CN114574427A - 一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法、评价模型及其应用 - Google Patents
一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法、评价模型及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及皮肤炎症治疗用药物、化妆品筛选方法的技术领域，具体公开了一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法、评价模型及其应用。构建方法包括如下步骤：S1、制备致炎产物，并梯度稀释至不同浓度；培养得到HaCaT细胞；S2、于HaCaT细胞内分别添不同浓度的致炎产物，并进行培养；S3、通过监测细胞生长曲线，确定添加浓度，得到评价模型。本申请的评价模型可用于探究金黄色葡萄球菌在皮肤炎性中的反应机制、筛选抗炎原料和/或组合物和/或药物、筛选具有皮肤屏障修复作用的化妆品原料和/或组合物和/或产品中、化妆品安全性和/或功效评价；本申请的评价模型具有操作简单方便且应用广泛的优点。
Description
技术领域
本申请涉及皮肤炎症治疗用药物、化妆品筛选方法的技术领域，更具体地说，它涉及一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法、评价模型及其应用。
背景技术
皮肤作为人体第一道保护屏障，通过物理与生物学屏障阻止外界病原体伤害人体。在免疫系统进行特异性免疫反应之前可以通过皮肤的炎性反应减缓病毒对机体的损伤、减轻组织损伤与细胞坏死并保护人体内部。皮肤的重要组成部分是角质形成细胞，角质形成细胞在皮肤炎症中起到非常重要的作用，也是炎症的基础细胞，它组成了皮肤对外界的天然抗菌屏障。
皮肤炎症反应是指皮肤受到外界的物理（如温度、辐射、机械损伤）、化学或生物化学（如洗涤剂、香皂）、微生物等刺激而诱导细胞（如角质形成细胞、免疫细胞）与血管的一种反应现象。皮肤组织受到外界的刺激后，组成表皮层的主要细胞即角质形成细胞释放促炎因子（如IL-1α、TNF-α），同时释放趋化因子（如IL-8），促炎因子进一步与细胞膜上对应的受体结合激活炎症相关信号通路（如NF-κB通路），从而产生更多的炎症因子，加速花生四烯酸类物质分泌，导致炎症的级联放大。另外趋化因子会诱导免疫细胞如单核细胞发生浸透迁移，从而诱导血管反应，产生红斑等症状。
参与皮肤炎症反应的组份主要是：免疫反应相关细胞（如角质形成细胞和免疫细胞如巨噬细胞）、炎症因子（主要是一些小分子肽类物质，起到诱导和介导趋化的作用）炎性介质（小分子化合物，是花生四烯酸代谢产物，分为前列腺素类和白三烯类）、炎症相关的信号通路（典型的通路如NF-κB信号通路，其中靶点基因主要是参与炎症反应的因子和酶）。
针对以上的炎症组分，也研究出一定的抗炎机制：抑制炎性介质的合成与分泌，主要的靶点是抑制炎性介质合成相关的酶或者标炎性介质，如环氧合酶COX；分泌炎性介质受体拮抗剂，合成释放的炎性介质与其对应的受体结合，激活下游的信号通路，进一步诱导炎症效应反应；抑制炎症因子的合成，主要是通过抑制炎症相关信号通路，典型的炎症相关信号通路为NF-κB。
细菌也是引起皮肤氧化损伤和炎症的元凶之一，其中，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，在皮肤的感染疾病中占据重要地位，是皮炎湿疹患者、特异性皮炎患者感染的主要病原菌之一，同时可以在正常皮肤上被检测到，可引起炎症反应以及皮肤氧化应激反应，严重时造成局部化脓感染。
已有科学家研究关于金黄色葡萄球菌和皮肤微生态及常见皮肤各类疾病反应的关系，也有相应的动物实验基础，但动物模型只能在某些层面模拟疾病发生的状态，与人体存在较大差异，因此建立基于人体皮肤细胞的金黄色葡萄球菌侵染疾病模型是很有必要的。但是，现对于金葡菌的实验主要方向是关于金黄色葡萄球菌的侵染致病，而关于金黄色葡萄球菌致炎或免疫反应得相关研究较少。因此建立简单、易实施的一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型及其构建方法是十分必要的。
发明内容
为了方便简单的获知金黄色葡萄球菌对人体皮肤的致炎或免疫的表现，本申请提供一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法、评价模型及其应用；其中该构建方法及评价模型简单、易实施，并且应用广泛。
第一方面，本申请提供一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法，采用如下的技术方案：
一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
S1、制备致炎产物，并梯度稀释至不同浓度，备用，所述致炎产物由金黄色葡萄球菌增殖和/或代谢后产生；
将复苏后的HaCaT细胞经细胞传代培养后，将对数生长期的HaCaT细胞以6000-100000个细胞/孔的密度接种于培养板上培养后；
S2、于所述培养板上培养有所述HaCaT细胞的不同孔内分别添加梯度稀释至不同浓度的所述致炎产物后，置于实时无标记细胞分析仪上进行培养；
S3、通过实时无标记细胞分析仪监测细胞生长曲线，选择对HaCaT细胞的细胞增殖造成有影响且HaCaT细胞总存活率变化较为稳定的所述致炎产物的添加浓度，用于构建基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型。
通过采用上述技术方案，本申请通过该方法建立金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型，建立方法高效简单、成本低，得到的评价模型稳定。
可选的，于培养板上接种HaCaT细胞后的培养时间为20~30h；步骤S2中，于实时无标记细胞分析仪上进行培养的时间为45~52h。
可选的，所述致炎产物为灭菌的金黄色葡萄球菌液或者去除金黄色葡萄球菌后的金黄色葡萄球菌细胞培养液。
通过采用上述技术方案，金黄色葡萄球菌无法直接接入体外细胞培养体系，所以在实验中需要在保留细菌的致炎性的基础上做到减少细菌本身的活性，故选择经灭菌的金黄色葡萄球菌液或者经去除金黄色葡萄球菌菌体的金黄色葡萄球菌细胞培养液。可选的，致炎产物为经去除金黄色葡萄球菌菌体的金黄色葡萄球菌细胞培养液，其主要成分是多糖、蛋白质等物质，在避免金黄色葡萄球菌菌体本身的前提下，可以保留金黄色葡萄球菌的致炎机理。
可选的，所述构建方法中，以未处理的HaCaT细胞作为阴性对照组。
本申请中，“未处理的HaCaT细胞”指的是未添加任浓度的致炎产物的HaCaT细胞。
可选的，所述金黄色葡萄球菌细胞培养液由包括如下步骤的方法得到：
取金黄色葡萄球菌于LB培养基中培养15~20h后，去除金黄色葡萄球菌菌体，留上清液即为金黄色葡萄球菌细胞培养液。
通过采用上述技术方案，培养得到的金黄色葡萄球菌细胞培养液中不含有金黄色葡萄球菌菌体，且其中含有的蛋白含量为2.45~2.60mg/mL，该蛋白混合物能够使得HaCaT细胞产生炎症反应，从而构建得到基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型。
可选的，步骤S1中，复苏HaCaT细胞的步骤包括：
将HaCaT细胞悬浮于含有包括10Vol.%胎牛血清、1Vol.%青链霉素混合液的DMEM高糖培养基中，培养至细胞占据培养器底面75~85%时即可。
可选的，所述培养条件为：于32~37℃、2~7%二氧化碳以及饱和湿度的条件下培养。
可选的，对复苏后的HaCaT细胞进行细胞传代前，还包括细胞消化的步骤，所述细胞消化采用添加胰酶的方式实现。
第二方面，本申请提供一种采用上述构建方法得到的基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型，采用如下的技术方案：
一种采用上述构建方法得到的基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型，所述评价模型采用包括以下步骤的方法得到：
于HaCaT细胞中添加浓度为10~25Vol.%的所述致炎产物，作用HaCaT细胞10~15h，即得到所述评价模型。
致炎产物的添加浓度即致炎产物添加后在培养基的终体积百分数，例如致炎产物的添加浓度为25%，其添加方式为致炎产物添加体积占50%，DMEM高糖培养基的体积占50%，每孔为100ul加入到96孔板中（孔板中已有100ul完全培养基），最终体积为200ul/孔（96孔板），最终浓度为25%。
通过采用上述技术方案，能够建立完成的刺激损伤模型可从诱发因素和致炎机制上较为完善的模拟金黄色葡萄球菌引起的皮肤炎症反应。其中，致炎产物的浓度越高，作用HaCaT细胞的时间越长，HaCaT细胞的存活率越低。当致炎产物的浓度低于6.25Vol.%时，无论致炎产物作用时间的长短，对比阴性对照组中HaCaT细胞存活率，都不发生明显变化，即视为该浓度下的致炎产物对HaCaT细胞生长无任何抑制作用。申请人发现，当致炎产物的浓度在12.5~25Vol.%之间时，该浓度下的致炎产物对HaCaT细胞的存活率造成一定影响；将该浓度下的致炎产物作用于HaCaT细胞12h后，其对HaCaT细胞的增长、增殖造成一定的影响，且HaCaT细胞的总存活率变化较为稳定。
可选的，所述添加终浓度为12.5~25Vol.%。
可选的，所述添加终浓度为12.5Vol.%。
可选的，评价模型中，通过对相关指标的含量分析来进行炎症评价；所述指标选自细胞活性氧、白介素-1、肿瘤坏死因子、人前列腺素E2、环氧合酶和核因子κB中的至少一种。
通过采用上述技术方案，本申请利用RTCA细胞实时无标记分析技术，建立的金黄色葡萄球菌致炎产物对人表皮HaCaT细胞的炎症损伤模型中，金黄色葡萄球菌的代谢产物可以造成皮肤细胞的毒性损伤和细胞指数降低。在致炎反应中，细胞活性氧（ROS）水平的急速升高能够表明HaCaT细胞开始了自我调节、发生了促炎反应。白介素-1(IL-1)在皮肤免疫系统和皮肤炎症中起到重要的调节作用，IL-1（IL-1α和IL-1β），可与先天免疫系统和后天免疫系统联系起来，在皮肤中提供协同功效，并与肿瘤坏死因子（TNF-α）以及Caspase-1等有一定的关系。细胞在受到致炎产物刺激后，其IL-1含量也可能会有明显上升，表示该刺激条件可以使细胞的IL-1含量上升。而白介素-8(IL-8)是一种具有趋化炎症细胞作用的细胞因子，经由角质形成细胞分泌后，趋化淋巴细胞、中性粒细胞等，激活炎症反应，能产生ROS等相关因子，从而起到调节免疫和炎症反应的作用。此外，炎性模型中，TNF-ɑ和核因子κB（NF-ĸB）分泌量和表达量也可能会有上升。人前列腺素E2(PG-E2)，是一种脂质代谢产物，其特别是炎症反应中会因受到一定刺激时被释放；此外，PG-E2的分泌水平也是炎症标志物环氧合酶（COX-2）的检测标准之一。因此，通过测定以上指标的检测，能够较为完善的反映金黄色葡萄球菌引起皮肤炎症反应时的诱发因素和致炎机制。
第三方面，本申请提供一种上述评价模型的应用，采用如下的技术方案：
上述评价模型的应用，所述应用包括探究金黄色葡萄球菌在皮肤炎性中的反应机制、筛选抗炎原料和/或组合物和/或药物、筛选具有皮肤屏障修复作用的化妆品原料和/或组合物和/或产品中、化妆品安全性和/或功效评价中的至少一种。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、首先本申请提供了一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法，该方法简单且易于操作，得到的基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型稳定且应用广泛。
2、本申请中提出的基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型中，是以于HaCaT细胞中添加浓度为10~25Vol.%的致炎产物来构建诱导损伤，从而引发HaCaT细胞的炎症反应；该评价模型稳定、简单。
3、本申请的评价模型应用广泛，可用于探究皮肤炎症的反应机制；根据该评价模型中各相关指标的变化，也可以用于筛选抗炎原料和/或组合物和/或药物；或者在化妆品方面，筛选具有皮肤屏障修复作用的化妆品原料和/或组合物和/或产品；也能够通过化妆品添加后的炎症反应来判断化妆品的安全性或者缓解炎症的功效评价等；该评价模型应用广范且操作简单。
附图说明
图1是致炎产物中蛋白浓度检测用标准曲线；
图2是本申请实施例1中不同浓度的致炎产物作用24h后HaCaT细胞生长曲线；
图3是不同致炎产物浓度和作用时间对HaCaT细胞存活率的影响图；
图4是不同浓度致炎产物作用12h时HaCaT细胞的显微照片；其中，A是25%致炎产物作用HaCaT细胞12h时的细胞形态图，B是12.5%致炎产物作用HaCaT细胞12h时的细胞形态图，C是6.25%致炎产物作用HaCaT细胞12h时的细胞形态图，D是阴性对照组的HaCaT细胞12h时的细胞形态图；
图5是不同精油对HaCaT损伤模型的修复作用；
图6是炎症修复模型中IL-1的表达量：其中P＜0.001为极显著***，P＜0.01为显著**，P＜0.05为显著*；
图7是炎症修复模型中IL-8的表达量：其中P＜0.001为极显著***，P＜0.01为显著**，P＜0.05为显著*；
图8是炎症修复模型中TNF-α的表达量：其中P＜0.001为极显著***，P＜0.01为显著**，P＜0.05为显著*；
图9是炎症修复模型中NF-ĸB的表达量：其中P＜0.001为极显著***，P＜0.01为显著**，P＜0.05为显著*；
图10是炎症修复模型中PG-E2的表达量：其中P＜0.001为极显著***，P＜0.01为显著**，P＜0.05为显著*；
图11是炎症修复模型中COX-2的表达量：其中P＜0.001为极显著***，P＜0.01为显著**，P＜0.05为显著*。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
致炎产物的制备例
将金黄色葡萄球菌（菌株编号：1.4519，中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)）接种到LB培养基中在摇瓶里培养18h后，按照6000r/min，15min进行离心，提取上清，过滤后得到的菌液，使用分光光度计进行测试，计算得到上清浓度的OD值。
金黄色葡萄球菌致炎产物的分析
由图1蛋白浓度检测标准曲线可以计算出菌液上清中蛋白质含量，y = 0.0007x +0.1294，R2 = 0.9985，将菌液稀释8倍，得到其OD值为y=0.3539，通过反向计算x=320，乘以稀释倍数得到上清液的蛋白浓度为2.56mg/mL，该制备得到的含有蛋白质的上清液即为以下实施例中使用的致炎产物。
实施例
实施例1 基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型及构建方法
一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法，包括如下步骤：
S1、准备致炎产物和HaCaT细胞
取金黄色葡萄球菌经培养后，离心后去除金黄色葡萄球菌菌体，留上清液即为金黄色葡萄球菌细胞培养液（即致炎产物），备用。
HaCaT细胞的制备：
1)、细胞培养：复苏人永生化表皮细胞(HaCaT，来自中国科学院细胞库)，将其悬浮于含10Vol.%胎牛血清（胎牛血清购自Gibco公司）、1Vol.%青链霉素混合液(100X，购自Gibco公司)的DMEM高糖培养基(DMEM高糖培养基购自Gibco公司)中，置于37℃、5%CO2以及饱和湿度的培养箱中进行细胞培养，待细胞培养至占据细胞培养瓶瓶底80%左右且HaCaT细胞生长状态良好时，按比例传代备用。
2)、弃去1)中细胞培养瓶内的液体，用PBS清洗两次，弃去液体，加入胰酶消化；并在显微镜下观察，待HaCaT细胞呈圆球状、不贴壁、可流动时，加入培养基停止消化，得到初始细胞悬浊液。将初始细胞悬浊液转移至离心管内，离心；随后弃去上清液，加入完全培养基吹打均匀，得到细胞悬浊液；然后向新的细胞培养瓶中加入完全培养基和107细胞悬浊液，放入37℃、5%CO2的培养箱中进行细胞培养。
3)、复苏后的HaCaT细胞经过三次传代后可以进行铺板
待细胞长满细胞培养瓶瓶底的80%以上时，可以进行铺板。同细胞传代的步骤，将细胞消化、离心后，加入2mL完全培养基制成细胞悬浊液。将细胞悬浊液吹打30-50次后取出10μL细胞悬浊液与10μL Trypan染色，混合均匀后，加入细胞计数仪进行计数，计算三次，取平均值。将细胞悬浊液稀释成106个/mL备用。
S2、于培养板上的孔内加入3)中制备得到的稀释好的细胞悬浊液，每孔加100μL。HaCaT细胞的不同孔内分别添加不同浓度的致炎产物（即金黄色葡萄球菌细胞培养液）后，置于实时无标记细胞分析仪上进行培养48h。其中，以不做致炎产物添加的组作为细胞阴性组；实验组中，致炎产物在培养基中添加浓度（即致炎产物占培养基的终体积百分数）分别为25%、12.5%、6.25%和3.13%。
基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型中HaCaT细胞的生长曲线、细胞存活率和生物学特性鉴定。致炎产物对HaCaT细胞毒性：收集对数生长期的HaCaT细胞，按照8000个/孔的密度接种于E-plate16培养板，并在RTCA上培养24h左右，分别加入不同浓度的致炎产物，观察48h内细胞生长趋势，以确定后续实验中使用的刺激浓度。致炎产物的添加浓度分别为25%、12.5%、6.25%和3.13%。
通过实时无标记细胞分析仪记录HaCaT细胞的生长曲线如图2所示,细胞存活率如图3所示，细胞状态图如图4所示。
由图2的RTCA分析、图3细胞存活率柱形图及图4致炎产物作用细胞12h的照片可以发现，同一时间不同浓度致炎产物和同一浓度不同时间对细胞指数均有梯度影响。致炎产物的浓度越高，作用细胞时间越长，细胞存活率越低。和细胞阴性组的细胞存活率相比，当致炎产物的浓度低于6.25%时，无论致炎产物的作用时间的长短，实验组的细胞存活率都不发生明显变化，即视为该浓度的致炎产物对HaCaT细胞生长无任何抑制作用。致炎产物浓度在12.5~25%之间时，致炎产物能够对细胞存活率造成一定影响，作用细胞12h后对HaCaT细胞的增殖有一定的影响，且HaCaT细胞的总存活率变化较为稳定。
因此，选用12.5%浓度的致炎产物、作用HaCaT细胞12h来构建基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型。
实施例2 基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的应用
本实施例基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型探究三种不同精油对HaCaT细胞炎症模型的修复作用。
刺激组构建：收集对数生长期HaCaT细胞，并按照8000个/孔的密度接种于E-plate16培养板；然后在RTCA上培养24h后加入12.5Vol.%的和实施例1中相同的致炎产物，并使得致炎产物作用HaCaT细胞12h（即此时细胞培养了36h），构建得到刺激组。
实验组构建：收集对数生长期HaCaT细胞，并按照8000个/孔的密度接种于E-plate16培养板；然后在RTCA上培养24h后加入12.5Vol.%的和实施例1中相同的致炎产物，并使得致炎产物作用HaCaT细胞12h（即此时细胞培养了36h）；随后，用200μL PBS清洗一次，按照表1所示的量分别加入三种精油（佛手柑精油、葡萄柚精油和莱姆精油）作为实验组；其中，三种精油的添加量也是对应精油添加后的终体积百分数。本实施例中的三种精油均为普通市售获得，其中一种购买来源为：莱姆精油购自广州垣鑫，采用冷压法提取得到；佛手柑精油购自上海雅琪，采用冷压法提取得到；葡萄柚精油购自上海雅琪，采用冷压法提取得到；三种精油保存于4℃冰箱。
阴性对照组构建：不对对数生长期HaCaT细胞做致炎产物处理和精油处理。
阳性对照组构建：收集对数生长期HaCaT细胞，并按照8000个/孔的密度接种于E-plate16培养板；然后在RTCA上培养24h后加入12.5Vol.%的和实施例1中相同的致炎产物，并使得致炎产物作用HaCaT细胞12h（即此时细胞培养了36h）；随后，用200μL PBS清洗一次，按照表1所示的量加入地塞米松作为阳性对照组。
表1 不同精油的添加量
其中，精油的添加量是添加后占培养基的终体积比。
如图5所示，结果显示在72 h细胞指数加药组与致炎产物单独作用的刺激组相比细胞曲线明显发生变化。
随后检测各精油对HaCaT细胞炎症模型的修复作用，检测该修复过程中不同指标的变化。
在该评价模型中，12.5%致炎产物处理12h后的HaCaT细胞内ROS水平急速升高(P＜0.05)，说明造模后引起了HaCaT细胞ROS水平的升高，荧光强度显著提高也有所印证，细胞开始自我调节、发生了促炎反应。
白介素-1(IL-1)在皮肤免疫系统和皮肤炎症中起到重要的调节作用，IL-1（IL-1α和IL-1β），可与先天免疫系统和后天免疫系统联系起来，在皮肤中提供协同功效，与TNF-α、Caspase-1等有一定的关系。HaCaT细胞在受到致炎产物刺激后，其IL-1含量有明显上升，表示该刺激条件可以使细胞的IL-1含量上升。白介素-8(IL-8)是一种具有趋化炎症细胞作用的细胞因子，经由角质形成细胞分泌后，趋化淋巴细胞、中性粒细胞等，激活炎症反应，能产生活性氧(ROS)等相关因子，从而起到调节免疫和炎症反应的作用。HaCaT细胞在受到致炎产物刺激后，细胞IL-8分泌量显著上升。
肿瘤坏死因子(TNF-ɑ)是机体炎症反应中的重要细胞因子，并在HaCaT细胞受到刺激后合成，被分泌至局部组织，可与其对应的受体结合同时激活相应的信号通路，调节炎性反应中的趋化因子、粘附分子、二级细胞因子及iNOS等分子的表达而激发皮肤炎症，可以与ILs协同促进HaCaT细胞中炎性因子表达。在炎性模型中，致炎产物刺激HaCaT细胞后，刺激组的TNF-ɑ和NF-ĸB分泌量与表达量有显著上升。
人前列腺素E2(PG-E2)，是一种脂质代谢产物，在受到一定刺激时被释放，特别是炎症反应中。PG-E2通过4种功能相互拮抗的的受体 (E-prostanoidreceptors,EP1、EP2、EP3和EP4)而广泛参与机体及细胞代谢过程。PG-E2的分泌水平也是炎症标志物COX-2的检测标准之一，PG-E2是COX-2的下游信号。在炎症修复模型中，与阴性对照组相比，致炎产物刺激HaCaT细胞后，刺激组的PG-E2和COX-2分泌量有显著上升(P＜0.05)。以上数据表明，建立完成的刺激损伤模型可从诱发因素和致炎机制上较为完善的模拟金黄色葡萄球菌引起的皮肤炎症反应。
具体的结果如下：
I、各精油对HaCaT细胞炎症模型的修复过程中白介素表达分析
I-I、白介素-1的表达分析
取对数生长期、密度为104个/孔的HaCaT细胞，用100μL完全培养基接种于96孔板并培养24h。根据表1的加药量，加入100μL、浓度为25%的致炎产物（该100μL、浓度为25%的致炎产物是将25μL的制备例中得到的致炎产物，和75μL的DMEM高糖培养基混合后得到），再培养12h后，按照表1的药量加入各精油，未加药组为阴性对照。在培养72h后吸出上清液，并在4℃、1000rpm条件下离心15min，并收集上清。然后通过酶联免疫检测法（ELISA）检测上清中炎症相关因子IL-1含量来评价细胞炎症程度。
如图6所示，各精油对HaCaT损伤修复模型中IL-1的含量有影响。细胞在受到致炎产物刺激后，其IL-1含量有明显上升，表示该刺激条件（即12.5Vol.%浓的致炎产物）可以使细胞的IL-1含量上升。并且发现仅有葡萄柚精油、莱姆精油可以抑制受损HaCaT细胞的IL-1的分泌，佛手柑精油及阳性对照组无明显抑制效果，说明葡萄柚精油、莱姆精油可干预HaCaT细胞经致炎产物刺激后产生的IL-1。
I-II、白介素-8的表达分析
取对数生长期、密度为104个/孔的HaCaT细胞，用100μL完全培养基接种于96孔板并培养24h。根据表1的加药量，加入100μL、浓度为25%的致炎产物（该100μL、浓度25%的致炎产物是将25μL的制备例中得到的致炎产物和75μL的DMEM高糖培养基混合后得到），再培养12h后，按照表1的药量加入各精油，未加药组为阴性对照组。在培养72h后吸出上清液，并在4℃、1000rpm条件下离心15min，并收集上清。然后通过酶联免疫检测法（ELISA）检测上清中炎症相关因子IL-8含量来评价细胞炎症程度。
如图7所示，炎症修复模型的IL-8分泌量，可以看出HaCaT细胞在受到致炎产物刺激后，细胞IL-8分泌量显著上升，说明该炎症修复模型可以刺激HaCaT细胞，上调其IL-8的分泌。三种精油及阳性对照组对受损的HaCaT细胞的IL-8的分泌有抑制作用，其中三种柑橘类精油的抑制IL-8效果优于阳性对照组。
II、各精油对HaCaT细胞炎症模型的修复过程中肿瘤坏死因子表达分析
取对数生长期、密度为104个/孔的HaCaT细胞，用100μL完全培养基接种于96孔板并培养24h。根据表1的加药量，加入100μL、浓度为25%的致炎产物（该100μL、浓度25%的致炎产物是将25μL的制备例中得到的致炎产物和75μL的DMEM高糖培养基混合后得到），再培养12h后，按照表1的药量加入各精油，未加药组为阴性对照。在培养72h后吸出上清液，并在4℃、1000rpm条件下离心15min，并收集上清。然后通过酶联免疫检测法（ELISA）检测上清中炎症相关因子TNF-ɑ含量来评价细胞炎症程度。
如图8所示，可以看出在炎症修复模型中，与阴性对照组相比，致炎产物刺激HaCaT细胞后，刺激组的TNF-ɑ分泌量有显著上升，在加入佛手柑精油、葡萄柚精油和阳性对照组的药剂后，TNF-ɑ分泌量明显减少；其中佛手柑精油减少效果最好且优于阳性对照组，莱姆精油作用无法使TNF-ɑ分泌量减少，反而促进TNF-ɑ的分泌。
III、各精油对HaCaT细胞炎症模型的修复过程中NF-ĸB表达分析
取对数生长期、密度为106个/孔的HaCaT细胞，用2.5mL完全培养基接种于6孔板培养24h。根据表1的加药量，加入2.5mL、浓度为25%的致炎产物（该2.5mL、浓度为25%的致炎产物是将0.625mL的制备例中得到的致炎产物，和1.875mL的DMEM高糖培养基混合后得到），再培养12h后，按照表1的药量加入各精油，未加药组为阴性对照组。在培养72h后弃去清液，用冷的PBS清洗细胞后并用200μL裂解液裂解细胞，并在4℃、1400rpm条件下离心4min，并收集上清。然后通过酶联免疫检测法（ELISA）检测上清中炎症相关因子NF-ĸB含量来评价细胞炎症程度。
如图9所示，可以看出在炎症修复模型中，与阴性对照组相比，致炎产物刺激HaCaT细胞后，刺激组的NF-ĸB表达量有显著上升，致炎产物激活了NF-ĸB信号通路。在佛手柑精油、莱姆精油作用HaCaT细胞后，其NF-ĸB表达量有明显下降，葡萄柚精油、阳性对照组的无明显变化；这说明佛手柑、葡萄柚精油可以调节由于致炎产物引起的NF-ĸB的表达。
IV、各精油对HaCaT细胞炎症模型的修复过程中人前列腺素的表达分析
取对数生长期、密度为106个/孔的HaCaT细胞，用2.5mL完全培养基接种于6孔板培养24h。根据表1的加药量，加入2.5mL、浓度为25%的致炎产物（该2.5mL、浓度为25%的致炎产物是将0.625mL的制备例中得到的致炎产物，和1.875mL的DMEM高糖培养基混合后得到），再培养12h后，按照表1的药量加入各精油，未加药组为阴性对照组。在培养72h后弃去清液，用冷的PBS清洗细胞后并用200μL裂解液裂解细胞，并在4℃、1400rpm条件下离心4min，并收集上清。然后通过酶联免疫检测法（ELISA）检测上清中炎症相关因子PG-E2含量来评价细胞炎症程度。
如图10所示，可以看出在炎症修复模型中，与阴性对照组相比，致炎产物刺激HaCaT细胞后，刺激组的PG-E2分泌量有显著上升(P＜0.05)，在加入三种精油和阳性对照组的药剂后，PG-E2分泌量明显减少；佛手柑组和阳性对照组的PG-E2含量显著低于刺激组(P＜0.05)，佛手柑精油、葡萄柚精油减少效果最好且优于阳性对照组，莱姆精油效果弱于阳性对照组。
V、各精油对HaCaT细胞炎症模型的修复过程中环加氧酶的表达分析
取对数生长期、密度为106个/孔的HaCaT细胞，用2.5mL完全培养基接种于6孔板培养24h。根据表1的加药量，加入2.5mL、浓度为25%的致炎产物（该2.5mL、浓度为25%的致炎产物是将0.625mL的制备例中得到的致炎产物，和1.875mL的DMEM高糖培养基混合后得到），再培养12h后，按照表1的药量加入各精油，未加药组为阴性对照组。在培养72h后弃去清液，用冷的PBS清洗细胞后并用200μL裂解液裂解细胞，并在4℃、1400rpm条件下离心4min，并收集上清。然后通过酶联免疫检测法（ELISA）检测上清中炎症相关因子COX-2含量来评价细胞炎症程度。
如图11所示，可以看出在炎症修复模型中，与阴性对照组相比，致炎产物刺激HaCaT细胞后，刺激组的COX-2分泌量有显著上升(P＜0.05)，在加入葡萄柚精油和阳性对照组的药剂后，葡萄柚精油和阳性对照组的COX-2分泌量显著降低(P＜0.05)，佛手柑精油组无显著性降低(P＜0.05)，说明葡萄柚精油可以显著减少COX-2分泌，且优于阳性对照组的药剂效果。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
S1、制备致炎产物，并梯度稀释至不同浓度，备用，所述致炎产物由金黄色葡萄球菌增殖和/或代谢后产生；
将复苏后的HaCaT细胞经细胞传代培养后，将对数生长期的HaCaT细胞以6000-100000个细胞/孔的密度接种于培养板上培养后；
S2、于所述培养板上培养有所述HaCaT细胞的不同孔内分别添加不同浓度的所述致炎产物后，置于实时无标记细胞分析仪上进行培养；
S3、通过实时无标记细胞分析仪监测细胞生长曲线，选择对HaCaT细胞的细胞增殖造成有影响且HaCaT细胞总存活率变化较为稳定的所述致炎产物的添加浓度，用于构建基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，于培养板上接种HaCaT细胞后的培养时间为20~30h；步骤S2中，于实时无标记细胞分析仪上进行培养的时间为45~52h。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述致炎产物为灭菌的金黄色葡萄球菌液或者去除金黄色葡萄球菌后的金黄色葡萄球菌细胞培养液。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌细胞培养液由包括如下步骤的方法得到：
取金黄色葡萄球菌于LB培养基中培养15~20h后，去除金黄色葡萄球菌菌体，留上清液即为金黄色葡萄球菌细胞培养液。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，复苏HaCaT细胞的步骤包括：
将HaCaT细胞悬浮于含有包括8~12Vol.%胎牛血清、0.8~1.3Vol.%青链霉素混合液的DMEM高糖培养基中，培养至细胞占据培养器底面75~85%时即可。
6.一种采用权利要求1-5任一所述构建方法得到的基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型，其特征在于，所述评价模型采用包括以下步骤的方法得到：
于HaCaT细胞中添加浓度为10~25Vol.%的所述致炎产物，作用HaCaT细胞10~15h，即得到所述评价模型。
7.根据权利要求6所述的评价模型，其特征在于，所述添加终浓度为12.5~25Vol.%。
8.根据权利要求6所述的评价模型，其特征在于，所述添加终浓度为12.5Vol.%。
9.根据权利要求6所述的评价模型，其特征在于，评价模型中，通过对相关指标的含量分析来进行炎症评价；所述指标选自细胞活性氧、白介素-1、肿瘤坏死因子、人前列腺素E2、环氧合酶和核因子κB中的至少一种。
10.权利要求6-9任一所述评价模型的应用，其特征在于，所述应用包括探究金黄色葡萄球菌在皮肤炎性中的反应机制、筛选抗炎原料和/或组合物和/或药物、筛选具有皮肤屏障修复作用的化妆品原料和/或组合物和/或产品中、化妆品安全性和/或功效评价中的至少一种。
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| DIANA GUTIÉRREZ ET AL.: "Design and Selection of Engineered Lytic Proteins With Staphylococcus aureus Decolonizing Activity", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》 * |
| JANINA EISENBEISA ET AL.: "The extracellular adherence protein (Eap) of Staphylococcus aureus acts as a proliferation and migration repressing factor that alters the cell morphology of keratinocytes", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MEDICAL MICROBIOLOGY》 * |
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