CN104560719A - 一种微藻富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微藻富集方法，使用絮凝剂富集微藻后进行采收，其特征在于所述絮凝剂为壳寡糖或水溶性低分子量壳聚糖。壳寡糖优选分子量为800-1000Da，水溶性低分子量壳聚糖优选分子量为4000-5000Da。本发明所述絮凝剂还可以包括聚合氯化铝。本发明使用的壳寡糖或水溶性低分子量壳聚糖安全无毒，与传统无机盐类相比，不会对藻类本身及后续的产业带来影响，是一类环境友好、安全健康的微藻絮凝剂。壳聚糖及其降解产物来源广泛、生产加工及基团结构改性方便，不需要与絮凝微藻二次分离，尤其是水溶性降解产物，还具有增强动物机体的免疫功能，作为微藻采收的预处理剂，具有潜在的而又及其广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种微藻富集方法，特别是使用壳寡糖或水溶性低分子量壳聚糖作为絮凝剂对藻类进行富集采收。
背景技术
海洋和江河湖泊中数量庞大的微藻是重要的生态类群，参与地球的碳、氧循环，同时一些种类富含大量的蛋白质、不饱和脂肪酸以及矿物质而具有极高的营养价值，被广泛用于水产养殖、人类功能食品以及未来生物能源的开发。微藻个体大小从几微米到几十微米之间，通过吸收水体中的无机盐而大量繁殖，因此其大规模培养工艺简单，成本低廉，但其采收一直是制约微藻产业化的瓶颈。有资料表明，微藻采收的成本占其养殖成本的20%～30%。寻求一种高效、安全无毒的采收方法越来越受到人们的关注。
物理方法如电场絮凝、超声波等以及化学方法如Al3+,Fe3+,Ca2+,Mg2+等游离阳离子被广泛用于微藻采收的预处理，但是受场地和设备限制，或是对微藻本身毒性的影响，人们开始把目光转向高分子聚合物，其吸附架桥、吸附电中和和网捕沉淀作用，显见的促沉降效果受到人们的青睐。申请号为201010205681.7的中国专利公开了一种利用含酸性基团的多糖收获微藻的方法，利用带有可解离酸性基团(包括羧基、磷酸基或硫酸基等)的多糖(包括纤维素、海藻酸盐、细菌纤维素、淀粉、壳聚糖、甲壳素等)为絮凝剂，将适当用量的多糖聚电解质溶液添加到微藻悬浮液中，再调节悬浮液pH值，使微藻絮凝沉降，然后静止分层、脱水、干燥，得微藻固体。然而由于多糖是高分子化合物,分子量通常在几十万至上百万,且分子结构紧密,不能溶于水，因此在使用中用量大，且存在与藻类分离困难的问题，限制了其在微藻生产的大规模应用。
发明内容
本发明针对现有技术不足，将水溶性、高活性的壳聚糖降解衍生物用于微藻的絮凝富集，大大提高了微藻的富集效果。
本发明技术方案具体如下：
一种微藻富集方法，使用絮凝剂絮凝微藻后进行采收，所述絮凝剂为壳寡糖或水溶性低分子量壳聚糖。上述壳寡糖优选800-1000Da，所述水溶性低分子量壳聚糖优选为4000-5000Da。
上述微藻富集方法中絮凝剂的用量优选控制壳寡糖在溶液中的终浓度为30-50mg/L，富集前微藻的密度大于1×105个/ml。
上述微藻富集方法优选在pH值大于7的碱性条件下絮凝微藻进行采收。
上述微藻富集方法，絮凝剂还可以包括聚合氯化铝。优选壳寡糖或水溶性低分子量壳聚糖与聚合氯化铝的质量比为5-8:1。。
上述微藻富集方法可广泛用于各种藻类的富集采收，优选绿色巴夫藻或小球藻。
上述微藻富集方法，所述微藻可以为干制的藻类也可以为活体藻类，由于本发明所述的壳寡糖和水溶性低分子量壳聚糖对藻类不但具有很好的富集作用，还能够很好的保持藻类的活性，特别适用于活体藻类的采收。
采用絮凝方法富集水体中的微藻已越来越受到人们的重视。常用的絮凝剂包括各种铁盐、铝盐、高岭土以及各种粘土矿物质等，但是，这些方法均用于水质净化，没有考虑对藻类存活、叶绿素及营养物质含量的影响，以及后续的使用效果。
壳寡糖（chitooligosaccharide，COS）又称低聚葡萄糖胺，低聚氨基葡萄糖等，学名β-1，4-寡糖-葡萄糖胺，是功能性低聚糖的一种，是壳聚糖降解后的产物，聚合度一般在2～10之间，是目前自然界中仅知的唯一的碱性寡糖，具有独特的生物活性，如抗菌抑菌；极强的吸湿保湿性；抑制肿瘤细胞（聚合度为6～8时活性最高）；诱发植物的诱导抗病性等，使其在食品、医药、化妆品和农业等方面有广阔的发展前景。本发明的研究结果表明，壳聚糖的降解产物壳寡糖或水溶性低分子量壳聚糖安全无毒，与传统无机盐类相比，不会对藻类本身及后续的产业带来影响，因此被认为是环境友好、安全健康的微藻絮凝剂。壳聚糖及其降解产物来源广泛、生产加工及基团结构改性方便，不需要与絮凝微藻二次分离，尤其是水溶性降解产物，还具有增强动物机体的免疫功能。因此，作为微藻采收的预处理剂，具有潜在的而又及其广阔的应用前景。
研究发现,低分子量的壳聚糖的生物活性较壳聚糖强。目前开发的水溶性低分子量的壳聚糖及其衍生物主要有羧甲基壳聚糖、壳寡糖、水溶性壳聚糖等，低分子量壳聚糖乙酰基取代度为52.71%，具有壳聚糖自身的特点，化学性质又得到优化。水溶性、螯合性显著增强。
附图说明
图1为壳寡糖对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的作用。
图2为水溶性低分子量壳聚糖对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的作用。
图3为溶液pH值对壳寡糖对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响。
图4为溶液pH值对水溶性低分子量壳聚糖对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响。
图5为不同浓度的聚合氯化铝对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的作用。
图6为壳寡糖/聚合氯化铝混合剂对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的作用。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1壳寡糖和水溶性低分子量壳聚糖的制备
参照文献《系列水溶性壳聚糖衍生物的抑菌性能研究》（杨宇民,马振祥,尹继成,温李楠,陈冠灿.中国公共卫生2005年9月第21卷第9期）公开的方法制备。
壳寡糖的制备：壳聚糖脱乙酰度90.5%,购自南通兴成生化有限公司。准确称取20g壳聚糖放入1L三颈瓶中,加入400ml2%的双氧水溶液,40-50℃下搅拌反应2h。停止反应后,布氏漏斗上抽滤。滤液在旋转蒸发仪上减压蒸馏,浓缩到一定程度后,加入3倍体积的95%乙醇,析出白色沉淀,过滤。将沉淀以尽可能少的水溶解,再加入3倍体积的95%乙醇,过滤。操作重复3次,将沉淀用红外线快速干燥器烘干,真空干燥器中干燥保存。
水溶性低分子量壳聚糖的制备：将10g壳聚糖、60ml20%磷酸放入三颈瓶中,控制温度80-90℃，搅拌,反应2h后,加入乙醇50ml,搅拌回流2h,过滤。用无水乙醇洗涤滤饼3次,烘干,得白色粉末样品，溶于水。
实施例2微藻的培养
绿色巴夫藻（Pavlovaviridis Tseng,Chen et Zhang）和小球藻(Chloreiia spp.)取自江苏省海洋水产研究所。培养基配方和培养方法参照《生物饵料培养》（陈明耀，北京，中国农业出版社.1995，33-71）公开的方法培养。
实施例3不同浓度的壳寡糖和水溶性低分子量壳聚糖对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响
控制绿色巴夫藻和小球藻培养液中壳寡糖和水溶性低分子量壳聚糖的浓度分别为0，10，20，30，40，50mg/L，以50rpm慢速搅拌10min,静置沉淀0.5h后烧杯底部上方约1/3处取样密度测定发现，壳寡糖处理组绿色巴夫藻的密度分别为2.7×105个/ml、3.6×105个/ml、28.9×105个/ml、58.3×105个/ml、385.2×105个/ml以及413.3×105个/ml；小球藻的密度分别为3.2×105个/ml、6.3×105个/ml、41.3×105个/ml、278.4×105个/ml、625.5×105个/ml以及879.7×105个/ml（图1）；水溶性低分子量壳聚糖处理组绿色巴夫藻的密度分别为4.1×105个/ml、7.2×105个/ml、47.6×105个/ml、63.3×105个/ml、318.1×105个/ml以及598.0×105个/ml；WSLC处理组小球藻的密度分别为6.9×105个/ml、17.2×105个/ml、48.1×105个/ml、189.2×105个/ml、560.4×105个/ml以及743.4×105个/ml（图2）。结果表明，浓度大于30mg/L的壳寡糖和水溶性低分子量壳聚糖均有明显的促沉降效果，并呈现浓度依赖性。
实施例4不同酸碱度的壳寡糖和水溶性低分子量壳聚糖对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响
控制培养液中壳寡糖的浓度为40mg/L，用5M HCl或5M NaOH调节培养液pH值分别为5、6、7、8和9。取样检测结果发现，绿色巴夫藻的密度分别为78.9×105个/ml、218.3×105个/ml、412.6×105个/ml、627.4×105个/ml和1125.5×105个/ml；小球藻的密度分别为155.2×105个/ml、283.8×105个/ml、397.6×105个/ml、750.7×105个/ml和992.2×105个/ml（图3）。结果发现，pH值大于7的碱性壳寡糖溶液有利于微藻的沉降。
控制培养液中水溶性低分子量壳聚糖的浓度为40mg/L，用5M HCl或5M NaOH调节培养液pH值分别为5、6、7、8和9。取样检测结果发现，绿色巴夫藻的密度分别为101.3×105个/ml、356.4×105个/ml、398.5×105个/ml、799.5×105个/ml和912.2×105个/ml；小球藻的密度分别为93.2×105个/ml、145.7×105个/ml、420.0×105个/ml、544.7×105个/ml和721.1×105个/ml（图4）。结果同样显示，pH值大于7的碱性水溶性低分子量壳聚糖溶液促进微藻的絮凝富集。
实施例5壳寡糖/聚合氯化铝混合剂对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响
将藻液稀释到适宜浓度,取500mL于800mL烧杯中,置于搅拌器下,加一定体积的100mg/L的壳寡糖母液,以250rpm搅拌1min,再加一定体积的100mg/L聚合氯化铝溶液（PAC，中科院生态环境研究中心提供）,继续搅拌1min后,以50rpm慢速搅拌10min,静置沉淀0.5h,于烧杯底部上方约1/3处取样进行密度测定。
聚合氯化铝被广泛用于水体除藻。为了研究其对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响，本发明采用加入聚合氯化铝至终浓度为0、3、6、9、12、15mg/L沉降0.5h。结果表明，烧杯底部上方1/3处绿色巴夫藻的密度分别为2.9×105个/ml、3.4×105个/ml、103.6×105个/ml、157.7×105个/ml、148.2×105个/ml以及166.6×105个/ml（图5）；烧杯底部上方1/3处小球藻的密度分别为10.1×105个/ml、13.7×105个/ml、80.2×105个/ml、107.6×105个/ml、128.9×105个/ml以及134.5×105个/ml（图5）。研究表明，浓度6mg/L的聚合氯化铝可以有效促进微藻絮凝。
微藻培养液中加入壳寡糖至终浓度为0、10、20、30、40、50mg/L后,搅拌1min，分别加入聚合氯化铝控制浓度为6mg/L，沉降0.5h。结果表明，烧杯底部上方1/3处绿色巴夫藻的密度分别为127.5×105个/ml、287.2×105个/ml、367.2×105个/ml、825.6×105个/ml、1231.2×105个/ml以及1428.6×105个/ml（图6）；小球藻的密度分别为99.3×105个/ml、421.6×105个/ml、514.5×105个/ml、978.7×105个/ml、1113.2×105个/ml、1390.4×105个/ml（图6）。壳寡糖/聚合氯化铝混合剂对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集具有协同效应。
Claims (8)
1.一种微藻富集方法，使用絮凝剂富集微藻后进行采收，其特征在于所述絮凝剂为壳寡糖或水溶性低分子量壳聚糖。
2.如权利要求1所述的微藻富集方法，其特征在于所述壳寡糖为800-1000Da，所述水溶性低分子量壳聚糖为4000-5000Da。
3.如权利要求2所述的微藻富集方法，其特征在于所述壳寡糖浓度为30-50mg/L，微藻的密度为大于1×105个/ml。
4.如权利要求1所述的微藻富集方法，其特征在于在溶液pH值大于7的碱性条件下富集微藻进行采收。
5.如权利要求1所述的微藻富集方法，其特征在于所述絮凝剂还包括聚合氯化铝。
6.如权利要求5所述的微藻富集方法，其特征在于所述壳寡糖或水溶性低分子量壳聚糖与聚合氯化铝的质量比为5-8:1。
7.如权利要求1-6任一项所述所述的微藻富集方法，其特征在于所述微藻为活体藻类。
8.如权利要求7所述的微藻富集方法，其特征在于所述微藻为绿色巴夫藻或小球藻。
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