JP2002065110A - Ｉｉｉ型アレルギー炎症モデル動物 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｉ型アレルギーであるアナフィラキシーを発
症せず、III型アレルギーであるアルサス反応を特異的
に誘導することができ、Ｉ型アレルギーに影響されるこ
となく、III型アレルギー炎症のみを評価しうる実験モ
デル動物や、かかる実験モデル動物を用いたＦｃγＲII
Iを介したIII型アレルギー反応における反応促進又は抑
制物質のスクリーニング方法を提供すること。 【解決手段】 ＦｃγＲIIIを介した応答に対して抑制
性の働きをするＦｃγＲIIＢを排除するために、Ｌｙｎ
及びＦｃγＲIIＢの両分子の欠失変異がホモ接合体の状
態になっているマウス（Lyn-IIB-)をＬｙｎノックアウ
トマウス（Ｌｙｎ- /-）とＦｃγＲIIＢノックアウトマ
ウス（ＦｃγＲIIＢ-/-）を掛け合わせて作製し、全身
性受動アナフィラキシーにおけるＦｃγＲIII機能の欠
損や、骨髄由来肥満細胞におけるＦｃγＲIII機能の減
弱等を測定評価する。
症せず、III型アレルギーであるアルサス反応を特異的
に誘導することができ、Ｉ型アレルギーに影響されるこ
となく、III型アレルギー炎症のみを評価しうる実験モ
デル動物や、かかる実験モデル動物を用いたＦｃγＲII
Iを介したIII型アレルギー反応における反応促進又は抑
制物質のスクリーニング方法を提供すること。 【解決手段】 ＦｃγＲIIIを介した応答に対して抑制
性の働きをするＦｃγＲIIＢを排除するために、Ｌｙｎ
及びＦｃγＲIIＢの両分子の欠失変異がホモ接合体の状
態になっているマウス（Lyn-IIB-)をＬｙｎノックアウ
トマウス（Ｌｙｎ- /-）とＦｃγＲIIＢノックアウトマ
ウス（ＦｃγＲIIＢ-/-）を掛け合わせて作製し、全身
性受動アナフィラキシーにおけるＦｃγＲIII機能の欠
損や、骨髄由来肥満細胞におけるＦｃγＲIII機能の減
弱等を測定評価する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｉ型アレルギーで
あるアナフィラキシーを発症せず、III型アレルギーで
あるアルサス反応を特異的に誘導することができるIII
型アレルギー炎症の実験モデル動物や、かかる実験モデ
ル動物を用いるＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー反
応における反応促進又は抑制物質のスクリーニング方法
に関する。
あるアナフィラキシーを発症せず、III型アレルギーで
あるアルサス反応を特異的に誘導することができるIII
型アレルギー炎症の実験モデル動物や、かかる実験モデ
ル動物を用いるＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー反
応における反応促進又は抑制物質のスクリーニング方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫グロブリン（Ｉｇ）は、魚類から哺
乳類に至る全ての脊椎動物の体液中に存在し、リンパ系
細胞によって産生され、物理化学的性質や免疫学的性質
によって５つのクラス、すなわちＩｇＧ，ＩｇＭ，Ｉｇ
Ａ，ＩｇＤ及びＩｇＥに分類され、分子の基本構造は各
クラス共通で、分子量５〜７万のＨ鎖と分子量２．３万
のＬ鎖とから構成され、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，Ｉｇ
Ｄ，ＩｇＥに対応してγ，μ，α，δ，ε鎖と呼ばれる
構造のＨ鎖を有することが知られている。このＩｇ分子
をパパインで分解して得られるヒンジ部からＣ末端まで
のＨ鎖２本がＳ−Ｓ結合で結ばれているものはＦｃフラ
グメントと呼ばれ、このＦｃフラグメントが結合する細
胞表面上の受容体はＦｃレセプター（以下「ＦｃＲ」と
いう）と呼ばれている。これらＦｃＲは、細胞内のシグ
ナル伝達を導出して、リガンドである抗原−抗体複合体
によって、クロスリンクすることで数多くのエフェクタ
ーの応答を誘発する造血細胞表面分子のファミリーを構
成することが知られている。また、ＩｇのＦｃ領域に対
して親和性をもち細胞表面上に存在しているＦｃＲは、
抗体依存性細胞傷害反応、過敏性反応などの免疫応答に
関与することが知られている。
乳類に至る全ての脊椎動物の体液中に存在し、リンパ系
細胞によって産生され、物理化学的性質や免疫学的性質
によって５つのクラス、すなわちＩｇＧ，ＩｇＭ，Ｉｇ
Ａ，ＩｇＤ及びＩｇＥに分類され、分子の基本構造は各
クラス共通で、分子量５〜７万のＨ鎖と分子量２．３万
のＬ鎖とから構成され、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，Ｉｇ
Ｄ，ＩｇＥに対応してγ，μ，α，δ，ε鎖と呼ばれる
構造のＨ鎖を有することが知られている。このＩｇ分子
をパパインで分解して得られるヒンジ部からＣ末端まで
のＨ鎖２本がＳ−Ｓ結合で結ばれているものはＦｃフラ
グメントと呼ばれ、このＦｃフラグメントが結合する細
胞表面上の受容体はＦｃレセプター（以下「ＦｃＲ」と
いう）と呼ばれている。これらＦｃＲは、細胞内のシグ
ナル伝達を導出して、リガンドである抗原−抗体複合体
によって、クロスリンクすることで数多くのエフェクタ
ーの応答を誘発する造血細胞表面分子のファミリーを構
成することが知られている。また、ＩｇのＦｃ領域に対
して親和性をもち細胞表面上に存在しているＦｃＲは、
抗体依存性細胞傷害反応、過敏性反応などの免疫応答に
関与することが知られている。
【０００３】ＦｃＲには、体液中のＩｇＧのγ鎖に特異
的に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのε鎖に特異的
に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのα鎖に特異的に
結合するＦｃαＲ等の種類が知られている。これら免疫
担当細胞のＦｃレセプターは細胞機能と重要な関係があ
り、大部分のリンパ球、Ｔ細胞リンパ球の一部、単核
球、好中球、好塩基球、マクロファージ、肥満細胞（マ
スト細胞）及び血小板等に多く存在していることが知ら
れている。また、これらのレセプターは抗体に依存した
リンパ球機能に役割を果たすが、その固有の機能に関し
ては不明な点が多い。Ｆｃγレセプター（以下「Ｆｃγ
Ｒ」という）は遺伝子構造の類似性に基づいてタイプＩ
（ＣＤ６４抗原）、タイプII（ＣＤ３２抗原）、タイプ
III（ＣＤ１６抗原）の３種に大きく分類され、Ｆｃγ
ＲＩは、分子量７２ｋＤａの糖タンパク質であり、Ｉｇ
Ｇ単量体と高い親和性で結合し、単球とマクロファージ
に発現し、ＦｃγＲIIは、他のＦｃＲとは異なりＩｇＧ
単量体に対して低親和性であり、免疫複合体となった多
価ＩｇＧと結合し、単球、マクロファージ、多形核白血
球（ＰＭＮ）、マスト細胞、血小板、いくつかのＴ細胞
リンパ球及びいくつかのＢ細胞リンパ球を含む造血幹細
胞に広く発現し、またＦｃγＲIIIは、低親和性のＦｃ
γＲで、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、ＰＭ
Ｎ及びマスト細胞に発現することが、それぞれ知られて
いる。また、ＦｃγＲIIには遺伝子配列が異なるＦｃγ
ＲIIＡ、ＦｃγＲIIＢ及びＦｃγＲIIＣの３種類の受容
体が存在しており、いずれの染色体も１ｑ２３に位置し
ていることも知られている。
的に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのε鎖に特異的
に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのα鎖に特異的に
結合するＦｃαＲ等の種類が知られている。これら免疫
担当細胞のＦｃレセプターは細胞機能と重要な関係があ
り、大部分のリンパ球、Ｔ細胞リンパ球の一部、単核
球、好中球、好塩基球、マクロファージ、肥満細胞（マ
スト細胞）及び血小板等に多く存在していることが知ら
れている。また、これらのレセプターは抗体に依存した
リンパ球機能に役割を果たすが、その固有の機能に関し
ては不明な点が多い。Ｆｃγレセプター（以下「Ｆｃγ
Ｒ」という）は遺伝子構造の類似性に基づいてタイプＩ
（ＣＤ６４抗原）、タイプII（ＣＤ３２抗原）、タイプ
III（ＣＤ１６抗原）の３種に大きく分類され、Ｆｃγ
ＲＩは、分子量７２ｋＤａの糖タンパク質であり、Ｉｇ
Ｇ単量体と高い親和性で結合し、単球とマクロファージ
に発現し、ＦｃγＲIIは、他のＦｃＲとは異なりＩｇＧ
単量体に対して低親和性であり、免疫複合体となった多
価ＩｇＧと結合し、単球、マクロファージ、多形核白血
球（ＰＭＮ）、マスト細胞、血小板、いくつかのＴ細胞
リンパ球及びいくつかのＢ細胞リンパ球を含む造血幹細
胞に広く発現し、またＦｃγＲIIIは、低親和性のＦｃ
γＲで、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、ＰＭ
Ｎ及びマスト細胞に発現することが、それぞれ知られて
いる。また、ＦｃγＲIIには遺伝子配列が異なるＦｃγ
ＲIIＡ、ＦｃγＲIIＢ及びＦｃγＲIIＣの３種類の受容
体が存在しており、いずれの染色体も１ｑ２３に位置し
ていることも知られている。
【０００４】最近、これらＦｃＲ分子群に対するノック
アウトマウスが次々と作製され（Cell 75, 969-976, 19
93、Cell 76, 519-529, 1994、Nature 379, 346-349, 1
996、Immunity 5, 181-188, 1996、Nature 369, 753-75
6, 1994、J. Immunol. 152,3378-3390, 1994、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 91, 6835-6839, 1994）、いくつか
のＦｃＲの生理的機能の理解が進んでいる。また本発明
者らは、ＩｇＥの高親和性レセプターであるＦｃεＲＩ
に会合しているホモダイマー分子として単離同定された
ＦｃＲγ鎖に対するノックアウトマウスを作製している
（Cell, 76,519-529, 1994）。そして、このＦｃＲγ鎖
ノックアウトマウスは、少なくともＦｃγＲＩ、Ｆｃγ
ＲIII、ＦｃεＲＩの３種のＦｃＲの発現及び機能を失
っていることも知られている。
アウトマウスが次々と作製され（Cell 75, 969-976, 19
93、Cell 76, 519-529, 1994、Nature 379, 346-349, 1
996、Immunity 5, 181-188, 1996、Nature 369, 753-75
6, 1994、J. Immunol. 152,3378-3390, 1994、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 91, 6835-6839, 1994）、いくつか
のＦｃＲの生理的機能の理解が進んでいる。また本発明
者らは、ＩｇＥの高親和性レセプターであるＦｃεＲＩ
に会合しているホモダイマー分子として単離同定された
ＦｃＲγ鎖に対するノックアウトマウスを作製している
（Cell, 76,519-529, 1994）。そして、このＦｃＲγ鎖
ノックアウトマウスは、少なくともＦｃγＲＩ、Ｆｃγ
ＲIII、ＦｃεＲＩの３種のＦｃＲの発現及び機能を失
っていることも知られている。
【０００５】上記免疫細胞群に発現するＦｃＲは、抗体
依存性に様々な免疫・炎症反応を開始する分子である。
ＦｃＲは、複数の細胞種に重複して発現するため、個々
のＦｃＲの役割は、遺伝的にＦｃＲ発現を欠損する幾つ
かのマウスが作出されて始めて明らかとなった。現在、
ＦｃＲの役割は、生体防御のみならずアレルギー（Cell
75, 969-976, 1993、Cell 76, 519-529, 1994）、アル
サス反応（Science 265, 1095-1098, 1994、Immunity
5, 387-390）、リウマチ様関節炎（J. Exp. Med. 189,
187-194, 1999、J. Exp. Med. 191, 1611-1616, 200
0）、免疫性糸球体腎炎（Kidney Int. 54, 1166-1174,
1998、Eur. J. Immunol. 30, 1182-1190, 2000）、自己
免疫性血管炎（Blood 94, 3855-3863, 1999）、全身性
紅斑性狼創（Science 279, 1052-1054, 1998）、グット
パスチャー症候群（Goodpasture's；J. Exp. Med. 191,
899-906, 2000）など病気の成立にも関与することが明
らかにされている。また、上記変異マウスの知見より、
様々な免疫過程におけるＦｃＲの不可欠な役割も解明さ
れつつある（Annu. Rev. Immunol. 16, 421-432, 199
8、Annu. Rev. Immunol. 15, 203-234, 1997、Takai,
T., and J. V. Ravetch. 1998. Fc receptor genetics
and the manipulation of genes in the study ofFcR b
iology. In Immunoglobulin Receptors and their Phys
iological and Pathological Roles in Immunity. J.
G. J. van de Winkel nad P. Mark Hogarth,editors. K
luwer Academic Publishers, Netherland, 37-48）。
依存性に様々な免疫・炎症反応を開始する分子である。
ＦｃＲは、複数の細胞種に重複して発現するため、個々
のＦｃＲの役割は、遺伝的にＦｃＲ発現を欠損する幾つ
かのマウスが作出されて始めて明らかとなった。現在、
ＦｃＲの役割は、生体防御のみならずアレルギー（Cell
75, 969-976, 1993、Cell 76, 519-529, 1994）、アル
サス反応（Science 265, 1095-1098, 1994、Immunity
5, 387-390）、リウマチ様関節炎（J. Exp. Med. 189,
187-194, 1999、J. Exp. Med. 191, 1611-1616, 200
0）、免疫性糸球体腎炎（Kidney Int. 54, 1166-1174,
1998、Eur. J. Immunol. 30, 1182-1190, 2000）、自己
免疫性血管炎（Blood 94, 3855-3863, 1999）、全身性
紅斑性狼創（Science 279, 1052-1054, 1998）、グット
パスチャー症候群（Goodpasture's；J. Exp. Med. 191,
899-906, 2000）など病気の成立にも関与することが明
らかにされている。また、上記変異マウスの知見より、
様々な免疫過程におけるＦｃＲの不可欠な役割も解明さ
れつつある（Annu. Rev. Immunol. 16, 421-432, 199
8、Annu. Rev. Immunol. 15, 203-234, 1997、Takai,
T., and J. V. Ravetch. 1998. Fc receptor genetics
and the manipulation of genes in the study ofFcR b
iology. In Immunoglobulin Receptors and their Phys
iological and Pathological Roles in Immunity. J.
G. J. van de Winkel nad P. Mark Hogarth,editors. K
luwer Academic Publishers, Netherland, 37-48）。
【０００６】また、マスト細胞上のＦｃγＲIIIが、２
種の区別される免疫応答、ＩｇＧ依存性アナフィラキシ
ー（J. Clin. Invest. 99, 915-925, 1997、J. Clin. I
nvest. 99, 901-914, 1997、J. Exp. Med. 189, 1573-1
579, 1999）と受動的アルサス反応（Science 265, 1095
-1098, 1994、Immunity 5, 387-390、J. Exp. Med.184,
2385-2392, 1996、Immunity 5, 181-188, 1996、Eur.
J. Immunol. 30, 481-490, 2000）の開始に、中心的な
役割を果たしていることも報告されている。これらの免
疫応答モデルは、病気の発症時期と組織像の違いで互い
に区別されている。アナフィラキシーは、皮膚の浮腫や
全身性の血液供給不全（ショック）を抗原暴露直後に発
症するが、一方アルサス反応は、出血を伴う組織障害と
して、抗原暴露後数時間を経てから見られる。現在、こ
れらの特徴を示すモデルの病態成立は、炎症性メディエ
ーター、例えば、ヒスタミンやセロトニンなどの既存物
質や、アラキドン酸代謝物やサイトカインなどの新たに
合成される物質などの、時間限定的放出の結果として説
明されている。しかし、これらのモデルの病態成立に関
係する細胞内の機構は不明である。
種の区別される免疫応答、ＩｇＧ依存性アナフィラキシ
ー（J. Clin. Invest. 99, 915-925, 1997、J. Clin. I
nvest. 99, 901-914, 1997、J. Exp. Med. 189, 1573-1
579, 1999）と受動的アルサス反応（Science 265, 1095
-1098, 1994、Immunity 5, 387-390、J. Exp. Med.184,
2385-2392, 1996、Immunity 5, 181-188, 1996、Eur.
J. Immunol. 30, 481-490, 2000）の開始に、中心的な
役割を果たしていることも報告されている。これらの免
疫応答モデルは、病気の発症時期と組織像の違いで互い
に区別されている。アナフィラキシーは、皮膚の浮腫や
全身性の血液供給不全（ショック）を抗原暴露直後に発
症するが、一方アルサス反応は、出血を伴う組織障害と
して、抗原暴露後数時間を経てから見られる。現在、こ
れらの特徴を示すモデルの病態成立は、炎症性メディエ
ーター、例えば、ヒスタミンやセロトニンなどの既存物
質や、アラキドン酸代謝物やサイトカインなどの新たに
合成される物質などの、時間限定的放出の結果として説
明されている。しかし、これらのモデルの病態成立に関
係する細胞内の機構は不明である。
【０００７】他方、Ｌｙｎは、Ｓｒｃファミリーキナー
ゼに属し、ＩＴＡＭモチーフ（細胞内チロシンキナーゼ
のＳＨ２領域により認識され結合するアミノ酸配列）を
持つ様々な免疫受容体と会合し、細胞内シグナル伝達を
開始する機能を有することが知られている（Int. J. Bi
ochem. Cell. Biol. 29, 397-400, 1997、Annu. Rev.Im
munol. 17, 555-592, 1999）。最近のＬｙｎ欠損マウス
を使った研究では、個体内において、Ｂ細胞やマスト細
胞の正常機能にＬｙｎが必須の役割を果たすことが示さ
れている（Cell 83, 301-311, 1995、Immunity 3, 549-
560, 1995、Immunity 7, 69-81, 1997）。実際には、Ｌ
ｙｎ欠損マウスでは、ＩｇＥと抗原により惹起される皮
膚のアナフィラキシー反応が著明に障害されており、Ｆ
ｃεＲＩを介したシグナル伝達にはＬｙｎが重要な役割
を果たしている（J. Immunol.158, 2350-2355, 199
7）。
ゼに属し、ＩＴＡＭモチーフ（細胞内チロシンキナーゼ
のＳＨ２領域により認識され結合するアミノ酸配列）を
持つ様々な免疫受容体と会合し、細胞内シグナル伝達を
開始する機能を有することが知られている（Int. J. Bi
ochem. Cell. Biol. 29, 397-400, 1997、Annu. Rev.Im
munol. 17, 555-592, 1999）。最近のＬｙｎ欠損マウス
を使った研究では、個体内において、Ｂ細胞やマスト細
胞の正常機能にＬｙｎが必須の役割を果たすことが示さ
れている（Cell 83, 301-311, 1995、Immunity 3, 549-
560, 1995、Immunity 7, 69-81, 1997）。実際には、Ｌ
ｙｎ欠損マウスでは、ＩｇＥと抗原により惹起される皮
膚のアナフィラキシー反応が著明に障害されており、Ｆ
ｃεＲＩを介したシグナル伝達にはＬｙｎが重要な役割
を果たしている（J. Immunol.158, 2350-2355, 199
7）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、Ｓｒｃ
ファミリーに属するＬｙｎチロシンキナーゼは、ＦｃＲ
等の様々な受容体に機能的に会合し、細胞内情報伝達に
おいて重要な役割を果たしている。一方、自己免疫疾患
やアレルギー反応等の免疫複合体が関与する炎症反応に
おいて、マスト細胞等に発現しているＩｇＧのＦｃγＲ
の役割が注目されており、例えばＦｃγＲIIIは免疫複
合体を介してマスト細胞を活性化し、逆にＦｃγＲIIＢ
は抑制することがノックアウトマウスを用い研究によっ
て明らかにされている。しかし、通常はＦｃγＲIIＢが
抑制的に作用するためにIII型アレルギー炎症のみを評
価しうることはできなかった。本発明の課題は、Ｉ型ア
レルギーであるアナフィラキシーを発症せず、III型ア
レルギーであるアルサス反応を特異的に誘導することが
でき、Ｉ型アレルギーに影響されることなく、III型ア
レルギー炎症のみを評価しうる実験モデル動物や、かか
る実験モデル動物を用いたＦｃγＲIIIを介したIII型ア
レルギー反応における反応促進又は抑制物質のスクリー
ニング方法を提供することにある。
ファミリーに属するＬｙｎチロシンキナーゼは、ＦｃＲ
等の様々な受容体に機能的に会合し、細胞内情報伝達に
おいて重要な役割を果たしている。一方、自己免疫疾患
やアレルギー反応等の免疫複合体が関与する炎症反応に
おいて、マスト細胞等に発現しているＩｇＧのＦｃγＲ
の役割が注目されており、例えばＦｃγＲIIIは免疫複
合体を介してマスト細胞を活性化し、逆にＦｃγＲIIＢ
は抑制することがノックアウトマウスを用い研究によっ
て明らかにされている。しかし、通常はＦｃγＲIIＢが
抑制的に作用するためにIII型アレルギー炎症のみを評
価しうることはできなかった。本発明の課題は、Ｉ型ア
レルギーであるアナフィラキシーを発症せず、III型ア
レルギーであるアルサス反応を特異的に誘導することが
でき、Ｉ型アレルギーに影響されることなく、III型ア
レルギー炎症のみを評価しうる実験モデル動物や、かか
る実験モデル動物を用いたＦｃγＲIIIを介したIII型ア
レルギー反応における反応促進又は抑制物質のスクリー
ニング方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究し、ＦｃγＲIIIを介した応
答に対して抑制性の働きをするＦｃγＲIIＢを排除する
ために、ＬｙｎとＦｃγＲIIＢの２重欠損マウスを作製
し、全身性受動アナフィラキシーをＩｇＧ−免疫複合体
で誘導することにより、ＦｃγＲIIIの情報伝達の下流
においてＬｙｎの役割がどのような意味を持つのか検討
し、全身性受動アナフィラキシーはＬｙｎ要求性であ
り、逆受動アルサス反応はＬｙｎ非要求性であることか
ら、ＦｃγＲIIIを介したアレルギー応答につながる経
路には、Ｌｙｎ依存性と非依存性の２つの経路があり、
III型アレルギー反応におけるＬｙｎ非依存性経路の機
能性に着目し、本発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意研究し、ＦｃγＲIIIを介した応
答に対して抑制性の働きをするＦｃγＲIIＢを排除する
ために、ＬｙｎとＦｃγＲIIＢの２重欠損マウスを作製
し、全身性受動アナフィラキシーをＩｇＧ−免疫複合体
で誘導することにより、ＦｃγＲIIIの情報伝達の下流
においてＬｙｎの役割がどのような意味を持つのか検討
し、全身性受動アナフィラキシーはＬｙｎ要求性であ
り、逆受動アルサス反応はＬｙｎ非要求性であることか
ら、ＦｃγＲIIIを介したアレルギー応答につながる経
路には、Ｌｙｎ依存性と非依存性の２つの経路があり、
III型アレルギー反応におけるＬｙｎ非依存性経路の機
能性に着目し、本発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち本発明は、Ｉ型アレルギーである
アナフィラキシーを発症せず、III型アレルギーである
アルサス反応を特異的に誘導することを特徴とするIII
型アレルギー炎症モデル非ヒト動物（請求項１）や、Ｌ
ｙｎ及びＦｃγIIＢの遺伝子機能が染色体上で欠損して
いることを特徴とする請求項１記載のIII型アレルギー
炎症モデル非ヒト動物（請求項２）や、非ヒト動物が齧
歯目動物であることを特徴とする請求項１又は２記載の
III型アレルギー炎症モデル非ヒト動物（請求項３）
や、齧歯目動物がマウスであることを特徴とする請求項
１〜３のいずれか記載のIII型アレルギー炎症モデル非
ヒト動物（請求項４）に関する。
アナフィラキシーを発症せず、III型アレルギーである
アルサス反応を特異的に誘導することを特徴とするIII
型アレルギー炎症モデル非ヒト動物（請求項１）や、Ｌ
ｙｎ及びＦｃγIIＢの遺伝子機能が染色体上で欠損して
いることを特徴とする請求項１記載のIII型アレルギー
炎症モデル非ヒト動物（請求項２）や、非ヒト動物が齧
歯目動物であることを特徴とする請求項１又は２記載の
III型アレルギー炎症モデル非ヒト動物（請求項３）
や、齧歯目動物がマウスであることを特徴とする請求項
１〜３のいずれか記載のIII型アレルギー炎症モデル非
ヒト動物（請求項４）に関する。
【００１１】また本発明は、請求項１〜４のいずれか記
載のIII型アレルギー炎症モデル非ヒト動物に被検物質
を投与し、該非ヒト動物におけるＦｃγＲIII機能を測
定・評価することを特徴とするＦｃγＲIIIを介したIII
型アレルギー反応における反応促進又は抑制物質のスク
リーニング方法（請求項５）や、非ヒト動物におけるＦ
ｃγＲIII機能の測定・評価が、全身性受動アナフィラ
キシー応答強度を指標とした、抗原投与時以降の直腸内
温度の測定・評価であることを特徴とする請求項５記載
のＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー反応における反
応促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項６）
や、請求項１〜４のいずれか記載のIII型アレルギー炎
症モデル非ヒト動物由来の骨髄細胞から誘導した骨髄由
来肥満細胞を生体外で被検物質と接触させ、該骨髄由来
肥満細胞におけるＦｃγＲIII機能を測定・評価するこ
とを特徴とするＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー反
応における反応促進又は抑制物質のスクリーニング方法
（請求項７）や、骨髄由来肥満細胞におけるＦｃγＲII
I機能の測定・評価が、肥満細胞の脱顆粒能、肥満細胞
の細胞質内カルシウム動態、又は肥満細胞の全タンパク
質チロシンリン酸化の測定・評価であることを特徴とす
る請求項７記載のＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー
反応における反応促進又は抑制物質のスクリーニング方
法（請求項８）や、請求項１〜４のいずれか記載のIII
型アレルギー炎症モデル非ヒト動物と、ＦｃγIIＢの遺
伝子機能が染色体上で欠損している非ヒト動物とを用い
ることを特徴とする請求項５〜８のいずれか記載のＦｃ
γＲIIIを介したIII型アレルギー反応における反応促進
又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項９）や、請
求項５〜９のいずれか記載のＦｃγＲIIIを介したIII型
アレルギー反応における反応促進又は抑制物質のスクリ
ーニング方法により得られた抑制物質を有効成分とする
ことを特徴とするIII型アレルギー反応に起因する疾病
の治療薬（請求項１０）に関する。
載のIII型アレルギー炎症モデル非ヒト動物に被検物質
を投与し、該非ヒト動物におけるＦｃγＲIII機能を測
定・評価することを特徴とするＦｃγＲIIIを介したIII
型アレルギー反応における反応促進又は抑制物質のスク
リーニング方法（請求項５）や、非ヒト動物におけるＦ
ｃγＲIII機能の測定・評価が、全身性受動アナフィラ
キシー応答強度を指標とした、抗原投与時以降の直腸内
温度の測定・評価であることを特徴とする請求項５記載
のＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー反応における反
応促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項６）
や、請求項１〜４のいずれか記載のIII型アレルギー炎
症モデル非ヒト動物由来の骨髄細胞から誘導した骨髄由
来肥満細胞を生体外で被検物質と接触させ、該骨髄由来
肥満細胞におけるＦｃγＲIII機能を測定・評価するこ
とを特徴とするＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー反
応における反応促進又は抑制物質のスクリーニング方法
（請求項７）や、骨髄由来肥満細胞におけるＦｃγＲII
I機能の測定・評価が、肥満細胞の脱顆粒能、肥満細胞
の細胞質内カルシウム動態、又は肥満細胞の全タンパク
質チロシンリン酸化の測定・評価であることを特徴とす
る請求項７記載のＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー
反応における反応促進又は抑制物質のスクリーニング方
法（請求項８）や、請求項１〜４のいずれか記載のIII
型アレルギー炎症モデル非ヒト動物と、ＦｃγIIＢの遺
伝子機能が染色体上で欠損している非ヒト動物とを用い
ることを特徴とする請求項５〜８のいずれか記載のＦｃ
γＲIIIを介したIII型アレルギー反応における反応促進
又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項９）や、請
求項５〜９のいずれか記載のＦｃγＲIIIを介したIII型
アレルギー反応における反応促進又は抑制物質のスクリ
ーニング方法により得られた抑制物質を有効成分とする
ことを特徴とするIII型アレルギー反応に起因する疾病
の治療薬（請求項１０）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明のIII型アレルギー炎症モ
デル非ヒト動物としては、Ｉ型アレルギーであるアナフ
ィラキシーを発症せず、III型アレルギーであるアルサ
ス反応を特異的に誘導する非ヒト動物であれば、特に制
限されるものではなく、例えば、Ｌｙｎ及びＦｃγIIＢ
の遺伝子機能が共に染色体上で欠損している非ヒト動物
を具体的に例示することができ、ここでＬｙｎ及びＦｃ
γIIＢの遺伝子機能が共に染色体上で欠損している非ヒ
ト動物とは、例えばＬｙｎやＦｃγIIＢをコードする非
ヒト動物の内在性遺伝子の一部もしくは全部が破壊・欠
損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、野生型に
おいてＬｙｎ及びＦｃγIIＢを発現する機能を失なった
非ヒト動物等をいう。また本発明における非ヒト動物と
しては、マウス、ラット、モルモット等の齧歯目動物を
具体的に挙げることができるが、これらに限定されるも
のではない。以下、Ｌｙｎ及びＦｃγIIＢの遺伝子機能
が共に染色体上で欠損している非ヒト動物の作製方法
を、Ｌｙｎ及びＦｃγIIＢの遺伝子機能が共に染色体上
で欠損したマウスを例にとって説明する。
デル非ヒト動物としては、Ｉ型アレルギーであるアナフ
ィラキシーを発症せず、III型アレルギーであるアルサ
ス反応を特異的に誘導する非ヒト動物であれば、特に制
限されるものではなく、例えば、Ｌｙｎ及びＦｃγIIＢ
の遺伝子機能が共に染色体上で欠損している非ヒト動物
を具体的に例示することができ、ここでＬｙｎ及びＦｃ
γIIＢの遺伝子機能が共に染色体上で欠損している非ヒ
ト動物とは、例えばＬｙｎやＦｃγIIＢをコードする非
ヒト動物の内在性遺伝子の一部もしくは全部が破壊・欠
損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、野生型に
おいてＬｙｎ及びＦｃγIIＢを発現する機能を失なった
非ヒト動物等をいう。また本発明における非ヒト動物と
しては、マウス、ラット、モルモット等の齧歯目動物を
具体的に挙げることができるが、これらに限定されるも
のではない。以下、Ｌｙｎ及びＦｃγIIＢの遺伝子機能
が共に染色体上で欠損している非ヒト動物の作製方法
を、Ｌｙｎ及びＦｃγIIＢの遺伝子機能が共に染色体上
で欠損したマウスを例にとって説明する。
【００１３】まず、Ｌｙｎ遺伝子機能が染色体上で欠損
したマウス、すなわちＬｙｎノックアウトマウス（Ｌｙ
ｎ-/-）を作製する。Ｌｙｎノックアウトマウスは、文
献（Immunity 3, 549-560, 1995）に記載する方法等に
よって作製することができる。具体的には、マウス遺伝
子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝
子断片を用いて、Ｌｙｎ遺伝子をスクリーニングし、ス
クリーニングされたＬｙｎ遺伝子を組換えＤＮＡ技術に
より、Ｌｙｎ遺伝子の一部又は全部を、例えばネオマイ
シン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子で置換し、５′末端
側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺
伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳ
Ｖ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティング
ベクターを作製し、この作製されたターゲッティングベ
クターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿
孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行
い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシク
ロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細
胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組
換え体かどうかをサザンブロット法等により確認するこ
とが好ましい。
したマウス、すなわちＬｙｎノックアウトマウス（Ｌｙ
ｎ-/-）を作製する。Ｌｙｎノックアウトマウスは、文
献（Immunity 3, 549-560, 1995）に記載する方法等に
よって作製することができる。具体的には、マウス遺伝
子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝
子断片を用いて、Ｌｙｎ遺伝子をスクリーニングし、ス
クリーニングされたＬｙｎ遺伝子を組換えＤＮＡ技術に
より、Ｌｙｎ遺伝子の一部又は全部を、例えばネオマイ
シン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子で置換し、５′末端
側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺
伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳ
Ｖ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティング
ベクターを作製し、この作製されたターゲッティングベ
クターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿
孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行
い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシク
ロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細
胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組
換え体かどうかをサザンブロット法等により確認するこ
とが好ましい。
【００１４】上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中に
マイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマ
ウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウ
スを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウ
スを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを
交配させることによって、Ｌｙｎノックアウトマウスを
得ることができる。そして、かかるＬｙｎノックアウト
マウスにおけるＬｙｎ遺伝子機能が染色体上で欠損して
いることを確認する方法としては、例えば、上記の方法
により得られたマウスの尾端の一部からＤＮＡを分離し
てサザンブロット法等により調べたり、このマウスの骨
髄細胞等からＲＮＡを単離してノーザンブロット法等に
より調べたり、またこのマウスのＬｙｎの発現をウエス
タンブロット法等により調べる方法を挙げることができ
る。
マイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマ
ウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウ
スを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウ
スを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを
交配させることによって、Ｌｙｎノックアウトマウスを
得ることができる。そして、かかるＬｙｎノックアウト
マウスにおけるＬｙｎ遺伝子機能が染色体上で欠損して
いることを確認する方法としては、例えば、上記の方法
により得られたマウスの尾端の一部からＤＮＡを分離し
てサザンブロット法等により調べたり、このマウスの骨
髄細胞等からＲＮＡを単離してノーザンブロット法等に
より調べたり、またこのマウスのＬｙｎの発現をウエス
タンブロット法等により調べる方法を挙げることができ
る。
【００１５】Ｌｙｎノックアウトマウス同様に、Ｆｃγ
ＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわ
ちＦｃγＲIIＢノックアウトマウスを作製する。Ｆｃγ
ＲIIＢノックアウトマウス（ＦｃγＲIIＢ-/-）は、文
献（Nature 379, 346-349, 1996）に記載する方法や、
上記Ｌｙｎノックアウトマウスの作製方法と同様な方法
等によって作製することができる。
ＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわ
ちＦｃγＲIIＢノックアウトマウスを作製する。Ｆｃγ
ＲIIＢノックアウトマウス（ＦｃγＲIIＢ-/-）は、文
献（Nature 379, 346-349, 1996）に記載する方法や、
上記Ｌｙｎノックアウトマウスの作製方法と同様な方法
等によって作製することができる。
【００１６】Ｌｙｎ及びＦｃγIIＢの遺伝子機能が共に
染色体上で欠損したダブルノックアウトマウス、すなわ
ちＬｙｎ及びＦｃγＲIIＢの両分子の欠失変異がホモ接
合体の状態になっているマウス（Lyn-IIB-)は、上記Ｌ
ｙｎノックアウトマウス（Ｌｙｎ-/-）とＦｃγＲIIＢ
ノックアウトマウス（ＦｃγＲIIＢ-/-）系統のマウス
を掛け合わせて作製することができる。また、本発明に
おけるＦｃγIIＢの遺伝子機能が染色体上で欠損してい
るマウスとして、上記ＦｃγＲIIＢノックアウトマウス
（ＦｃγＲIIＢ-/-）、好ましくはダブルノックアウト
マウス（Lyn-IIB-)と同腹子のＬｙｎ+/-ＦｃγＲIIＢ
-/-マウス（IIB-）を例示することができる。
染色体上で欠損したダブルノックアウトマウス、すなわ
ちＬｙｎ及びＦｃγＲIIＢの両分子の欠失変異がホモ接
合体の状態になっているマウス（Lyn-IIB-)は、上記Ｌ
ｙｎノックアウトマウス（Ｌｙｎ-/-）とＦｃγＲIIＢ
ノックアウトマウス（ＦｃγＲIIＢ-/-）系統のマウス
を掛け合わせて作製することができる。また、本発明に
おけるＦｃγIIＢの遺伝子機能が染色体上で欠損してい
るマウスとして、上記ＦｃγＲIIＢノックアウトマウス
（ＦｃγＲIIＢ-/-）、好ましくはダブルノックアウト
マウス（Lyn-IIB-)と同腹子のＬｙｎ+/-ＦｃγＲIIＢ
-/-マウス（IIB-）を例示することができる。
【００１７】本発明におけるＦｃγＲIIIを介したIII型
アレルギー反応における反応促進又は抑制物質のスクリ
ーニング方法としては、本発明のＩ型アレルギーである
アナフィラキシーを発症せず、III型アレルギーである
アルサス反応を特異的に誘導するIII型アレルギー炎症
モデル非ヒト動物、例えば上記ダブルノックアウトマウ
ス（Lyn-IIB-)に被検物質を投与し、該非ヒト動物にお
けるＦｃγＲIII機能を測定・評価するスクリーニング
方法や、本発明のＩ型アレルギーであるアナフィラキシ
ーを発症せず、III型アレルギーであるアルサス反応を
特異的に誘導するIII型アレルギー炎症モデル非ヒト動
物、例えば上記ダブルノックアウトマウス（Lyn-IIB-)
由来の骨髄細胞から誘導した骨髄由来肥満細胞を生体外
で被検物質と接触させ、該骨髄由来肥満細胞におけるＦ
ｃγＲIII機能を測定・評価するスクリーニング方法で
あれば特に制限されるものではないが、スクリーニング
に際して、ＦｃγＲIII機能の程度をＦｃγIIＢの遺伝
子機能が染色体上で欠損している非ヒト動物、例えば前
記ＦｃγＲIIＢノックアウトマウス（ＦｃγＲII
Ｂ-/-）、好ましくはダブルノックアウトマウス（Lyn-I
IB-)と同腹子のＬｙｎ+/-ＦｃγＲIIＢ-/-マウス（II
B-）と比較評価することが好ましい。
アレルギー反応における反応促進又は抑制物質のスクリ
ーニング方法としては、本発明のＩ型アレルギーである
アナフィラキシーを発症せず、III型アレルギーである
アルサス反応を特異的に誘導するIII型アレルギー炎症
モデル非ヒト動物、例えば上記ダブルノックアウトマウ
ス（Lyn-IIB-)に被検物質を投与し、該非ヒト動物にお
けるＦｃγＲIII機能を測定・評価するスクリーニング
方法や、本発明のＩ型アレルギーであるアナフィラキシ
ーを発症せず、III型アレルギーであるアルサス反応を
特異的に誘導するIII型アレルギー炎症モデル非ヒト動
物、例えば上記ダブルノックアウトマウス（Lyn-IIB-)
由来の骨髄細胞から誘導した骨髄由来肥満細胞を生体外
で被検物質と接触させ、該骨髄由来肥満細胞におけるＦ
ｃγＲIII機能を測定・評価するスクリーニング方法で
あれば特に制限されるものではないが、スクリーニング
に際して、ＦｃγＲIII機能の程度をＦｃγIIＢの遺伝
子機能が染色体上で欠損している非ヒト動物、例えば前
記ＦｃγＲIIＢノックアウトマウス（ＦｃγＲII
Ｂ-/-）、好ましくはダブルノックアウトマウス（Lyn-I
IB-)と同腹子のＬｙｎ+/-ＦｃγＲIIＢ-/-マウス（II
B-）と比較評価することが好ましい。
【００１８】上記非ヒト動物におけるＦｃγＲIII機能
を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を生
体内に投与する場合は、全身性受動アナフィラキシー応
答強度を指標とした、抗原投与時以降の直腸内温度を測
定・評価する方法や、組織内の好酸球や肥満細胞等から
放出される顆粒内に含まれる物質を、ＥＬＩＳＡやウエ
スタンブロット等により測定・評価する方法などを挙げ
ることができ、被検物質を骨髄由来肥満細胞と生体外で
接触させる場合は、かかる肥満細胞における脱顆粒能、
肥満細胞における細胞質内カルシウム動態、肥満細胞の
全タンパク質チロシンリン酸化等を測定・評価する方法
などを挙げることができる。
を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を生
体内に投与する場合は、全身性受動アナフィラキシー応
答強度を指標とした、抗原投与時以降の直腸内温度を測
定・評価する方法や、組織内の好酸球や肥満細胞等から
放出される顆粒内に含まれる物質を、ＥＬＩＳＡやウエ
スタンブロット等により測定・評価する方法などを挙げ
ることができ、被検物質を骨髄由来肥満細胞と生体外で
接触させる場合は、かかる肥満細胞における脱顆粒能、
肥満細胞における細胞質内カルシウム動態、肥満細胞の
全タンパク質チロシンリン酸化等を測定・評価する方法
などを挙げることができる。
【００１９】本発明のスクリーニング方法により得られ
る、ＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー反応における
反応促進又は抑制物質の候補物質としては、ＦｃγＲII
Iに対するアゴニスト及びアンタゴニスト、Ｌｙｎに依
存しないシグナル伝達経路に対して作用を有するタンパ
ク質・ペプチド等を挙げることができる。また、本発明
のIII型アレルギー反応に起因する疾病の治療薬として
は、前記いずれか記載のＦｃγＲIIIを介したIII型アレ
ルギー反応における反応促進又は抑制物質のスクリーニ
ング方法により得ることができる抑制物質を有効成分と
するものであれば特に制限されるものではなく、かかる
治療薬を哺乳動物等に適宜方法で投与することにより、
III型アレルギー反応に起因する疾病、例えば血清病、
糸球体腎炎、ループス腎炎、過敏性肺臓炎等を治療する
ことができる。
る、ＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー反応における
反応促進又は抑制物質の候補物質としては、ＦｃγＲII
Iに対するアゴニスト及びアンタゴニスト、Ｌｙｎに依
存しないシグナル伝達経路に対して作用を有するタンパ
ク質・ペプチド等を挙げることができる。また、本発明
のIII型アレルギー反応に起因する疾病の治療薬として
は、前記いずれか記載のＦｃγＲIIIを介したIII型アレ
ルギー反応における反応促進又は抑制物質のスクリーニ
ング方法により得ることができる抑制物質を有効成分と
するものであれば特に制限されるものではなく、かかる
治療薬を哺乳動物等に適宜方法で投与することにより、
III型アレルギー反応に起因する疾病、例えば血清病、
糸球体腎炎、ループス腎炎、過敏性肺臓炎等を治療する
ことができる。
【００２０】
【実施例】以下に、実施例を掲げて本発明を具体的に説
明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限
定されるものではない。 実施例Ａ［材料と方法］ Ａ−１（マウス） すべての実験において、特定の病原体に関して無感染で
ある状況において飼育している７週齢から１２週齢のマ
ウスを使用した。Ｌｙｎ及びＦｃγＲIIＢの両分子の欠
失変異がホモ接合体の状態になっているマウス（Lyn-II
B-)は、Ｌｙｎ- /-（Immunity 3, 549-560, 1995）とＦ
ｃγＲIIＢ-/-（Nature 379, 346-349, 1996）系統のマ
ウスを掛け合わせて作製した。また、同腹子のＬｙｎ
+/-ＦｃγＲIIＢ-/-マウス（IIB-）を上記Ｌｙｎ-/-Ｆ
ｃγＲIIＢ-/-マウス（Lyn-IIB-）のコントロールとし
て用いた。
明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限
定されるものではない。 実施例Ａ［材料と方法］ Ａ−１（マウス） すべての実験において、特定の病原体に関して無感染で
ある状況において飼育している７週齢から１２週齢のマ
ウスを使用した。Ｌｙｎ及びＦｃγＲIIＢの両分子の欠
失変異がホモ接合体の状態になっているマウス（Lyn-II
B-)は、Ｌｙｎ- /-（Immunity 3, 549-560, 1995）とＦ
ｃγＲIIＢ-/-（Nature 379, 346-349, 1996）系統のマ
ウスを掛け合わせて作製した。また、同腹子のＬｙｎ
+/-ＦｃγＲIIＢ-/-マウス（IIB-）を上記Ｌｙｎ-/-Ｆ
ｃγＲIIＢ-/-マウス（Lyn-IIB-）のコントロールとし
て用いた。
【００２１】Ａ−２（細胞と抗体） 骨髄由来肥満細胞（ＢＭＭＣｓ）は、骨髄細胞をＲＰＭ
Ｉ１６４０［最終濃度で、５ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−
３（R&D Systems Inc, Minneapolis, MN）、１０％の非
動化ウシ胎児血清、非必須アミノ酸溶液（GIBCO-BRL, G
rand Island, NY）、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、
１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０μＭの２
−メルカプトエタノールを含有］で培養することにより
誘導した。マウス抗トリニトロフェニルハプテン（ＴＮ
Ｐ）ＩｇＥ（ＩＧＥＬａ２；American Type Culture Co
llection）とマウス抗−ＴＮＰ ＩｇＧ１（Ｇ１；Cell.
Immunol. 145, 299-310, 1992）に関しては、それぞれ
のハイブリドーマ培養上清をＤＥＡＥ−セルロースカラ
ムクロマトグラフィーにより精製した。ラット抗マウス
ＦｃγＲII／III（２．４Ｇ２, PharMigen, San Diego,
CA）、ウサギＩｇＧ抗卵白アルブミン（ＯＶＡ；Sigm
a, St Louis, MO）、ヤギ抗ラットＩｇＧのＦ(ａｂ′)2
フラグメント（Immunotech, Cedex, France）及び抗リ
ン酸化チロシン抗体（４Ｇ１０；upstate Biotechnolog
y, Lake Placid, NY）は購入したものを使用した。
Ｉ１６４０［最終濃度で、５ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−
３（R&D Systems Inc, Minneapolis, MN）、１０％の非
動化ウシ胎児血清、非必須アミノ酸溶液（GIBCO-BRL, G
rand Island, NY）、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、
１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０μＭの２
−メルカプトエタノールを含有］で培養することにより
誘導した。マウス抗トリニトロフェニルハプテン（ＴＮ
Ｐ）ＩｇＥ（ＩＧＥＬａ２；American Type Culture Co
llection）とマウス抗−ＴＮＰ ＩｇＧ１（Ｇ１；Cell.
Immunol. 145, 299-310, 1992）に関しては、それぞれ
のハイブリドーマ培養上清をＤＥＡＥ−セルロースカラ
ムクロマトグラフィーにより精製した。ラット抗マウス
ＦｃγＲII／III（２．４Ｇ２, PharMigen, San Diego,
CA）、ウサギＩｇＧ抗卵白アルブミン（ＯＶＡ；Sigm
a, St Louis, MO）、ヤギ抗ラットＩｇＧのＦ(ａｂ′)2
フラグメント（Immunotech, Cedex, France）及び抗リ
ン酸化チロシン抗体（４Ｇ１０；upstate Biotechnolog
y, Lake Placid, NY）は購入したものを使用した。
【００２２】Ａ−３（全身性受動アナフィラキシーの誘
導） ２０μｇの抗ＴＮＰ ＩｇＧまたは２０μｇの抗ＴＮＰ
ＩｇＥを、Ａ−１で作製したそれぞれのマウス［Ｌｙｎ
-/-ＦｃγＲIIＢ-/-（Lyn-IIB-）及びＬｙｎ+/ -Ｆｃγ
ＲIIＢ-/-（IIB-）］に静脈注射することにより感作し
た。感作から３０分後（ＩｇＧ感作）もしくは２４時間
後（ＩｇＥ感作）に、１ｍｇのＴＮＰ結合ＯＶＡを１０
０ｍｌのＰＢＳに溶解した溶液を静脈注射することによ
り全身性受動アナフィラキシーを誘導した。コントロー
ルは、誘導時にＴＮＰ−ＯＶＡの代わりに同量のＯＶＡ
により全身性受動アナフィラキシーを誘導した。誘導
後、温度センサーのプローブがついたデジタル温度計
（Natume Seisakusyo Co., Osaka, Japan）により経時
的に直腸内温度を計測した。
導） ２０μｇの抗ＴＮＰ ＩｇＧまたは２０μｇの抗ＴＮＰ
ＩｇＥを、Ａ−１で作製したそれぞれのマウス［Ｌｙｎ
-/-ＦｃγＲIIＢ-/-（Lyn-IIB-）及びＬｙｎ+/ -Ｆｃγ
ＲIIＢ-/-（IIB-）］に静脈注射することにより感作し
た。感作から３０分後（ＩｇＧ感作）もしくは２４時間
後（ＩｇＥ感作）に、１ｍｇのＴＮＰ結合ＯＶＡを１０
０ｍｌのＰＢＳに溶解した溶液を静脈注射することによ
り全身性受動アナフィラキシーを誘導した。コントロー
ルは、誘導時にＴＮＰ−ＯＶＡの代わりに同量のＯＶＡ
により全身性受動アナフィラキシーを誘導した。誘導
後、温度センサーのプローブがついたデジタル温度計
（Natume Seisakusyo Co., Osaka, Japan）により経時
的に直腸内温度を計測した。
【００２３】Ａ−４（脱顆粒とサイトカイン放出） ＢＭＭＣｓ（５×１０4ｃｅｌｌ）を６．６μＣｉ／ｍ
ｌの5-[1,2-3H]-hydroxytryptamine creatinine sulfat
e（Amersham Pharmacia Biotech）で１６時間ラベル
し、残り３０分間前に５μｇ／ｍｌの２．４Ｇ２又は１
μｇ／ｍｌのマウス抗ＴＮＰ ＩｇＥを加え、これらの
ＢＭＭＣｓを感作した。ＢＭＭＣｓに結合しなかった抗
体を除去した後、０．３〜１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ラッ
トＩｇＧ Ｆ（ａｂ′)2フラグメント又は０．０３〜３
０ｎｇ／ｍｌのＴＮＰ−ＯＶＡを添加し１時間刺激させ
た。セロトニン遊離率（％脱顆粒）は以前の報告（Cell
76, 519-529, 1994）と同様に計算した。サイトカイン
放出については、ラベルしていないＢＭＭＣｓを上記と
同様の方法により刺激した。刺激後、１２時間又は６時
間後の培養上清を用いて、それぞれＩＬ−４又はＴＮＦ
−αの放出を測定した。サイトカインの放出量はＥＬＩ
ＳＡ（Endogen, Inc., Woburn, MA）を用いて測定し
た。
ｌの5-[1,2-3H]-hydroxytryptamine creatinine sulfat
e（Amersham Pharmacia Biotech）で１６時間ラベル
し、残り３０分間前に５μｇ／ｍｌの２．４Ｇ２又は１
μｇ／ｍｌのマウス抗ＴＮＰ ＩｇＥを加え、これらの
ＢＭＭＣｓを感作した。ＢＭＭＣｓに結合しなかった抗
体を除去した後、０．３〜１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ラッ
トＩｇＧ Ｆ（ａｂ′)2フラグメント又は０．０３〜３
０ｎｇ／ｍｌのＴＮＰ−ＯＶＡを添加し１時間刺激させ
た。セロトニン遊離率（％脱顆粒）は以前の報告（Cell
76, 519-529, 1994）と同様に計算した。サイトカイン
放出については、ラベルしていないＢＭＭＣｓを上記と
同様の方法により刺激した。刺激後、１２時間又は６時
間後の培養上清を用いて、それぞれＩＬ−４又はＴＮＦ
−αの放出を測定した。サイトカインの放出量はＥＬＩ
ＳＡ（Endogen, Inc., Woburn, MA）を用いて測定し
た。
【００２４】Ａ−５（細胞質内カルシウム動態） ２μＭのFura-2/acetoxymethyl ester（Molecular Prob
es, Eugene, OR）によりラベルしたＢＭＭＣｓを２５℃
で１０分間の条件で２μｇ／ｍｌのビオチン結合マウス
抗ＴＮＰ ＩｇＥもしくは５μｇ／ｍｌのビオチン結合
２．４Ｇ２により感作した。結合しなかった抗体を除去
した後、１ｍＭのＣａＣｌ2と１ｍＭのＭｇＣｌ2を含む
２ｍｌのＰＢＳ中で上記感作した細胞を１０μｇのスト
レプトアビジン（Wako Pure Chemicals, Osaka, Japa
n）により刺激した。細胞質内カルシウム動態は、蛍光
吸光度計（Hitachi model F4500, Hitachi Ldt., Toky
o,Japan）を用いて、３４０と３６０ｎｍの励起を５１
０ｎｍのエミッション波長で測定した。カルシウム濃度
の測定と換算は文献（J. Biol. Chem. 260, 3440-345
0）記載の方法に準じて行った。
es, Eugene, OR）によりラベルしたＢＭＭＣｓを２５℃
で１０分間の条件で２μｇ／ｍｌのビオチン結合マウス
抗ＴＮＰ ＩｇＥもしくは５μｇ／ｍｌのビオチン結合
２．４Ｇ２により感作した。結合しなかった抗体を除去
した後、１ｍＭのＣａＣｌ2と１ｍＭのＭｇＣｌ2を含む
２ｍｌのＰＢＳ中で上記感作した細胞を１０μｇのスト
レプトアビジン（Wako Pure Chemicals, Osaka, Japa
n）により刺激した。細胞質内カルシウム動態は、蛍光
吸光度計（Hitachi model F4500, Hitachi Ldt., Toky
o,Japan）を用いて、３４０と３６０ｎｍの励起を５１
０ｎｍのエミッション波長で測定した。カルシウム濃度
の測定と換算は文献（J. Biol. Chem. 260, 3440-345
0）記載の方法に準じて行った。
【００２５】Ａ−６（免疫ブロット解析） ２．４Ｇ２もしくはビオチン結合マウスＩｇＥにより感
作したＢＭＭＣｓ（１×１０6）を１ｍＭのＣａＣｌ2及
び１ｍＭのＭｇＣｌ2を含む１００μｌのＰＢＳに懸濁
し、それぞれの懸濁液に３０μｇ／ｍｌのヤギ抗ラット
ＩｇＧ Ｆ（ａｂ′)2フラグメント又は５μｇ／ｍｌの
ストレプトアビジンを添加し、３７℃の条件下で０．
５、１又は５分間処理した。これらの処理は、同量の氷
冷した可溶化溶液（５０ｍＭのTris-HCl（pH 7.4）、１
％のNonident P-40、１３７ｍＭのNaCl、２ｍＭのEDT
A、５０ｍＭのNaF、２ｍＭのNaVO4、１ｍＭのphenylmet
hylsulfonyl、１０ｍｇ／ｍｌのaprotinin、５ｍｇ／ｍ
ｌのleupeptine、２ｍｇ／ｍｌのpepstatin）を加える
ことにより終了とした。核分画を取り除いた細胞溶解液
はタンパク質のリン酸化の検討に用いた。免疫ブロット
には抗リン酸化チロシン抗体（４Ｇ１０）を用いて行っ
た。
作したＢＭＭＣｓ（１×１０6）を１ｍＭのＣａＣｌ2及
び１ｍＭのＭｇＣｌ2を含む１００μｌのＰＢＳに懸濁
し、それぞれの懸濁液に３０μｇ／ｍｌのヤギ抗ラット
ＩｇＧ Ｆ（ａｂ′)2フラグメント又は５μｇ／ｍｌの
ストレプトアビジンを添加し、３７℃の条件下で０．
５、１又は５分間処理した。これらの処理は、同量の氷
冷した可溶化溶液（５０ｍＭのTris-HCl（pH 7.4）、１
％のNonident P-40、１３７ｍＭのNaCl、２ｍＭのEDT
A、５０ｍＭのNaF、２ｍＭのNaVO4、１ｍＭのphenylmet
hylsulfonyl、１０ｍｇ／ｍｌのaprotinin、５ｍｇ／ｍ
ｌのleupeptine、２ｍｇ／ｍｌのpepstatin）を加える
ことにより終了とした。核分画を取り除いた細胞溶解液
はタンパク質のリン酸化の検討に用いた。免疫ブロット
には抗リン酸化チロシン抗体（４Ｇ１０）を用いて行っ
た。
【００２６】Ａ−７（逆皮膚受動アルサス反応） ０、１６又は８０μｇのウサギ抗ＯＶＡ ＩｇＧを含む
生理食塩水を、体幹を除毛した実施例Ａ−１で得られた
それぞれのマウスの背部皮内に投与し、その直後、１ｍ
ｇのＯＶＡを含む生理食塩水２００μｌを静脈より注入
した。これらのマウスを８時間後に屠殺し、背部の皮膚
を採取した。Myeloperoxidase（ＭＰＯ）アッセイはBra
dleyらによる方法（J. Invest. Dermatol. 78, 206-20
9, 1982）を参考にした。簡便に、炎症を引き起こした
部分を組織片（１２．５ｍｍ2）として切り出し、４０
０μｌの５０ｍＭのリン酸溶液（pH 6.0）でホモジェナ
イズし、さらに、hexadecyltrimethylammonium bromide
（ＨＴＡＢ；Sigma）を０．５％になるように加え、２
０秒間超音波により破砕した後、凍結融解を３回繰り返
すことにより抽出液を作製した。これら抽出液を１４，
０００ｒｐｍ、１５分間遠心した後、得られた上清をＭ
ＰＯ活性の測定に使用した。これらの上清２０μｌを２
００μｌの基質溶液［５０ｍＭのリン酸溶液（pH 6.
0）、０．１６７ｍｇ／ｍｌのo-dianisidine duhydroch
loride（Sigma）、０．０００５％の過酸化水素（Wako
Pure Chemical）］と混合した後、基質溶液の色の変化
を４６０ｎｍの吸光度で測定した。なお、０．２５μｌ
のマウス全血から得られたＭＰＯ活性を１ユニットとし
て計測した。病理組織学的検討のため、皮膚断片は１０
％（vol/vol）中性緩衝ホルマリン溶液により固定し、
パラフィン切片とした後、ヘマトキシリン／エオシン染
色を行った。
生理食塩水を、体幹を除毛した実施例Ａ−１で得られた
それぞれのマウスの背部皮内に投与し、その直後、１ｍ
ｇのＯＶＡを含む生理食塩水２００μｌを静脈より注入
した。これらのマウスを８時間後に屠殺し、背部の皮膚
を採取した。Myeloperoxidase（ＭＰＯ）アッセイはBra
dleyらによる方法（J. Invest. Dermatol. 78, 206-20
9, 1982）を参考にした。簡便に、炎症を引き起こした
部分を組織片（１２．５ｍｍ2）として切り出し、４０
０μｌの５０ｍＭのリン酸溶液（pH 6.0）でホモジェナ
イズし、さらに、hexadecyltrimethylammonium bromide
（ＨＴＡＢ；Sigma）を０．５％になるように加え、２
０秒間超音波により破砕した後、凍結融解を３回繰り返
すことにより抽出液を作製した。これら抽出液を１４，
０００ｒｐｍ、１５分間遠心した後、得られた上清をＭ
ＰＯ活性の測定に使用した。これらの上清２０μｌを２
００μｌの基質溶液［５０ｍＭのリン酸溶液（pH 6.
0）、０．１６７ｍｇ／ｍｌのo-dianisidine duhydroch
loride（Sigma）、０．０００５％の過酸化水素（Wako
Pure Chemical）］と混合した後、基質溶液の色の変化
を４６０ｎｍの吸光度で測定した。なお、０．２５μｌ
のマウス全血から得られたＭＰＯ活性を１ユニットとし
て計測した。病理組織学的検討のため、皮膚断片は１０
％（vol/vol）中性緩衝ホルマリン溶液により固定し、
パラフィン切片とした後、ヘマトキシリン／エオシン染
色を行った。
【００２７】実施例Ｂ［結果］ Ｂ−１（Ｌｙｎ-/-ＦｃγＲIIＢ-/-マウスの全身性受動
アナフィラキシーにおけるＦｃγＲIII機能の欠損） これまでの研究において、Ｌｙｎ欠損マウスはＩｇＥに
よる皮膚受動アナフィラキシーを引き起こすことが出来
ないことが明らかになっている。このことは肥満細胞上
のＦｃεＲＩの情報伝達の下流においてＬｙｎが重要な
働きをすることを示している（Cell 83, 301-311, 199
5）。本発明者らは全身性受動アナフィラキシーをＩｇ
Ｇ−免疫複合体で誘導することにより、ＦｃγＲIIIの
情報伝達の下流においてＬｙｎの役割がどのような意味
を持つのか検討するため、ＦｃγＲIIIを介した応答に
対して抑制性の働きをするＦｃγＲIIＢ（Annu. Rev. I
mmunol. 15, 203-234, 1997、J. Exp. Med. 189, 1573-
1579, 1999、Nature 379, 346-349, 1996）を排除する
ために、実施例Ａ−１に記載のＬｙｎとＦｃγＲIIＢの
２重欠損マウス（Ｌｙｎ-/-ＦｃγＲIIＢ-/-マウス：Ly
n-IIB-）の系統を用いた。
アナフィラキシーにおけるＦｃγＲIII機能の欠損） これまでの研究において、Ｌｙｎ欠損マウスはＩｇＥに
よる皮膚受動アナフィラキシーを引き起こすことが出来
ないことが明らかになっている。このことは肥満細胞上
のＦｃεＲＩの情報伝達の下流においてＬｙｎが重要な
働きをすることを示している（Cell 83, 301-311, 199
5）。本発明者らは全身性受動アナフィラキシーをＩｇ
Ｇ−免疫複合体で誘導することにより、ＦｃγＲIIIの
情報伝達の下流においてＬｙｎの役割がどのような意味
を持つのか検討するため、ＦｃγＲIIIを介した応答に
対して抑制性の働きをするＦｃγＲIIＢ（Annu. Rev. I
mmunol. 15, 203-234, 1997、J. Exp. Med. 189, 1573-
1579, 1999、Nature 379, 346-349, 1996）を排除する
ために、実施例Ａ−１に記載のＬｙｎとＦｃγＲIIＢの
２重欠損マウス（Ｌｙｎ-/-ＦｃγＲIIＢ-/-マウス：Ly
n-IIB-）の系統を用いた。
【００２８】実施例Ａ−３記載の方法により、尾静脈を
介してハプテン特異的な抗体［抗ＴＮＰ ＩｇＧ１（図
１左；ｎ＝４）もしくは抗ＴＮＰ ＩｇＥ（図１右；ｎ
＝６）］と抗原（ＴＮＰ−ＯＶＡ）を投与することによ
り２重欠損マウスとコントロールマウスに全身性受動ア
ナフィラキシーを誘導し、全身性受動アナフィラキシー
応答強度を指標として、抗原を投与した時点から経時的
に直腸内温度の低下を測定した。この結果を図１に示
す。ＩｇＧ及びＩｇＥによる刺激において、コントロー
ルマウスは明らかな応答を示している一方で、２重欠損
マウスはその応答が明らかに減弱していることが確認で
きた。２重欠損マウスで応答が損なわれることから、肥
満細胞におけるＬｙｎの活性はＦｃεＲＩを介したアナ
フィラキシーと同様にＦｃγＲIIIを介したときにも必
要であることがわかった。なお、コントロール実験（図
１上段）は、上記それぞれのマウスに抗体を投与しない
こと以外は上記記載の方法と同様に直腸内温度を測定し
た。
介してハプテン特異的な抗体［抗ＴＮＰ ＩｇＧ１（図
１左；ｎ＝４）もしくは抗ＴＮＰ ＩｇＥ（図１右；ｎ
＝６）］と抗原（ＴＮＰ−ＯＶＡ）を投与することによ
り２重欠損マウスとコントロールマウスに全身性受動ア
ナフィラキシーを誘導し、全身性受動アナフィラキシー
応答強度を指標として、抗原を投与した時点から経時的
に直腸内温度の低下を測定した。この結果を図１に示
す。ＩｇＧ及びＩｇＥによる刺激において、コントロー
ルマウスは明らかな応答を示している一方で、２重欠損
マウスはその応答が明らかに減弱していることが確認で
きた。２重欠損マウスで応答が損なわれることから、肥
満細胞におけるＬｙｎの活性はＦｃεＲＩを介したアナ
フィラキシーと同様にＦｃγＲIIIを介したときにも必
要であることがわかった。なお、コントロール実験（図
１上段）は、上記それぞれのマウスに抗体を投与しない
こと以外は上記記載の方法と同様に直腸内温度を測定し
た。
【００２９】Ｂ−２（Ｌｙｎ欠損マウスから誘導された
ＢＭＭＣｓにおけるＦｃγＲIII機能の減弱） 次に即時型の応答として、またアナフィラキシーを引き
起こす主要な要因として、肥満細胞の脱顆粒能を検討す
るため、培養ＢＭＭＣｓを用いてセロトニン放出を検討
することにより機能解析を行った。ＦｃγＲIIIもしく
はＦｃεＲＩを段階的に架橋することにより肥満細胞の
活性化を誘導し、培養上清中に放出される放射線ラベル
されたセロトニンを測定した（図２）。なお、ＢＭＭＣ
ｓの脱顆粒は、２．４２Ｇ２とヤギ抗ラットＩｇＧ１
Ｆ(ａｂ′)2（図２左）又は抗ＴＮＰ ＩｇＥとＴＮＰ−
ＯＶＡ（図２右）によりＦｃγＲIII及びＦｃεＲＩを
架橋することにより誘導した。脱顆粒は刺激後１時間の
培養上清中に放出されたセロトニンを実施例Ａ−４記載
の方法により定量した。これらの結果から、ＦｃγＲII
I及びＦｃεＲＩを介した刺激により、２重欠損マウス
由来のＢＭＭＣｓは、弱い刺激（１〜３μｇ／ｍｌの抗
ラットＩｇＧや０．３〜３ｎｇ／ｍｌのＴＮＰ−ＯＶ
Ａ）に対して応答性が低くなっていることが明らかとな
った。一方、２重欠損マウス由来のＢＭＭＣｓで程度の
高い刺激に対しては同等の脱顆粒を引き起こすことも分
かった。２重欠損マウスとコントロールマウスでのこれ
らの違いは３回繰り返した実験で確認し、また２個体か
ら独立に誘導した培養肥満細胞を使用して確認した。
ＢＭＭＣｓにおけるＦｃγＲIII機能の減弱） 次に即時型の応答として、またアナフィラキシーを引き
起こす主要な要因として、肥満細胞の脱顆粒能を検討す
るため、培養ＢＭＭＣｓを用いてセロトニン放出を検討
することにより機能解析を行った。ＦｃγＲIIIもしく
はＦｃεＲＩを段階的に架橋することにより肥満細胞の
活性化を誘導し、培養上清中に放出される放射線ラベル
されたセロトニンを測定した（図２）。なお、ＢＭＭＣ
ｓの脱顆粒は、２．４２Ｇ２とヤギ抗ラットＩｇＧ１
Ｆ(ａｂ′)2（図２左）又は抗ＴＮＰ ＩｇＥとＴＮＰ−
ＯＶＡ（図２右）によりＦｃγＲIII及びＦｃεＲＩを
架橋することにより誘導した。脱顆粒は刺激後１時間の
培養上清中に放出されたセロトニンを実施例Ａ−４記載
の方法により定量した。これらの結果から、ＦｃγＲII
I及びＦｃεＲＩを介した刺激により、２重欠損マウス
由来のＢＭＭＣｓは、弱い刺激（１〜３μｇ／ｍｌの抗
ラットＩｇＧや０．３〜３ｎｇ／ｍｌのＴＮＰ−ＯＶ
Ａ）に対して応答性が低くなっていることが明らかとな
った。一方、２重欠損マウス由来のＢＭＭＣｓで程度の
高い刺激に対しては同等の脱顆粒を引き起こすことも分
かった。２重欠損マウスとコントロールマウスでのこれ
らの違いは３回繰り返した実験で確認し、また２個体か
ら独立に誘導した培養肥満細胞を使用して確認した。
【００３０】本発明者らは次に２重欠損マウス由来のＢ
ＭＭＣｓの細胞内機能欠如の特色として細胞質内のカル
シウム動態と細胞の全タンパク質チロシンリン酸化につ
いて検討した。実施例Ａ−５記載の方法でＢＭＭＣｓを
刺激し、細胞質内カルシウム動態を蛍光吸光度計により
５１０ｎｍ励起で測定した。この結果を図３Ａに示す。
これらの結果から、２重欠損マウス由来のＢＭＭＣｓに
おいて、ＦｃγＲIIIもしくはＦｃεＲＩを介した刺激
によるカルシウム動態の減弱が見られた。この応答は特
に誘導後、早い段階（＜１５０秒）で影響を受けてお
り、遅い段階（＞３００秒）では十分に誘導されている
ことがわかった。なお、図中の矢印はストレプトアビジ
ンにより架橋したことを示す。
ＭＭＣｓの細胞内機能欠如の特色として細胞質内のカル
シウム動態と細胞の全タンパク質チロシンリン酸化につ
いて検討した。実施例Ａ−５記載の方法でＢＭＭＣｓを
刺激し、細胞質内カルシウム動態を蛍光吸光度計により
５１０ｎｍ励起で測定した。この結果を図３Ａに示す。
これらの結果から、２重欠損マウス由来のＢＭＭＣｓに
おいて、ＦｃγＲIIIもしくはＦｃεＲＩを介した刺激
によるカルシウム動態の減弱が見られた。この応答は特
に誘導後、早い段階（＜１５０秒）で影響を受けてお
り、遅い段階（＞３００秒）では十分に誘導されている
ことがわかった。なお、図中の矢印はストレプトアビジ
ンにより架橋したことを示す。
【００３１】また、実施例Ａ−５記載の方法でＢＭＭＣ
ｓを刺激し、実施例Ａ−６記載のように反応を終了さ
せ、核分画を除外した細胞溶解液（１レーンにつき２．
５×１０4に相当）を抗リン酸化チロシンモノクローナ
ル抗体（抗ｐＴｙｒ：４Ｇ１０）を用いて免疫ブロッテ
ィングを行った。結果を図３Ｂに示す。この結果からも
明らかなように刺激後５分間は、２重欠損マウス由来の
ＢＭＭＣｓにおいてチロシンリン酸化の誘導に影響を及
ぼすことがわかった。また、２重欠損マウス由来のＢＭ
ＭＣｓでは、ＦｃγＲIII、ＦｃεＲＩ及びｃ−ｋｉｔ
の発現、ＩＬ−３による増殖、またセロトニンの取り込
みは通常であった。このことは２重欠損マウス由来のＢ
ＭＭＣｓでは、ＦｃＲｓの発現量が少ないなどの分化異
常を起こしているのではなく、機能的異常（欠損）が起
きていることを示している。これらin vitroの結果はin
vivoの結果を擬態しており、少なくとも肥満細胞の活
性化の即時段階において、ＬｙｎはＦｃＲｓの情報伝達
の活性化に重要であることが示された。
ｓを刺激し、実施例Ａ−６記載のように反応を終了さ
せ、核分画を除外した細胞溶解液（１レーンにつき２．
５×１０4に相当）を抗リン酸化チロシンモノクローナ
ル抗体（抗ｐＴｙｒ：４Ｇ１０）を用いて免疫ブロッテ
ィングを行った。結果を図３Ｂに示す。この結果からも
明らかなように刺激後５分間は、２重欠損マウス由来の
ＢＭＭＣｓにおいてチロシンリン酸化の誘導に影響を及
ぼすことがわかった。また、２重欠損マウス由来のＢＭ
ＭＣｓでは、ＦｃγＲIII、ＦｃεＲＩ及びｃ−ｋｉｔ
の発現、ＩＬ−３による増殖、またセロトニンの取り込
みは通常であった。このことは２重欠損マウス由来のＢ
ＭＭＣｓでは、ＦｃＲｓの発現量が少ないなどの分化異
常を起こしているのではなく、機能的異常（欠損）が起
きていることを示している。これらin vitroの結果はin
vivoの結果を擬態しており、少なくとも肥満細胞の活
性化の即時段階において、ＬｙｎはＦｃＲｓの情報伝達
の活性化に重要であることが示された。
【００３２】Ｂ−３（２重欠損マウスのＢＭＭＣｓにお
けるサイトカイン産生に対するＦｃγＲIIIの正常機
能） 肥満細胞ではＦｃＲを介した刺激によりサイトカインは
新たに生産されることが明らかになっている（Nature 3
39, 64-67, 1989、J. Exp. Med. 170, 245-257, 1989、
Nature 346, 274-276, 1990、Int. Arch. Allergy Immu
nol. 107, 158-159, 1995）。肥満細胞の活性化に関連
してよく調べられているサイトカインであるＴＮＦ−α
やＩＬ−４はＦｃＲを介した刺激後、２，３時間もしく
は数時間で実際に放出される。肥満細胞のサイトカイン
放出は、肥満細胞が係わる組織破壊（Blood 94, 3855-3
863, 1999、Immunology 77, 422-427, 1992、Science 2
58, 1957-1959, 1992）やアレルギー（Allergy 50, 851
-862, 1995）の発症に重要であることが示されている。
これらのことから、ＦｃＲを介した刺激で誘導されるＢ
ＭＭＣｓからのＴＮＦ−αとＩＬ−４の生産量を調べて
みた。ＦｃγＲIIIを架橋するために抗ＦｃγＲII／III
抗体（２．４Ｇ２）と様々な濃度の２次抗体が存在する
状況で実施例Ａ−４記載の方法でＢＭＭＣｓを数時間刺
激した。この結果を図４に示す。これらの結果は、図２
や図３で示した脱顆粒や生化学的アッセイから得られた
結果に反して、２重欠損マウス由来のＢＭＭＣｓにおい
てＴＮＦ−αやＩＬ−４の誘導には影響が見られなかっ
た。これらのことは、ＦｃγＲIIIの情報伝達の下流で
は、Ｌｙｎの活性に係わらずサイトカイン遺伝子が活性
化されることを意味しており、肥満細胞においてサイト
カイン生産誘導に十分なシグナル伝達機構の存在が示唆
される。
けるサイトカイン産生に対するＦｃγＲIIIの正常機
能） 肥満細胞ではＦｃＲを介した刺激によりサイトカインは
新たに生産されることが明らかになっている（Nature 3
39, 64-67, 1989、J. Exp. Med. 170, 245-257, 1989、
Nature 346, 274-276, 1990、Int. Arch. Allergy Immu
nol. 107, 158-159, 1995）。肥満細胞の活性化に関連
してよく調べられているサイトカインであるＴＮＦ−α
やＩＬ−４はＦｃＲを介した刺激後、２，３時間もしく
は数時間で実際に放出される。肥満細胞のサイトカイン
放出は、肥満細胞が係わる組織破壊（Blood 94, 3855-3
863, 1999、Immunology 77, 422-427, 1992、Science 2
58, 1957-1959, 1992）やアレルギー（Allergy 50, 851
-862, 1995）の発症に重要であることが示されている。
これらのことから、ＦｃＲを介した刺激で誘導されるＢ
ＭＭＣｓからのＴＮＦ−αとＩＬ−４の生産量を調べて
みた。ＦｃγＲIIIを架橋するために抗ＦｃγＲII／III
抗体（２．４Ｇ２）と様々な濃度の２次抗体が存在する
状況で実施例Ａ−４記載の方法でＢＭＭＣｓを数時間刺
激した。この結果を図４に示す。これらの結果は、図２
や図３で示した脱顆粒や生化学的アッセイから得られた
結果に反して、２重欠損マウス由来のＢＭＭＣｓにおい
てＴＮＦ−αやＩＬ−４の誘導には影響が見られなかっ
た。これらのことは、ＦｃγＲIIIの情報伝達の下流で
は、Ｌｙｎの活性に係わらずサイトカイン遺伝子が活性
化されることを意味しており、肥満細胞においてサイト
カイン生産誘導に十分なシグナル伝達機構の存在が示唆
される。
【００３３】Ｂ−４（Ｌｙｎ欠損マウスにおける逆皮膚
受動アルサス反応に対するＦｃγＲIIIの正常機能） サイトカイン産生がIn vitroでＬｙｎに依存しないとい
う上記の結果から、次に、サイトカインがその発現に重
要と考えられている逆皮膚受動アルサス反応を調べてみ
た。この逆皮膚受動アルサス反応はin vivoにおける免
疫複合体が引き起こす炎症モデルで、肥満細胞上のＦｃ
γＲIII機能に依存していることが明らかになっている
（Science 265, 1095-1098, 1994、Immunity 5, 387-39
0、J. Clin. Invest. 99, 915-925, 1997、J. Clin. In
vest. 99, 901-914, 1997、Immunity 5, 181-188, 199
6）。上記実施例Ａ−７記載の方法によりＭＰＯ（myelo
peroxidase）活性を測定し、病理組織による検討も行っ
た。これらの結果を図５に示す。図５（Ａ）には、好中
球の浸潤度合が抗原投与後８時間の炎症部位のＭＰＯ活
性（１単位を０．２５μｌに含まれるＭＰＯ活性とした
５匹のマウスの平均値±標準偏差）で示されている。図
５（Ｂ）には、炎症誘導後８時間のヘマトキシリン・エ
オシン染色した組織学的変化が、生理食塩水を皮内に投
与したコントロール標本（−）と共に示されている（写
真はすべて４０倍で観察）。これらの結果から、２重欠
損マウス及びコントロールマウスともにＭＰＯ活性の誘
導及び病理組織見解は同等なものであることがわかっ
た。皮膚の肥満細胞の数は２重欠損マウスでは正常であ
ることが分かっている。ＦｃγＲIIIのＬｙｎに依存し
ない情報伝達の活性は逆皮膚受動アルサス反応を起こさ
せるのに十分であり、Ｌｙｎは肥満細胞の後期の反応開
始においては必要不可欠なものではないことがわかっ
た。
受動アルサス反応に対するＦｃγＲIIIの正常機能） サイトカイン産生がIn vitroでＬｙｎに依存しないとい
う上記の結果から、次に、サイトカインがその発現に重
要と考えられている逆皮膚受動アルサス反応を調べてみ
た。この逆皮膚受動アルサス反応はin vivoにおける免
疫複合体が引き起こす炎症モデルで、肥満細胞上のＦｃ
γＲIII機能に依存していることが明らかになっている
（Science 265, 1095-1098, 1994、Immunity 5, 387-39
0、J. Clin. Invest. 99, 915-925, 1997、J. Clin. In
vest. 99, 901-914, 1997、Immunity 5, 181-188, 199
6）。上記実施例Ａ−７記載の方法によりＭＰＯ（myelo
peroxidase）活性を測定し、病理組織による検討も行っ
た。これらの結果を図５に示す。図５（Ａ）には、好中
球の浸潤度合が抗原投与後８時間の炎症部位のＭＰＯ活
性（１単位を０．２５μｌに含まれるＭＰＯ活性とした
５匹のマウスの平均値±標準偏差）で示されている。図
５（Ｂ）には、炎症誘導後８時間のヘマトキシリン・エ
オシン染色した組織学的変化が、生理食塩水を皮内に投
与したコントロール標本（−）と共に示されている（写
真はすべて４０倍で観察）。これらの結果から、２重欠
損マウス及びコントロールマウスともにＭＰＯ活性の誘
導及び病理組織見解は同等なものであることがわかっ
た。皮膚の肥満細胞の数は２重欠損マウスでは正常であ
ることが分かっている。ＦｃγＲIIIのＬｙｎに依存し
ない情報伝達の活性は逆皮膚受動アルサス反応を起こさ
せるのに十分であり、Ｌｙｎは肥満細胞の後期の反応開
始においては必要不可欠なものではないことがわかっ
た。
【００３４】
【発明の効果】本発明のＩ型アレルギーであるアナフィ
ラキシーを発症せず、III型アレルギーであるアルサス
反応を特異的に誘導することができるIII型アレルギー
炎症モデル非ヒト動物、例えばＬｙｎ及びＦｃγIIＢの
遺伝子機能が染色体上で欠損しているダブルノックアウ
トマウスは、Ｉ型アレルギーに影響されることなく、II
I型アレルギー炎症のみを評価しうる実験モデル動物と
して有用であり、またかかる実験モデル動物を用いる
と、ＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー反応に特異的
なアレルギー反応促進又は抑制物質をスクリーニングす
ることができ、とりわけスクリーニングにより得られる
抑制物質はIII型アレルギー反応に起因する疾病の治療
薬として用いることができる可能性がある。
ラキシーを発症せず、III型アレルギーであるアルサス
反応を特異的に誘導することができるIII型アレルギー
炎症モデル非ヒト動物、例えばＬｙｎ及びＦｃγIIＢの
遺伝子機能が染色体上で欠損しているダブルノックアウ
トマウスは、Ｉ型アレルギーに影響されることなく、II
I型アレルギー炎症のみを評価しうる実験モデル動物と
して有用であり、またかかる実験モデル動物を用いる
と、ＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー反応に特異的
なアレルギー反応促進又は抑制物質をスクリーニングす
ることができ、とりわけスクリーニングにより得られる
抑制物質はIII型アレルギー反応に起因する疾病の治療
薬として用いることができる可能性がある。
【図１】本発明の２重欠損マウス（Lyn-IIB-）及びコン
トロールマウス（IIB-）における全身性受動アナフィラ
キシーを直腸内温度測定によりモニターした結果を示す
図である。
トロールマウス（IIB-）における全身性受動アナフィラ
キシーを直腸内温度測定によりモニターした結果を示す
図である。
【図２】本発明の２重欠損マウス（Lyn-IIB-）及びコン
トロールマウス（IIB-）の骨髄由来肥満細胞の脱顆粒能
をセロトニン定量によりモニターした結果を示す図であ
る。
トロールマウス（IIB-）の骨髄由来肥満細胞の脱顆粒能
をセロトニン定量によりモニターした結果を示す図であ
る。
【図３】ＦｃＲの架橋により誘導される本発明の２重欠
損マウス（Lyn-IIB-）及びコントロールマウス（IIB-）
の骨髄由来肥満細胞の細胞内Ｃａ2+動態（Ａ）と、細胞
全タンパク質のチロシンリン酸化（Ｂ）の測定結果を示
す図である。
損マウス（Lyn-IIB-）及びコントロールマウス（IIB-）
の骨髄由来肥満細胞の細胞内Ｃａ2+動態（Ａ）と、細胞
全タンパク質のチロシンリン酸化（Ｂ）の測定結果を示
す図である。
【図４】ＦｃγＲIIIを架橋することにより引き起こさ
れる本発明の２重欠損マウス（Lyn-IIB-）及びコントロ
ールマウス（IIB-）の骨髄由来肥満細胞からのサイトカ
イン放出の測定結果を示す図である。
れる本発明の２重欠損マウス（Lyn-IIB-）及びコントロ
ールマウス（IIB-）の骨髄由来肥満細胞からのサイトカ
イン放出の測定結果を示す図である。
【図５】ＩｇＧ−免疫複合体により誘導した本発明の２
重欠損マウス（Lyn-IIB-）及びコントロールマウス（II
B-）の逆皮膚受動アルサス反応における炎症部位のＭＰ
Ｏ活性（Ａ）と、組織学的変化（Ｂ）を示す図である。
重欠損マウス（Lyn-IIB-）及びコントロールマウス（II
B-）の逆皮膚受動アルサス反応における炎症部位のＭＰ
Ｏ活性（Ａ）と、組織学的変化（Ｂ）を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｎ 33/50 33/50 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｑ 1/02 (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 渡邊 武 佐賀県佐賀市開成５−６−19 Ｆターム(参考） 2G045 BA14 BB20 BB22 CB01 CB09 CB17 FA16 FB03 GC10 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ96 QR48 QR69 QR72 QR80 QS28 QX02 QX07 4B065 AA92X AC20 BA24 CA46 4C084 AA17 NA14 ZB132
Claims (10)
- 【請求項１】 Ｉ型アレルギーであるアナフィラキシー
を発症せず、III型アレルギーであるアルサス反応を特
異的に誘導することを特徴とするIII型アレルギー炎症
モデル非ヒト動物。 - 【請求項２】 Ｌｙｎ及びＦｃγIIＢの遺伝子機能が染
色体上で欠損していることを特徴とする請求項１記載の
III型アレルギー炎症モデル非ヒト動物。 - 【請求項３】 非ヒト動物が齧歯目動物であることを特
徴とする請求項１又は２記載のIII型アレルギー炎症モ
デル非ヒト動物。 - 【請求項４】 齧歯目動物がマウスであることを特徴と
する請求項１〜３のいずれか記載のIII型アレルギー炎
症モデル非ヒト動物。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか記載のIII型ア
レルギー炎症モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該
非ヒト動物におけるＦｃγＲIII機能を測定・評価する
ことを特徴とするＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー
反応における反応促進又は抑制物質のスクリーニング方
法。 - 【請求項６】 非ヒト動物におけるＦｃγＲIII機能の
測定・評価が、全身性受動アナフィラキシー応答強度を
指標とした、抗原投与時以降の直腸内温度の測定・評価
であることを特徴とする請求項５記載のＦｃγＲIIIを
介したIII型アレルギー反応における反応促進又は抑制
物質のスクリーニング方法。 - 【請求項７】 請求項１〜４のいずれか記載のIII型ア
レルギー炎症モデル非ヒト動物由来の骨髄細胞から誘導
した骨髄由来肥満細胞を生体外で被検物質と接触させ、
該骨髄由来肥満細胞におけるＦｃγＲIII機能を測定・
評価することを特徴とするＦｃγＲIIIを介したIII型ア
レルギー反応における反応促進又は抑制物質のスクリー
ニング方法。 - 【請求項８】 骨髄由来肥満細胞におけるＦｃγＲIII
機能の測定・評価が、肥満細胞の脱顆粒能、肥満細胞の
細胞質内カルシウム動態、又は肥満細胞の全タンパク質
チロシンリン酸化の測定・評価であることを特徴とする
請求項７記載のＦｃγＲIIIを介したIII型アレルギー反
応における反応促進又は抑制物質のスクリーニング方
法。 - 【請求項９】 請求項１〜４のいずれか記載のIII型ア
レルギー炎症モデル非ヒト動物と、ＦｃγIIＢの遺伝子
機能が染色体上で欠損している非ヒト動物とを用いるこ
とを特徴とする請求項５〜８のいずれか記載のＦｃγＲ
IIIを介したIII型アレルギー反応における反応促進又は
抑制物質のスクリーニング方法。 - 【請求項１０】 請求項５〜９のいずれか記載のＦｃγ
ＲIIIを介したIII型アレルギー反応における反応促進又
は抑制物質のスクリーニング方法により得られた抑制物
質を有効成分とすることを特徴とするIII型アレルギー
反応に起因する疾病の治療薬。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000253984A JP3453348B2 (ja) | 2000-08-24 | 2000-08-24 | Ｉｉｉ型アレルギー炎症モデル動物 |
| EP01958410A EP1312259B1 (en) | 2000-08-24 | 2001-08-23 | Type iii allergic inflammation model animal |
| CA2420159A CA2420159C (en) | 2000-08-24 | 2001-08-23 | Model animal for type iii allergy inflammation |
| DE60140876T DE60140876D1 (de) | 2000-08-24 | 2001-08-23 | Tiermodell für typ iii allergische entzündungen |
| PCT/JP2001/007196 WO2002015680A1 (fr) | 2000-08-24 | 2001-08-23 | Modele animal permettant d'evaluer l'inflammation allergique de type iii |
| US10/362,593 US7282620B2 (en) | 2000-08-24 | 2001-08-23 | Type III allergic inflammation model animal |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000253984A JP3453348B2 (ja) | 2000-08-24 | 2000-08-24 | Ｉｉｉ型アレルギー炎症モデル動物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=18743006
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