JP3410679B2 - グッドパスチャー症候群モデルマウス - Google Patents
グッドパスチャー症候群モデルマウスInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、グッドパスチャー
症候群モデルマウスや、これを用いたグッドパスチャー
症候群治療薬のスクリーニング方法に関する。
症候群モデルマウスや、これを用いたグッドパスチャー
症候群治療薬のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】びまん性肺胞出血、糸球体腎炎及び抗腎
糸球体基底膜抗体出現の３つを合わせもつグッドパスチ
ャー症候群は、ヴェゲナー肉芽腫症（Wegener's granul
omatosis）、全身性壊死性血管炎及び全身性エリテマト
ーデス（ＳＬＥ）等と臨床像として共通性があるが、患
者血清中に腎糸球体基底膜と肺胞上皮基底膜に対する共
通する抗体が存在し、これらが標的組織に結合してII型
過敏症反応に基づく炎症病巣を惹起させると考えられて
いる（J. Exp. Med. 126,989-1004 ,1987）。グッドパ
スチャー症の診断は、上記の臨床像の特徴のほかに、腎
糸球体基底膜への免疫グロブリン（以下「Ｉｇ」とい
う）沈着の証明によってなされ、抗基底膜抗体の大部分
はＩｇＧ画分に属し、近年、タイプIVコラーゲンのα3
鎖の一部分に対する自己抗体と同定されている（Cell M
ol. Biol. 5, 107-112, 1991）。
糸球体基底膜抗体出現の３つを合わせもつグッドパスチ
ャー症候群は、ヴェゲナー肉芽腫症（Wegener's granul
omatosis）、全身性壊死性血管炎及び全身性エリテマト
ーデス（ＳＬＥ）等と臨床像として共通性があるが、患
者血清中に腎糸球体基底膜と肺胞上皮基底膜に対する共
通する抗体が存在し、これらが標的組織に結合してII型
過敏症反応に基づく炎症病巣を惹起させると考えられて
いる（J. Exp. Med. 126,989-1004 ,1987）。グッドパ
スチャー症の診断は、上記の臨床像の特徴のほかに、腎
糸球体基底膜への免疫グロブリン（以下「Ｉｇ」とい
う）沈着の証明によってなされ、抗基底膜抗体の大部分
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鎖の一部分に対する自己抗体と同定されている（Cell M
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【０００３】また、グッドパスチャー症候群は、広い年
齢層にわたって発症し、早期診断及び早期治療がなされ
なければ８０％の患者は１年以内に腎症の悪化により死
亡し、３０％の患者は肺出血によって死亡する。早期治
療によって、最近ではグッドパスチャー症の救命率は約
５０％にまで向上しているが、経口ステロイド剤又は経
口免疫抑制剤のみの治療では不十分で、肺出血に対して
は高用量のプレドニンパルス療法が効果的である。しか
し、腎症に対してはパルス療法は十分ではなく、血漿交
換と高用量プレドニン、それにサイクロホスファミドの
併用が有効であるとされ、また、高度な腎障害では、人
工透析あるいは腎移植の対象となっている。
齢層にわたって発症し、早期診断及び早期治療がなされ
なければ８０％の患者は１年以内に腎症の悪化により死
亡し、３０％の患者は肺出血によって死亡する。早期治
療によって、最近ではグッドパスチャー症の救命率は約
５０％にまで向上しているが、経口ステロイド剤又は経
口免疫抑制剤のみの治療では不十分で、肺出血に対して
は高用量のプレドニンパルス療法が効果的である。しか
し、腎症に対してはパルス療法は十分ではなく、血漿交
換と高用量プレドニン、それにサイクロホスファミドの
併用が有効であるとされ、また、高度な腎障害では、人
工透析あるいは腎移植の対象となっている。
【０００４】他方、免疫系などの細胞の表面上には、Ｉ
ｇのＦｃ部分を認識して結合するレセプター（以下「Ｆ
ｃＲ」という）が存在し、その中でも体液中のＩｇＧの
γ鎖に特異的に結合する受容体蛋白質であるＦｃγレセ
プター（以下「ＦｃγＲ」という）は遺伝子構造の類似
性に基づいてタイプＩ（ＣＤ６４抗原）、タイプII（Ｃ
Ｄ３２抗原）、タイプIII（ＣＤ１６抗原）の３種に大
きく分類されている。これらのうち、ＦｃγＲIIは、他
のＦｃＲとは異なりモノマーのＩｇＧに対して低親和性
であり、免疫複合体となった多価ＩｇＧと結合し、単
球、マクロファージ、多形核白血球（ＰＭＮ）、マスト
細胞、血小板、いくつかのＴ細胞リンパ球及びいくつか
のＢ細胞リンパ球を含む造血幹細胞に広く発現する。ま
た、ＦｃγＲIIには遺伝子配列が異なるＦｃγＲIIＡ、
ＦｃγＲIIＢ及びＦｃγＲIIＣの３種類の受容体が存在
しており、いずれの染色体も１ｑ２３に位置しているこ
とも知られている。
ｇのＦｃ部分を認識して結合するレセプター（以下「Ｆ
ｃＲ」という）が存在し、その中でも体液中のＩｇＧの
γ鎖に特異的に結合する受容体蛋白質であるＦｃγレセ
プター（以下「ＦｃγＲ」という）は遺伝子構造の類似
性に基づいてタイプＩ（ＣＤ６４抗原）、タイプII（Ｃ
Ｄ３２抗原）、タイプIII（ＣＤ１６抗原）の３種に大
きく分類されている。これらのうち、ＦｃγＲIIは、他
のＦｃＲとは異なりモノマーのＩｇＧに対して低親和性
であり、免疫複合体となった多価ＩｇＧと結合し、単
球、マクロファージ、多形核白血球（ＰＭＮ）、マスト
細胞、血小板、いくつかのＴ細胞リンパ球及びいくつか
のＢ細胞リンパ球を含む造血幹細胞に広く発現する。ま
た、ＦｃγＲIIには遺伝子配列が異なるＦｃγＲIIＡ、
ＦｃγＲIIＢ及びＦｃγＲIIＣの３種類の受容体が存在
しており、いずれの染色体も１ｑ２３に位置しているこ
とも知られている。
【０００５】上記ＦｃγＲIIＢは、他のＦｃＲとは異な
り、γ鎖と会合することなく、しかも細胞内領域に抑制
性シグナルを伝達するアミノ酸配列（ＩＴＩＭ：Immuno
receptor Tyrosine-based Inhibition Motif）を有して
いる（Immunol. Rev. 125, 49-76, 1992、Science 256,
1808-1812, 1992）。このようなＦｃγＲIIＢの生理的
機能を解明するために、本発明者らはＦｃγＲIIＢ欠損
マウスを既に作出し（Nature 379, 346-349, 1996）、
ＦｃγＲIIＢ欠損マウスをタイプIIコラーゲンで免疫す
ることによる関節炎モデルマウス（J. Exp. Med. 189,
187-194, 1999）や、自己免疫疾患モデル動物を作製し
た（特開平０８−２８９６９９号公報）。
り、γ鎖と会合することなく、しかも細胞内領域に抑制
性シグナルを伝達するアミノ酸配列（ＩＴＩＭ：Immuno
receptor Tyrosine-based Inhibition Motif）を有して
いる（Immunol. Rev. 125, 49-76, 1992、Science 256,
1808-1812, 1992）。このようなＦｃγＲIIＢの生理的
機能を解明するために、本発明者らはＦｃγＲIIＢ欠損
マウスを既に作出し（Nature 379, 346-349, 1996）、
ＦｃγＲIIＢ欠損マウスをタイプIIコラーゲンで免疫す
ることによる関節炎モデルマウス（J. Exp. Med. 189,
187-194, 1999）や、自己免疫疾患モデル動物を作製し
た（特開平０８−２８９６９９号公報）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】早期診断及び早期治療
をしなければ８０％の患者が１年以内に腎症の悪化によ
り死亡し、そのうち３０％の患者は肺出血によって死亡
するというグッドパスチャー症候群の病態の研究やグッ
ドパスチャー症候群の治療法の開発に有効な動物モデル
は現在まで知られていない。本発明の課題は、その発症
機構を解明するための適切な病態モデルが存在しておら
ず治療方法の開発が遅れているグッドパスチャー症候群
の治療の道を拓くグッドパスチャー症候群モデルマウス
や、これを用いたグッドパスチャー症候群治療薬のスク
リーニング方法を提供することにある。
をしなければ８０％の患者が１年以内に腎症の悪化によ
り死亡し、そのうち３０％の患者は肺出血によって死亡
するというグッドパスチャー症候群の病態の研究やグッ
ドパスチャー症候群の治療法の開発に有効な動物モデル
は現在まで知られていない。本発明の課題は、その発症
機構を解明するための適切な病態モデルが存在しておら
ず治療方法の開発が遅れているグッドパスチャー症候群
の治療の道を拓くグッドパスチャー症候群モデルマウス
や、これを用いたグッドパスチャー症候群治療薬のスク
リーニング方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＦｃγＲ
IIＢの生理的機能の解明について鋭意研究を進めていた
ところ、ＦｃγＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損した
マウス、すなわちＦｃγＲIIＢノックアウトマウスをタ
イプIVコラーゲンで免疫することにより、該ＦｃγＲII
Ｂノックアウトマウスがグッドパスチャー症候群の徴候
を示すことを見い出し、本発明を完成するに至った。
IIＢの生理的機能の解明について鋭意研究を進めていた
ところ、ＦｃγＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損した
マウス、すなわちＦｃγＲIIＢノックアウトマウスをタ
イプIVコラーゲンで免疫することにより、該ＦｃγＲII
Ｂノックアウトマウスがグッドパスチャー症候群の徴候
を示すことを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、免疫グロブリンＦｃγ
レセプターIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス
をタイプIVコラーゲンで免疫することにより得られるこ
とを特徴とするグッドパスチャー症候群モデルマウスに
関する。
レセプターIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス
をタイプIVコラーゲンで免疫することにより得られるこ
とを特徴とするグッドパスチャー症候群モデルマウスに
関する。
【０００９】また本発明は、免疫グロブリンＦｃγレセ
プターIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスをタ
イプIVコラーゲンで免疫する前後又は免疫すると同時
に、該マウスに被検物質を投与し、グッドパスチャー症
候群の発現の程度を指標として評価することを特徴とす
るグッドパスチャー症候群治療薬のスクリーニング方法
や、グッドパスチャー症候群モデルマウスに被検物質を
投与し、グッドパスチャー症候群の発現の程度を指標と
して評価することを特徴とするグッドパスチャー症候群
治療薬のスクリーニング方法や、グッドパスチャー症候
群の発現の程度を指標として評価するに際し、対照とし
て用いた野生型のマウスとの比較評価を行うことを特徴
とする上記グッドパスチャー症候群治療薬のスクリーニ
ング方法や、グッドパスチャー症候群の発現が、びまん
性肺胞出血、糸球体腎炎及び抗腎糸球体基底膜抗体出現
のうちの少なくとも１つであることを特徴とする上記グ
ッドパスチャー症候群治療薬のスクリーニング方法に関
する。
プターIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスをタ
イプIVコラーゲンで免疫する前後又は免疫すると同時
に、該マウスに被検物質を投与し、グッドパスチャー症
候群の発現の程度を指標として評価することを特徴とす
るグッドパスチャー症候群治療薬のスクリーニング方法
や、グッドパスチャー症候群モデルマウスに被検物質を
投与し、グッドパスチャー症候群の発現の程度を指標と
して評価することを特徴とするグッドパスチャー症候群
治療薬のスクリーニング方法や、グッドパスチャー症候
群の発現の程度を指標として評価するに際し、対照とし
て用いた野生型のマウスとの比較評価を行うことを特徴
とする上記グッドパスチャー症候群治療薬のスクリーニ
ング方法や、グッドパスチャー症候群の発現が、びまん
性肺胞出血、糸球体腎炎及び抗腎糸球体基底膜抗体出現
のうちの少なくとも１つであることを特徴とする上記グ
ッドパスチャー症候群治療薬のスクリーニング方法に関
する。
【００１０】さらに本発明は、ヒトの被験細胞からＦｃ
γレセプターIIＢ遺伝子を抽出し、その遺伝子機能の欠
損の有無を調べることを特徴とするグッドパスチャー症
候群の早期診断法をも開示している。
γレセプターIIＢ遺伝子を抽出し、その遺伝子機能の欠
損の有無を調べることを特徴とするグッドパスチャー症
候群の早期診断法をも開示している。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明において、ＦｃγＲIIＢ遺
伝子機能が染色体上で欠損したマウスとは、ＦｃγＲII
Ｂをコードするマウスの内在性遺伝子が破壊・欠損・置
換等の遺伝子変異により不活性化され、ＦｃγＲIIＢを
発現する機能を失なったマウスをいう。
伝子機能が染色体上で欠損したマウスとは、ＦｃγＲII
Ｂをコードするマウスの内在性遺伝子が破壊・欠損・置
換等の遺伝子変異により不活性化され、ＦｃγＲIIＢを
発現する機能を失なったマウスをいう。
【００１２】例えば、ＦｃγＲIIＢ遺伝子機能が染色体
上で欠損したマウス、すなわちＦｃγＲIIＢノックアウ
トマウスは、本発明者らの前掲の文献（Nature 379, 34
6-349, 1996）に記載する方法等によって作製すること
ができる。具体的には、マウス遺伝子ライブラリーから
ＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、Ｆ
ｃγＲIIＢ遺伝子をスクリーニングし、スクリーニング
されたＦｃγＲIIＢ遺伝子をウイルスベクター等を用い
てサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定す
る。このクローンのＳ2エキソン及びＥＣ1エキソンを含
むフラグメントをｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換
することによって、ターゲットベクターを作製する。
上で欠損したマウス、すなわちＦｃγＲIIＢノックアウ
トマウスは、本発明者らの前掲の文献（Nature 379, 34
6-349, 1996）に記載する方法等によって作製すること
ができる。具体的には、マウス遺伝子ライブラリーから
ＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、Ｆ
ｃγＲIIＢ遺伝子をスクリーニングし、スクリーニング
されたＦｃγＲIIＢ遺伝子をウイルスベクター等を用い
てサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定す
る。このクローンのＳ2エキソン及びＥＣ1エキソンを含
むフラグメントをｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換
することによって、ターゲットベクターを作製する。
【００１３】この線状化されたベクターをエレクトロポ
レーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入
し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中か
ら、Ｇ４１８等に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択し、その
細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェ
クションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメ
ラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウ
スとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得
ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタ
ークロスさせることによって、ＦｃγＲIIＢノックアウ
トマウスを得ることができる。
レーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入
し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中か
ら、Ｇ４１８等に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択し、その
細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェ
クションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメ
ラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウ
スとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得
ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタ
ークロスさせることによって、ＦｃγＲIIＢノックアウ
トマウスを得ることができる。
【００１４】本発明において、ＦｃγＲIIＢ遺伝子機能
が染色体上で欠損したマウスにグッドパスチャー症候群
を誘導するために用いられる免疫源としては、タイプIV
コラーゲンを具体的に例示することができるが、Ｆｃγ
ＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスにグッド
パスチャー症候群を誘導することができるものであれ
ば、タイプIVコラーゲンのアミノ酸配列の一部を含むペ
プチドなどどのようなものでもよい。
が染色体上で欠損したマウスにグッドパスチャー症候群
を誘導するために用いられる免疫源としては、タイプIV
コラーゲンを具体的に例示することができるが、Ｆｃγ
ＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスにグッド
パスチャー症候群を誘導することができるものであれ
ば、タイプIVコラーゲンのアミノ酸配列の一部を含むペ
プチドなどどのようなものでもよい。
【００１５】本発明において、グッドパスチャー症候群
モデルマウスとは、びまん性肺胞出血、糸球体腎炎及び
抗腎糸球体基底膜抗体出現の３つの徴候を合わせもつマ
ウスであればどのようなマウスでもよく、例えばＦｃγ
ＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスをタイプ
IVコラーゲンで免疫することにより得ることができる。
モデルマウスとは、びまん性肺胞出血、糸球体腎炎及び
抗腎糸球体基底膜抗体出現の３つの徴候を合わせもつマ
ウスであればどのようなマウスでもよく、例えばＦｃγ
ＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスをタイプ
IVコラーゲンで免疫することにより得ることができる。
【００１６】本発明におけるグッドパスチャー症候群治
療薬のスクリーニング方法としては、ＦｃγＲIIＢ遺伝
子機能が染色体上で欠損したマウスをタイプIVコラーゲ
ンで免疫しグッドパスチャー症候群を誘導する前や後あ
るいはタイプIVコラーゲンで免疫しグッドパスチャー症
候群を誘導すると同時に、該マウスにグッドパスチャー
症候群治療薬の候補となる被検物質を投与し、グッドパ
スチャー症候群の発現（諸症状の出現）の程度を指標と
して評価する方法や、グッドパスチャー症候群モデルマ
ウスにグッドパスチャー症候群治療薬の候補となる被検
物質を投与し、グッドパスチャー症候群の発現の程度を
指標として評価する方法を挙げることができる。
療薬のスクリーニング方法としては、ＦｃγＲIIＢ遺伝
子機能が染色体上で欠損したマウスをタイプIVコラーゲ
ンで免疫しグッドパスチャー症候群を誘導する前や後あ
るいはタイプIVコラーゲンで免疫しグッドパスチャー症
候群を誘導すると同時に、該マウスにグッドパスチャー
症候群治療薬の候補となる被検物質を投与し、グッドパ
スチャー症候群の発現（諸症状の出現）の程度を指標と
して評価する方法や、グッドパスチャー症候群モデルマ
ウスにグッドパスチャー症候群治療薬の候補となる被検
物質を投与し、グッドパスチャー症候群の発現の程度を
指標として評価する方法を挙げることができる。
【００１７】また、グッドパスチャー症候群の発現の程
度を指標として評価するに際し、グッドパスチャー症候
群モデルマウスと同種の野生型のマウスを対照として用
い、グッドパスチャー症候群モデルマウスと対照として
の同種の野生型マウスとにおけるグッドパスチャー症候
群の発現の程度を比較評価することもできる。
度を指標として評価するに際し、グッドパスチャー症候
群モデルマウスと同種の野生型のマウスを対照として用
い、グッドパスチャー症候群モデルマウスと対照として
の同種の野生型マウスとにおけるグッドパスチャー症候
群の発現の程度を比較評価することもできる。
【００１８】グッドパスチャー症候群の発現（諸症状の
出現）の程度の指標としては、肺組織におけるびまん性
肺胞出血、腎組織における糸球体腎炎及び抗腎糸球体基
底膜抗体出現のうちの少なくともいずれか１つを好まし
く例示することができるが、この他、肺胞に沈着してい
る抗基底膜抗体の出現、血清クレアチニンのレベル又は
糸球体ろ過値等を挙げることもできる。このような指標
のうち少なくとも１つについて評価することにより、グ
ッドパスチャー症候群治療薬をスクリーニングすること
ができる。
出現）の程度の指標としては、肺組織におけるびまん性
肺胞出血、腎組織における糸球体腎炎及び抗腎糸球体基
底膜抗体出現のうちの少なくともいずれか１つを好まし
く例示することができるが、この他、肺胞に沈着してい
る抗基底膜抗体の出現、血清クレアチニンのレベル又は
糸球体ろ過値等を挙げることもできる。このような指標
のうち少なくとも１つについて評価することにより、グ
ッドパスチャー症候群治療薬をスクリーニングすること
ができる。
【００１９】本発明のグッドパスチャー症候群の早期診
断法としては、ヒトの被験細胞からＦｃγＲIIＢ遺伝子
を抽出し、その遺伝子機能の欠損の有無を調べることに
より診断する方法を具体的に挙げることができる。そし
て、ＦｃγＲIIＢ遺伝子源としてのヒトの被験細胞とし
ては、例えば、マクロファージ、マスト細胞、Ｂ細胞、
樹状細胞等を挙げることができ、またＦｃγＲIIＢ遺伝
子の遺伝子機能の欠損の有無を調べる方法としては、ク
ローニングされたＦｃγＲIIＢ遺伝子を常法によりヒト
株化細胞で発現させ、この発現産物のＦｃγＲIIＢ機
能、例えばＩｇＧ免疫複合体との結合を調べる方法を例
示することができる。発現産物にＦｃγＲIIＢ機能が欠
損している場合は、グッドパスチャー症候群が発症する
可能性があり、上記のように、ＦｃγＲIIＢ遺伝子の遺
伝子機能の欠損の有無を調べることによりグッドパスチ
ャー症候群の早期診断法が可能となる。
断法としては、ヒトの被験細胞からＦｃγＲIIＢ遺伝子
を抽出し、その遺伝子機能の欠損の有無を調べることに
より診断する方法を具体的に挙げることができる。そし
て、ＦｃγＲIIＢ遺伝子源としてのヒトの被験細胞とし
ては、例えば、マクロファージ、マスト細胞、Ｂ細胞、
樹状細胞等を挙げることができ、またＦｃγＲIIＢ遺伝
子の遺伝子機能の欠損の有無を調べる方法としては、ク
ローニングされたＦｃγＲIIＢ遺伝子を常法によりヒト
株化細胞で発現させ、この発現産物のＦｃγＲIIＢ機
能、例えばＩｇＧ免疫複合体との結合を調べる方法を例
示することができる。発現産物にＦｃγＲIIＢ機能が欠
損している場合は、グッドパスチャー症候群が発症する
可能性があり、上記のように、ＦｃγＲIIＢ遺伝子の遺
伝子機能の欠損の有無を調べることによりグッドパスチ
ャー症候群の早期診断法が可能となる。
【００２０】以下に、実施例等を挙げてこの発明を更に
具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの
実施例に限定されるものではない。参考例（ＦｃγＲII
Ｂ欠損マウスの作製）１２９／Ｓｖ／Ｊ系統由来のマウ
スのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするこ
とによって、ＦｃγＲIIＢ遺伝子のゲノムＤＮＡのクロ
ーンを単離した。このクローンのＳ2及びＥＣ1の２つの
独立したエキソンを含む２．６５Ｋｂのフラグメントを
ｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット（東洋紡社製）に、置換す
ることによってターゲットベクターを作製した。この線
状化したベクターをエレクトロポレーションによってＥ
Ｓ細胞（Ｊ１）に導入し、相同的組換えを行った。
具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの
実施例に限定されるものではない。参考例（ＦｃγＲII
Ｂ欠損マウスの作製）１２９／Ｓｖ／Ｊ系統由来のマウ
スのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするこ
とによって、ＦｃγＲIIＢ遺伝子のゲノムＤＮＡのクロ
ーンを単離した。このクローンのＳ2及びＥＣ1の２つの
独立したエキソンを含む２．６５Ｋｂのフラグメントを
ｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット（東洋紡社製）に、置換す
ることによってターゲットベクターを作製した。この線
状化したベクターをエレクトロポレーションによってＥ
Ｓ細胞（Ｊ１）に導入し、相同的組換えを行った。
【００２１】上記の相同的組換えを起こしたＥＳ細胞か
らＥＳクローンを単離し、Ｇ４１８及びＧＡＮＣ（ガン
シクロビア）に対してネオマイシン耐性ＥＳクローンを
スクリーニングし、サザンブロット法によって相同的組
換え体を同定した。その同定された相同的組換え体から
ゲノムＤＮＡを単離して、ＨｉｎｄIIIでダイジェスト
し、ｐＭＣ１ネオ遺伝子カセットを含むターゲティング
された対立遺伝子を含んでいることを確認した。かかる
確認されたＥＳクローンを胚盤胞中にマイクロインジェ
クションし、キメラマウスを作製し、作製されたマウス
を野生型のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとインタークロスさ
せることによってヘテロ接合体マウスを得て、また、ホ
モ接合体マウスを得るために、このヘテロ接合体マウス
をインタークロスさせて、ＦｃγＲIIＢ遺伝子が染色体
上で欠損した欠損マウス及びその野生型マウスを作製し
た。
らＥＳクローンを単離し、Ｇ４１８及びＧＡＮＣ（ガン
シクロビア）に対してネオマイシン耐性ＥＳクローンを
スクリーニングし、サザンブロット法によって相同的組
換え体を同定した。その同定された相同的組換え体から
ゲノムＤＮＡを単離して、ＨｉｎｄIIIでダイジェスト
し、ｐＭＣ１ネオ遺伝子カセットを含むターゲティング
された対立遺伝子を含んでいることを確認した。かかる
確認されたＥＳクローンを胚盤胞中にマイクロインジェ
クションし、キメラマウスを作製し、作製されたマウス
を野生型のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとインタークロスさ
せることによってヘテロ接合体マウスを得て、また、ホ
モ接合体マウスを得るために、このヘテロ接合体マウス
をインタークロスさせて、ＦｃγＲIIＢ遺伝子が染色体
上で欠損した欠損マウス及びその野生型マウスを作製し
た。
【００２２】実施例１（グッドパスチャー症候群モデル
マウスの作製） １ｍＭのＨＣｌ溶液（ｐＨ３．０）に３ｍｇ／ｍｌの蛋
白濃度で牛水晶体から調製されたセルマトリックスIV
（新田ゼラチン株式会社製）に、最終濃度で１ｍＭにな
るようにＮａＯＨを加えてタイプIVコラーゲン（ｐＨ
８．０）を作製した。このタイプIVコラーゲン（ｐＨ
８．０）３ｍｇ／ｍｌと、流動パラフィン、界面活性剤
及び結核死菌からなる完全フロイントアジュバンド（Ｃ
ＦＡ）３ｍｇ／ｍｌとを連結シリンジ中で混合して、ま
たタイプIVコラーゲン（ｐＨ８．０）３ｍｇ／ｍｌと、
流動パラフィンと界面活性剤とからなる不完全フロイン
トアジュバント（ＩＦＡ）３ｍｇ／ｍｌとを連結シリン
ジ中で混合して、２種類のエマルジョンを作製した。
マウスの作製） １ｍＭのＨＣｌ溶液（ｐＨ３．０）に３ｍｇ／ｍｌの蛋
白濃度で牛水晶体から調製されたセルマトリックスIV
（新田ゼラチン株式会社製）に、最終濃度で１ｍＭにな
るようにＮａＯＨを加えてタイプIVコラーゲン（ｐＨ
８．０）を作製した。このタイプIVコラーゲン（ｐＨ
８．０）３ｍｇ／ｍｌと、流動パラフィン、界面活性剤
及び結核死菌からなる完全フロイントアジュバンド（Ｃ
ＦＡ）３ｍｇ／ｍｌとを連結シリンジ中で混合して、ま
たタイプIVコラーゲン（ｐＨ８．０）３ｍｇ／ｍｌと、
流動パラフィンと界面活性剤とからなる不完全フロイン
トアジュバント（ＩＦＡ）３ｍｇ／ｍｌとを連結シリン
ジ中で混合して、２種類のエマルジョンを作製した。
【００２３】上記参考例記載の方法により作製したＦｃ
γＲIIＢ遺伝子欠損マウス（８週齢：雌雄差なし）をエ
ーテルで麻酔し尾根部を剃毛し、タイプIVコラーゲンと
ＣＦＡとをそれぞれ１５０μｇ含むエマルジョン１００
μｌをマウスの皮内に注射して一次免疫を行い、その一
次免疫後、１４、２８及び４２日目に、タイプIVコラー
ゲンとＩＦＡとをそれぞれ１５０μｇ含むエマルジョン
１００μｌを皮内に注射し、５６日目にマウスを屠殺
し、肺及び腎臓組織を採取した。また、対照としては野
生型マウスを用いた。
γＲIIＢ遺伝子欠損マウス（８週齢：雌雄差なし）をエ
ーテルで麻酔し尾根部を剃毛し、タイプIVコラーゲンと
ＣＦＡとをそれぞれ１５０μｇ含むエマルジョン１００
μｌをマウスの皮内に注射して一次免疫を行い、その一
次免疫後、１４、２８及び４２日目に、タイプIVコラー
ゲンとＩＦＡとをそれぞれ１５０μｇ含むエマルジョン
１００μｌを皮内に注射し、５６日目にマウスを屠殺
し、肺及び腎臓組織を採取した。また、対照としては野
生型マウスを用いた。
【００２４】図１に示すように、タイプIVコラーゲンで
免疫されたＦｃγＲIIＢ遺伝子欠損マウス（ＦｃγＲII
Ｂ-/-）は対照の野生型マウス（ＷＴ）に比べて、肺組
織においてマクロファージや好中球等の炎症細胞浸潤を
含む広い範囲で著しい肺胞出血を示し、また、図２に示
すように、腎組織において糸球体や近位尿細管の変性が
生起しており、糸球体腎炎を主体とする腎病変が生じて
いた。これらの結果から、ＦｃγＲIIＢ遺伝子欠損マウ
スをタイプIVコラーゲンで免疫すると、グッドパスチャ
ー症候群モデルマウスが得られることがわかる。
免疫されたＦｃγＲIIＢ遺伝子欠損マウス（ＦｃγＲII
Ｂ-/-）は対照の野生型マウス（ＷＴ）に比べて、肺組
織においてマクロファージや好中球等の炎症細胞浸潤を
含む広い範囲で著しい肺胞出血を示し、また、図２に示
すように、腎組織において糸球体や近位尿細管の変性が
生起しており、糸球体腎炎を主体とする腎病変が生じて
いた。これらの結果から、ＦｃγＲIIＢ遺伝子欠損マウ
スをタイプIVコラーゲンで免疫すると、グッドパスチャ
ー症候群モデルマウスが得られることがわかる。
【００２５】実施例２（タイプIVコラーゲンに対する抗
体価の検査） ＦｃγＲIIＢノックアウトマウス、ＦｃＲγノックアウ
トマウス、野生型マウスのそれぞれに、タイプIVコラー
ゲンで免疫し、所定期間の後、眼窩より採血を行ない、
文献（Cell. Immunol. 145, 299-310, 1992）記載のＥ
ＬＩＳＡ分析に改良を加えた以下の方法により、タイプ
IVコラーゲンに対する抗体価を検査した。
体価の検査） ＦｃγＲIIＢノックアウトマウス、ＦｃＲγノックアウ
トマウス、野生型マウスのそれぞれに、タイプIVコラー
ゲンで免疫し、所定期間の後、眼窩より採血を行ない、
文献（Cell. Immunol. 145, 299-310, 1992）記載のＥ
ＬＩＳＡ分析に改良を加えた以下の方法により、タイプ
IVコラーゲンに対する抗体価を検査した。
【００２６】リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）１ｍｌに２０μ
ｇのタイプIVコラーゲンを溶解させ、この溶解液を１ウ
ェル当たり５０μｌの割合で用い、９６ウェルマイクロ
プレート（Ｆａｌｃｏｎ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ社製）を４℃にて一晩コーティ
ングした後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０と０．１％の
ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、１ウェル当たり２５
０μｌの０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳで４℃にて一晩
ブロックした。
ｇのタイプIVコラーゲンを溶解させ、この溶解液を１ウ
ェル当たり５０μｌの割合で用い、９６ウェルマイクロ
プレート（Ｆａｌｃｏｎ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ社製）を４℃にて一晩コーティ
ングした後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０と０．１％の
ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、１ウェル当たり２５
０μｌの０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳで４℃にて一晩
ブロックした。
【００２７】次に上記血液から得られた血清を４００〜
２００００倍に希釈し、その希釈した血清を１ウェル当
たり５０μｌの割合で上記９６ウェルマイクロプレート
に加え、４℃にて一晩反応させた。反応後、９６ウェル
マイクロプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳで３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（シ
グマ社製）が結合したヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２
ａ又はＩｇＧ２ｂを２００倍に希釈したものを５０μｌ
加えて、４℃にて２時間インキュベートした。インキュ
ベート後、再び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓで３回洗浄し、０．１ｍｌのTureBlue Peroxidase Su
bstrate（Kirkegaard & Perry Labs社製）と共に３０分
間室温で酵素反応を行った。その後、ミクロプレートリ
ーダー（Biolumin 960；Molecular Dynamics社製）でＯ
Ｄ４５０を測定した。結果を図３に示す。
２００００倍に希釈し、その希釈した血清を１ウェル当
たり５０μｌの割合で上記９６ウェルマイクロプレート
に加え、４℃にて一晩反応させた。反応後、９６ウェル
マイクロプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳで３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（シ
グマ社製）が結合したヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２
ａ又はＩｇＧ２ｂを２００倍に希釈したものを５０μｌ
加えて、４℃にて２時間インキュベートした。インキュ
ベート後、再び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓで３回洗浄し、０．１ｍｌのTureBlue Peroxidase Su
bstrate（Kirkegaard & Perry Labs社製）と共に３０分
間室温で酵素反応を行った。その後、ミクロプレートリ
ーダー（Biolumin 960；Molecular Dynamics社製）でＯ
Ｄ４５０を測定した。結果を図３に示す。
【００２８】これらの結果から、ＦｃγＲIIＢノックア
ウトマウス（IIＢ−ＫＯ）は、ＦｃＲγノックアウトマ
ウス（γ−ＫＯ）や野生型マウス（Wild）に比べて、タ
イプIVコラーゲンに対する抗体価（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２
ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＭ）の上昇が認められ、グッド
パスチャー症候群の所見と矛盾していないことから、グ
ッドパスチャー症候群モデルマウスが作製できたことが
わかった。
ウトマウス（IIＢ−ＫＯ）は、ＦｃＲγノックアウトマ
ウス（γ−ＫＯ）や野生型マウス（Wild）に比べて、タ
イプIVコラーゲンに対する抗体価（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２
ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＭ）の上昇が認められ、グッド
パスチャー症候群の所見と矛盾していないことから、グ
ッドパスチャー症候群モデルマウスが作製できたことが
わかった。
【００２９】
【発明の効果】本発明によると、グッドパスチャー症候
群モデルマウスや、これを用いたグッドパスチャー症候
群治療薬のスクリーニング方法や、グッドパスチャー症
候群の早期診断法を提供することができるので、その発
症機構を解明するための適切な病態モデルが存在してお
らず治療方法の開発が遅れているグッドパスチャー症候
群の治療の道を拓くことができる。
群モデルマウスや、これを用いたグッドパスチャー症候
群治療薬のスクリーニング方法や、グッドパスチャー症
候群の早期診断法を提供することができるので、その発
症機構を解明するための適切な病態モデルが存在してお
らず治療方法の開発が遅れているグッドパスチャー症候
群の治療の道を拓くことができる。
【図１】タイプIVコラーゲン免疫によるグッドパスチャ
ー症候群様の肺胞出血を示す図である。
ー症候群様の肺胞出血を示す図である。
【図２】タイプIVコラーゲン免疫によるグッドパスチャ
ー症候群様の糸球体腎炎を示す図である。
ー症候群様の糸球体腎炎を示す図である。
【図３】タイプIVコラーゲン免疫に対する抗体価のレベ
ルを示す図である。
ルを示す図である。
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平８−289699（ＪＰ，Ａ)
Ｔ．Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ，ｖｏｌ．379，ｐｐ．346−
349（1996)
Ｔ．Ｙｕａｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ.
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．189（１）,
ｐｐ．187−194（1999)
Ｒ．Ｋａｌｌｕｒｉ ｅｔ ａｌ．,
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．，ｖｏｌ．91，ｐｐ．6201
−6205（1994)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A01K 67/027
C12N 15/09
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)
ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)
ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (5)
- 【請求項１】 免疫グロブリンＦｃγレセプターIIＢ遺
伝子機能が染色体上で欠損したマウスをタイプIVコラー
ゲンで免疫することにより得られることを特徴とするグ
ッドパスチャー症候群モデルマウス。 - 【請求項２】 免疫グロブリンＦｃγレセプターIIＢ遺
伝子機能が染色体上で欠損したマウスをタイプIVコラー
ゲンで免疫する前後又は免疫すると同時に、該マウスに
被検物質を投与し、グッドパスチャー症候群の発現の程
度を指標として評価することを特徴とするグッドパスチ
ャー症候群治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項３】 グッドパスチャー症候群モデルマウスに
被検物質を投与し、グッドパスチャー症候群の発現の程
度を指標として評価することを特徴とするグッドパスチ
ャー症候群治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項４】 グッドパスチャー症候群の発現の程度を
指標として評価するに際し、対照として用いた野生型の
マウスとの比較評価を行うことを特徴とする請求項２又
は３記載のグッドパスチャー症候群治療薬のスクリーニ
ング方法。 - 【請求項５】 グッドパスチャー症候群の発現が、びま
ん性肺胞出血、糸球体腎炎及び抗腎糸球体基底膜抗体出
現のうちの少なくとも１つであることを特徴とする請求
項２〜４のいずれか記載のグッドパスチャー症候群治療
薬のスクリーニング方法。
Priority Applications (8)
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|---|---|---|---|
| JP18060099A JP3410679B2 (ja) | 1999-06-25 | 1999-06-25 | グッドパスチャー症候群モデルマウス |
| PCT/JP2000/004132 WO2001000015A1 (fr) | 1999-06-25 | 2000-06-23 | Modele murin du syndrome de goodpasture |
| US10/009,950 US7135607B1 (en) | 1999-06-25 | 2000-06-23 | Goodpasture's syndrome model mouse |
| DE60032366T DE60032366T2 (de) | 1999-06-25 | 2000-06-23 | Mäusemodell für das 'goodpasture-syndrom' |
| CA002375921A CA2375921C (en) | 1999-06-25 | 2000-06-23 | Goodpasture's syndrome model mouse |
| AU55687/00A AU770998B2 (en) | 1999-06-25 | 2000-06-23 | Goodpasture's syndrome model mouse |
| EP00940819A EP1197143B1 (en) | 1999-06-25 | 2000-06-23 | Goodpasture's syndrome model mouse |
| US11/584,649 US20070039062A1 (en) | 1999-06-25 | 2006-10-23 | Goodpasture's syndrome model mouse |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18060099A JP3410679B2 (ja) | 1999-06-25 | 1999-06-25 | グッドパスチャー症候群モデルマウス |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001008576A JP2001008576A (ja) | 2001-01-16 |
| JP3410679B2 true JP3410679B2 (ja) | 2003-05-26 |
Family
ID=16086102
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18060099A Expired - Fee Related JP3410679B2 (ja) | 1999-06-25 | 1999-06-25 | グッドパスチャー症候群モデルマウス |
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|---|---|
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| EP (1) | EP1197143B1 (ja) |
| JP (1) | JP3410679B2 (ja) |
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| WO (1) | WO2001000015A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| AU2005200479B2 (en) * | 2000-05-04 | 2005-02-24 | Silverbrook Research Pty Ltd | Thermal bend actuator |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08289699A (ja) | 1995-04-24 | 1996-11-05 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 自己免疫疾患モデル動物及びその作製方法 |
-
1999
- 1999-06-25 JP JP18060099A patent/JP3410679B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-06-23 EP EP00940819A patent/EP1197143B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-23 AU AU55687/00A patent/AU770998B2/en not_active Ceased
- 2000-06-23 WO PCT/JP2000/004132 patent/WO2001000015A1/ja active IP Right Grant
- 2000-06-23 DE DE60032366T patent/DE60032366T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-23 US US10/009,950 patent/US7135607B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-23 CA CA002375921A patent/CA2375921C/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-10-23 US US11/584,649 patent/US20070039062A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｒ．Ｋａｌｌｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，ｖｏｌ．９１，ｐｐ．６２０１−６２０５（１９９４） |
| Ｔ．Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３７９，ｐｐ．３４６−３４９（１９９６） |
| Ｔ．Ｙｕａｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１８９（１），ｐｐ．１８７−１９４（１９９９） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU770998B2 (en) | 2004-03-11 |
| DE60032366D1 (en) | 2007-01-25 |
| EP1197143B1 (en) | 2006-12-13 |
| CA2375921C (en) | 2006-08-01 |
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| US20070039062A1 (en) | 2007-02-15 |
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| WO2001000015A1 (fr) | 2001-01-04 |
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| EP1197143A4 (en) | 2004-05-26 |
| US7135607B1 (en) | 2006-11-14 |
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