CN108130312B - 一种天麻素在抑制meth诱导sh-sy5y细胞自噬中的应用 - Google Patents

一种天麻素在抑制meth诱导sh-sy5y细胞自噬中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种天麻素在抑制METH诱导SH‑SY5Y细胞自噬中的应用，属于生物医药技术领域。本发明通过体外培养SH‑SY5Y细胞，经不同浓度的METH诱导处理，再经天麻素进行干预，通过显微镜观察细胞形态变化及检测天麻素干预前后LC3‑II、Beclin‑1以及Akt、p‑Akt、mTOR、p‑mTOR的表达情况；其结果表明METH可诱导SY5Y细胞自噬，天麻素可减弱METH诱导的SY5Y细胞自噬，这一作用与天麻素调控Akt和mTOR信号通路密切相关；本发明可为METH滥用者提供治疗的新策略，同时也为中药的研发奠定基础。

Description

一种天麻素在抑制METH诱导SH-SY5Y细胞自噬中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体的涉及一种天麻素在抑制METH诱导SH-SY5Y细胞自噬中的应用。
背景技术
甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)是一种依赖性极高的新型合成毒品，具有精神依赖性强、复吸率高、神经毒性大等特点，长期滥用具有很强的神经毒性和药物依赖性。METH的神经毒性主要与中枢神经系统的多巴胺能信号通路相关，影响多巴胺的释放而导致神经退行性损伤[1]。SH-SY5Y细胞即人神经母细胞瘤细胞，是一种与人类多巴胺能神经细胞具有相似生化特征的细胞株，被广泛用于中枢神经系统神经毒性的研究[2]。目前METH滥用趋势严重，已成为当今全球最严重的公共卫生问题之一。研究表明，自噬参与了METH神经毒性的发生、发展，但自噬在METH神经毒性及其依赖机制中的作用目前尚未完全阐明。
随着METH依赖机制和戒断干预研究的不断深入，寻找戒毒药物逐渐受到重视。天麻素(gastrodin)是天然中药天麻的主要化学成分，是天麻活性成分中含量最高的有效单体成分，其具有镇静催眠、抗癫痫、镇痛、抗氧化、抗炎、增强机体免疫力等作用。此外，研究表明，天麻素具有抗自由基和保护细胞膜、抗氧化、抗细胞凋亡、抑制能量代谢及减少细胞脂肪蓄积以及对多种因素导致的神经元损伤具有保护作用等[3-6]。因此，本研究拟证实METH可诱导SY5Y细胞自噬，并用天麻素进行干预，观察天麻素在METH诱导SY5Y细胞自噬中的作用，并初步探讨其作用机制，为甲基苯丙胺滥用者提供治疗的新策略，同时也为中药的研发奠定基础。
参考文献：
[1]Li X,Wang H,Qiu P,et al.Proteomic profiling of proteinsassociaated with methamphetamine-induced neurotoxicity in different regionsof rat brain[J].Neurochem Int,2008,52(1-2):256-64.
[2]Rabelo T K,Zeidan-chulia F,Vasques L M,et al.Redoxcharacterization of usnic acid and its cytotoxic effect on hunman neuron-likecells(SH-SY5Y)[J].Toxicol In Vitro,2012,26(2):304-14.
[3]陈维红,罗栋.天麻素、天麻多糖药理作用研究进展[J].中国药物评价,2013,30(3):132-4,141.
[4]耿雅娜,于滨,孔维佳.天麻素通过激活AMPK通路减少油酸诱导的HL-7702细胞脂肪蓄积[J].中国药理学通报,2015,31(1):39-44.
[5]赵燕玲,张博爱,贾延劼,等.天麻素对海人酸致大鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用[J].中国实用神经疾病杂志,2009,12(5):33-6.
[6]李海龙,栗艳,厚荣荣,等.天麻素对百草枯和代森锰诱导的小鼠脑黑质多巴胺能神经元损伤作用[J].成都中医药大学学报,2010,33(1):57-9.
发明内容
本发明的目的在于公开一种天麻素在抑制METH诱导SH-SY5Y细胞自噬中的应用，为METH滥用者提供治疗的新策略，同时也为中药的研发奠定基础。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
一种天麻素在抑制METH诱导SH-SY5Y细胞自噬中的应用，其特征在于：天麻素通过增强SH-SY5Y细胞Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达水平，发挥抑制甲基苯丙胺诱导SY5Y细胞自噬的作用。
优选的，所述SH-SY5Y细胞用含15％胎牛血清、1％双抗的DMEM:F12培养基在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每36h换液1次，待细胞长满细胞培养板后，通过胰酶消化液消化并进行传代培养，当培养细胞达到一定数量，且呈现对数生长时待用。
优选的，所述SH-SY5Y细胞的贴壁细胞经胰酶消化制备成单细胞悬液，以4×105～5×105/孔的密度接种于6孔板中，培养36h后，用METH(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3mmol·L-1)处理细胞；
所述METH诱导自噬的浓度是2.0mmol·L-1，提前1h给予1mmol·L-1天麻素干预，随后在显微镜下观察细胞形态学变化，并检测给药前后LC3、Beclin-1、mTOR、p-mTOR、Akt和p-Akt的变化情况。
本发明的有益效果为：本发明通过体外培养SH-SY5Y细胞，经不同浓度的METH诱导处理，再经天麻素进行干预，通过显微镜观察细胞形态变化及检测天麻素干预前后LC3-II、Beclin-1以及Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表达情况；其结果表明METH可诱导SY5Y细胞自噬，天麻素可减弱METH诱导的SY5Y细胞自噬，这一作用与天麻素调控Akt和mTOR信号通路密切相关；本发明可为METH滥用者提供治疗的新策略，同时也为中药的研发奠定基础。
附图说明
图1为实施例METH处理及天麻素干预24小时后细胞形态学变化示意图；
图2为实施例METH对SY5Y细胞自噬相关蛋白LC3-II、Beclin-1表达的影响示意图；
图3为实施例不同时间点METH对SY5Y细胞LC3-II、Beclin-1表达的影响示意图；
图4为实施例天麻素干预前后LC3-II、Beclin-1的表达情况图；
图5为实施例天麻素干预前后SY5Y细胞Akt、p-Akt表达情况示意图；
图6为实施例天麻素干预前后SY5Y细胞mTOR和p-mTOR表达情况示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
1)材料准备
细胞SH-SY5Y细胞株购自国家实验细胞资源共享平台。
试剂METH试剂购自中国药品生物制品检定所；天麻素购自成都思曼特生物科技有限公司；DEME:F12培养基、胎牛血清(Gibco公司)；LC3、Beclin-1、mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt抗体(Abcam公司)；β-actin抗体(Sigma公司)；山羊抗兔和抗鼠二抗(CST公司)；BCA蛋白定量试剂盒、Western blot相关试剂(碧云天生物技术研究所)。
仪器超净工作台(苏州净化公司产品)；CO2恒温培养箱(美国Thermo Fisher公司)；倒置显微镜(Nikon)；CT15RE台式微量高速离心机(Hitachi公司)；Synergy HT酶标仪(美国Bio-Tek公司)；164-5050型Western电泳仪、GelDoc2000型凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；激光共聚焦显微镜(德国徕卡)。
2)实验方法
试剂配制
取20mg METH(分子量185.7)，加2mL PBS溶解，过滤除菌，配制成浓度为53.85mmol·L-1，4℃冰箱保存。取20mg天麻素(分子量为286.28)，溶于2mL PBS中，配制成浓度为83.02mmol·L-1，4℃冰箱保存。
细胞培养
SH-SY5Y细胞用含15％胎牛血清、1％双抗的DMEM:F12培养基在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每36h换液1次，待细胞长满细胞培养板后，通过胰酶消化液消化并进行传代培养，当培养细胞达到一定数量，且呈现对数生长时待用。根据实验方案设计加入不同浓度的METH和天麻素。
细胞药物处理及干预
贴壁细胞经胰酶消化制备成单细胞悬液，以4×105～5×105/孔的密度接种于6孔板中，培养36h后，用METH(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3mmol·L-1)处理细胞。通过检测自噬相关蛋白并结合细胞形态学改变，本研究选择METH诱导自噬的浓度是2.0mmol·L-1，提前1h给予1mmol·L-1天麻素干预，随后在显微镜下观察细胞形态学变化，并检测给药前后LC3、Beclin-1、mTOR、p-mTOR、Akt和p-Akt的变化情况。
免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜分析
对数生长的细胞经胰酶消化后，接种于铺有小玻片的24孔板内，当细胞密度达70％-80％时加药，24h后弃掉每孔内的培养液，用PBS小心漂洗细胞2次，每孔加入1mL 4％多聚甲醛溶液固定20min，漂洗细胞5min×3次；0.5％Triton-X100穿孔30min,漂洗细胞5min×3次；5％山羊血清封闭液封闭30min，漂洗细胞5min×3次；加入一抗(1:200),4℃过夜。漂洗细胞5min×3次，加入1％BSA稀释的二抗(1:200)，于37℃杂交1h，漂洗细胞5min×3次，5mg·L-1DAPI染色2min，漂洗细胞5min×3次，在载玻片上滴1滴抗淬灭剂，随后将小玻片倒扣在载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察结果。
Western blot分析
弃掉每孔内的培养液，用PBS漂洗细胞2次，6孔细胞培养板中每孔加入100μL裂解液，于冰上裂解10-20min后，用细胞刮收集蛋白并移至离心管，于4℃、14000r·min-1离心10min，取上清分装，用BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白混合5×蛋白上样缓冲液，在沸水浴中煮10min进行蛋白变性。SDS-PAGE电泳，半干电转移法将蛋白转至PVDF膜。用5％的脱脂奶粉封闭1h，滴加一抗(1∶1000)4℃过夜，TBST洗膜10min×4次，滴加二抗(1∶5000)室温孵育1h，TBST洗膜10min×4次，用ECL显色液激发化学发光，曝光，β-actin作为内参。应用ImageJ软件对Western blot条带进行灰度值比较。
统计学分析
实验数据均以x±s表示，并应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，组间的比较采用单因素方差分析。
3)结果统计
METH处理24h后细胞形态学变化
如图1所示，图1中B：0.5mmol·L-1METH；C:1.0mmol·L-1METH；D:1.5mmol·L- 1METH；E:2.0mmol·L-1METH；F:2.5mmol·L-1METH；G:3.0mmol·L-1METH；H:1mmol·L-1天麻素；I:1mmol·L-1天麻素+2.0mmol·L-1METH；随着METH浓度的增加，SY5Y细胞胞体逐渐萎缩变圆，突起逐渐变短、消失，同时部分细胞质内可见大小不等的散在性空泡结构形成。当METH浓度达3mmol·L-1时，可见SY5Y细胞失去原形，不贴壁呈漂浮状态。天麻素干预后，细胞折光性增强，胞质内空泡结构减少，部分细胞形态发生变化。
METH对SY5Y细胞自噬相关蛋白LC3-II、Beclin-1表达的影响
如图2所示，与对照组相比，SY5Y细胞LC3-II表达水平随着METH浓度的增加逐渐增强，Beclin-1表达水平升高(P<0.05，P<0.01)。提示METH可诱导SY5Y细胞自噬。
不同时间点METH对SY5Y细胞LC3-II、Beclin-1表达的影响
如图3所示，在不同时间点(6-48h)给予2mmol·L-1METH处理SY5Y细胞，24h后LC3II和Beclin-1水平升高最明显。
天麻素干预前后LC3-II、Beclin-1的表达情况
如图4结果显示，图4中A为Western blot分析图；B为共聚焦显微镜分析图；天麻素+METH组LC3-II的表达水平比METH组有所降低。与对照组相比，METH组LC3-II和Beclin1表达水平明显增强(P<0.01)；与METH组相比，给予天麻素干预后，LC3-II和Beclin1表达水平降低(P<0.05,P<0.01)，说明天麻素对METH诱导的SY5Y细胞自噬有抑制作用。
天麻素干预前后SY5Y细胞Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR表达情况
如图5、6所示，METH处理SY5Y细胞24h后，与对照组相比，mTOR和Akt表达差异无显著性，p-mTOR、p-Akt表达水平明显降低(P<0.01)，说明METH诱导SY5Y细胞自噬与其减弱p-mTOR和p-Akt的表达水平有关。与METH组相比，天麻素干预后，mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt表达水平升高(P<0.05,P<0.01)。说明天麻素通过增强Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达水平，发挥抑制METH诱导SY5Y细胞自噬的作用。
本研究得出，随着METH浓度的增加，SY5Y细胞胞体逐渐萎缩变圆，突起逐渐变短、消失，同时部分细胞质内可见大小不等的散在性空泡形成。当METH浓度达3mmol·L-1时，细胞失去原形，不贴壁呈漂浮状态。说明METH对SY5Y细胞具有一定的毒性作用，同时可诱导细胞质内大量类似自噬泡结构的形成。2mmol·L-1METH处理SY5Y细胞24h后，与对照组相比，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达明显增强，说明METH可诱导SY5Y细胞自噬，且METH处理24h后自噬发生最明显。研究表明，METH可明显诱导神经细胞自噬，METH滥用可使机体产生大量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)，并破坏线粒体功能，从而诱导细胞死亡。随着METH滥用的严重性和影响性，药物戒毒治疗的研究逐渐受到重视。本研究选择云南天然药物天麻素，探讨天麻素在甲基苯丙胺诱导SY5Y细胞自噬中的作用及其作用机制。本研究发现，天麻素干预后，细胞折光性增强，部分细胞形态发生变化，胞质内空泡结构减少。给予2mmol·L-1METH处理前1h加入1mmol·L-1天麻素，与对照组相比，天麻素组表达LC3-Ⅱ差异无显著性，Beclin-1表达水平稍升高。与METH组相比，天麻素+METH组LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平均明显降低，说明天麻素可减弱METH诱导的SY5Y细胞自噬，对METH诱导的SY5Y细胞自噬有一定的抑制作用。
mTOR是调节自噬的负调控因子，当机体处于饥饿状态和产生大量ROS时，mTOR的活性被抑制而激发自噬。本研究检测了天麻素干预前后Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达情况。结果发现，2mmol·L-1METH处理SY5Y细胞24h后，与对照组相比，p-mTOR和p-Akt表达水平明显降低，然而，mTOR和Akt表达无明显差异，说明METH诱导SY5Y细胞自噬与其减弱p-mTOR和p-Akt的表达水平有关。提前1h给予1mmol·L-1天麻素干预后，与METH组相比，天麻素+METH组Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表达水平均升高,说明天麻素通过增强Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达水平，发挥抑制METH诱导SY5Y细胞自噬的作用。
由于METH神经毒性戒断药物的研究目前尚处于起步阶段，本实验通过研究天麻素在METH诱导SY5Y细胞自噬中的作用及机制，揭示了天麻素对METH诱导的SY5Y细胞自噬具有一定的抑制作用，其机制与天麻素调控Akt和mTOR信号通路密切相关。本研究可为METH滥用者提供治疗的新策略，同时也为中药的研发奠定基础。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。

Claims (1)

1.一种天麻素在体外抑制甲基苯丙胺诱导SH-SY5Y细胞自噬中的应用，其特征在于：天麻素通过增强SH-SY5Y细胞Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达水平，发挥抑制甲基苯丙胺诱导SY5Y细胞自噬的作用。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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