CN111944756A - 一种raw 264.7细胞炎症模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法。该方法首次使用革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌匀浆提取液为刺激物诱导RAW 264.7细胞炎症反应。通过简单的超声和离心步骤获得细菌匀浆提取物，对革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌匀浆提取物按不同的体积比制备刺激物，结果发现不同体积比的制剂的细胞毒性低，均能高效诱导RAW 264.7细胞发生炎症反应。本发明建立的RAW 264.7细胞炎症模型弥补了LPS诱导RAW 264.7炎症模型不稳定的缺点，此外由于包含多种病原相关分子模式，涉及多条信号通路，为抗炎药物及抗炎机制研究提供了更有效的细胞炎症模型，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法。
背景技术
炎症是机体对于内部和外部刺激产生的一种防御性免疫反应，它能够促进机体对组织进行修复和对外界入侵的病原微生物进行清除，在维持机体稳态方面发挥重要作用。然而炎症反应又好比一把双刃剑，适度可控的炎症反应对机体有益，但当炎症得不到消退形成不可控的慢性炎症时会对机体产生危害。目前发现的与慢性炎症有关的疾病有很多，比如类风湿性关节炎、肥胖症、2型糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、红斑狼疮、癌症等。针对慢性炎症引起的疾病，主要的治疗手段是抗炎症治疗。鉴于目前的抗炎症药物的疗效和副作用，开发新型抗炎药物成为研究人员的关注点。
开发抗炎药物离不开细胞和动物炎症模型。细胞炎症模型由于操作简单、成本低、周期短，一直是研究人员进行抗炎药物开发和机制研究的首选。目前常用的细胞炎症模型包括小鼠巨噬细胞RAW 264.7和小鼠小胶质细胞BV2炎症模型。常用的方法就是用细菌脂多糖(LPS)诱导细胞产生炎症反应，用LPS诱导BV2建立炎症模型通常比较容易成功，但是LPS诱导RAW 264.7细胞建立炎症模型却并不稳定，经常会出现不成功或者诱导炎症不显著的情况，大家的解释都是RAW 264.7细胞在诱导前已经被激活分化了。然而如果细胞是被激活分化了怎么可能还能传代培养呢？这其中肯定还有其他原因。由于RAW264.7细胞属于巨噬细胞在炎症反应的研究中使用最多，诱导其活化建立稳定高效的炎症反应模型非常重要。
鉴于单一的LPS诱导RAW 264.7炎症反应不稳定，我采用革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的匀浆提取液为诱导剂，其中不仅包含革兰氏阴性菌的病原相关分子模式LPS、鞭毛素蛋白等，还包含革兰氏阳性菌的病原相关分子模式磷壁酸等。多种病源相关分子的刺激补充单一LPS刺激作用弱的不足，另外不需要昂贵的纯化LPS，制备的刺激物简单、廉价，诱导的炎症反应稳定高效。所建立的RAW 264.7炎症模型，涉及多条信号通路，为抗炎药物及抗炎机制研究提供了更有效的细胞炎症模型。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法。本发明所述RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法高效稳定、操作简单、成本低廉。
本发明的另一目的在于提供通过上述方法建立得到细菌匀浆提取物诱导的RAW264.7细胞炎症模型，为研究炎症机制和筛选抗炎药物提供技术支持和理论基础。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，采用革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌匀浆提取物诱导RAW 264.7细胞炎症反应。
进一步地，所述方法具体包括如下步骤：
(1)将鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别接种于250ml LB培养基培养过夜，分别对菌体进行6000rpm离心分离并用预冷PBS洗涤2-3遍，然后分别对菌体进行冰浴超声破碎，鼠伤寒沙门氏菌超声条件100-200w，10s/20s，10-30min，金黄色葡萄球菌超声条件100-200w，10s/20s，20-40min，将细菌匀浆于4℃，12000rpm离心10min，获取上清并用0.22μm的针孔滤器过滤；
(2)将处于对数期生长的RAW 264.7细胞重悬于细胞培养基，然后将细胞按每孔5000个细胞接种于96孔板中，培养过夜后吸去培养基，然后分别加入含有不同浓度和不同配比的细菌匀浆提取物，其中配比按照金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌匀浆提取物体积比(1:0-0:1)进行配置，浓度分别为1.25-10μl/ml，每个浓度设5个重复孔，同时设置阴性对照和空白对照。培养24h后加入20μl MTT(5mg/ml)，继续培养4h，最后每孔加入100μl DMSO后用酶标仪在550nm波长下测定吸光度；
(3)将处于对数期生长的RAW264.7巨噬细胞以5×104个细胞每孔接种于96孔板，置于5％CO2培养箱，培养过夜后吸去培养基，然后分别加入含有不同浓度和不同配比的细菌匀浆，其中配比按照金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌匀浆提取物体积比(1:0-0:1)进行配置，浓度分别为1.25-10μl/ml，每个浓度设3个重复孔，同时设置阴性对照和LPS组(0.01-10μg/ml)。培养3-24h后收集上清，测定NO的浓度。
优选的，步骤(1)中所述鼠伤寒沙门氏菌超声条件150w，10s/20s，20min，金黄色葡萄球菌超声条件150w，10s/20s，30min。
优选的，步骤(3)中所述金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌匀浆提取物体积比为1:1。
优选的，步骤(3)中所述金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌匀浆提取物浓度为5μl/ml。
优选的，步骤(3)中所述LPS浓度为1μg/ml。
优选的，步骤(3)中所述培养时间为24h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次采用革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的匀浆提取物混合制剂作为刺激物诱导RAW 264.7细胞，建立细胞炎症模型。通过测定NO的水平评价炎症反应，与单一使用纯化LPS相比，所制备的匀浆提取物混合制剂由于含有多种病原相关分子模式能够更加高效稳定地诱导RAW 264.7细胞产生炎症反应，且细菌匀浆提取物混合制剂制备简单、成本较低。本发明建立的RAW 264.7细胞炎症模型弥补了LPS诱导RAW 264.7炎症模型不稳定的缺点，此外由于包含多种病原相关分子模式，涉及多条信号通路，为抗炎药物及抗炎机制研究提供了更有效的细胞炎症模型，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为不同浓度的不同配比的细菌匀浆提取物处理对RAW264.7细胞活力的影响图。
图2为不同浓度的不同配比的细菌匀浆提取物和不同浓度LPS处理对RAW264.7细胞NO分泌水平的影响图。
图3为不同浓度的1:1配比的细菌匀浆提取物处理RAW264.7细胞3、6、12和24h后的NO分泌水平图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步的详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1细菌匀浆提取物混合制剂的制备
将鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别接种于250ml LB培养基培养过夜，分别对菌体进行6000rpm离心分离并用预冷PBS洗涤2遍，用5ml PBS重悬菌体，然后分别对菌体进行冰浴超声破碎，鼠伤寒沙门氏菌超声条件150w，10s/20s，20min，金黄色葡萄球菌超声条件150w，10s/20s，30min，将细菌匀浆于4℃，12000rpm离心10min，获取上清并用0.22μm的针孔滤器过滤。然后将细菌匀浆提取物按不同的体积比进行配置并于-80℃保存。
实施例2细胞毒性分析
将处于对数期生长的RAW 264.7细胞重悬于细胞培养基，然后将细胞按每孔5000个细胞接种于96孔板中，培养过夜后吸去培养基，然后分别加入含有不同浓度和不同配比的细菌匀浆提取物，其中配比按照金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌匀浆提取物体积比(1:0、1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4和0:1)进行配置，浓度分别为1.25μl/ml、2.5μl/ml、5μl/ml和10μl/ml，每个浓度设5个重复孔，同时设置阴性对照和空白对照。培养24h后加入20μlMTT(5mg/ml)，继续培养4h，最后每孔加入100μl DMSO后用酶标仪在550nm波长下测定吸光度，计算细胞活力。结果如图1所示，随着浓度的增加，不同配比的细菌匀浆提取物细胞活力有所下降，但其活力始终保持在92％以上。说明我们制备的细菌匀浆提取物混合制剂的细胞毒性低，适合用于诱导细胞炎症反应建立细胞炎症模型。
实施例3诱导炎症反应
将处于对数期生长的RAW264.7巨噬细胞以5×104个细胞每孔接种于96孔板，置于5％CO2培养箱，培养过夜后吸去培养基，然后分别加入含有不同浓度和不同配比的细菌匀浆，其中配比按照金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌匀浆提取物体积比(1:0、1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4和0:1)进行配置，浓度分别为1.25μl/ml、2.5μl/ml、5μl/ml和10μl/ml，每个浓度设3个重复孔，同时设置阴性对照和LPS组(0.01、0.1、1和10μg/ml)。培养24h后收集上清，测定NO的浓度。结果如图2所示，与阴性对照组相比各处理组均能显著提高RAW264.7巨噬细胞的NO分泌水平，并且随着诱导物浓度的增加而增加，大部分细菌匀浆提取物浓度为5μl/ml时达到最大值，LPS浓度为1μg/ml时达到最大值。所有的细菌匀浆提取物所诱导的NO的最高水平均高于LPS诱导的最大值，其中体积比为1:1组的NO水平最高，为最佳配比。
实施例3细胞炎症模型的建立
将处于对数期生长的RAW264.7巨噬细胞以5×104个细胞每孔接种于96孔板，置于5％CO2培养箱，培养过夜后吸去培养基，然后分别加入含有不同浓度的体积比为1:1的细菌匀浆，浓度分别为1.25μl/ml、2.5μl/ml、5μl/ml和10μl/ml，每个浓度设3个重复孔，同时设置阴性对照和LPS组(0.01、0.1、1和10μg/ml)。分别培养3、6、12和24h后收集上清，测定NO的浓度。结果如图3所示，无论细菌匀浆提取物还是LPS，作用24h后NO水平达到最高值，说明细胞炎症模型诱导的最佳时间是24h。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：采用革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌匀浆提取物诱导RAW 264.7细胞炎症反应。
2.根据权利要求1所述的RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别接种于250ml LB培养基培养过夜，分别对菌体进行6000rpm离心分离并用预冷PBS洗涤2-3遍，然后分别对菌体进行冰浴超声破碎，鼠伤寒沙门氏菌超声条件100-200w，10s/20s，10-30min，金黄色葡萄球菌超声条件100-200w，10s/20s，20-40min，将细菌匀浆于4℃，12000rpm离心10min，获取上清并用0.22μm的针孔滤器过滤；
(2)将处于对数期生长的RAW 264.7细胞重悬于细胞培养基，然后将细胞按每孔5000个细胞接种于96孔板中，培养过夜后吸去培养基，然后分别加入含有不同浓度和不同配比的细菌匀浆提取物，其中配比按照金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌匀浆提取物体积比(1:0-0:1)进行配置，浓度分别为1.25-10μl/ml，每个浓度设5个重复孔，同时设置阴性对照和空白对照。培养24h后加入20μl MTT(5mg/ml)，继续培养4h，最后每孔加入100μl DMSO后用酶标仪在550nm波长下测定吸光度；
(3)将处于对数期生长的RAW264.7巨噬细胞以5×104个细胞每孔接种于96孔板，置于5％CO2培养箱，培养过夜后吸去培养基，然后分别加入含有不同浓度和不同配比的细菌匀浆，其中配比按照金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌匀浆提取物体积比(1:0-0:1)进行配置，浓度分别为1.25-10μl/ml，每个浓度设3个重复孔，同时设置阴性对照和LPS组(0.01-10μg/ml)。培养3-24h后收集上清，测定NO的浓度。
3.根据权利要求1或2所述RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于，所述的细菌为革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌。
4.根据权利要求1或2所述RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于，所述的细菌为革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的超声破碎条件分别是100-200w，10s/20s，10-30min和100-200w，10s/20s，20-40min。
5.根据权利要求1或2所述RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于，所述将细菌匀浆于的离心条件是4℃，12000rpm，10min。
6.根据权利要求1或2所述RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌匀浆提取物体积比分别为1:0、1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4和0:1，浓度分别为1.25μl/ml、2.5μl/ml、5μl/ml和10μl/ml。
7.根据权利要求1或2所述RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于，所述细菌匀浆提取物和LPS对细胞作用时间分别为3、6、12和24h。
8.权利要求1或2所述RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法在抗炎症药物筛选和机制研究中的应用。
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