CN115969938B - 一种用于抑制由猪链球菌感染引起igf-1r转录水平上调的中药方剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于抑制由猪链球菌感染引起IGF‑1R转录水平上调的中药方剂的制备方法，其制备方法包括以下步骤：S1：配药，首先将各种药物按照比重进行配置并准备药物重量10倍的蒸馏水；S2：浸泡，将蒸馏水将药物浸泡30min；S3：一次熬煮，使用武火煮沸后文火熬煮一段时间，收集药液；S4：二次熬煮，收集药液；S5：蒸汽灭菌，合并步骤S3和步骤S4的2次药液，旋转蒸发浓缩至药液中生药含量为1.0g/mL，进行高温高压蒸汽灭菌。所述中药方剂组成为甘草10份，钩藤30份，天麻20份，栀子10份，当归10份，川芎10份，石菖蒲15份，水牛角20份和大青叶10份。本发明基于抑制IGF‑1R转录水平进行药物筛选配伍并制备，为猪链球菌病治疗方法提供新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及猪链球菌性脑膜炎的药物应用技术领域，特别涉及一种用于抑制由猪链球菌感染引起IGF-1R转录水平上调的中药方剂的制备方法
背景技术
猪链球菌是一种革兰氏阳性菌，可引起猪产生脑膜炎、败血症、关节炎和心内膜炎等临床症状。猪链球菌感染范围目前主要在东南亚的猪肉消费和养猪国家，对养猪业造成了巨大的经济损失，成为影响中国养猪业的主要传染病之一。更为重要的是，猪链球菌是一种重要的人畜共患病原体，最公众健康构成重大威胁，主要通过与病猪和猪肉的密切接触从猪传播给人类，可导致人类脑膜炎、链球菌中毒性休克综合征，严重情况下甚至可能导致死亡。无论猪和人，猪链球菌感染最显著的特点都是引起急性脑膜炎，最终导致严重的中枢神经系统（CNS）损害和死亡，死亡率为68%。此外，人感染后会出现严重的后遗症，比如永久性耳聋和心内膜炎。
目前国内外仍以抗生素类治疗为主，但长期使用抗生素类药物治疗畜禽疾病容易造成病原微生物耐药性的产生，且易造成动物性食品药物残留，因此开发无耐药性、毒副作用小的药物有较大的发展前景。
胰岛素样生长因子受体蛋白1（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）为酪氨酸激酶受体家族的主要成员之一，广泛分布于上皮细胞和间充质细胞，在正常生长和发育中起关键作用。研究表明，IGF-1R信号通路的表达与细胞的增殖、分化，抑制凋亡有关，目前在癌症研究（如胰腺癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌的恶性表型的发展和维持）和病毒（如呼吸道合胞病毒、博尔纳病病毒）等治疗疾病方面已有多项研究报道，但目前暂无关于结合IGF-1R信号通路治疗细菌导致脑膜炎的相关研究。并且鬼臼毒素等IGF-1R小分子抑制在使用后普遍都存在毒副作用大、生物利用度低、容易产生耐药性和价格昂贵的缺点，因此在临床治疗中受到限制。
中药资源充裕，价格适中，含有多种营养成分和化学成分，经过数千年的临床实践，具有明确的治疗效果，具有多组分、多靶点、多路径的综合治疗品质，并且不会出现耐药性和药物残留等问题。同时中药对机体的副作用较小，因此在临床上有很好的应用价值。
综上所述，由于该病在公共卫生中的危害性和畜禽养殖中的“限抗令”，我们亟需开发一种安全有效的新型药物来治疗该病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于抑制由猪链球菌感染引起IGF-1R转录水平上调的中药方剂的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于抑制由猪链球菌感染引起IGF-1R转录水平上调的中药方剂的制备方法，包括能下调由猪链球菌引起升高的IGF-1R转录水平的中药药物之间根据中药配伍原则进行配合制备，其制备方法包括以下步骤：
S1：配药，首先将各种药物按照比重进行配置，将药材准备好，然后准备药物重量10倍的蒸馏水；
S2：浸泡，将准备好的药材加入药物重量10倍的蒸馏水将药物浸泡一段时间；
S3：一次熬煮，将浸泡一段时间后的药材，使用武火煮沸后文火熬煮一段时间，对熬制后的药液进行过滤，收集药液；
S4：二次熬煮，准备6倍量药重的蒸馏水，然后往药渣加入6倍量药重的蒸馏水再煎煮一段时间，对熬制后的药液进行过滤，收集药液；
S5：蒸汽灭菌，合并步骤S3和步骤S4的2次药液，旋转蒸发浓缩至药液中生药含量为1.0g/mL，进行高温高压蒸汽灭菌一段时间，然后保存备用。
优选的，所述中药方剂应用到猪链球菌感染小鼠脑膜炎模型和猪链球菌感染hBMEC体内模型进行验证对IGF-1R的作用效果。
优选的，所述步骤S2中的浸泡时间具体为30min，所述步骤S3中的文火熬煮时间具体为15min，所述步骤S4中的文火煎煮时间具体为15min，所述步骤S5中的蒸汽灭菌温度为115℃，时间为15min，且药剂保存的温度为4℃。
优选的，所述下调IGF-1R的中药及及份数包括甘草10份，钩藤30份，天麻20份，栀子10份，当归10份，川芎10份，石菖蒲15份，水牛角20份和大青叶10份。
一种用于抑制由猪链球菌感染引起IGF-1R转录水平上调的中药方剂的制备方法，
实验方法：建立猪链球菌感染小鼠脑膜炎模型，将88只6周龄雌性BALB/C小鼠分为实验组和观察组，实验组随机分成8组，每组5只，观察组随机分为8组，每组6只，分组与实验组相同，各组小鼠分笼饲养，入笼后适应性饲养7天；
给药方案：SC19感染组、中药方剂治疗组、磺胺嘧啶钠治疗组、中药方剂+磺胺嘧啶钠治疗组分别采用尾静脉注射方式进行SC19攻毒，每只注射100μL菌液，攻毒剂量为108CFU/只；其余各组采用尾静脉注射方式注射无菌PBS 100μL/只，攻毒24h后每天固定时间为小鼠给相应药物，连续给药3天，实验组给药3天后处死小鼠，进行后续实验；观察组每日观察小鼠症状并记录各组小鼠死亡率；
载菌量测定：在无菌条件下从实验小鼠中收集脑组织于2mL无菌研磨管中，加入无菌PBS进行匀浆，梯度稀释后取100μL涂布TSA平板，置于37℃培养箱培养16-18h。观察结果并进行SC19计数，单菌落数目在30-300内为有效计数，通过统计和计算确定每克均质组织中CFU数值。
组织IGF-1R和炎症因子水平检测：荧光定量PCR进行检测各组小鼠脑组织IGF-1R和炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平。
组织血脑屏障通透性评估：通过检测各组小鼠脑组织伊文思蓝外渗含量评估血脑屏障通透性。
细胞通透性检测：在Transwell小室中培养hBMEC细胞至致密单层，实验分组使用SC19（108CFU/孔）刺激1.5h后继续添加相应浓度的药物处理hBMEC细胞，并在添加药后3h、6h、9h、12h分别测定上层小室中hBMEC的（Transendothelial electrical resistance，TEER）数值，记录并计算数值下降百分比。
优选的，所述小鼠分组实验组和观察组的8组分别为空白对照组、中药方剂对照组、磺胺嘧啶钠对照组、中药方剂+磺胺嘧啶钠对照组、SC19感染组、中药方剂治疗组、磺胺嘧啶钠治疗组和中药方剂+磺胺嘧啶钠治疗组。
优选的，所述给药方案中的中药方剂约为0.4g/20g，磺胺嘧啶钠约为2mg/20g。
本发明的技术效果和优点：
本发明基于抑制猪链球菌感染引起的IGF-1R转录水平上调结合中药配伍原则进行中药方剂设计和制备，并且选取猪链球菌感染小鼠脑膜炎体外模型和猪链球菌感染hBMEC体内模型评估该中药方剂对IGF-1R转录水平的抑制作用，并且通过实验初步验证该中药方剂的安全性和有效性，从而为猪链球菌病治疗提供新的思路。发现使用该中药方剂能显著降低SC19上调的猪链球菌脑膜炎小鼠脑组织中和猪链球菌感染hBMEC中IGF-1R转录水平，并且改善了猪链球菌感染小鼠脑膜炎模型的症状，同时还能降低猪链球菌感染小鼠的血脑屏障通透性，并发现该中药方剂能够抑制猪链球菌感染小鼠脑组织的炎症反应。另外，该中药方剂与磺胺嘧啶钠联合治疗猪链球菌小鼠脑膜炎时能降低SC19的组织载菌量，降低猪链球菌在脑组织中的耐药性。且选取中药单药在我国产量大且价格低廉，安全有效，为猪链球菌病防治提供了新的思路。
附图说明
图1为各实验组小鼠生存率统计图。
图2为各实验组小鼠体重记录图。
图3为猪链球菌感染小鼠的临床症状图。
图4为各实验组小鼠临床打分情况。
图5为小鼠脑组织载菌量统计图。
图6为伊文思蓝染料对SC19感染小鼠脑组织染色情况图。
图7为小鼠脑组织中伊文思蓝染料含量图。
图8为小鼠脑组织H&E染色病理切片图
图9为小鼠脑组织中炎症因子的表达水平情况图。
图10为小鼠脑组织中IGF-1R表达水平情况图。
图11为不同浓度药物对人脑微血管内皮细胞（hBMEC）细胞活性的影响结果图之一。
图12为hBMEC细胞中IGF-1R表达情况图。
图13为hBMEC细胞通透性的变化情况图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了如图1-13所示的一种治疗猪链球菌性脑膜炎的中药方剂的应用的制备方法：
实施例1：观察中药方剂对猪链球菌感染小鼠脑膜炎的影响。
实验材料
实验动物：
88只6周龄SPF级雌性BALB/C小鼠，体重18-20g。
主要试剂与药物：
中药方剂：甘草、钩藤、天麻、栀子、当归、川芎、石菖蒲、水牛角、大青叶按水煎法煎制，灌服，一天一次，0.4g/20g。
磺胺嘧啶钠：称取适量磺胺嘧啶钠粉末，溶解于去离子水中，配制成1mg/mL的母液，肌肉注射，一天一次，2mg/20g。
胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）：称取TSA粉末40g溶于800mL蒸馏水，定容至1L，分装后于121℃高温高压蒸汽灭菌15min，室温保存。使用前加入5%（v/v）新生牛血清。
猪链球菌SC19株为本室保存。
主要仪器与设备：
电子天平，超净工作台，Bioprep-24生物样品匀质仪。
实验方法
将88只6周龄雌性BALB/C小鼠（18-20g）分为实验组和观察组。实验组随机分成8组，每组5只，分别为空白对照组、中药方剂对照组、磺胺嘧啶钠对照组、中药方剂+磺胺嘧啶钠对照组、SC19感染组、中药方剂治疗组、磺胺嘧啶钠治疗组和中药方剂+磺胺嘧啶钠治疗组。观察组随机分为8组，每组6只，分组与实验组相同。各组小鼠分笼饲养，入笼后适应性饲养7天。
给药方案：SC19感染组、中药方剂治疗组、磺胺嘧啶钠治疗组、中药方剂+磺胺嘧啶钠治疗组分别采用尾静脉注射方式进行SC19攻毒，每只注射100μL菌液，攻毒剂量为108CFU/只；其余各组采用尾静脉注射方式注射无菌PBS 100μL/只。攻毒24h后每天固定时间为小鼠给相应药物（中药方剂约为0.4g/20g，磺胺嘧啶钠约为2mg/20g），连续给药3天。实验组给药3天后处死小鼠，进行后续实验；观察组每日观察小鼠症状并记录各组小鼠死亡率。
小鼠脑组织的猪链球菌载菌量测定：在无菌条件下从实验小鼠中收集脑组织于2mL无菌研磨管中，加入无菌PBS进行匀浆，梯度稀释后取100μL涂布TSA平板，置于37℃培养箱培养16-18h。观察结果并进行SC19计数，单菌落数目在30-300内为有效计数，通过统计和计算确定每克均质组织中CFU数值。
实验结果
结果如图1所示，中药方剂、磺胺嘧啶钠和中药方剂与磺胺嘧啶钠联合治疗组的小鼠存活率均显著高于SC19感染组小鼠，其中联合治疗组的小鼠比未经治疗的小鼠的存活率高83%，说明中药方剂能提高SC19感染小鼠的生存率，并且具有一定安全性和有效性。
经中药方剂治疗后，小鼠的体重显著高于SC19感染组，见图2。
经中药方剂治疗后，各组小鼠症状表现如图3，图3-A所示为空白组小鼠症状，无明显异常组织；图3-B、图3-C和图3-D为SC19感染组小鼠临床症状，多数小鼠表现出脑膜炎典型症状，如抽搐、惊厥、瘫痪、眼睑粘连、消瘦等；而治疗组小鼠均可以显著改善SC19感染组小鼠的临床神经症状，为更直观评估该中药方剂治疗效果，进行了临床症状打分，结果如图4显示，中药方剂与磺胺嘧啶钠联用治疗组的治疗效果最有效。
中药方剂与磺胺嘧啶钠联用能使小鼠脑组织中猪链球菌载菌量较SC19感染组显著减少，说明该中药方剂能降低猪链球菌在脑组织中的耐药性，结果如图5所示。
该项动物实验各项结果证实，中药方剂治疗能显著减轻SC19引起的小鼠脑膜炎临床症状，与磺胺嘧啶钠联用能够抑制猪链球菌在小鼠脑组织内的增殖。
实施例2：观察中药方剂对猪链球菌SC19感染小鼠的血脑屏障通透性影响。
实验动物：
88只6周龄SPF级雌性BALB/C小鼠，体重18-20g。
主要试剂与药物：
中药方剂：甘草、钩藤、天麻、栀子、当归、川芎、石菖蒲、水牛角和大青叶按水煎法煎制，灌服，一天一次，0.4g/20g。
磺胺嘧啶钠：称取适量磺胺嘧啶钠粉末，溶解于去离子水中，配制成1mg/mL的母液，肌肉注射，一天一次，2mg/20g。
伊文思蓝染料：称取0.5g EB溶于50mL蒸馏水配制成1% EB溶液，室温保存备用。
主要仪器与设备：
电子天平，恒温温箱，温控摇床，酶标仪
实验方法
将88只6周龄雌性BALB/C小鼠（18-20g）分为实验组和观察组。实验组随机分成8组，每组5只，分别为空白对照组、中药方剂对照组、磺胺嘧啶钠对照组、中药方剂+磺胺嘧啶钠对照组、SC19感染组、中药方剂治疗组、磺胺嘧啶钠治疗组和中药方剂+磺胺嘧啶钠治疗组。观察组随机分为8组，每组6只，分组与实验组相同。各组小鼠分笼饲养，入笼后适应性饲养7天。
给药方案：同实例1
在小鼠给药3天后，将800μL 1%（w/v）EB经腹腔注射到各组小鼠体内。一小时后，使用异氟烷对小鼠进行麻醉，并将含有肝素钠的PBS经心灌注以冲净血管内的EB，直至灌注液澄清。随后取出小鼠脑组织进行拍照、称重，将脑组织放入3mL甲酰胺37℃水浴72h以浸取EB。最后使用酶标仪测量上清液在620nm处的吸光度，计算EB含量。
实验结果：如图6所示，经过药物治疗后的小鼠中伊文思蓝的渗透明显低于感染猪链球菌SC19小鼠的渗透。同时通过对外渗伊文思蓝的定量评估如图所示，经过中药方剂治疗后能够显著降低脑组织中伊文思蓝外渗含量。
这些数据表明，该中药方剂能显著抑制SC19感染小鼠后的血脑屏障通透性。
实施例3：观察中药方剂对猪链球菌病感染小鼠脑膜炎体内炎症反应的影响。
实验材料
实验动物：
88只6周龄SPF级雌性BALB/C小鼠，体重18-20g。
主要试剂与药物：
中药方剂：甘草、钩藤、天麻、栀子、当归、川芎、石菖蒲、水牛角和大青叶按水煎法煎制，灌服，一天一次，0.4g/20g。
磺胺嘧啶钠：称取适量磺胺嘧啶钠粉末，溶解于去离子水中，配制成1mg/mL的母液，肌肉注射，一天一次，2mg/20g。
反转录试剂盒、SYBR Green Real-time PCR Mix。
主要仪器与设备：
电子天平，LightCycler480荧光定量PCR仪，NanoDrop分光光度计,制冰机，温控摇床，超净工作台，超速冷冻离心机，组织研磨仪。
实验方法
将88只6周龄雌性BALB/C小鼠（18-20g）分为实验组和观察组。实验组随机分成8组，每组5只，分别为空白对照组、中药方剂对照组、磺胺嘧啶钠对照组、中药方剂+磺胺嘧啶钠对照组、SC19感染组、中药方剂治疗组、磺胺嘧啶钠治疗组和中药方剂+磺胺嘧啶钠治疗组。观察组随机分为8组，每组6只，分组与实验组相同。各组小鼠分笼饲养，入笼后适应性饲养7天。
给药方案：同实例1
3天后采集脑组织制备病理组织切片并进行H＆E染色来观察病理变化。取0.1g脑组织提取组织RNA，反转录后进行荧光定量PCR，检测炎症因子表达水平。
实验结果
H＆E染色结果如图8所示，发现经该中药方剂能显著缓解脑膜炎和病理损伤，空白对照组及药物对照组均无明显病理变化，镜下观察切片染色均匀，细胞形态及排列正常；在SC19感染组小鼠可以观察到局部脑膜增厚，有炎性细胞渗出，且脑膜有明显水肿，同时存在脉络膜增厚，脑室有扩张现象的病理变化，说明SC19感染小鼠脑膜炎会导致脑组织病理学损伤。而在各药物治疗组可以观察到小鼠脑组织上述病变有明显改善，仅检出轻微病变，如TCM治疗组和SD-Na治疗组小鼠脑组织炎性渗出减少，存在少量充血，水肿明显减轻，脉络丛无增厚现象；TCM和SD-Na联合治疗组小鼠脑组织未见水肿充血现象，无脑室扩张和脉络丛增厚现象。说明经TCM药物治疗后能明显改善SC19致脑膜炎病理变化。
qRT-PCR检测IL-6、TNF和IL-1β结果见图9，该中药方剂能够显著抑制炎症因子的转录。以上数据表明，该中药方剂对猪链球菌SC19感染小鼠脑膜炎具有良好的抗炎作用。
以上表明，该中药方剂可以减轻SC19感染小鼠体内炎症的发生，显著抑制炎症因子的表达，减轻病理损伤。
实施例4：观察中药方剂对猪链球菌感染小鼠脑膜炎的脑组织中IGF-1R表达的影响。
实验材料
实验动物：
88只6周龄SPF级雌性BALB/C小鼠，体重18-20g。
主要试剂与药物：
中药方剂：甘草、钩藤、天麻、栀子、当归、川芎、石菖蒲、水牛角和大青叶按水煎法煎制，灌服，一天一次，0.4g/20g。
磺胺嘧啶钠：称取适量磺胺嘧啶钠粉末，溶解于去离子水中，配制成1mg/mL的母液，肌肉注射，一天一次，2mg/20g。
反转录试剂盒、SYBR Green Real-time PCR Mix。
主要仪器与设备：
电子天平，LightCycler480荧光定量PCR仪，NanoDrop分光光度计,制冰机，温控摇床，超净工作台，超速冷冻离心机，组织研磨仪。
实验方法
将88只6周龄雌性BALB/C小鼠（18-20g）分为实验组和观察组。实验组随机分成8组，每组5只，分别为空白对照组、中药方剂对照组、磺胺嘧啶钠对照组、中药方剂+磺胺嘧啶钠对照组、SC19感染组、中药方剂治疗组、磺胺嘧啶钠治疗组和中药方剂+磺胺嘧啶钠治疗组。观察组随机分为8组，每组6只，分组与实验组相同。各组小鼠分笼饲养，入笼后适应性饲养7天。
给药方案：同实例1
3天后采集取0.1g脑组织提取组织RNA，反转录后进行荧光定量PCR，检测IGF-1R转录水平。
实验结果
如图10所示，所有经药物治疗3天后的小鼠脑组织中IGF-1R表达量相较于SC19感染组小鼠均显著降低，其中经中药方剂治疗后的小鼠脑组织中IGF-1R表达量降低最为显著，相比于磺胺嘧啶钠治疗组更为明显。
结果表明，该中药方剂能够显著下调SC19感染脑膜炎小鼠脑组织中IGF-1R的表达。
实施例5：观察不同浓度中药方剂对人微血管内皮细胞（hBMEC）活性的影响。
实验材料
主要试剂与药物：
中药方剂及各单药药液：甘草、钩藤、天麻、栀子、当归、川芎、石菖蒲、水牛角和大青叶按水煎法煎制，灌服，一天一次，0.4g/20g。
磺胺嘧啶钠：称取适量磺胺嘧啶钠粉末，溶解于去离子水中，配制成1mg/mL的母液，肌肉注射，一天一次，2mg/20g。
细胞消化液：将胰酶2.5g、NaCl 7.94g、KCl 0.4g、D-葡萄糖1.0g、NaHCO3 0.35g、EDTA·Na2 2g依次溶于900mL的蒸馏水中，待完全溶解后，定容至1L，调整pH至7.2，使用0.22μm滤膜过滤除菌，分装后置-20℃保存备用。
细胞基础培养液（RPMI 1640）：细胞基础培养液(1640)：将一袋1640粉剂、2.0 gNaHCO3完全溶于900 mL超纯水，再用NaOH溶液调节pH值至6.8，随后定容至1 L，最后用0.22μm滤膜过滤除菌，置4℃分装保存。
hBMEC细胞培养液配置：10%的FBS，L-glutamine 200mM、Sodium Pyruvate 100mM、MEM Non-essential Amino Acids Solution 100×、MEM Vitamin Solution 100×各取5mL，MEM Amino Acids Solution 50×取10mL，再加入RPMI 1640培养基至500mL总体积，0.22μM滤器过滤除菌后4℃保存。
胎牛血清（FBS）、CCK-8检测试剂。
主要仪器与设备：
电子天平，酶标仪，倒置显微镜，移液枪。
实验方法
将不同中药药液稀释成浓度分别为0、1、10、50、100、500mg/mL的悬浊液，磺胺嘧啶钠稀释成0、2、10、25、50、100、125、150、200μg/mL的药液。待hBMEC细胞长成致密单层时进行加药（200μL/孔），将细胞培养板置于37℃细胞培养箱中培养48h。
药物处理48h后加入100μL 10% CCK-8溶液，置于37℃培养箱孵育1-3h，每隔30min观察一次孔板中颜色变化，待溶液颜色变为棕黄色时，用酶标仪测定各孔在450nm处的OD值。
实验结果
如图11所示中药方剂在0-50mg/mL浓度范围作用于细胞时，hBMEC的细胞存活率未受影响。磺胺嘧啶钠在0-200μg/mL浓度范围时，细胞存活率不受影响。中药单味药中钩藤、水牛角和天麻在0-100mg/mL浓度范围时，细胞存活率不受影响；石菖蒲、当归、川芎、栀子在0-50mg/mL浓度范围时，细胞存活率不受影响；大青叶和甘草在0-10mg/mL浓度范围时，细胞存活率不受影响。结合实例4中中药方剂与磺胺嘧啶钠联合药敏试验结果，后续实验选取中药浓度为15.625mg/mL结合磺胺嘧啶钠浓度为125μg/mL进行后续细胞实验。
实施例7：观察该中药方剂对猪链球菌SC19感染hBMEC细胞中IGF-1R的影响。
实验材料
主要试剂与药物：
中药方剂及各单药药液：甘草、钩藤、天麻、栀子、当归、川芎、石菖蒲、水牛角和大青叶按水煎法煎制，灌服，一天一次，0.4g/20g。
磺胺嘧啶钠：称取适量磺胺嘧啶钠粉末，溶解于去离子水中，配制成1mg/mL的母液，肌肉注射，一天一次，2mg/20g。
细胞消化液：将胰酶2.5g、NaCl 7.94g、KCl 0.4g、D-葡萄糖1.0g、NaHCO3 0.35g、EDTA·Na2 2g依次溶于900mL的蒸馏水中，待完全溶解后，定容至1L，调整pH至7.2，使用0.22μm滤膜过滤除菌，分装后置-20℃保存备用。
细胞基础培养液（RPMI 1640）：细胞基础培养液(1640)：将一袋1640粉剂、2.0 gNaHCO3完全溶于900 mL超纯水，再用NaOH溶液调节pH值至6.8，随后定容至1 L，最后用0.22μm滤膜过滤除菌，置4℃分装保存。
hBMEC细胞培养液配置：10%的FBS，L-glutamine 200mM、Sodium Pyruvate 100mM、MEM Non-essential Amino Acids Solution 100×、MEM Vitamin Solution 100×各取5mL，MEM Amino Acids Solution 50×取10mL，再加入RPMI 1640培养基至500mL总体积，0.22μM滤器过滤除菌后4℃保存。
胎牛血清（FBS）
猪链球菌SC19为本室保存，反转录试剂盒、SYBR Green Real-time PCR Mix。
主要仪器与设备：
电子天平，倒置显微镜，移液枪、LightCycler480荧光定量PCR仪。
实验方法
培养hBMEC至单层，使用SC19（108CFU）刺激单层hBMEC 1.5h后，添加相应药物处理1.5h，随后采用qRT-PCR检测hBMEC中IGF-1R转录水平。
实验结果
药物包括中药方剂、各单味中药、磺胺嘧啶钠均可降低由SC19感染hBMEC所上调的IGF-1R转录水平，其中中药方剂和两药联用均能极显著下调SC19感染hBMEC中IGF-1R的表达。
实施例8：观察该中药方剂对SC19感染hBMEC后细胞通透性的影响。
实验材料
主要试剂与药物：
中药方剂及各单药药液：甘草、钩藤、天麻、栀子、当归、川芎、石菖蒲、水牛角和大青叶按水煎法煎制，灌服，一天一次，0.4g/20g。
磺胺嘧啶钠：称取适量磺胺嘧啶钠粉末，溶解于去离子水中，配制成1mg/mL的母液，肌肉注射，一天一次，2mg/20g。
细胞消化液：将胰酶2.5g、NaCl 7.94g、KCl 0.4g、D-葡萄糖1.0g、NaHCO3 0.35g、EDTA·Na2 2g依次溶于900mL的蒸馏水中，待完全溶解后，定容至1L，调整pH至7.2，使用0.22μm滤膜过滤除菌，分装后置-20℃保存备用。
细胞基础培养液（RPMI 1640）：细胞基础培养液(1640)：将一袋1640粉剂、2.0 gNaHCO3完全溶于900 mL超纯水，再用NaOH溶液调节pH值至6.8，随后定容至1 L，最后用0.22μm滤膜过滤除菌，置4℃分装保存。
hBMEC细胞培养液配置：10%的FBS，L-glutamine 200mM、Sodium Pyruvate 100mM、MEM Non-essential Amino Acids Solution 100×、MEM Vitamin Solution 100×各取5mL，MEM Amino Acids Solution 50×取10mL，再加入RPMI 1640培养基至500mL总体积，0.22μM滤器过滤除菌后4℃保存。
胎牛血清（FBS）
猪链球菌SC19为本室保存，反转录试剂盒、SYBR Green Real-time PCR Mix。
主要仪器与设备：
电子天平，倒置显微镜， Transwell细胞共培养板，移液枪，跨上皮电阻测量仪EVOM。
实验方法：
在SC19感染单层hBMEC细胞1.5h后，添加相应药物作用于细胞。处理后于37℃培养，并在给药后3h、6h、9h、12h分别使用电阻仪测定不同组hBMEC的跨内皮细胞电阻值（TEER）。
实验结果：
SC19感染hBMEC可以显著下调单层hBMEC的TEER，说明SC19能够增强内皮细胞的通透性，造成血脑屏障损伤。然而添加中药方剂处理后极显著上调了单层hBMEC的TEER，同时中药方剂与磺胺嘧啶钠联用对TEER的上调比单独使用磺胺嘧啶钠更为明显。说明中药方剂能够降低内皮细胞的通透性，改善血脑屏障的损伤，对血脑屏障完整性具有正调控意义。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用于抑制由猪链球菌感染引起IGF-1R转录水平上调的中药组合物的制备方法，其特征在于，能下调由猪链球菌引起升高的IGF-1R转录水平的中药之间根据中药配伍原则进行选择并制备，其制备方法包括以下步骤：
S1：配药，首先将各种药物按照比重进行配置，将药材准备好，然后准备药物重量10倍的蒸馏水；
S2：浸泡，将准备好的药材加入药物重量10倍的蒸馏水将药物浸泡一段时间；
S3：一次熬煮，将浸泡一段时间后的药材，使用武火煮沸后文火熬煮一段时间，对熬制后的药液进行过滤，收集药液；
S4：二次熬煮，准备6倍量药重的蒸馏水，然后往药渣加入6倍量药重的蒸馏水再煎煮一段时间，对熬制后的药液进行过滤，收集药液；
S5：蒸汽灭菌，合并步骤S3和步骤S4的2次药液，旋转蒸发浓缩至药液中生药含量为1.0g/mL，进行高温高压蒸汽灭菌一段时间，然后保存备用；
所述中药组合物由以下重量份数的原料制成：甘草10份，钩藤30份，天麻20份，栀子10份，当归10份，川芎10份，石菖蒲15份，水牛角20份和大青叶10份。
2.根据权利要求1所述的一种用于抑制由猪链球菌感染引起IGF-1R转录水平上调的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述中药组合物应用到猪链球菌感染小鼠脑膜炎体外模型和猪链球菌感染hBMEC细胞体内模型进行验证对IGF-1R转录水平的作用效果。
3.根据权利要求1所述的一种用于抑制由猪链球菌感染引起IGF-1R转录水平上调的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的浸泡时间具体为30min，所述步骤S3中的文火熬煮时间具体为15min，所述步骤S4中的文火煎煮时间具体为15min，所述步骤S5中的蒸汽灭菌温度为115℃，时间为15min，且药剂保存的温度为4℃。
4.一种用于抑制由猪链球菌感染引起IGF-1R转录水平上调的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由以下重量份数的原料组成：甘草10份，钩藤30份，天麻20份，栀子10份，当归10份，川芎10份，石菖蒲15份，水牛角20份和大青叶10份组成。
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