトマウスを作出することができる。 なお、 キメラマウスを以下の工程にしたがって交配させて所期のノックァゥトマウスを 作出するためには、 キメラマウスにおける生殖系列に組換え E S細胞由来の細胞 が含まれる必要がある。 このようなキメラマウスを得る効率を高めるために、 組 換え E S細胞と発生をともにする正常なマウス細胞との組合わせを考慮する必要 がある。 例えば、 組換え E S細胞の起源マウスとは異なる体毛色のマウスからの 正常細胞を組み合わせれば、 生まれたキメラマウスの体毛色を観察することによ り、 生体における組換え E S細胞の占める割合の高いキメラマウスの選択が容易 となり、 結果として、 生殖系列に組換え E S細胞由来の細胞を含むキメラマウス の獲得の効率を高めることができる。
上記のようにして得られたキメラマウスから本発明のノックァゥトマウスを得 るには、 雄性キメラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、 F 1世代のへテロ 接合体マゥスを産出させ、 生まれた雄性及び雌性のへテ口接合体マゥスを交配し て、 F 2世代の、 破壊されたフィコリン A遺伝子のホモ接合体マウスを選択すれ ばよい。 F 1及び F 2の各世代において所期の遺伝子型が達成されているか否か は、 組換え E S細胞の検索と同様に、 サザンブロッテイング、 P C R、 塩基配列 の解読等の常法によればよい。
このようにして作出した本発明のノックアウトマウスを、 雄性 ·雌性の糸且合わ せとして一旦得ておけば、 それ以降は、 必要に応じて適宜繁殖させることにより 、 容易に同じ遺伝子型のノックアウトマウスを必要数得ることができる。 本発明 のノックアウトマウスは、 哺乳類の生体内でのフィコリン Aの生理学的役割を個 体レベルで解析するためのモデル動物や、 フィコリン Aの欠損ないしは不全に関 連する疾患の発症や進行のメカニズムの解析のための実験動物、 また、 このよう な疾患に対する治療 .予防 ·診断剤の検索用の動物などとしてとりわけ有用であ る。
本発明はまた、 生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーニング方法を提供 する。 本発明の生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーユング方法における 生体防御機能の促進または抑制剤とは、 感染症予防治療剤、 免疫抑制剤、 抗ウイ ルス剤、 抗細菌剤、 表面に G 1 c N A cを有する病原体などを挙げることができ るが、 これらに限定されるものではなく、 生体防御機能の促進または抑制剤は、 フィコリン Aノックァゥトマウスに試験化合物を投与し、 感染症などの症状の有 無、 致死率等を同腹の野生型マウスの場合と比較評価することによりスクリー二 ングすることができる。 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
マウスフィコリン A遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示 す。
〔配列番号： 2〕
マウスフィコリン Aをコードする c D NAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
実施例 3で用いたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
実施例 3で用いたプライマ一の塩基配列を示す。 実施例
以下に、 実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、 この発明の技術 的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。 実施例 1
フィコリン Aノックァゥトマウスの作出 野生型のフィコリン A遺伝子を図 1の上段に示す。 ターゲッティングベクター を用いて、 相同組み換えにより第 1から第 3ェクソン （図中、 F c nAの領域の 黒のバーで示す部分がェクソンであり、 5， 末端から順に 「ェクソン 1」 、 「ェ クソン 2」 、 「ェクソン 3」 とする） をネオマイシン耐性遺伝子と置き換えるこ とによって遺伝子を改変した （targeted allele：改変遺伝子） 。 ターゲティン グベクターの構築は、 まず p B l u e s c r i p t I Iプラスミ ドのなかで、 ネオマイシン耐性遺伝子の 3 ' 側に 1. 76 K b、 5 ' 側に 5. 50 K bの フィコリン A遺伝子 DNAを連結した。 さらに、 1. 76 Kbゲノム DNAの 5， 側に逆向きにジフテリアトキシン Aフラグメント (DT-A) を連結した。 この全体のプラスミ ドを制限酵素 No t Iで切断して、 直鎖 DNAとした。 この ターゲテイングベクターをマウス 129系統由来の E S細胞に導入し、 得られた ネオマイシン耐性クローンをさらに PC R法により選択した。 その結果、 5個の E Sクローンを得た。
遺伝子改変によって得られた 5個の組換え E Sクローンに対してサザンプロッ ト解析を行い、 図 2に示したように、 予想されるサイズのバンドを示したクロー ン 2と 5を選択し、 卵細胞 （マウス C57BL/6系統由来） へのインジェクショ ンに用いた。 その結果、 1 nと 2 nと命名した 2系統のへテロマウスを得た。 実施例 2
ノックァゥトマウスの解析
実施例 1で得られた子マウスの遺伝子型を解析した。 得られた 2系統のうち、 1 nの系統ではホモマウスは生まれていないので、 解析には 2 nの系統を用いた 。 ヘテロとヘテロの交配から生まれた子マウス遺伝子型は + /+ (野生型） ： +
/一 (ヘテロ） ：—/— (ホモ） が 27 ： 46 ： 20 (約 1 ： 2 ： 1) の割合で あった。 2 nのホモマウスの表現型は、 野生型マウスと比較し、 外観や体重に差 は観察されず、 また組織学的にも、 調べた範囲 （肺、 胸腺、 脾臓、 肝臓） で明ら かな異常は認められなかった。 さらに、 ホモマウス同士の交配で正常に仔が産ま れることから、 その生殖能力も正常と考えられる。 実施例 3
血清を用いたノックァゥトマウスの生化学的解析
自然免疫に働くとされる補体レクチン経路の異常について、 血清を用いた生化 学的解析を行った。 対照として野生型マウスを用い、 ホモマウスについてフィコ リン Aの発現を調べた。 解析方法として、 ノーザンプロット解析、 RT— PCR 、 EL I S Aおよびウェスタンプロット解析を用いた。 具体的には、 ノーザンブ ロット解析は以下のように行った：マウス肝臓から抽出した mRN Aをァガロー スゲル電気泳動にかけた後、 ナイロン膜に転写し、 32Pで標識したフィコリン A c DNA (塩基番号 5 2- 1 1 9 2) でハイブリダィゼーシヨンを行い、 ナ イロン膜を洗浄後、 オートラジオグラフィによりパンドを検出した。 RT— PC Rは、 肝臓から抽出した mRNAを c DNAに転換して錶型とし、 プライマーと
3' (配列番号： 4) を用い、 フィコリン A c DNA断片を増幅した。 反応産 物はァガロースゲル電気泳動により分析した。 EL I SAは以下のように行った ：抗フィコリン A抗体をマイコロプレートに結合させ、 これに 1 0 μ Lのマウス 血清を 1 00 /i Lの PB S (0. 1 5M N a C 1を含む 1 0 mM リン酸緩衝 液、 pH7. 4) の中で、 室温で 1時間反応させた。 洗浄後、 ペルォキシダーゼ 標識抗フィコリン A F a b ' を加えて、 さらに 1時間反応させた。 洗浄後、 A BT Sと過酸化水素を加えて、 40 5 nmでの発色を測定した。 また、 ゥエスタ ンプロット解析は、 試料を 1 0 %ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、 これを メンプレンへ転写し、 各種抗体を室温で 1時間反応させた。 その後洗浄し、 ペル ォキシダ-ゼ標識第 2抗体を反応させ、 化学発光基質を加えて、 生じた発光を検 出装置 L A S 30 00で測定した。 図 3 (ノ一ザンブロット解析および R T— P CR) およぴ図 4 (ウェスタンプロット解析） に示すように、 肝臓のノーザンブ ロット解析、 RT— P CRさらに血清のウェスタンプロット解析において、 ホモ マウスにフィコリン Aに相当するバンドは全く観察されなかった。 また、 EL I S Aにより血清中のフィコリン A量は、 野生型では平均 3. 4 μ g/m 1 , へテ 口では平均 1· 9 μ gノ m 1を示したが、 ホモでは全く検出されなかった。 実施例 4
ホモマウスの補体活性化能 （1)
実施例 2で得られたホモマゥスの補体活性化能を G 1 c NAc結合プレート上 での C 4沈着により検討した。 具体的には、 G 1 c NA c—B S Aをマイクロプ レートに結合させ、 これにマウス血清または血清成分を加え、 1 00 ^ Lの PB S中で、 3 7°C、 1 0分間反応させた。 その後洗浄し、 ヒト補体 C 4を加えて氷 上で 3 0分間反応させた。 さらに洗浄し、 基質 TMBを加えて反応させ、 1 0分後 1Mリン酸を加えて反応を停止させ、 波長 4 5 0 ηπιにおける吸光度を測定した 。 図 5に示したように、 同じ遺伝子型のマウスでも活性に大きな個体差が観察さ れた。 平均値は野生型、 ヘテロ、 ホモの順に低下傾向を示し、 野生型とホモとの 間には統計的な有意差があった。 ここで調べた活性には MB Lとブイコリン A両 者の活性が含まれるので、 両者を分離して調べることとした （実施例 6参照） 。 実施例 5
ホモマウスにおける補体レクチン経路成分の分布
ヒト Lおよび Hフィコリンは補体レクチン経路の認識分子として働き、 セリ ンプロテアーゼ MAS Pやその短縮型タンパク質である sMAPと複合体を形成 していることが報告されている （Matsushita, M. ら、 J. Immunol. 164： 2281, 2000； Matsushita, M.ら J. Immunol. 168： 3502, 2002) 。 そこで実施例 2で 得られたホモマウスにおいてこれら補体レクチン経路の成分がどのように分布し ているかをウェスタンプロット解析により調べた。 MB Lとフィコリン Aの画分 を分離するために、 マウス血清 （200 μ L) を G l c NAcァガロース （50 %溶液、 1 0 0 ^ L) と 4°Cでー晚ィンキュペートし、 その後遠心して結合しな 力つた素通り画分を分け、 さらに結合画分をマンノースで溶出し、 次に G 1 c N Acで溶出した。 これを TB S (0. 1 5M Na C lを含む50mM T r i s— HC 1緩衝液、 pH8. 0) に透析したものをウェスタンプロット解析に用 いた。 結果を図 6に示す。 野生型マウスでは G l c NA c分画にほとんどのフィ コリン Aが溶出されるが、 ホモマウスではどの画分にもフィコリン Aは検出され なかった。 一方、 マンナンと G l cNAc両者に親和性のある MB Lはマンノー ス画分に溶出された。 マンノース画分には MB Lと複合体を形成していると考え られる Ma s p— 1、 Ma s p— 2、 および s MAPが多量存在するが、 その量 はホモマウスと野生型マウスでほとんど差はなかった。 さらに、 野生型マウスの G 1 c NA c画分には少量の Ma s pおよび s MA Pが確認できたが、 ホモマウ スの G 1 c NAc画分には Ma s pおよび s MAPは全く検出できなかった。 こ の結果は、 野生型マウスではフィコリン Aが Ma s pおよび s MAPと複合体を 形成しているのに対し、 ホモマウスではこれらの複合体が存在しないことを示し ている。 実施例 6
ホモマウスの補体活性化能 （2)
実施例 2で得られたホモマウスの補体活性化能を G 1 c NAc結合プレート上 での C 4沈着により検討した。 実施例 5同様、 マウス血清を G l c NAcァガロ ースとインキュベート後、 マンノース溶出画分と G l c NAc溶出画分に分け、 それぞれの画分の活性を測定した。 マンノース溶出画分は、 ゥヱスタンプロット 解析の結果では Mb 1 /Ma s s MAP複合体を含んでいた （実施例 5参照 ) 力 図 7に示すように、 ホモマウスと野生型マウスで有為な差はなかった。 一 方、 G l cNAc画分の活性は、 野生型マウスと比較し、 ホモマウスで有為に低 下している結果を示した。 このことは、 ホモマウスがフィコリン Aを介するレク チン経路を欠損していることを示唆するものである。 実施例 7
組換え型フィコリンの製造
レクチン経路の再構成を行うために、 組換え型フィコリンをショウジヨウバエ の発現システムを用いて作成した。 c DNAをベクターに組み込み、 ショウジョ ゥバエ S 2細胞で分泌型タンパク質として発現させた。 培地中に分泌された糸且換 え型フィコリンを G l c NAcァガロースを用いて精製した。 組換え型フィコリンのレクチン活性を調べた結果、 組換え型フィコリンは G 1 cNAcに結合することが明らかとなった。 この結果に基づいて、 G l cNAc ァガロースカラムを用いて組換え型フィコリンを精製した。 実施例 8
フィコリン A複合体の再構築と補体活性化能の回復
ホモマウスにおけるフィコリン A/Ma s p/ sMa p複合体の再構築を試み た。 図 8に示したように、 血清に組換え型フィコリン Aを添加後、 4 °Cでー晚放 置し、 その後 G 1 c NAcァガロースに吸着させ、 マンノース溶出画分と G l c NAc画分に分けた。 フィコリン Aの添加量が増えるにつれて G 1 c NA c画分 に Ma s pおよび sMa pが出現した。
この結果は、 フィコリン AZMa s p/sMa p複合体がホモマウス血清中で 再構築されたことを示している。 また、 これとともに G l c NAc画分の C 4沈 着活性も回復し、 この実験では過剰量 （血清濃度の約 25倍量） のフィコリン A 添加により、 野生型マウスよりも高い活性が観察された。 組換え型フィコリン A の代わりに組換え型フィコリン Bを用いた検討では、 再構成の効果はなかった。 これらの結果は、 フィコリン Aが、 レクチン経路の認識分子として特異的に作用 し、 補体の活性化に働いていることを示している。 実施例 9
フィコリン Aと Ma s pZsMa pとの結合
フィコリン Aと Ma s p/ sMa pとの結合を確かめるために、 フィコリン A と組換え型 Ma s p— 2および s Ma pとの結合を調べた。 種々の組み合わせで インキュベートした後、 実施例 5に記載の条件で G 1 cNAcァガロースに結合 させ、 G l c NAcで溶出し、 実施例 3と同様にウェスタンプロット解析を行つ た。 図 9に示すように、 フィコリン Aは Ma s p-2にも s Ma pにも結合する ことが明らかとなった。 一方、 フィコリン Bは Ma s pにも s Ma pにも結合し ないことが確認された。 実施例 1 o
パクテリアに対する防御作用
フィコリン Aのバクテリアに対する防御作用を調べるために、 マウス血液中で の Staphylococcus aureusの増殖速度を測定した。 結果を図 1 O Aに示すように 、 まず、 F A C Sにより、 フィコリン Aが Staphylococcus aureusに結合するこ とを確認した。 この結合は、 部分的ではあるが、 G l c N A cの添加により阻害 された。 増殖実験は、 まず共存する M B Lの効果を除くために、 血液とマンナン ァガロースとインキュベートし、 次にこの血液にバクテリア （Staphylococcus aureus) を加え、 培養液の中で一定時間培養した。 その後、 一部を L B寒天培 地に播き、 3 7 °Cでー晚培養後に生じたコロニーをカウントした。 図 1 0 Bに示 すように、 コロニー数は 2時間までは低下したが、 3時間以降は指数関数的に増 加した。 また遺伝子型の異なる兄弟マウスを 1匹ずつ用い比較した結果、 マンナ ンァガロースにかけない未処理の血液では、 増殖速度に差はなかったが、 マンナ ンァガロースにかけた血液では、 全体として增殖速度が高くなつており、 さらに 欠損マウスでは有意に高い傾向にあった。 図 1 0 Cは、 7組の兄弟について検討 し平均をとつた結果を示す。 2時間の培養において、 欠損マウスは野生型マウス と比較し、 有意に高い増殖速度を示した。 この結果は、 欠損マウスの血液はバタ テリアの増殖を抑える能力において低下していることを示唆している。 産業上の利用可能性
本発明の非ヒト動物は、 非自己認識の異常、 レクチン経路の異常などにより生 じる疾患の研究に有用であり、 実験動物として上記疾患の予防 ·治療物質のスク リーユング等に利用できる。

Claims

請求の範囲
1. フィコリン A遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒ ト動物。
2. フィコリン A遺伝子の全部または一部が欠損または他の遺伝子により置換さ れた、 請求項 1に記載の非ヒ ト動物。
3. 非ヒ ト動物がげつ歯目動物である、 請求項 1または 2に記載の非ヒ ト動物。
4. げっ歯目動物がマウスである、 請求項 1から 3のいずれかに記載の非ヒ ト動 物。
5. 自然免疫異常モデルである、 請求項 1から 4のいずれかに記載の非ヒ ト動物 。
6. 以下の工程を含む請求項 1から 5のいずれかに記載の非ヒ ト動物の作製法： (1) フィコリン A遺伝子におけるコード領域が改変されている DNA分子を得 る工程、 （2) 工程 （1) で得られた DNA分子をマウス胚性幹細胞内でフィコ リン A遺伝子と相同的組換えをおこさせる工程、 および （3) 工程 （2) により 相同的組換えをおこさせたマウス胚性幹細胞を発生させマウス個体を得る工程。
7. 請求項 6に記載の非ヒ ト動物の作製法の作出方法において、 工程 （3) で得 られるマウス個体が、 相同的糸且換えをおこした細胞を体内の一部に含むキメラマ ウスであって、 該工程 （3) に引き続く以下の工程をさらに含む請求項 6に記載 の非ヒ ト動物の作製法： （a) 雄性キメラマウスと雌性野生型マウスを交配して 、 F 1世代のへテロ接合体マウスを産出させる工程、 及び （b) 工程 （a) で得 られた雄性及び雌性のへテロ接合体マウスを交配して、 F 2世代の、 破壊された フィコリン A遺伝子のホモ接合体マウスを得る工程。
8. 請求項 5に記載の非ヒ ト動物を用い、 生体防御機能の促進または抑制を測定 することを特徴とする、 生体防御機能の促進または抑制剤のスクリーニング方法 。
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