JP2001523467A - 炎症性疾患のトランスジェニックモデル - Google Patents

炎症性疾患のトランスジェニックモデル

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、１種類またはそれ以上のインターロイキン遺伝子の発現が抑制された哺乳動物を提供する。より詳しくは、本発明は、内因性遺伝子の発現が減少したまたは完全に抑制されたノックアウト非ヒト哺乳動物を生じるためのインターロイキン−１受容体アンタゴニスト遺伝子の不活性欠失に関する。本発明は、このようなノックアウト哺乳動物を製造する方法、およびインターロイキン経路の混乱に関係した疾患または障害を治療する治療薬および治療方式の有効性を評価するためのノックアウト哺乳動物の使用方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 疾病におけるＩＬ−１遺伝子 ＩＬ−１遺伝子クラスターはヒト染色体２の長腕（２ｑ１３）上に位置し、少
なくともＩＬ−１α（ＩＬ１Ａ）、ＩＬ−１β（ＩＬ１Ｂ）、およびＩＬ−１受
容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＮ）を、４３０Ｋｂの領域内に含む（Ｎｉｃｋ
ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９：３８２−４（１９９４））。
アゴニスト分子ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは有効な前炎症活性をもち、多くの
炎症性カスケードを開始させる。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βタンパク質は互い
に３０％未満の相同性であるが、両種とも同一の細胞表面受容体に結合し、サイ
トカインとしてのそれらの生物学的活性は類似するように思われる。ＩＬ−１サ
イトカイン活性は、２種類の天然阻害物質、すなわちＩＬ−１受容体アンタゴニ
ストおよびＩＬ−１タイプＩＩ受容体によりアンタゴナイズされる。ＩＬ−１受
容体アンタゴニストは構造的にはＩＬ−１αおよびＩＬ−１βと相同であり、Ｉ
Ｌ−１タイプＩ受容体に結合するが、生物学的には不活性であり、このためＩＬ
−１の競合阻害物質として機能する。これに対しインターロイキン−１タイプＩ
Ｉ受容体は、タイプＩ受容体へのＩＬ−１の結合を競合阻害することにより、Ｉ
Ｌ−１の作用をアンタゴナイズする。特定の細胞タイプにおいては、ＩＬ−１受
容体アンタゴニストｍＲＮＡはスプライスされてシグナル配列を除かれ、したが
ってそれは分泌されない。ただし細胞内ＩＬ−１受容体アンタゴニストの機能は
分かっていない。
【０００２】 ＩＬ−１受容体アンタゴニストとＩＬ−１タイプＩＩ受容体は、ＩＬ−１機能
の天然アンタゴニストとして重要な役割を果たしていると思われる。不適切なＩ
Ｌ−１産生が、リウマチ様関節炎、炎症性腸障害、Ｉ型糖尿病および乾癬を含め
た多くの自己免疫疾患および炎症性疾患の病理において中心的役割を果たしてい
るらしい。ＩＬ−１ＲＮ対立遺伝子２は、骨粗鬆症（米国特許第５，６９８，３
９９号）、糖尿病における腎障害（Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ
．Ｇｅｎｅｔ．，９７：３６９−７４（１９９６））、円形脱毛症（Ｃｏｒｋ，
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０４（５ Ｓｕｐｐ
．）：１５Ｓ−１６Ｓ（１９９５））、グレーブズ病（Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，８０（１）：１１１−５
（１９９５））、全身性エリテマトーデス（Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．
，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，３７：１３８０−８５（１９９４））、
硬化性苔癬（Ｃｌａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，９４：４０７−
１０（１９９４））、および潰瘍性大腸炎（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．
，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１０６（３）：６３７−４２（１９９４））
に随伴する。
【０００３】 さらに、これらの疾病および状態を発現するリスクが高いことに付随する特定
のヒト多型性の同定によれば、さらに他の疾病および状態にＩＬ−１機能が随伴
していた。たとえば冠動脈疾患（国際特許出願第ＵＳ９８／０４７２５号）には
ＩＬ−１Ｂ（−５１１）対立遺伝子２およびＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝
子２が随伴する。糖尿病性網膜症（国際特許出願第ＧＢ９７／０２７９０号）に
はＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）が随伴する。出産時低体重、妊娠合併症および重症
歯周疾患（米国特許第５，６８６，２４６号）にはＩＬ−１Ａ（−８８９）対立
遺伝子２およびＩＬ−１Ｂ（３９５４）対立遺伝子２が随伴する。ＩＬ−１Ｂ（
３９５４）対立遺伝子２は、ＤＲ３／４患者において乾癬およびインスリン依存
性糖尿病に随伴する（ｄｉ Ｇｉｏｖｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
，７：６０６（１９９５）；Ｐｏｃｉｏｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２２：３９６−４０２（１９９２））。さらに、ＩＬ−１
の産生率には一定の個体差があり、この変異はＩＬ−１遺伝子座における遺伝子
相異により説明できる（Ｍｏｌｖｉｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．，２７：７０５−１６（１９８８）；Ｐｏｃｉｏｔ，ｅｔ ａｌ．，
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２２：３９６−４０２（１９９２））
。さらに、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）の対立遺伝子２は、北米および欧州出身の
コーカソイド集団（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｇａ
ｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．，１０６：６３７−４２）、特に民族的に関連
するアシュケナジム系ユダヤ人集団内（国際特許出願公開第ＷＯ９７／２５４４
５号）における潰瘍性大腸炎に随伴する。
【０００４】 現在、炎症は一般にアテローム性動脈硬化症の病原プロセスの重要な構成要素
とみなされている（Ｍｕｎｒｏ，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５８：２４９−２６
１（１９８８）；Ｂａｄｉｍｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８
７：３−１６（１９９３）；Ｌｉｕｚｚｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅ．Ｊ．Ｍ．，
３３１（７）：４１７−２４（１９９４）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｎ．Ｅ．Ｊ．
Ｍ．，３３１（７）：４６８−９（１９９４））。ＩＬ−１βを含めた数種類の
炎症産物が、アテローム性動脈硬化症病変部または罹患冠動脈内皮に同定された
（Ｇａｌｅａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｔｈ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，
１６：１０００−６（１９９６））。冠動脈疾患を伴う患者では血清ＩＬ−１β
濃度も上昇する（Ｈａｓｄａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ，７６：２４−８（
１９９６））。従来は炎症性物質の存在が損傷や単球活性化に関与すると信じら
れていたが、現在では異常な炎症反応が冠動脈疾患の原因であり、またはこの疾
患の罹患性増大を作り出す可能性があると考えられている。事実、ＣＡＤを伴う
患者では特定のＩＬ−１ＲＮおよびＩＬ−１Ｂ対立遺伝子が過剰発現したことが
認められた（国際特許出願第ＵＳ９８／０４７２５号）。
【０００５】 トランスジェニック動物モデル 遺伝子操作したゲノムをもつ動物には２つの基本的タイプがある。従来のトラ
ンスジェニック哺乳動物のゲノムには修飾された遺伝子が導入されており、その
修飾遺伝子は外因性または内因性いずれの由来のものであってもよい。“ノック
アウト”哺乳動物は、遺伝子操作による内因性遺伝子発現抑制を特徴とする特殊
なタイプのトランスジェニック哺乳動物である。特定の内因性遺伝子の破壊（ｄ
ｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）は、遺伝子の一部を欠失させるかまたはそれを他の配列で
置換してヌル対立遺伝子（ｎｕｌｌ ａｌｌｅｌｅ）を形成することにより達成
できる。ヌル対立遺伝子をもつ哺乳動物を交雑繁殖させると、その遺伝子の有効
コピーを欠如したホモ接合性哺乳動物が形成される。
【０００６】 そのような哺乳動物が多数開発されており、これらは医療開発にきわめて有用
である。たとえば米国特許第４，７３６，８６６号には、癌遺伝子を取り込んだ
トランスジーンを含むマウスが記載されている。米国特許第５，１７５，３８３
号には、ｉｎｔ−２／ＦＧＦファミリーの遺伝子を取り込んだトランスジーンを
含むマウスが記載されている。米国特許第５，６１６，４９１号には、ＣＤ２８
およびＣＤ４５を抑制したノックアウトマウスが記載されている。さらに米国特
許第５，８２４，８３７号には、ヒトＩＬ−１Ｂトランスジーンを発現するトラ
ンスジェニックマウスが記載されている。このトランスジェニックマウスは、Ｉ
Ｌ−１が仲介する特定の炎症プロセスを研究するのに有用である。また国際特許
出願公開第ＷＯ９７２３１２９号には、ＩＬ−１ａを発現するトランスジェニッ
ク動物が記載されており、これはＩＬ−１ａが仲介する炎症プロセスの研究およ
び治療法の開発に利用できる。
【０００７】 ＩＬ−１仲介炎症性疾患のトランスジェニック動物モデルは、炎症性疾患を治
療または予防できる医薬の同定にきわめて有用である。
【０００８】 発明の概要 １態様において本発明は、炎症性障害の処置に有用な薬物または他の療法方式
をインビボでスクリーニングおよび評価する際に用いるトランスジェニック非ヒ
ト生物および細胞系を提供する。１態様において本発明は、インターロイキン−
１遺伝子中にターゲティングした破壊を含むトランスジェニック動物である。特
に、遺伝子はＩＬ−１ＲＮ遺伝子である。動物は、破壊した遺伝子に関してキメ
ラ、ヘテロ接合性またはホモ接合性のいずれであってもよい。ホモ接合性ノック
アウトＩＬ−１ＲＮ哺乳動物は、炎症状態、たとえばリウマチ様関節炎、炎症性
腸障害、Ｉ型糖尿病、乾癬、骨粗鬆症、糖尿病における腎障害、円形脱毛症、グ
レーブズ病、全身性エリテマトーデス、硬化性苔癬、潰瘍性大腸炎、冠動脈疾患
、動脈炎性障害、糖尿病性網膜症、出産時低体重、妊娠合併症、重症歯周疾患、
乾癬およびインスリン依存性糖尿病を発現する傾向が強いが、特に動脈炎性障害
を特徴とする。ターゲティングした破壊は、それが機能性ＩＬ−１ｒａタンパク
質の産生を阻害するという要件に従いさえすれば、遺伝子のいかなる位置であっ
てもよい。好ましい態様において、破壊は野生型遺伝子のエキソン３中のＥｃｏ
ＲＶ部位からエキソン４中の第１ ＸｂａＩ部位まで起きる。トランスジェニッ
ク動物はいかなる種（ヒト以外）であってもよいが、好ましくは哺乳動物である
。好ましい態様において、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト遺伝子中
にターゲティングした破壊をもつ非ヒト動物であって、ターゲティングした破壊
は野生型インターロイキン−１受容体アンタゴニストの産生を阻害し、したがっ
てターゲティングした破壊に関してホモ接合性である非ヒト哺乳動物の表現型は
炎症状態を特徴とする。
【０００９】 他の態様において本発明は、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト遺伝
子中にターゲティングした破壊を含む細胞または細胞系である。好ましい態様に
おいて、この細胞または細胞系は未分化の細胞、たとえば幹細胞、胚性幹細胞、
卵母細胞および胚細胞である。
【００１０】 さらに他の態様において本発明は、インターロイキン−１遺伝子中にターゲテ
ィングした破壊を含む非ヒト哺乳動物の形成方法である。たとえばＩＬ−１ＲＮ
遺伝子の内部部分がマーカーで置換されたＩＬ−１ＲＮ遺伝子の一部を含むノッ
クアウト構築体を形成することができる。次いでこのノックアウト構築体を胚性
幹ｍ（ＥＳ）細胞集団内へトランスフェクションすることができる。次いでその
マーカーを発現するものとして、トランスフェクションされたＥＳ細胞を選択す
ることができる。次いでこのトランスフェクションされたＥＳ細胞をその哺乳動
物の祖先の（ａｎｃｅｓｔｏｒ）胚に導入することができる。その胚を満期（ｔ
ｅｒｍ）まで発生させて、その生殖細胞系列中に前記ノックアウト構築体をもつ
キメラ哺乳動物を形成することができる。そのキメラ哺乳動物を繁殖させると、
ＩＬ−１ＲＮ遺伝子中にターゲティングした破壊をもつホモ接合性哺乳動物が形
成されるであろう。
【００１１】 他の態様において本発明は、ＩＬ−１受容体アンタゴニストノックアウト構築
体である。これは前記動物の形成に使用できる。１態様において、このＩＬ−１
ＲＮ構築体はインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＮ）遺伝
子の一部を含むことができ、このＩＬ−１ＲＮ遺伝子の内部部分が選択マーカー
で置換されている。好ましくはマーカーはｎｅｏ遺伝子であり、ＩＬ−１ＲＮ遺
伝子の部分は少なくとも２．５ｋｂの長さまたは７．０もしくは９．５ｋｂの長
さである（置換された部分とＩＬ−１ＲＮフランキング配列を含めて）。内部部
分は好ましくは少なくともエキソンの一部を包含し、最も好ましくはそれはエキ
ソン３のＥｃｏＲＶ部位からエキソン４のＸｂａＩ部位までである。
【００１２】 さらに他の態様において本発明は、物質を炎症状態の治療および／または予防
における有効性について試験する方法である。１態様において、この方法には前
記のトランスジェニック動物または細胞系を使用できる。たとえば被験物質をト
ランスジェニック動物に投与し、その物質が炎症状態を軽減する能力を炎症状態
に対する有効性をもつものとして採点できる。ＩＬ−１成分を伴ういかなる炎症
状態もこれらの哺乳動物を用いて試験できるが、特に関節炎性病変を特徴とする
状態が試験される。この方法はＩＬ−１炎症性タンパク質およびそれらの下流成
分に対し有効な物質の試験にも利用できる。
【００１３】 ４．発明の詳細な説明 ４．１ 全般 一般に本発明は、１以上のＩＬ−１関連遺伝子がトランスジェニッククローニ
ング法で修飾されたトランスジェニック動物を提供する。これらのＩＬ−１トラ
ンスジェニック動物は、ＩＬ−１が仲介する炎症プロセスを伴う各種疾患の動物
モデルとして有用である。前記の炎症性疾患および状態は大部分が複雑な多因子
病因をもつと思われるが、それらはすべて最終的にはＩＬ−１が仲介する炎症プ
ロセスを伴うと思われる。本発明は、ＩＬ−１が仲介するこれらの炎症プロセス
を妨害し、他の点では異なるこれらの疾患をこれにより遮断することができる物
質、および医薬組成物を見出す方法をも提供する。
【００１４】 好ましい態様において本発明は、マウス染色体２の位置１０．０ｃＭにあるマ
ウスＩＬ−１ＲＮ（インターロイキン−１受容体アンタゴニスト）遺伝子（マウ
スゲノムインフォーマティクス、ｗｗｗ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏ
ｒｇ／）が破壊または欠失され、このためＩＬ−１ＲＮ遺伝子の発現が低下また
は排除されたトランスジェニック“ノックアウト”マウス系である。他の態様に
おいて本発明は、マウス染色体１の位置１９．５ｃＭにあるマウスＩＬ−１タイ
プＩＩ受容体（デコイ受容体）遺伝子（マウスゲノムインフォーマティクス、ｗ
ｗｗ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ／）が破壊または欠失され、こ
のためＩＬ−１タイプＩＩ受容体の発現が低下または排除されたトランスジェニ
ック“ノックアウト”マウス系である。ＩＬ−１ＲＮおよびＩＬ−１タイプＩＩ
受容体のノックアウトマウス系は両方とも、内因性ＩＬ−１アンタゴニスト分子
の喪失により、ＩＬ−１サイトカイン仲介炎症プロセスが亢進している。より好
ましい態様において本発明は、ＩＬ−１ＲＮ遺伝子およびＩＬ−１タイプＩＩ受
容体アンタゴニスト遺伝子の両方の発現が低下した“二重”ノックアウトマウス
系を提供する。
【００１５】 トランスジェニック“ノックアウト”マウス系は、ヘテロ接合性およびホモ接
合性両方のＩＬ−１アンタゴニスト遺伝子ノックアウトマウスを形成するのに有
用であり、これらを用いてＩＬ−１が仲介する炎症性疾患および状態を研究する
ことができる。たとえばＩＬ−１受容体アンタゴニストリガンドの喪失によりＩ
Ｌ−１仲介炎症プロセスの過剰活性が生じ、ＩＬ−１仲介炎症プロセスのこの過
剰活性は下記を含めた多数の疾患および状態の病因となる：リウマチ様関節炎、
炎症性腸障害、Ｉ型糖尿病、乾癬、骨粗鬆症、糖尿病における腎障害、円形脱毛
症、グレーブズ病、全身性エリテマトーデス、硬化性苔癬、潰瘍性大腸炎、冠動
脈疾患、動脈炎性障害、糖尿病性網膜症、出産時低体重、妊娠合併症、重症歯周
疾患、乾癬およびインスリン依存性糖尿病ならびに動脈炎性病変。
【００１６】 慢性形および急性形のこのような炎症性疾患および状態を、適切なＩＬ−１Ｒ
Ｎノックアウト動物または動物系において再現することができる。たとえばＩＬ
−１ＲＮノックアウト構築体に関してヘテロ接合性である動物は、インターロイ
キン−１受容体アンタゴニスト産生能が低下しており、したがってこれに対応し
て増強されたＩＬ−１仲介炎症プロセスを示す。したがってヘテロ接合性マウス
系は、慢性炎症性疾患および状態の状況を再現することができる。さらに、これ
らのヘテロ接合性動物または細胞系は、減少した内因性ＩＬ−１受容体アンタゴ
ニストプールの発現または活性を増強する作用をもつ療法薬を見出すのに好適で
ある。そのような受容体アンタゴニスト“アゴニスト”は、たとえば残ったＩＬ
−１ＲＮ遺伝子コピーの発現を高めるものであってもよい。これに対しホモ接合
性ＩＬ−１ＲＮ“ノックアウト”動物および系は、ＩＬ−１ＲＮ遺伝子産物を産
生する能力をもたず、したがってこれに対応してＩＬ−１ＲＮ仲介プロセスの大
幅な亢進を示す。したがってホモ接合性動物および系は、急性炎症性疾患におい
て起きる異常な免疫機能を再現する。さらにこれらのホモ接合性動物および系は
、たとえばインターロイキン−１ａおよび／またはインターロイキン−１ｂに結
合してそれらとインターロイキン受容体との相互作用を阻止することによりイン
ターロイキン−１受容体アンタゴニストの分子模倣体として機能する療法用ＩＬ
−１ＲＮアゴニストを見出すのに好適である。
【００１７】 本発明はさらに、ＩＬ−１ＲＮ“ノックアウト”およびＩＬ−１ＲＮ“ノック
イン”トランスジェニックマウス細胞系およびトランスジェニックマウスの形成
に有用な種々の核酸構築体を提供する。たとえば遺伝子の染色体コピーにレポー
ターまたはマーカー遺伝子（たとえばβ−ガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タン
パク質）を取込ませるようにＩＬ−１ＲＮ破壊構築体を工学的に形成し、これに
より得られるキメラレポーター遺伝子を、その発現に関して内因性ＩＬ−１ＲＮ
遺伝子プロモーター依存性にすることができる。このような“ノックイン”構築
体を取込んだトランスジェニック細胞系および動物は、ＩＬ−１受容体アンタゴ
ニスト遺伝子の転写を高めることによりＩＬ−１依存性炎症プロセスを抑制する
能力について化合物をスクリーニングするのに特に好適である。他の例では、Ｉ
Ｌ−１ＲＮ遺伝子座に異種の調節可能なプロモーターを“ノックイン”し、これ
によりＩＬ−１受容体アンタゴニスト発現をこの調節可能なプロモーターにより
制御することができる。調節可能なプロモーターは、誘導性プロモーター、抑制
性プロモーター、または発生的に調節可能なプロモーターであってもよい。この
場合のプロモーターの選択は、行われる個々の研究に合わせることができる。た
とえば、テトラサイクリンリプレッサー配列および対応するオペレーター配列の
特定の誘導体により得られるような抑制性プロモーター系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ
ａｌ．，（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−９）は、正常に
発育および発生した後のある時点まではＩＬ−１ＲＮ遺伝子を発現するマウス系
の形成を容易にする。次いでＩＬ−１ＲＮ遺伝子の転写を遮断する適切なリガン
ド（たとえばテトラサイクリン）の投与により、ＩＬ−１ＲＮ遺伝子の機能を突
然停止させることができる。これにより、この誘導性ＩＬ−１受容体アンタゴニ
スト欠乏は、他の点では正常に発育している動物においてＩＬ−１仲介炎症状態
の引金を引く。したがって、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト欠乏により誘発され
る炎症反応を遮断できる化合物のための医薬スクリーニング法を考案することが
できる。他の態様においては、組織特異性プロモーター要素をＩＬ−１ＲＮ遺伝
子に“ノックイン”することができる。得られる動物は、この組織特異性プロモ
ーターが発現しないいずれの身体組織においてもＩＬ−１受容体アンタゴニスト
を産生しないであろう。そのようなトランスジェニック動物は、特定の一組の組
織に作用する炎症プロセスの研究に特に有用である。こうして、非発現組織に起
きる、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト欠乏により誘発される炎症反応を遮断でき
る化合物のための医薬スクリーニング法を考案することができる。同様な態様で
、ｃｒｅ／ｌｏｘトランスジーン置換系を用いて、Ｃｒｅ組換え酵素タンパク質
の発現に伴って身体組織の遺伝子欠失を生じやすい受容体アンタゴニストノック
イン構築体を設計することができる。これにより、組織特異性および／または誘
導性プロモーターによるＣｒｅ組換え酵素のトランスジェニック発現は、空間的
および／または時間的にターゲティングしたＩＬ−１ＲＮ遺伝子喪失を可能にす
る。この方法をたとえば、ＩＬ−１受容体アンタゴニストが組織特異的に欠失し
、これに対応して炎症プロセスが組織特異的に活性化されるマウスの形成に利用
できる。したがって、これらのトランスジェニックマウス系を用いて、特定の１
以上の組織およびその生物の生涯の特定の時期に作用するＩＬ−１仲介炎症性疾
患を研究することができる。ヒトにおいて類似の組織特異性炎症性疾患を治療ま
たは予防する化合物を見出すために、そのようなトランスジェニックマウスを用
いる医薬スクリーニング法を採用できる。
【００１８】 したがって、本発明のＩＬ−１トランスジェニック動物および細胞系は、ＩＬ
−１が仲介する疾患および状態の治療または予防に有用な医薬の開発に使用でき
る。
【００１９】 ４．２ 定義 便宜のため、本明細書、実施例および請求の範囲で用いる特定の用語および句
の意味を以下に示す。
【００２０】 本明細書中で用いる“アゴニスト”という用語は、ＩＬ−１の生物学的活性を
模倣またはアップレギュレーションする（たとえば増強または補充する）物質を
意味するものとする。ＩＬ−１アゴニストは、野生型ＩＬ−１タンパク質である
か、または野生型ＩＬ−１の少なくとも１つの生物学的活性、たとえば受容体結
合活性をもつその誘導体であってもよい。ＩＬ−１療法薬は、ＩＬ−１遺伝子の
発現をアップレギュレーションするか、またはＩＬ−１タンパク質の少なくとも
１つの生物学的活性を高める化合物であってもよい。アゴニストは、ＩＬ−１ポ
リペプチドと他の分子、たとえばインターロイキン受容体との相互作用を高める
化合物であってもよい。アゴニストは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、ま
たはその組合わせを含めた一群の分子、好ましくは小分子であってもよい。
【００２１】 本明細書中で用いる“アンタゴニスト”という用語は、ＩＬ−１の生物学的活
性の少なくとも１つをダウンレギュレーションする（たとえば抑制または阻害す
る）物質を意味するものとする。ＩＬ−１アンタゴニストは、ＩＬ−１タンパク
質と他の分子、たとえばインターロイキン受容体などの受容体との相互作用を阻
害または低下させる化合物であってもよい。したがって好ましいアンタゴニスト
は、ＩＬ−１受容体への結合を阻害または低下させ、次いでこれによりＩＬ−１
受容体の活性化を遮断する化合物である。アンタゴニストは、ＩＬ−１遺伝子座
の発現をダウンレギュレーションするか、またはＩＬ−１タンパク質の存在量を
減少させる化合物であってもよい。ＩＬ−１アンタゴニストは、優性ネガティブ
の形のＩＬ−１ポリペプチド、たとえばターゲットペプチド（たとえばＩＬ−１
受容体）と相互作用しうるがＩＬ−１受容体の活性化を促進しない形のＩＬ−１
ポリペプチドであってもよい。ＩＬ−１アンタゴニストは、優性ネガティブの形
のＩＬ−１ポリペプチドをコードする核酸、ＩＬ−１アンチセンス核酸、または
ＩＬ−１ ＲＮＡと特異的に相互作用しうるリボザイムであってもよい。さらに
他のＩＬ−１アンタゴニストは、ＩＬ−１ポリペプチドに結合してその作用を阻
害する分子である。そのような分子には、ペプチド、たとえば生物学的活性をも
たず、かつＩＬ−１受容体へのＩＬ−１の結合を阻害する形のＩＬ−１ターゲッ
トペプチドが含まれる。したがって、そのようなペプチドはＩＬ−１の活性部位
に結合して、それがターゲットペプチド、たとえばＩＬ−１受容体と相互作用す
るのを阻止するであろう。さらに他のＩＬ−１アンタゴニストには、ＩＬ−１分
子のエピトープと特異的に相互作用し、したがってこの結合によりＩＬ−１遺伝
子座ポリペプチドの生物学的機能を妨害する抗体が含まれる。さらに他の好まし
い態様においてＩＬ−１アンタゴニストは、小分子、たとえばＩＬ−１ポリペプ
チドとターゲットＩＬ−１受容体との相互作用を阻害しうる分子である。あるい
はこの小分子は、ＩＬ−１受容体結合部位以外の部位と相互作用することにより
アンタゴニストとして機能してもよい。
【００２２】 本明細書中で“対立遺伝子変異体”と互換性をもって用いる“対立遺伝子（ａ
ｌｌｅｌｅ）”という用語は、遺伝子またはその一部の別形態を意味する。対立
遺伝子は相同染色体上の同一の遺伝子座または位置を占める。対象が２つの等し
い対立遺伝子をもつ場合、その対象はその遺伝子または対立遺伝子に関してホモ
接合性であると言う。対象が２つの異なる対立遺伝子をもつ場合、その対象はそ
の遺伝子または対立遺伝子に関してヘテロ接合性であると言う。特定の遺伝子の
対立遺伝子は、１個のヌクレオチドまたは数個のヌクレオチドにおいて互いに異
なってもよく、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含んでもよい。頻繁に起
きる配列変異には、トランジション変異（すなわちプリンからプリンへの置換、
およびピリミジンからピリミジンへの置換、たとえばＡからＧ、またはＣからＴ
）、トランスバージョン変異（すなわちプリンからピリミジンへの置換、および
ピリミジンからプリンへの置換、たとえばＡからＴ、またはＣからＧ）、および
反復ＤＮＡ配列の変化（たとえばトリヌクレオチド反復配列および他の縦列反復
配列の拡張および縮小）が含まれる。遺伝子の対立遺伝子は、変異を含む形の遺
伝子であってもよい。“ＩＬ−１遺伝子の多型領域の対立遺伝子変異体”という
用語は、他の個体の遺伝子のその領域にみられるものとの１個または数個のヌク
レオチド配列相異をもつＩＬ−１遺伝子座の遺伝子領域を意味する。
【００２３】 本明細書中で用いる“炎症成分を含む動脈疾患”または“動脈炎性疾患”とい
う句は、硬化症を特徴とする一群の動脈疾患を意味する。これらには冠動脈疾患
および発作が含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】 本明細書中の目的に関して互換性をもって用いる“生物学的活性”または“生
物活性”または“活性”または“生物学的機能”は、ＩＬ−１ポリペプチド（そ
の天然または変性コンホメーションのいずれであってもよい）により直接的また
は間接的に行われるエフェクター機能もしくは抗原機能、またはその何らかの後
続効果を意味する。生物学的活性には、ターゲットペプチド、たとえばＩＬ−１
受容体への結合が含まれる。ＩＬ−１の生物学的活性は、ＩＬ−１ポリペプチド
に直接作用することにより調節できる。あるいはＩＬ−１の生物学的活性は、た
とえばＩＬ−１遺伝子の発現を調節することによりＩＬ−１ポリペプチドの濃度
を調節することによって調節できる。
【００２５】 本明細書中で用いる“ＩＬ−１ポリペプチドの生物学的活性フラグメント”と
いう用語は、全長ＩＬ−１ポリペプチドのフラグメントであって、そのフラグメ
ントが野生型ＩＬ−１ポリペプチドの活性を特異的に模倣またはアンタゴナイズ
するものを意味する。好ましくは、生物学的活性フラグメントはインターロイキ
ン受容体と相互作用しうるフラグメントである。
【００２６】 ＩＬ−１などのポリペプチドの活性に付与される“異常な活性”という用語は
、野生型ポリペプチドの活性と異なる活性、または健康な対象におけるこのポリ
ペプチドの活性と異なる活性を意味する。ポリペプチドの活性は、それに対応す
る天然物質の活性より強いため異常である可能性がある。あるいは、それに対応
する天然物質の活性と比較して弱いか、または存在しないため、活性が異常であ
る可能性もある。異常な活性は、活性の変化である可能性もある。たとえば異常
なポリペプチドは、異なるターゲットペプチドと相互作用する可能性がある。Ｉ
Ｌ−１遺伝子座ポリペプチドをコードするＩＬ−１遺伝子の過剰発現または発現
不足のため、細胞が異常なＩＬ−１活性をもつ可能性がある。
【００２７】 本明細書中で用いる“冠動脈疾患”という用語は、心臓に供給する大および中
動脈におけるアテロームの沈着に関連して当業者に一般に認識されている障害お
よび状態を意味する。したがって冠動脈疾患は、冠動脈アテロームの病理に基づ
く臨床症候群（アンギナ、心筋梗塞、不安定性アンギナ、および虚血性突然死が
含まれるが、これらに限定されない）を意味する。
【００２８】 “細胞”、“宿主細胞”または“組換え宿主細胞”は、本明細書中で互換性を
もって用いる用語である。これらの用語はその対象細胞だけでなく、そのような
細胞の子孫または潜在的子孫をも意味するものと理解される。継続した世代には
変異または環境の影響によってある修飾が起きる可能性があるので、そのような
子孫は実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書中で用いる用語
の範囲にはなお含まれる。
【００２９】 “キメラポリペプチド”または“融合ポリペプチド”は、対象ＩＬ−１遺伝子
座ポリペプチドのいずれかを定める第１アミノ酸配列と、ＩＬ−１ポリペプチド
のいずれのドメインに対しても外来であって実質的に相同でないドメイン（たと
えばポリペプチド部分）を定める第２アミノ酸配列との融合体である。キメラポ
リペプチドは同様に第１ポリペプチドを発現する生物中にみられる外来ドメイン
（異なるポリペプチド中ではあるが）を提示してもよく、または “種間”、“ 遺伝子間（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ）”など異なる種類の生物が発現するポリペプ
チド構造の融合体であってもよい。一般に融合ポリペプチドは一般式Ｘ−ＩＬ−
１−Ｙで表すことができ、式中のＩＬ−１はＩＬ−１ポリペプチド由来のポリペ
プチド部分を表し、ＸおよびＹは独立して、存在しないか、またはある生物中の
、ＩＬ−１に関連しないアミノ酸配列を表し、天然変異体も含まれる。
【００３０】 “配列番号：ｘに示すヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列”という
句は、配列番号：ｘをもつ核酸鎖の相補鎖のヌクレオチド配列を意味する。本明
細書中で“相補鎖”という用語は“相補体”という用語と互換性をもって用いら
れる。核酸鎖の相補体はコード鎖の相補体または非コード鎖の相補体であってよ
い。二本鎖核酸について述べる場合、配列番号：ｘをもつ核酸の相補体とは、配
列番号：ｘをもつ鎖の相補鎖を意味するか、または配列番号：ｘの相補鎖のヌク
レオチド配列をもついずれかの核酸を意味する。ヌクレオチド配列番号：ｘをも
つ一本鎖核酸について述べる場合、この核酸の相補体は、配列番号：ｘの相補鎖
のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列をもつ核酸である。ヌクレオチ
ド配列およびその相補配列は、常に５′から３′の方向に示してある。
【００３１】 “運搬複合体（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）”とは、ターゲティング
手段（たとえば、ターゲット細胞表面に対する遺伝子、タンパク質、ポリペプチ
ドまたはペプチドの結合親和性を高め、および／またはターゲット細胞による細
胞もしくは核への取込みを高める分子）を意味する。ターゲティング手段の例に
は、ステロール（たとえばコレステロール）、脂質（たとえばカチオン性脂質、
ヴィロソームまたはリポソーム）、ウイルス（たとえばアデノウイルス、アデノ
随伴ウイルスおよびレトロウイルス）、またはターゲット細胞特異性結合剤（た
とえばターゲット細胞特異性受容体が認識するリガンド）が含まれる。好ましい
複合体は、ターゲット細胞によるインターナリゼーション前に有意の脱結合を生
じるのを阻止するのに十分なほどインビボ安定性である。ただし複合体は、細胞
内で適切な条件下では開裂可能であり、これにより遺伝子、タンパク質、ポリペ
プチドまたはペプチドが機能性形態で放出される。
【００３２】 周知のように、遺伝子は個体のゲノム内に１個または多数個のコピーとして存
在する可能性がある。そのような複数の遺伝子は同一でもよく、または、ヌクレ
オチドの置換、付加もしくは欠失を含めたある修飾をもち、これらのすべてがな
お実質的に同じ活性をもつポリペプチドをコードするものであってもよい。した
がって、“ＩＬ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列”という用語は、その
個体内の１以上の遺伝子を表すことができる。さらに、生物個体間でヌクレオチ
ド配列にある種の相異がある場合があり、これを対立遺伝子と呼ぶ。そのような
対立遺伝子差は、コードするポリペプチドのアミノ酸配列の相異を生じる場合ま
たは生じない場合があるが、なお同じ生物学的活性をもつポリペプチドをコード
する。
【００３３】 “遺伝子の破壊”および“ターゲティングした破壊”またはこれらに類するい
ずれかの句は、遺伝子の野生型コピーと比較して細胞内でその遺伝子の発現を阻
止するような、天然ＤＮＡ配列の部位特異的妨害を意味する。妨害は遺伝子に対
する欠失、挿入もしくは修飾、またはそのいずれかの組合わせにより起きるもの
であってもよい。
【００３４】 “ハプロタイプ”という用語は、一群として一緒に遺伝する（連鎖不平衡であ
る）一組の対立遺伝子を意味する。本明細書中で用いるハプロタイプは、統計学
的に有意のレベル（ｐcorr≦０．０５）で起きるハプロタイプを含むと定義され
る。本明細書中で用いる“ＩＬ−１ハプロタイプ”という句は、ＩＬ−１遺伝子
座のハプロタイプを意味する。
【００３５】 “相同性”または“同一性”または“類似性”という用語は、２つのペプチド
間または２つの核酸分子間の配列類似性を意味する。相同性は、各配列において
比較のためにアラインさせることができる位置を比較することにより判定できる
。比較した配列中のある位置が同一の塩基またはアミノ酸で占められている場合
、それらの分子はその位置において同一である。核酸配列間の相同性または類似
性または同一性の程度は、それらの核酸配列が共有する位置における同一または
一致したヌクレオチドの個数の関数である。アミノ酸配列の一致の程度は、それ
らのアミノ酸配列が共有する位置における同一アミノ酸の個数の関数である。ア
ミノ酸配列の相同性または類似性の程度は、それらのアミノ酸配列が共有する位
置における、構造的に関連するアミノ酸の個数の関数である。“非関連”または
“非相同”配列は、本発明のＩＬ−１遺伝子座配列のいずれかとの一致度が４０
％未満、好ましくは２５％未満のものである。
【００３６】 本明細書中で用いる“炎症性疾患”とは、原因または病因に関係なく、個体に
おいて組織損傷により起きる疾患または障害を意味する。この組織損傷は、微生
物の侵入、自己免疫プロセス、組織もしくは器官同種移植片の拒絶、腫瘍形成、
突発性疾患、または熱、寒冷、放射エネルギー、電気もしくは化学薬品による刺
激のような、損傷を与える外部作用、または機械的外傷により生じる可能性があ
る。原因が何であれ、結果として生じる炎症反応はきわめて類似し、ミクロ循環
の変化、体液の移動、および炎症細胞（たとえば白血球）の流入と活性化を伴う
複雑な一連の機能性および細胞性適応からなる。そのような疾患および状態の例
には以下のものが含まれる：冠動脈疾患、骨粗鬆症、糖尿病における腎障害、円
形脱毛症、グレーブズ病、全身性エリテマトーデス、硬化性苔癬、潰瘍性大腸炎
、糖尿病性網膜症、歯周疾患、若年性慢性関節炎（たとえば慢性虹彩毛様体炎）
、乾癬、ＤＲ３／４患者におけるインスリン依存性糖尿病、喘息、慢性炎症性肝
疾患、慢性炎症性肺疾患、肺線維症、肝線維症、リウマチ様関節炎、潰瘍性大腸
炎、ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）、消化器系、皮膚および関連構造体、免疫系
、肝−胆嚢系、または炎症成分により病理状態が起きる可能性のあるいずれかの
身体部位における他の急性および慢性炎症性疾患。本明細書中で用いる“炎症状
態”という用語はさらに、ＩＬ−１成分を伴ういかなる疾患も含み、これにはリ
ウマチ様関節炎、炎症性腸障害、Ｉ型糖尿病、乾癬、骨粗鬆症、糖尿病における
腎障害、円形脱毛症、グレーブズ病、全身性エリテマトーデス、硬化性苔癬、潰
瘍性大腸炎、冠動脈疾患および他の動脈炎性障害、糖尿病性網膜症、出産時低体
重および妊娠合併症、重症歯周疾患、乾癬およびインスリン依存性糖尿病が含ま
れる。
【００３７】 本明細書中で用いる“相互作用”という用語には、分子間の検出可能な関係ま
たは関連（たとえば生化学的相互作用）、たとえば事実上、タンパク質−タンパ
ク質、タンパク質−核酸、核酸−核酸、およびタンパク質−小分子、または核酸
−小分子間の相互作用が含まれるものとする。
【００３８】 本明細書中で用いる“ＩＬ−１関連”という用語は、ヒト染色体２上のヒトＩ
Ｌ−１遺伝子座の遺伝子（２ｑ１２−１４）に関連するマウスおよびヒトのすべ
ての遺伝子を含むものとする。これらには、下記を含めたヒト染色体２に位置す
るヒトＩＬ−１遺伝子クラスターのＩＬ−１遺伝子（２ｑ１３−１４）が含まれ
る：インターロイキン−１ａをコードするＩＬ−１Ａ遺伝子、インターロイキン
−１ｂをコードするＩＬ−１Ｂ遺伝子、およびインターロイキン−１受容体アン
タゴニストをコードするＩＬ−１ＲＮ（またはＩＬ−１ｒａ）遺伝子。さらにこ
れらのＩＬ−１関連遺伝子には、ヒト染色体２上に位置するタイプＩおよびタイ
プＩＩヒトＩＬ−１受容体遺伝子（２ｑ１２）、およびマウス染色体Ｉの位置１
９．５ｃＭにあるそれらのマウス相同体が含まれる。インターロイキン−１ａ、
インターロイキン−１ｂ、およびインターロイキン−１ＲＮはそれらすべてがＩ
Ｌ−１タイプＩ受容体に結合するほど関連性があるが、インターロイキン−１ａ
およびインターロイキン−１ｂのみがＩＬ−１タイプＩ受容体を活性化するアゴ
ニストリガンドであり、インターロイキン−１ＲＮは天然のアンタゴニストリガ
ンドである。
【００３９】 遺伝子産物またはポリペプチドに関して“ＩＬ−１”という用語を用いる場合
、それはヒト染色体２上のインターロイキン−１遺伝子座（２ｑ１２−１４）お
よびそれらに対応するマウス相同体がコードするすべての遺伝子産物を意味する
ものとする。したがってＩＬ−１という用語には、炎症反応を促進する分泌ポリ
ペプチド、たとえばＩＬ−１ａおよびＩＬ−１ｂ、ならびに炎症反応にアンタゴ
ナイズする分泌ポリペプチド、たとえばＩＬ−１受容体アンタゴニストおよびＩ
Ｌ−１タイプＩＩ（デコイ）受容体が含まれる。
【００４０】 “ＩＬ−１受容体”または“ＩＬ−１Ｒ”という用語は、ＩＬ−１遺伝子座が
コードするリガンドに結合し、および／またはそこからのシグナルを伝達しうる
種々の細胞膜結合タンパク質受容体を意味する。この用語は、インターロイキン
−１（ＩＬ−１）分子を結合することができ、かつそれらの天然立体配置におい
て哺乳動物細胞膜タンパク質として、ＩＬ−１が発するシグナルを細胞へ伝達す
る役割を果たすと思われるいかなるタンパク質にも適用される。本明細書中で用
いるこの用語には、ＩＬ−１結合活性またはシグナル伝達活性をもつ天然タンパ
ク質類似体が含まれる。その例には、米国特許第４，９６８，６０７号に記載さ
れるヒトおよび／またはネズミＩＬ−１受容体が含まれる。“ＩＬ−１核酸”と
いう用語は、ＩＬ−１タンパク質をコードする核酸を意味する。
【００４１】 本明細書中で用いる“ＩＬ−１アンタゴニスト”という用語は、ＩＬ−１受容
体アンタゴニストおよびＩＬ−１タイプＩＩ（デコイ）受容体両方の遺伝子およ
び対応する遺伝子産物を含むものとする。
【００４２】 “ＩＬ−１ポリペプチド”および“ＩＬ−１タンパク質”という用語は、図１
、２および３に示すＩＬ−１ゲノムＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を含む
ポリペプチドまたはそのフラグメント、およびその相同体を含むものとし、アゴ
ニストおよびアンタゴニストポリペプチドが含まれる。
【００４３】 “ＩＬ−１療法薬”という用語は、種々の形のＩＬ−１ポリペプチド、ならび
にペプチド模倣体、核酸、または小分子であって、天然ＩＬ−１ポリペプチドの
作用を模倣もしくは増強（アゴナイズ）または阻害（アンタゴナイズ）すること
により、ＩＬ−１ポリペプチドの少なくとも１つの活性、たとえばＩＬ−１受容
体との相互作用を調節することができるものを意味する。野生型ＩＬ−１ポリペ
プチドの活性を模倣または増強するＩＬ−１療法薬は、“ＩＬ−１アゴニスト”
である。逆に、野生型ＩＬ−１ポリペプチドの活性を阻害するＩＬ−１療法薬は
、“ＩＬ−１アンタゴニスト”である。
【００４４】 本明細書中でＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して用いる“単離した”とい
う用語は、その高分子の天然源中に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞ
れ分離した分子を意味する。たとえば対象ＩＬ−１ポリペプチドのいずれかをコ
ードする単離した核酸は、ゲノムＤＮＡ中で天然状態においてＩＬ−１遺伝子に
隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）１０キロベース（ｋｂ）を超える核酸配列を含ま
ないことが好ましく、５ｋｂを超えるそのような天然フランキング配列を含まな
いことがより好ましく、そのような天然隣接配列は１．５ｋｂ未満であることが
最も好ましい。本明細書中で用いる単離したという用語は、組換えＤＮＡ法で調
製した場合は細胞性物質、ウイルス性物質もしくは培地を実質的に含有せず、化
学的に合成した場合は前駆物質もしくは他の化学物質を含有しない核酸またはペ
プチドをも意味する。さらに、“単離した核酸”とは、天然にはフラグメントと
して存在せず、天然状態でみられない核酸フラグメントをも含むものとする。本
明細書中で“単離した”という用語は、他の細胞タンパク質から単離されたポリ
ペプチドを意味するためにも用いられ、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプ
チドの両方を包含するものとする。
【００４５】 “ノックアウト”という用語は、ある内因性遺伝子の部分的または完全な抑制
を意味する。これは一般に、その遺伝子の一部を欠失させることにより、または
一部を第２配列で置換することにより達成されるが、遺伝子に対する他の修飾、
たとえば終止コドンの導入、重要なアミノ酸の変異、イントロンジャンクション
の除去などによっても起こすことができる。
【００４６】 “ノックアウト構築体”という用語は、細胞において内因性ＤＮＡ配列がコー
ドするタンパク質の発現を低下または抑制するために使用できる核酸配列を意味
する。簡単な例では、ノックアウト構築体は、遺伝子の重要な部分に欠失がある
ためそれから活性タンパク質は発現し得ない遺伝子（たとえばＩＬ−１遺伝子）
を含む。あるいは、多数の終止コドンを天然遺伝子に付加してタンパク質を早期
に終止させるか、またはイントロンジャンクションを不活性化してもよい。典型
的なノックアウト構築体では、遺伝子の一部を選択マーカー（たとえばｎｅｏ遺
伝子）で置換し、したがってこの遺伝子は下記のように表すことができる：ＩＬ
−１ＲＮ ５′／ｎｅｏ／ＩＬ−１ＲＮ ３′。ここでＩＬ−１ＲＮ ５′およ
びＩＬ−１ＲＮ ３′はそれぞれＩＬ−１ＲＮ遺伝子の部分に対し上流および下
流にあるゲノムまたはｃＤＮＡ配列を意味し、ｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝子
を意味する。他のノックアウト構築体では、隣接（ｆｌａｎｋｉｎｇ）領域に第
２の選択マーカーを付加し、したがってこの遺伝子は下記のように表すことがで
きる：ＩＬ−１ＲＮ／ｎｅｏ／ＩＬ−１ＲＮ／ＴＫ。ここでＴＫはチミジンキナ
ーゼ遺伝子であり、これは前記構築体のＩＬ−１ＲＮ ５′配列またはＩＬ−１
ＲＮ ３′配列のいずれにも付加することができ、これはさらに、適切な培地中
で負に選別できる（すなわち負の選択マーカーである）。この２マーカー構築体
によれば、隣接ＴＫマーカーを分離する相同的組換え事象を、ＴＫ配列が一般に
保持された非相同的組換え事象から選択することができる。遺伝子の欠失および
／または置換は、エキソン、特にイントロンジャンクションから、および／また
はプロモーターなどの調節領域から行うことができる。
【００４７】 “ノックアウト哺乳動物”などの用語は、特定の遺伝子がノックアウト構築体
との組換えによって抑制されたトランスジェニック哺乳動物を意味する。この用
語はすべての子孫世代を含むものである点を強調すべきである。したがって創始
動物と、すべてのＦ１、Ｆ２、Ｆ３など、その子孫が含まれる。
【００４８】 “キメラ”、“モザイク”、“キメラ哺乳動物”などの用語は、そのゲノム含
有細胞の一部にノックアウト構築体を含むトランスジェニック哺乳動物を意味す
る。
【００４９】 “ヘテロ接合体”、“ヘテロ接合性哺乳動物”などの用語は、そのゲノム含有
細胞のすべての染色体対の一方にノックアウト構築体を含むトランスジェニック
哺乳動物を意味する。
【００５０】 “ホモ接合体”、“ホモ接合性哺乳動物”などの用語は、そのゲノム含有細胞
のすべての染色体対の両方の員子にノックアウト構築体を含むトランスジェニッ
ク哺乳動物を意味する。
【００５１】 “連鎖不平衡”という用語は、特定の対照集団内で各対立遺伝子の個々の発生
頻度から予想されるより高い頻度で２つの対立遺伝子が同時遺伝することを意味
する。独立して遺伝する２つの対立遺伝子の予想頻度は、第１対立遺伝子の頻度
に第２対立遺伝子の頻度を掛けたものである。予想頻度で同時遺伝する対立遺伝
子は、“連鎖平衡”と呼ばれる。
【００５２】 “マーカー”もしくは“マーカー配列”またはこれらに類する句は、選択性遺
伝子型、好ましくは選択性表現型を生じる、いかなる遺伝子をも意味する。それ
にはｎｅｏ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ＴＫ遺伝子、β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子などの例が含まれる。マーカー配列はこれらの目的に用い
られる、当業者に既知のいかなる配列であってもよいが、一般にマーカー配列は
選択性特質を与えるタンパク質をコードする配列、たとえば抗生物質耐性遺伝子
、または検出可能であってその細胞中に一般にみられない酵素であろう。マーカ
ー配列には、そのタンパク質の発現を調節する調節領域、たとえばプロモーター
またはエンハンサーも含めることができる。しかし、内因性調節配列を用いてマ
ーカーを転写することもできる。本発明の１態様においてマーカーは、トランス
フェクションした細胞をトランスフェクションしていない細胞から蛍光活性化細
胞ソーティングにより、たとえば蛍光標識抗体の使用、またはＧＦＰなどの蛍光
タンパク質の発現により分離するのを容易にする。マーカー遺伝子の発現を容易
にする他のＤＮＡ配列を本発明のＤＮＡ構築体に取り込ませることもできる。数
例を挙げると、これらの配列には転写開始および終止シグナル、翻訳シグナル、
翻訳後修飾シグナル、イントロンスプライスジャンクション、リボソーム結合部
位、およびポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらに限定されない。マー
カー配列は配列をターゲット遺伝子に付与するためにも使用できる。たとえばそ
れを用いて終止コドンを付加し、ＩＬ−１ＲＮ翻訳をトランケートすることがで
きる。選択マーカーの使用は当技術分野で周知であり、本明細書に詳述する必要
はない。本明細書中で用いる“調節”という用語は、アップレギュレーション（
すなわち活性化または刺激（たとえばアゴナイズまたは増強することによる））
およびダウンレギュレーション（すなわち阻害または抑制（たとえばアンタゴナ
イズ、低下または阻害することによる））の両方を意味する。
【００５３】 “変異遺伝子”という用語は、変異遺伝子をもたない対象と比較して変異遺伝
子をもつ対象の表現型を変化させることができる対立遺伝子形の遺伝子を意味す
る。この変異が変化した表現型をもつために対象がホモ接合性でなければならな
い場合、その変異は劣性であると言う。対象の遺伝子型を変化させるのに変異遺
伝子１コピーで十分である場合、その変異は優性であると言う。対象が変異遺伝
子１コピーをもち、ホモ接合性対象とヘテロ接合性対象との中間の表現型をもつ
場合（その遺伝子に関して）、その変異は相互優性（ｃｏ−ｄｏｍｉｎａｎｔ）
であると言う。
【００５４】 本発明の“非ヒト動物”には、哺乳動物、たとえばげっ歯類、非ヒト霊長類、
ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などが含まれる。好ましい非ヒ
ト動物はラットおよびマウスを含めたげっ歯動物科から選択され、最も好ましく
はマウスであるが、トランスジェニック両生類、たとえばアフリカツメガエル（
Ｘｅｎｏｐｕｓ）属の構成員、およびトランスジェニックニワトリも、たとえば
胚形成および組織形成に影響を与える可能性のある物質を理解および同定するた
めの重要な道具となることができる。“キメラ動物”という用語は、本明細書中
で、組換え遺伝子が見出される動物、またはその組換え遺伝子が動物の全部では
なく一部の細胞において発現する動物を表すために用いられる。“組織特異的キ
メラ動物”という用語は、一部の組織にＩＬ−１遺伝子のいずれかが存在し、お
よび／または発現もしくは破壊するが、他の組織ではこれがみられないことを示
す。“非ヒト動物”という用語は、ヒト以外の哺乳動物クラスのいずれかの構成
員を意味する。
【００５５】 本明細書中で用いる“核酸”という用語は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチド、たとえばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、場合によりリボ核酸（ＲＮ
Ａ）を意味する。この用語は、同等物としてヌクレオチド類似体から形成された
ＲＮＡまたはＤＮＡの類似体を含み、記載した態様に適用できるように、一本鎖
（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むことも理解
すべきである。
【００５６】 “多型”という用語は、１より多い形の、ある遺伝子またはその部分（たとえ
ば対立遺伝子変異体）が、同時に存在することを意味する。少なくとも２つの異
なる形、すなわち２つの異なるヌクレオチド配列がある遺伝子の部分を、“遺伝
子の多型領域”と呼ぶ。多型領域は単一ヌクレオチドであってもよく、その本質
は異なる対立遺伝子においては異なる。多型領域はヌクレオチド数個の長さであ
ってもよい。
【００５７】 “多型遺伝子”は、少なくとも１つの多型領域をもつ遺伝子を意味する。 本明細書中で用いる“プロモーター”という用語は、プロモーターに機能可能
な状態で結合した選択されたＤＮＡ配列の発現を調節し、その選択されたＤＮＡ
配列の細胞内での発現に影響を与えるＤＮＡ配列を意味する。この用語には、“
組織特異的”プロモーター、すなわち特定の細胞（たとえば特定の組織の細胞）
においてのみその選択されたＤＮＡ配列を発現させるプロモーターが含まれる。
この用語は、いわゆる“漏出（ｌｅａｋｙ）”プロモーター、すなわちその選択
されたＤＮＡ配列を主にある組織において発現するように調節するが、他の組織
においても発現させるプロモーターをも包含する。この用語には、組織特異的で
ないプロモーター、および構成性発現するか、または誘導性である（すなわち発
現レベルを制御できる）プロモーターも含まれる。
【００５８】 “タンパク質”、“ポリペプチド”および“ペプチド”という用語は、遺伝子
産物について述べる場合、本明細書中で互換性をもって用いられる。
【００５９】 “組換えタンパク質”という用語は、組換えＤＮＡ法で調製される本発明のポ
リペプチドを意味し、その際一般に、ＩＬ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡ
を適切な発現ベクターに挿入し、次いでこれを用いて宿主細胞を形質転換して異
種タンパク質を産生させる。さらに、組換えＩＬ−１遺伝子に関する“に由来す
る”という句は、“組換えタンパク質”の意味において、天然ＩＬ−１ポリペプ
チドのアミノ酸配列、または天然形のポリペプチドの置換および欠失（トランケ
ーションを含む）を含めた変異により形成された、それに類似のアミノ酸配列を
もつタンパク質を含むものとする。
【００６０】 本明細書中で用いる“小分子”とは、約５ｋＤ未満、好ましくは約４ｋＤ未満
の分子量をもつ組成物を意味する。小分子は核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペ
プチド模倣体、炭水化物、脂質、または他の有機（炭素含有）もしくは無機の分
子であってよい。多くの製薬会社が化合物および／または生物学的混合物のライ
ブラリー（しばしば真菌、細菌または藻類の抽出物）をもっており、これらを本
発明のいずれかのアッセイ法でスクリーニングして、ＩＬ−１の生物学的活性を
調節する化合物を同定することができる。
【００６１】 本明細書中で用いる“特異的にハイブリダイズする”または“特異的に検出す
る”という用語は、本発明の核酸分子が脊椎動物の約６、１２、２０、３０、５
０、１００、１５０、２００、３００、３５０、４００または４２５個の連続し
たヌクレオチド、好ましくはＩＬ−１遺伝子にハイブリダイズする能力を意味す
る。
【００６２】 “転写調節配列”という用語は、本明細書中で、それらが機能可能な状態で結
合しているタンパク質コード配列の転写を誘導または制御するＤＮＡ配列、たと
えば開始シグナル、エンハンサーおよびプロモーターを表すために用いられる総
称である。好ましい態様においてＩＬ−１遺伝子の転写は、発現させたい細胞タ
イプにおける組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（または他の転写
調節配列）の制御下にある。組換え遺伝子が天然形ＩＬ−１ポリペプチドの転写
を制御する配列と同一の転写調節配列または異なる転写調節配列のいずれの制御
下にあってよいことも理解されるであろう。
【００６３】 本明細書中で用いる“トランスフェクション”という用語は、たとえば発現ベ
クターを介して、核酸仲介遺伝子伝達により核酸をレシピエント細胞中へ導入す
ることを意味する。当技術分野で既知の形質転換法には、任意の電気的、磁気的
、物理的、生物学的または化学的手段が含まれる。本明細書中で用いる“トラン
スフェクション”には、特にエレクトロポレーション、マグネトポレーション、
Ｃａ++処理、注入、衝突（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、レトロウイルス感染およ
びリポフェクションなどの具体的方法が含まれる。本明細書中で用いる“形質転
換”という用語は、細胞が外因性ＤＮＡまたはＲＮＡを取り込んだ結果、細胞の
遺伝子型が変化し、形質転換細胞がたとえば組換え体の形のＩＬ−１ポリペプチ
ドを発現するか、あるいは伝達された遺伝子からのアンチセンス発現の場合は天
然形ＩＬ−１ポリペプチドの発現が破壊されるプロセスを意味する。
【００６４】 本明細書中で用いる“トランスジーン”という用語は、細胞に導入された核酸
配列（たとえばＩＬ−１ポリペプチドの１つ、またはそれに対するアンチセンス
転写体）を意味する。トランスジーンは、それを導入するトランスジェニック動
物または細胞に対し部分的または全体的に異種（すなわち外来）であってもよく
、あるいはそれを導入するトランスジェニック動物または細胞の内因性遺伝子に
対し相同であってもよいが、それを挿入する細胞のゲノムを変化させる状態で（
たとえば天然遺伝子のものと異なる位置にそれを挿入するか、またはその挿入の
結果ノックアウトされる）動物のゲノムに挿入するように設計されるか、または
その状態で挿入される。トランスジーンはエピソームの形で細胞中に存在しても
よい。トランスジーンは、１以上の転写調節配列、および選択した核酸の最適発
現に必要と思われる他のいずれかの核酸（たとえばイントロン）を含むことがで
きる。
【００６５】 “トランスジェニック動物”とは、動物の１以上の細胞がヒトの介入により、
たとえば当技術分野で周知のトランスジェニック法により導入された異種核酸を
含む任意の動物、好ましくは非ヒト哺乳動物、鳥類または両生類を意味する。核
酸は、細胞前駆体への導入、計画的な遺伝子操作、たとえばマイクロインジェク
ションもしくは組換えウイルスの感染により、細胞に直接的または間接的に導入
される。遺伝子操作という用語は、古典的な雑種形成、すなわちインビトロ受精
を含まず、むしろ組換えＤＮＡ分子の導入を指す。この分子は染色体内に組み込
まれるか、または染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。本明細書に記載す
る代表的トランスジェニック動物においては、トランスジーンが細胞に組換え形
のＩＬ−１ポリペプチドのいずれか、たとえばアゴニスト形またはアンタゴニス
ト形のポリペプチドを発現させる。しかし、たとえば後記のＦＬＰまたはＣＲＥ
組換え酵素依存性構築体のように、組換えＩＬ−１遺伝子がサイレントであるト
ランスジェニック動物も包含される。さらに“トランスジェニック動物”には、
ヒトの介入（組換え法およびアンチセンス法を共に含む）により１以上のＩＬ−
１遺伝子の破壊が行われた組換え動物も含まれる。
【００６６】 本明細書中で用いる“処置”という用語は、その状態または疾患の少なくとも
１つの症状を治癒および軽減させることを包含する。
【００６７】 本明細書中で用いる“ベクター”という用語は、それに結合した他の核酸を輸
送できる核酸分子を意味する。好ましいタイプのベクターの１つは、エピソーム
、すなわち染色体外複製を行うことができる核酸である。好ましいベクターは、
それが結合している核酸を自己複製および／または自己発現できるものである。
それらが機能可能な状態で結合している遺伝子の発現を指令しうるベクターを、
本明細書中では“発現ベクター”と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ法に有用な発現
ベクターは“プラスミド”の形である場合が多い。これは一般に環状二本鎖ＤＮ
Ａループを意味し、それらはベクターの形では染色体に結合しない。プラスミド
が最も一般的に用いられる形のベクターであるので、本明細書において“プラス
ミド”と“ベクター”は互換性をもって用いられる。しかし本発明は、同等の機
能をもち、当技術分野で今後知られるようになる他の形の発現ベクターも包含す
るものとする。
【００６８】 “野生型対立遺伝子”という用語は、対象内に２コピーとして存在する場合に
野生型表現型を生じる対立遺伝子を意味する。遺伝子におけるある種のヌクレオ
チド変化は、それらのヌクレオチド変化を含む遺伝子の２コピーをもつ対象の表
現型に影響を与えない可能性があるので、個々の遺伝子には数種類の異なる野生
型対立遺伝子がありうる。 ４．３ ターゲットインターロイキン−１アンタゴニスト遺伝子 破壊すべきＤＮＡについて、ノックアウト構築体およびスクリーニングプロー
ブの両方の調製に際し使用できる少なくともある程度の配列情報またはマッピン
グ情報が得られる限り、ノックアウトされる遺伝子はインターロイキン経路また
はカスケードに関与するいかなる遺伝子であってもよい。ＩＬ−１ＲＮ遺伝子を
用いて本発明を例示したが、ジーンバンク寄託番号Ｌ３２８３８で入手できるＩ
Ｌ−１遺伝子クラスターに関する配列情報およびマッピング情報に基づいて（Ｚ
ａｈｅｄｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，６：１−９（１９９４））、Ｉ
Ｌ−１遺伝子クラスター由来の他の遺伝子をターゲティングすることもできる。
入手できる配列情報および当技術分野で周知の方法、たとえばＡｕｓｕｂｅｌ，
ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７、ジョン・ワイリー、ニューヨーク）に記載の方
法を用いて、クローンを得ることもできる。
【００６９】 本発明の好ましい態様においては、染色体２の位置１０．０ｃＭにあるマウス
ＩＬ−１ＲＮ遺伝子を破壊のためにターゲティングする（マウスゲノムインフォ
ーマティクス、ｗｗｗ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ／、寄託番号
ＭＧＩ：９６５４７）。このネズミＩＬ−１ＲＮ遺伝子のＤＮＡ配列を図１に示
す（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｌｏｏｄ，７８：６１
６−２３；およびＳｈｕｃｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．，２１：２７７５−８０）。ヒト、マウスおよびラットのＩＬ−１ＲＮ
の遺伝子は、イントロン−エキソンオーガニゼーションにおいてＩＬ−１αおよ
びＩＬ−１βに対する遺伝子に類似する。これは進化起源が共通である可能性を
示す（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５２３２−６）。このイントロン−エキソン遺
伝子構造の共通性により、適切な種特異的ターゲット遺伝子構築体の設計がさら
に容易になる。これらのターゲット遺伝子構築体には、本発明の種々の態様に特
別に合わせたＩＬ−１ＲＮターゲット遺伝子ノックアウトおよびノックイン構築
体が含まれる。
【００７０】 本発明の他の態様においては、染色体１の位置１９．５ｃＭにあるマウスＩＬ
−１タイプＩＩ受容体遺伝子（マウスゲノムインフォーマティクス、ｗｗｗ．ｉ
ｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ／、寄託番号：ＭＧＩ：９６５４６）を
破壊のためにターゲティングする。マウスＩＬ−１タイプＩＩ受容体遺伝子は、
種間戻し交雑において制限断片長多型分析により染色体１のセントロメア末端（
ヒト染色体２の一部とシンテニックである領域）にマッピングされた。こうして
ネズミＩＬ−１ｒ１遺伝子がネズミ染色体２上にあるＩＬ−１遺伝子から分離さ
れた（Ｃｏｐｅｌａｎｄ（１９９１），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，９：４４−５０（１
９）。この遺伝子のエキソン配列を図２に示す（ＭｃＭａｈａｎ，ｅｔ ａｌ．
（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１−３２）。ターゲット遺伝子構築体
には、後記の本発明の種々の態様それぞれに特別に合わせたＩＬ−１タイプＩＩ
受容体ターゲット遺伝子ノックアウト構築体およびノックイン構築体が含まれる
。 ４．４ インターロイキン−１ターゲット遺伝子構築体 １態様においては、ノックアウト構築体の形成に用いるクローンを、遺伝子の
その位置にマーカー遺伝子を挿入できるように切断すべく選択した制限酵素で消
化する。他の態様においては、ランダムヌクレアーゼを用い、遺伝子を１回の制
限酵素切断で部分消化することにより、ＤＮＡ配列を分離することができる。
【００７１】 マーカー遺伝子挿入に適切な位置は、天然遺伝子の発現を抑制するのに役立つ
位置である。この位置は、ターゲティングすべき配列の種類（エキソン、イント
ロンまたはプロモーター）（プロモーター機能を阻害するのに必要な、または天
然エキソンの合成を阻害するのに必要な正確な挿入位置）、およびその配列内に
おいて好都合な制限部位の得やすさを含めた、種々の要因に依存するであろう。
場合により、マーカー遺伝子をノックアウト構築体に挿入する際にノックアウト
構築体の長さを元のゲノム配列に匹敵するように維持するために、遺伝子の大き
な部分を除去することが望ましい。
【００７２】 好ましい態様においては、翻訳終止コドンの下流の、エキソン３中のＥｃｏＲ
Ｖ部位からエキソン４中の第１ ＸｂａＩ部位までのヌクレオチドを欠失させる
。
【００７３】 マーカー遺伝子は、検出可能および／またはアッセイ可能な、当業者に周知の
いかなる核酸配列であってもよい。一般に抗生物質耐性遺伝子、またはゲノム中
でのその発現または存在を容易に検出できる他の任意の遺伝子を用いる。マーカ
ー遺伝子は通常は、それを挿入した細胞内で活性であるかまたは容易に活性化で
きる任意の供給源からのプロモーターに、機能可能な状態で結合している。しか
しターゲティングした遺伝子のプロモーターを用いて転写できるので、マーカー
遺伝子がそれ自身のプロモーターをもつ必要はない。さらに、マーカー遺伝子は
普通はその遺伝子の転写終止のためにその遺伝子の３′末端に結合したポリＡ配
列をもつであろう。好ましいマーカー遺伝子は、アミノグリコシドホスホトラン
スフェラーゼ遺伝子（ａｐｈ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ
遺伝子、またはノックアウト法に有用であることが知られている任意の抗生物質
耐性遺伝子である。
【００７４】 線状ノックアウト構築体を胚性幹細胞に直接トランスフェクションしてもよく
（後記に述べる）、または挿入前にまず増幅のために適切なベクター内に配置し
てもよい。適切なベクターは当業者に既知である。好ましいベクターは、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）から妥当な量で得られるものである。これらにはｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫベクター（ストラタジーン、カリフォルニア州サンディ
エゴ）またはｐＧＥＭ７（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）が含まれ
るが、これらに限定されない。ただし構築体が大きい場合はファージベクターま
たはコスミドベクターを用いるのが望ましいであろう。 ４．５ トランスジェニック動物 本発明はさらにトランスジェニック動物を提供する。これはたとえばＩＬ−１
が仲介する炎症性障害に対する療法薬を同定するためなど、多様な目的に使用で
きる。本発明のトランスジェニック動物には、ＩＬ−１プロモーターの制御下ま
たは異種プロモーターの制御下にある異種ＩＬ−１遺伝子またはそのフラグメン
トを含む非ヒト動物が含まれる。したがって本発明のトランスジェニック動物は
、野生型ＩＬ−１タンパク質またはそのフラグメントもしくはその変異体（その
突然変異体および多型変異体を含む）をコードするトランスジーンを発現する動
物であってよい。これらの動物は、特定の部位におけるＩＬ−１タンパク質発現
の影響を判定するために、またはＩＬ−１療法薬を同定し、もしくはそれらのイ
ンビボ活性を確認するために使用できる。
【００７５】 トランスジェニック動物は、ＩＬ−１プロモーターまたはそのフラグメントの
制御下にあるトランスジーン、たとえばレポーター遺伝子を含む動物であっても
よい。これらの動物は、たとえばＩＬ−１遺伝子発現の調節などによりＩＬ−１
の産生を調節するＩＬ−１薬の同定に有用である。ＩＬ−１遺伝子プロモーター
は、たとえばゲノムライブラリーをＩＬ−１ ｃＤＮＡフラグメントでスクリー
ニングし、当技術分野で既知の方法で解明することにより単離できる。本発明の
好ましい態様においては、ＩＬ−１レポーター遺伝子を含むトランスジェニック
動物を用いて、ステロイドホルモンとして知られている一群の生物学的活性分子
をそれらがＩＬ−１発現を調節する能力についてスクリーニングする。本発明の
より好ましい態様において、ＩＬ−１発現調節活性についてスクリーニングする
ステロイドホルモンは、アンドロゲンとして知られるグループに属する。本発明
のさらに好ましい態様において、ステロイドホルモンはテストステロンまたはテ
ストステロン類似体である。本発明の範囲内のさらに他の非ヒト動物には、内因
性ＩＬ−１遺伝子の発現が変異または“ノックアウト”されているものが含まれ
る。“ノックアウト”動物は、１以上の特定の遺伝子のホモ接合性またはヘテロ
接合性欠失を含む動物である。これらの動物は、ＩＬ−１の不存在により特定の
表現型を生じるかどうか、特にこれらのマウスが特定の疾患をもつか、または発
症しやすいかどうか（たとえば心臓疾患または癌に対する高い罹患性）を判定す
るのに有用である。さらにこれらの動物は、後記に概説するように、ＩＬ−１遺
伝子の変異により生じる疾病状態を軽減または衰退させる薬物のスクリーニング
に有用である。これらの動物は、ＩＬ−１遺伝子における特定のアミノ酸の相異
または対立遺伝子の変異が与える影響を判定するのにも有用である。すなわち、
ＩＬ−１ノックアウト動物を、たとえばＩＬ−１の変異形または対立遺伝子変異
体を発現するトランスジェニック動物と交雑し、こうして変異タンパク質のみを
発現し、野生型ＩＬ−１タンパク質を発現しない動物を得ることができる。この
観点の本発明における好ましい態様では、その染色体の一方または両方に変異Ｉ
Ｌ−１遺伝子座をもつトランスジェニックＩＬ−１ノックアウトマウスを、ＩＬ
−１発現の喪失により生じる状態をトランスジェニック処置または薬物処置する
ためのモデル系として用いる。
【００７６】 トランスジェニックおよびノックアウトした非ヒト動物を得る方法は当技術分
野で周知である。ノックアウトマウスは一般に、ノックアウトすべき遺伝子をコ
ードするマウス胚性幹細胞染色体に“ノックアウト”構築体を相同組込みするこ
とにより形成される。１態様においては、動物のゲノムを修飾するための相同組
換えを用いる方法である遺伝子ターゲティングを採用し、培養した胚性幹細胞に
変更を導入することができる。目的とするＩＬ−１遺伝子をＥＳ幹細胞にターゲ
ティングすることにより、これらの変更を動物の生殖細胞系列に導入してキメラ
を形成することができる。遺伝子ターゲティング法は、ターゲットＩＬ−１遺伝
子座と相同なセグメントを含みかつＩＬ−１ゲノム配列に対し意図する配列修飾
（たとえば挿入、欠失、点変異）を含むＤＮＡターゲティング構築体を、組織培
養細胞に導入することにより行われる。次いで処理した細胞を正確なターゲティ
ングについてスクリーニングし、適正にターゲティングしたものを同定および単
離する。
【００７７】 胚性幹細胞における遺伝子ターゲティングは、１またはそれ以上のＩＬ−１ゲ
ノム配列と相同組換えするように設計したターゲティング用トランスジーン構築
体を用いてＩＬ−１遺伝子機能を破壊するための手段として本発明により実際に
考慮した方式である。ターゲティング構築体は、ＩＬ−１遺伝子の要素と組換え
する際に正の選択マーカーを遺伝子のコード配列に挿入（または置換）するよう
に配置できる。挿入された配列はＩＬ−１遺伝子の機能を破壊し、一方では正の
選択特質を付与する。ＩＬ−１ターゲティング構築体の例を後記に詳述する。
【００７８】 一般に、ノックアウト動物の形成に用いる胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、形成さ
れるノックアウト動物と同種のものであろう。たとえばノックアウトマウスの形
成には通常はマウス胚性幹細胞を用いる。
【００７９】 胚性幹細胞は当業者に周知の方法、たとえばＤｏｅｔｓｃｈｍａｎ，ｅｔ ａ
ｌ．（１９８５）Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８７：２７
−４５に記載の方法で形成および維持される。いかなる系列のＥＳ細胞も使用で
きるが、選ばれる系列は一般に、細胞が発生中の胚の生殖細胞系列に組み込まれ
てその一部になり、これによりノックアウト構築体の生殖細胞系列伝達を形成す
る能力で選択される。したがって、この能力をもつと考えられるいかなるＥＳ細
胞系も本発明に用いるのに適する。ＥＳ細胞の調製に一般に用いられるマウス系
統の１つは、１２９Ｊ系統である。他のＥＳ細胞系は、ネズミ細胞系Ｄ３（アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション、カタログｎｏ．ＣＫＬ １９３４
）である。さらに他の好ましいＥＳ細胞系は、ＷＷ６細胞系（Ｉｏｆｆｅ，ｅｔ
ａｌ．（１９９５）ＰＮＡＳ，９２：７３５７−７３６１）である。当業者に
周知の方法、たとえば下記の方法でこれらの細胞を培養し、ノックアウト構築体
挿入用に調製する：Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏ
ｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，
Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，ＩＲＬプレス，ワシントンＤ．Ｃ．［１９８７
］；Ｂｒａｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ
ｉｎ Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．，２０：３５７−３７１；およびＨｏｇａｎ，
ｅｔ．ａｌ．（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク［１
９８６］）。
【００８０】 ノックアウト構築体とは、幹細胞系に導入し、変異させる目的遺伝子の染色体
遺伝子座にあるゲノムと組換えさせる、独自の構造をもつ核酸フラグメントを意
味する。したがって、ノックアウト構築体は破壊のためにターゲティングする特
定の遺伝子に特異的である。それにもかかわらず、これらの構築体には多数の共
通要素があり、これらの要素は当技術分野で周知である。典型的なノックアウト
構築体は、変異させる遺伝子をコードするゲノム遺伝子座の５′末端および３′
末端の両方から約０．５ｋｂ未満でなく、約１０．０ｋｂを超えない核酸フラグ
メントを含む。これら２フラグメントは正の選択マーカーをコードする介在核酸
フラグメント、たとえばネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏR）により分離される 。得られた核酸フラグメント（ゲノム遺伝子座の５′最端由来の核酸が、正の選
択マーカーをコードする核酸に結合し、これが該ゲノム遺伝子座の３′最端由来
の核酸に結合したものからなる）は、ＩＬ−１またはノックアウトすべき他の遺
伝子のコード配列の大部分が排除されている。得られた構築体が染色体のこの遺
伝子座と相同組換えすると、排除されたコード配列（または構造遺伝子として知
られている）がゲノム遺伝子座から喪失する。正の選択マーカーをコードする遺
伝子の核酸をゲノムに安定に組み込み、次いで適切な薬物（この例ではネオマイ
シン）の存在下でこのマーカー遺伝子を発現する細胞を選択することにより、こ
のように稀な相同組換え事象が起きた幹細胞を選択することができる。
【００８１】 この基本的方法の変法が当技術分野で周知である。たとえば“ノックイン”構
築体は、５′側ゲノム遺伝子座フラグメントが正の選択マーカーをコードする核
酸に結合し、これが３′側ゲノム遺伝子座フラグメントをコードする核酸に結合
した同じ基本配置であるが、コード配列は全く排除されておらず、したがって用
いる５′側および３′側ゲノムフラグメントは、正の選択マーカー遺伝子をコー
ドする核酸の導入により破壊される前は本来連続していたものを意味する。した
がってこの“ノックイン”タイプの構築体は、変異させる遺伝子のゲノム遺伝子
座の限られた領域（たとえば単一エキソン）のみがクローニングおよび遺伝子操
作に用いられる場合に、変異体トランスジェニック動物を構築するのにきわめて
有用である。あるいは“ノックイン”構築体を用いて、ターゲティングした遺伝
子の単一機能ドメインを特異的に排除することができ、その結果、コードされる
ポリペプチドの１機能のみが欠損し、他のドメインの機能は保持された、ターゲ
ティングした遺伝子のポリペプチドを発現するトランスジェニック動物が得られ
る。このタイプの“ノックイン”変異体は、いわゆる“優性ネガティブ”変異体
の特色をもつことが多い。特にホモ多量体形成するタンパク質の場合、それが由
来する野生型遺伝子のポリペプチド産物の作用を特異的に遮断する（または“毒
性をもつ”）可能性があるからである。ノックイン法の変法では、マーカー遺伝
子の発現がターゲティングした遺伝子の転写調節要素の制御下にあるように、目
的ゲノム遺伝子座にマーカー遺伝子を組み込む。マーカー遺伝子は、その活性を
検出できる酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ）をコードするものであり、適
切な条件下で細胞にこの酵素の基質を添加し、そして酵素活性を分析することが
できる。当業者には、他の有用なマーカーおよびその細胞内でそれらの存在を検
出する手段が周知であろう。たとえばそのような別のマーカーの１つは緑色蛍光
タンパク質（ＧＦＰ）である。ＧＦＰマーカーは、個々の生細胞内で遺伝子発現
を調べるのに特に有用である。ＧＦＰおよび関連のマーカーは、“ノックイン”
遺伝子の発現レベルをｉｎ ｓｉｔｕ分析するのに特に有用である。そのような
マーカーはすべて本発明の教示の範囲に含まれる。
【００８２】 前記のように、前記“ノックアウト”および“ノックイン”構築体の相同組換
えはきわめて稀であり、そのような構築体がゲノムのランダム領域に非相同挿入
される頻度が高い。この場合は欠失をターゲティングした遺伝子に影響がなく、
変更を意図しなかった他の遺伝子を破壊するように組換えられる可能性がある。
そのような非相同組換え事象は、前記のノックアウトおよびノックイン構築体を
それらがいずれかの末端で負の選択マーカーによりフランキングされるように修
飾することによって選別できる（特にチミジンキナーゼ遺伝子の２つの対立遺伝
子変異体を用いることにより、当技術分野で周知の適切な組織培養培地、すなわ
ち５−ブロモデオキシウリジンなどの薬物を含有する培地中で細胞系を発現させ
ると、そのポリペプチド産物を選別することができる）。したがって、本発明の
そのようなノックアウトおよびノックイン構築体の好ましい態様は、負の選択マ
ーカーをコードする核酸が、ゲノム遺伝子座の５′末端をコードする核酸に結合
し、これが正の選択マーカーの核酸に結合し、そしてこれが同一ゲノム遺伝子座
の３′末端をコードする核酸に結合し、これが負の選択マーカーをコードする第
２核酸に結合したものからなる。得られたノックアウト構築体とゲノムの非相同
組換えでは、通常はこれら負の選択マーカーの一方または両方が安定に組み込ま
れ、したがって非相同組換えを行った細胞は、適切な選択培地（たとえば５−ブ
ロモデオキシウリジンなどの薬物を含有する培地）中で増殖させることにより選
別できる。正の選択マーカーの選択と負の選択マーカーの選別を同時に行うと、
変異させることを意図した遺伝子の遺伝子座にノックアウト構築体が相同組換え
されたクローンが大幅に濃縮される。得られたノックアウト幹細胞系においてタ
ーゲティングした遺伝子座に予想した染色体変更が存在することは、当業者に周
知のサザンブロット分析法で確認できる。あるいはＰＣＲを採用できる。
【００８３】 細胞に挿入すべき各ノックアウト構築体は、最初は線状でなければならない。
したがって、ノックアウト構築体をベクター（前記）に挿入した場合は、ベクタ
ー配列内でのみ切断し、ノックアウト構築体配列内では切断しないように選択し
た適切な制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化することにより、線状にする。
【００８４】 挿入のためには、選ばれた挿入法に適切な、当業者に既知の条件下で、ノック
アウト構築体をＥＳ細胞に添加する。たとえばＥＳ細胞をエレクトロポレーショ
ンする場合、ＥＳ細胞とノックアウト構築体にエレクトロポレーション装置で製
造業者の使用指示に従って電気パルスをかける。エレクトロポレーション後、一
般にＥＳ細胞を適切なインキュベーション条件下で回復させる。次いで細胞を前
記に説明したようにノックアウト構築体の存在についてスクリーニングする。Ｅ
Ｓ細胞に１より多い構築体を導入する場合、各ノックアウト構築体を同時に、ま
たは一度に１つずつ導入できる。
【００８５】 適正な位置にノックアウト構築体を含む適切なＥＳ細胞を前記に概説した方法
で同定した後、それらの細胞を胚に挿入することができる。挿入は当業者に既知
の多様な方法で行うことができるが、好ましい方法はマイクロインジェクション
によるものである。マイクロインジェクションのためには、約１０〜３０個の細
胞をマイクロピペットに集め、ノックアウト構築体を含む外来ＥＳ細胞を発生中
の胚に組み込ませるのに適した発生段階にある胚に注入する。たとえば形質転換
したＥＳ細胞を芽細胞にマイクロインジェクションすることができる。ＥＳ細胞
挿入に用いる胚の適切な発生段階は著しく種依存性であるが、マウスについては
約３．５日である。胚は妊娠した雌の子宮を潅流することにより得られる。これ
を行うのに適した方法は当業者に既知であり、たとえばＢｒａｄｌｅｙ，ｅｔ．
ａｌ．（前掲）に述べられている。
【００８６】 適正な発生段階にあるいかなる胚も使用に適するが、好ましい胚は雄である。
マウスの場合、好ましい胚はＥＳ細胞遺伝子がコードする毛皮の色と異なる毛皮
の色をコードする遺伝子も含む。この方法では、モザイク毛皮の色（発生中の胚
にＥＳ細胞が取り込まれたことを示す）を見ることにより、ノックアウト構築体
の存在について子孫を容易にスクリーニングできる。たとえばＥＳ細胞が白色の
毛皮の遺伝子をもつ場合、選択する胚は黒色または褐色の毛皮の遺伝子をもつも
のであろう。
【００８７】 ＥＳ細胞を胚に導入した後、この胚を偽妊娠乳母の子宮に妊娠期間中移植して
おくことができる。いかなる乳母も使用できるが、乳母は一般に繁殖および生殖
能力が良好であり、幼仔を世話する能力のあるものが選ばれる。そのような乳母
は一般に、同種の精管切除雄と交配させることにより調製される。偽妊娠乳母の
段階が移植の成功にとって重要であり、それは種依存性である。マウスについて
は、この段階は偽妊娠の約２〜３日目である。
【００８８】 毛皮の色による選択方式（前記および実施例に共通したように）を採用した場
合、乳母から産まれた子孫をまず毛皮の色についてスクリーニングすることがで
きる。さらに、子孫の尾組織からのＤＮＡを前記のサザンブロット法および／ま
たはＰＣＲ法により、ノックアウト構築体の存在についてスクリーニングするこ
とができる。次いでモザイクに見える子孫がそれらの生殖細胞系列中にノックア
ウト構築体をもつと思われる場合、ホモ接合性ノックアウトマウスを形成するた
めに、それらを互いに交雑させることができる。ホモ接合性は、この交雑で産ま
れたマウス、ならびにヘテロ接合性であることが知られているマウス、および野
生型マウスから得た等量のゲノムＤＮＡのサザンブロットにより確認できる。
【００８９】 ノックアウト子孫を同定するための他の手段がある。たとえばノーザンブロッ
ト法を用い、遺伝子ノックアウト、マーカー遺伝子、または両方をコードする転
写体の存否についてｍＲＮＡを調べることができる。さらに、ウェスタンブロッ
ト法を用い、ウェスタンブロットをそのＩＬ−１タンパク質に対する抗体または
マーカー遺伝子産物に対する抗体（この遺伝子が発現している場合）で検査する
ことにより、ノックアウトされたＩＬ−１遺伝子の発現レベルを子孫の種々の組
織において評価することができる。最後に、ノックアウト構築体遺伝子産物の存
否を調べるのに適した抗体を用いて、子孫から得た種々の細胞のｉｎ ｓｉｔｕ
分析（たとえば細胞を固定し、抗体で標識する）および／またはＦＡＣＳ（蛍光
活性化細胞選別）分析を行うことができる。
【００９０】 ノックアウトまたは破壊トランスジェニック動物を形成するためのさらに他の
方法も一般に知られている。たとえばＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏ
ｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク，１９８６）。たとえば、
組換え酵素配列（前記）によりＩＬ−１遺伝子が組織特異的および／または時間
的に制御できるように相同組換えによりターゲット配列を挿入することによって
、組換え酵素依存性ノックアウト体も形成できる。
【００９１】 １より多いノックアウト構築体および／または１より多いトランスジーン発現
構築体を含む動物を、幾つかの方法のいずれかで形成できる。好ましい形成方法
は下記のものである。それぞれ目的とするトランスジェニック表現型の１つを含
む一連の哺乳動物を形成する。それらの動物を一連の交雑、戻し交雑および選択
により繁殖させ、最終的には目的とするすべてのノックアウト構築体および／ま
たは発現構築体を含む１匹の動物を形成する。その動物は、１以上のノックアウ
ト構築体および／または１以上のトランスジーンが存在する以外はコンジェニッ
クである（遺伝的に等しい）。
【００９２】 ＩＬ−１トランスジーンは、アンチセンス構築体と同様に、野生型のタンパク
質をコードしてもよく、またはその相同体（アゴニストおよびアンタゴニストの
両方を含む）をコードしてもよい。好ましい態様においてトランスジーンの発現
は、発現を目的パターンに制御するシス作用性配列の使用により、特定の一組の
細胞、組織または発生段階に限定される。本発明においてそのようなＩＬ−１タ
ンパク質のモザイク発現は多くの形の系列分析に必須であり、さらにたとえば他
の点では正常な胚内で組織のごく一部の発生を著しく変化させるＩＬ−１発現欠
如が与える影響を評価する手段を提供できる。このために、組織特異的調節配列
および条件的調節配列を用いて、トランスジーン発現をある空間パターンに制御
することができる。さらに、たとえば条件的組換え系または原核細胞性転写調節
配列により、時間的発現パターンを提供することができる。
【００９３】 インビボでの部位特異的遺伝子操作によりトランスジーン発現を調節できる遺
伝学的方法は、当業者に既知である。たとえばターゲット配列の遺伝子組換えを
触媒する組換え酵素を調節発現させることができる遺伝学的系がある。本明細書
中で用いる“ターゲット配列”という句は、組換え酵素により遺伝子組換えされ
るヌクレオチド配列を意味する。ターゲット配列は組換え酵素認識配列によりフ
ランキングされ、一般に組換え酵素活性を発現する細胞中で除去され、または逆
転する。組換え酵素により触媒される組換え事象は、ターゲット配列の組換えに
より対象ＩＬ−１タンパク質の発現が活性化または抑制されるように設計できる
。たとえば組換えＩＬ−１遺伝子（たとえばアンタゴニスト性相同体またはアン
チセンス転写体）の発現を妨害するターゲット配列の除去は、その遺伝子の発現
を活性化するために設計できる。このタンパク質の発現妨害は、プロモーター要
素または内部終止コドンからのＩＬ−１遺伝子の空間的分離など、多様な機序に
より生じさせることができる。さらに、遺伝子のコード配列が組換え酵素認識配
列によりフランキングされ、そして最初はプロモーター要素に対し３′から５′
の方向で細胞にトランスフェクションされるトランスジーンを作成できる。その
ような場合、プロモーター駆動による転写活性化を可能にする方向で、コード配
列の５′末端をプロモーター要素に対し配置することにより、ターゲット配列の
逆転で対象遺伝子が再配向するであろう。
【００９４】 本発明のトランスジェニック動物はすべて、それらの多数の細胞内に本発明の
トランスジーンを含み、そのトランスジーンが細胞の増殖、死および／または分
化の調節に関して“宿主細胞”表現型を変化させる。本明細書に記載する１以上
のトランスジーン構築体を用いて本発明のトランスジェニック生物を形成できる
ので、一般に外因性遺伝子材料についてトランスジェニック生物の形成に関する
全般的記載を行う。この全般的記載は、後記の方法および材料を用いて特定のト
ランスジーン配列を生物に取り込ませるために、当業者が利用できる。
【００９５】 具体的態様においては、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え酵
素系（Ｌａｋｓｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ，８９：６２３２−６２
３６；Ｏｒｂａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ，８９：６８６１−６８
６５）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＬＰ組換え酵素系（Ｏ‘Ｇｏｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（
１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３５１−１３５５；国際特許出願公開第
ＷＯ９２／１５６９４号）を用いて、インビボ部位特異的遺伝子組換え系を形成
することができる。Ｃｒｅ組換え酵素はｌｏｘＰ配列間に位置する介在ターゲッ
ト配列の部位特異的組換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ組換え酵素が結
合する３４塩基対のヌクレオチド反復配列であり、Ｃｒｅ組換え酵素仲介による
遺伝子組換えに必要である。ｌｏｘＰの配向は、Ｃｒｅ組換え酵素が存在する場
合にこの介在ターゲット配列が除去されるかまたは逆転するかを決定する（Ａｂ
ｒｅｍｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：
１５０９−１５１４）；ｌｏｘＰ配列が直列反復配列として配向している場合は
ターゲット配列の除去を触媒し、ｌｏｘＰ配列が逆方向反復配列として配向して
いる場合はターゲット配列の逆転を触媒する。
【００９６】 したがって、ターゲット配列の遺伝子組換えはＣｒｅ組換え酵素の発現に依存
する。組換え酵素の発現は、外部から添加する物質による調節制御を受けてたと
えば組織特異性、発生段階特異性、誘導性または抑制性となるプロモーター要素
により調節できる。この調節制御の結果、組換え酵素の発現がプロモーター要素
により仲介される細胞においてのみターゲット配列が遺伝子組換えされる。こう
して、組換えＩＬ−１タンパク質の活性化発現を、組換え酵素発現の制御により
調節できる。
【００９７】 組換えＩＬ−１タンパク質の発現を調節するためにｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え酵
素系を用いるには、Ｃｒｅ組換え酵素と対象タンパク質の両方をコードするトラ
ンスジーンを含むトランスジェニック動物を構築する必要がある。Ｃｒｅ組換え
酵素遺伝子と組換えＩＬ−１遺伝子の両方を含むトランスジェニック動物は、“
二重”トランスジェニック動物の構築により得ることができる。そのような動物
を得るのに好都合な方法は、たとえばＩＬ−１遺伝子および組換え酵素遺伝子を
それぞれ含む２匹のトランスジェニック動物を交配することである。
【００９８】 リコンビナーゼに媒介される発現可能な形式でＩＬ−１トランスジーンを含有
するトランスジェニック動物を最初に構築することによって得られる一つの利点
は、その対象タンパク質が、アゴニストであれアンタゴニストであれ、そのトラ
ンスジェニック動物における発現に有害でありうるという可能性に由来している
。このような場合、その対象トランスジーンが全ての組織中で発現しない創始者
集団（ｆｏｕｎｄｅｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を増殖させ且つ維持することが
できる。この創始者集団の個体は、リコンビナーゼを、例えば、１種類またはそ
れ以上の組織および／または望ましい時間的パターンで発現する動物と交雑する
ことができる。したがって、例えば、アンタゴニストＩＬ−１トランスジーンが
発現しない創始者集団の発生は、特定の組織中のまたはいくつかの発育段階での
ＩＬ−１に媒介される誘導の破壊が、例えば、致死表現型を生じると考えられる
その創始者からの子孫の研究を可能にするであろう。
【００９９】 同様の条件付きトランスジーンは、ＩＬ−１トランスジーンの発現を促進する
ために原核性タンパク質を同時発現させる必要がある原核性プロモーター配列を
用いて提供することができる。典型的なプロモーターおよび対応するトランス活
性化原核性タンパク質は、米国特許第４，８３３，０８０号に与えられている。
【０１００】 更に、それら条件付きトランスジーンの発現は、トランス活性化タンパク質、
例えば、リコンビナーゼまたは原核性タンパク質をコードしている遺伝子を組織
に供給し、そして細胞種特異的方式などで発現させる遺伝子治療様方法によって
誘導することができる。この方法により、ＩＬ−１Ａトランスジーンは、トラン
ス活性化因子の導入によって“作動する（ｔｕｒｎｅｄ ｏｎ）”まで、成体集
団中に発現しないまま残りうると考えられる。
【０１０１】 典型的な実施態様において、本発明の“トランスジェニック非ヒト動物”は、
非ヒト動物の生殖系列中にトランスジーンを導入することによって生産される。
いろいろな発育段階の胚性標的細胞を用いて、トランスジーンを導入することが
できる。その胚性標的細胞の発育段階によって異なった方法が用いられる。本発
明を実施するのに用いられる任意の動物の１種類または複数の具体的な系統は、
全身の良好な健康状態、充分な胚収率、胚中の充分な前核可視度および充分な繁
殖適応度について選択される。更に、ハプロタイプは有意の因子である。例えば
、トランスジェニックマウスを生産する場合、Ｃ５７ＢＬ／６またはＦＶＢ系統
などの系統がしばしば用いられる（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，バ
ー・ハーバー，ＭＥ）。好ましい系統は、Ｃ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／１のよ
うなＨ−２ｂ、Ｈ−２ｄまたはＨ−２ｑハプロタイプを含むものである。本発明
を実施するのに用いられる１種類または複数の系統はそれ自体、トランスジェニ
ック系統であってよいしおよび／またはノックアウト系統であってよい（すなわ
ち、部分的にまたは完全に抑制された１個またはそれ以上の遺伝子を有する動物
から得られる）。
【０１０２】 一つの実施態様において、トランスジーン構築物は、一つの時期の胚に導入さ
れる。その接合子は、マイクロインジェクションに最良の標的である。マウスの
場合、雄前核は約２０マイクロメートル直径の寸法に達し、１−２ｐｌのＤＮＡ
溶液の再現性のある注入を可能にする。遺伝子導入の標的としてのそれら接合子
の使用は、大部分は、注入されたＤＮＡが、最初の分裂の前に宿主遺伝子中に包
含されるであろうという主な利点を有する（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ら（１９８５）
ＰＮＡＳ ８２：４４３８−４４４２）。結果として、トランスジェニック動物
の細胞は全て、その包含されたトランスジーンを有するであろう。これは、生殖
細胞の５０％がそのトランスジーンを含むので、概して、創始者の子孫へのトラ
ンスジーンの有効な伝達にも反映されるであろう。
【０１０３】 通常は、受精した胚を適当な培地中で前核が現れるまでインキュベートする。
ほぼこの時点に、トランスジーンを含むヌクレオチド配列を下記のように雌性ま
たは雄性前核中に導入する。マウスのようないくつかの種では、雄性前核が好適
である。接合子の雄性ＤＮＡ補体が卵子核または接合子雌性前核によってプロセ
ッシングされる前に、それに外因性遺伝物質を加えることは最も好適である。卵
子核または雌性前核は、おそらくは、雄性ＤＮＡのプロタミンをヒストンと置き
換えることによって雄性ＤＮＡ補体に影響を与える分子を放出し、それによって
、二倍体接合子を形成する雌性および雄性ＤＮＡ補体の組合せを促進すると考え
られる。
【０１０４】 したがって、ＤＮＡの雄性補体またはＤＮＡの任意の他のＤＮＡ補体が雌性前
核によって影響される前に、それに外因性遺伝物質を加えることは好適である。
例えば、外因性遺伝物質は、雄性前核の形成後できるだけ早く初期雄性前核に加
えられるが、これは、雄性および雌性前核が充分に離れていて且つ双方が細胞膜
の近くにある場合である。或いは、外因性遺伝物質を、精子の核が脱圧縮される
ように誘導された後にそれに加えることができると考えられる。次に、外因性遺
伝物質を含有する精子を卵子に加えることができるしまたは脱圧縮精子を卵子に
加え、その後できるだけ早くトランスジーン構築物を加えうると考えられる。
【０１０５】 トランスジーンヌクレオチド配列の胚中への導入は、当該技術分野において知
られている任意の手段、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレー
ションまたはリポフェクチンによって行うことができる。トランスジーンヌクレ
オチド配列を胚中に導入後、その胚をｉｎ ｖｉｔｒｏでいろいろな時間インキ
ュベートしてよいし、または代理宿主中に再移植してよいしまたは両方行っても
よい。成熟までのｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーションは、本発明の範囲内であ
る。一つの一般的な方法は、それら胚をｉｎ ｖｉｔｒｏで、種によって約１−
７日間インキュベートした後、それらを代理宿主中に再移植することである。
【０１０６】 本発明の目的のために、接合子は、本質的には、発育して完全な生物になるこ
とができる二倍体細胞の形成である。概して、その接合子は、１個または複数の
配偶子からの２個の半数体核の融合によって天然にかまたは人工的に形成される
核を含有する卵子から成るであろう。したがって、それら配偶子核は、天然に適
合しうるもの、すなわち、分化することができ且つ機能性生物に発育することが
できる生存可能な接合子を生じるものでなければならない。概して、正倍数体接
合子が好適である。正倍数体接合子が得られるならば、それら染色体の数は、両
配偶子が由来する生物の正倍数に関して２以上異ならないはずである。
【０１０７】 同様の生物学的考察に加えて、物理的考察は、接合子の核にまたは接合子核の
一部分を形成する遺伝物質に加えることができる外因性遺伝物質の量（例えば、
容量）も決定する。遺伝物質が取り出されない場合、加えることができる外因性
遺伝物質の量は、物理的に破壊されることなく吸収される量によって制限される
。概して、挿入される外因性遺伝物質の容量は、約１０ピコリットル以下であろ
う。添加の物理的影響は、接合子の生存率を物理的に破壊するほど大きくてはな
らない。ＤＮＡ配列の数および種類の生物学的限界は、得られた接合子の外因性
遺伝物質を含めた遺伝物質が、その接合子の分化および発育を生物学的に開始し
且つ維持して機能性生物にすることができなければならないので、特定の接合子
および外因性遺伝物質の機能によって異なるであろうし、当業者に容易に明らか
であろう。
【０１０８】 接合子に加えられるトランスジーン構築物のコピー数は、加えられる外因性遺
伝物質の全量に依るし、遺伝的形質転換を生じさせる量であろう。理論的には、
１コピーだけ必要であるが、しかしながら、１コピーが確実に機能性であるため
には、概して多数のコピー、例えば、トランスジーン構築物の１，０００−２０
，０００コピーが用いられる。本発明に関しては、しばしば、外因性ＤＮＡ配列
の表現型発現を促進するために、挿入された外因性ＤＮＡ配列それぞれの２個以
上の機能性コピーを有することが好都合であろう。
【０１０９】 外因性遺伝物質を核の遺伝物質中に加えることを可能にするいずれの技術も、
それが細胞、核膜または他の既存の細胞若しくは遺伝的構造に破壊的でない限り
用いることができる。外因性遺伝物質は、マイクロインジェクションによって核
の遺伝物質中に選択的に挿入される。細胞および細胞構造のマイクロインジェク
ションは知られているし、当該技術分野において用いられている。
【０１１０】 再移植は、標準法を用いて行われる。通常は、代理宿主を麻酔し、その輸卵管
に胚を挿入する。特定の宿主中に移植される胚の数は種によって異なるであろう
が、通常は、それら種が天然に生じる子孫の数に匹敵するであろう。
【０１１１】 代理宿主のトランスジェニック子孫は、任意の適当な方法によってそのトラン
スジーンの存在および／または発現についてスクリーニングすることができる。
スクリーニングは、しばしば、サザンブロットまたはノーザンブロット分析によ
り、トランスジーンの少なくとも一部分に相補的であるプローブを用いて行われ
る。トランスジーンによってコードされるタンパク質に対する抗体を用いるウェ
スタンブロット分析は、トランスジーン産物の存在についてスクリーニングする
代わりのまたは追加の方法として用いることができる。典型的には、ＤＮＡを尾
組織から調製し、そのトランスジーンについてサザン分析またはＰＣＲによって
分析する。或いは、トランスジーンを最高レベルで発現すると考えられる組織ま
たは細胞を、そのトランスジーンの存在および発現についてサザン分析またはＰ
ＣＲを用いて調べるが、いずれの組織または細胞種類もこの分析に用いることが
できる。
【０１１２】 トランスジーンの存在を評価するための代わりのまたは追加の方法には、制限
されるものではないが、酵素および／または免疫学検定などの適当な生化学検定
、特定のマーカーまたは酵素活性に関する組織染色、フローサイトメトリー分析
等が含まれる。血液の分析は、血中のトランスジーン産物の存在を検出するのに
も、更には、いろいろな種類の血液細胞および他の血液成分のレベルに対するト
ランスジーンの作用を評価するのにも有用でありうる。
【０１１３】 トランスジェニック動物の子孫は、そのトランスジェニック動物を適当なパー
トナーと交配することによって、またはそのトランスジェニック動物から得られ
る卵子および／または精子のｉｎ ｖｉｔｒｏ受精によって得ることができる。
パートナーとの交配を行う場合、そのパートナーは、トランスジェニックおよび
／またはノックアウトであってよいしまたはなくてもよく、それがトランスジェ
ニックである場合、同じまたは異なったトランスジーンを含有してよいしまたは
両方とも含有してよい。或いは、そのパートナーは親の系統であってよい。ｉｎ
ｖｉｔｒｏ受精を用いる場合、受精した胚を代理宿主中に移植してよいしまた
はｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートしてよいしまたは両方行ってよい。どちら
の方法を用いても、その子孫は、上記の方法または他の適当な方法を用いてその
トランスジーンの存在について評価することができる。
【０１１４】 本発明によって生産されるトランスジェニック動物は、外因性遺伝物質を含む
であろう。上記のように、その外因性遺伝物質は、若干の実施態様において、Ｉ
Ｌ−１タンパク質（アゴニストかまたはアンタゴニスト）の生産をもたらすＤＮ
Ａ配列、アンチセンス転写物、またはＩＬ−１突然変異体であろう。更に、この
ような実施態様において、その配列は、好ましくは、特定の種類の細胞中でのト
ランスジーン産物の発現を可能にする転写調節要素、例えば、プロモーターに結
合しているであろう。
【０１１５】 レトロウイルス感染も、トランスジーンを非ヒト動物に導入するのに用いるこ
とができる。発育している非ヒト胚は、胚盤胞段階まで培養することができる。
この期間中、それら割球はレトロウイルス感染の標的でありうる（Ｊａｅｎｉｃ
ｈ，Ｒ．（１９７６）ＰＮＡＳ ７３：１２６０−１２６４）。それら割球の有
効な感染は、透明帯を除去する酵素的処置によって得られる（Ｍａｎｉｐｕｌａ
ｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｈｏｇａｎ監修（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８６）。トランスジーンを導入するのに用いら
れるウイルスベクター系は、典型的には、そのトランスジーンを有する複製欠損
性レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒら（１９８５）ＰＮＡＳ ８２：６９２
７−６９３１；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら（１９８５）ＰＮＡＳ ８２：
６１４８−６１５２）。トランスフェクションは、ウイルス生産性細胞の単層上
で割球を培養することによって容易に且つ効率よく得られる（Ｖａｎ ｄｅｒ
Ｐｕｔｔｅｎ，上記；Ｓｔｅｗａｒｔら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３８３
−３８８）。或いは、感染は、もっと後の段階で行うことができる。ウイルスま
たはウイルス生産性細胞を、割腔中に注入することができる（Ｊａｈｎｅｒら（
１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９８：６２３−６２８）。トランスジェニック非ヒ
ト動物を形成した細胞のサブセットでのみ包含が起こるので、創始者の大部分は
、トランスジーンに関してモザイクであろう。更に、創始者は、一般的には子孫
で分離するゲノム中の異なった位置にトランスジーンの種々のレトロウイルス挿
入を含有しうる。更に、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染によって生殖系
列中へトランスジーンを導入することも可能である（Ｊａｈｎｅｒら（１９８２
）上記）。
【０１１６】 トランスジーン導入のための第三の種類の標的細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ）で
ある。ＥＳ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された着床前胚から得られ、胚と融
合される（Ｅｖａｎｓら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６；
Ｂｒａｄｌｅｙら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓ
ｓｌｅｒら（１９８６）ＰＮＡＳ ８３：９０６５−９０６９；およびＲｏｂｅ
ｒｔｓｏｎら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４５−４４８）。トランス
ジーンは、ＤＮＡトランスフェクションによってまたはレトロウイルスに媒介さ
れる形質導入によってＥＳ細胞中に効率よく導入することができる。このような
形質転換されたＥＳ細胞を、その後、非ヒト動物からの胚盤胞と一緒にすること
ができる。次に、それらＥＳ細胞は胚を定着させ、得られるキメラ動物の生殖系
列に貢献する。概説に関しては、Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ（１９８８）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４０：１４６８−１４７４を参照されたい。
【０１１７】 ４．６ 薬学的スクリーニング ４．６．１ 概略 本発明は、ＩＬ−１に媒介される炎症過程を阻止することができる化合物を同
定するために薬学的スクリーニングを行うことができる種々のトランスジェニッ
ク細胞系および生物を提供する。上記のように、それらトランスジェニック細胞
系および生物は、１種類またはそれ以上の内因性ＩＬ−１拮抗遺伝子活性を欠損
しているように遺伝子操作される。結果として得られる内因性ＩＬ−１アゴニス
ト活性の増加（例えば、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β）は、概して、“急性期応
答”を導く。その急性期応答は、更に、上に論じられた種々の炎症性疾患および
異常に特有のものを含めた炎症過程を開始する。その急性期応答は、血清タンパ
ク質ＳＡＰ（マウスの場合）およびＣＲＰ（ヒトの場合）を含めた種々の急性期
マーカーの生産によって特徴付けられる。これら様々な炎症性疾患過程の開始に
おける急性期応答の潜在的重要性は、ＩＬ−１に媒介される炎症性疾患過程に拮
抗することができる候補薬化合物の評価においてこのような急性期マーカーの使
用を可能にする。
【０１１８】 ４．６．２ 急性期応答 急性期応答は、炎症刺激に応答して、活性単核食細胞、リンパ球および他の分
化した細胞種類によって生産されるサイトカインによって引き起こされる。サイ
トカインは、局所的且つ全身的に作用して、更に別のサイトカインを生じるもの
を含めた標的細胞を補充し且つ活性化させる。これは、それら引き出された種々
のサイトカインによって主に制御され且つ協調される現象のカスケードを引き起
こす。続いて起こる標的細胞および組織の活性化および増殖は、結果としての細
胞表現型の変化を伴って、炎症性物質を中和することによりおよび修復過程およ
びホメオスタシスへの復帰を促進することにより宿主生存を促す。この項目は、
インターロイキン−１（ＩＬ−１）を含めた炎症性サイトカインの局所および全
身作用について本発明者が現在理解していることに焦点を合わせている。
【０１１９】 インターロイキン−１は、概して、急性期応答の開始および維持において中心
的に重要である前炎症性サイトカインと考えられる。発熱を引き起こすその能力
に関して初めは‘内因性発熱物質’と称されたＩＬ−１は、過去２０年間にわた
って、その多数の生物学的活性に基づく他の頭字語を有してきた。これらには、
リンパ球活性化因子、胸腺細胞増殖因子、および胸腺細胞活性化および増殖を引
き起こすその能力に関するヘルパーピーク−１；形質細胞の直接的活性化を刺激
するその能力に関するＢ細胞活性化因子；急性期タンパク質合成を引き起こすそ
の能力に関する白血球内因性メディエーター；および単核細胞因子、単球に誘導
されるリクルート活性、カタボリン、破骨細胞活性化因子、および広範囲の他の
生理学的過程におけるその役割を反映しているヘモポエチン−Ｉが含まれる。上
の機能の全てが、結局は、インターロイキン−１の包括的名称を与えられた１７
．５ｋＤａタンパク質に帰すると考えられた（Ａａｒｄｅｎら（１９７９）Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２３：２９２８−９）。２種類のイソ型のヒトＩＬ−１、す
なわち、ｐＩ５．０のＩＬ−１αおよびｐＩ７．０のＩＬ−１βが存在する。ど
ちらのイソ型も、クローン化され且つ配列決定されており、両方の分子が約３１
ｋＤａのプロペプチドとして合成され、それが成熟１７．５ｋＤａ生産物までプ
ロセッシングされることが確かめられた。そのプロペプチドからの成熟ＩＬ−１
β分子の発生は、最近になって分子レベルで確認されたインターロイキン−１β
変換酵素である特異的で明らかに独特の酵素によって媒介されるタンパク質分解
切断を必要とする。このような酵素の存在は、このサイトカインの活性型の生産
を支配する正確な制御機序を暗示し、しかもこのおよび他の活性炎症メディエー
ターの生産が、特定の且つ微調整された制御経路に左右される可能性を示してい
る。
【０１２０】 ＩＬ−１は、主として、活性単核食細胞の生産物と考えられるが、適当な刺激
性シグナルが与えられると、それは、リンパ球（ヘルパーＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ
細胞、好中球および大型顆粒リンパ球）；血管細胞（平滑筋細胞および内皮細胞
）；角膜および胸腺の上皮細胞；皮膚細胞（ケラチノサイト、ランゲルハンス細
胞）；脳細胞（星状細胞、小グリア細胞、グリオーマ細胞）；樹状細胞；腎臓の
メサンギウム細胞；線維芽細胞；および軟骨細胞を含めた多数の他の分化した細
胞種類によって合成される。単核食細胞は、Ｔ細胞（抗原提示中）、ウイルス、
細菌、抗原−抗体複合体および若干の化学薬品との接触のような多数の活性化刺
激に応答してＩＬ−１を生じるように刺激されうる。
【０１２１】 ＩＬ−１は、視床下部を刺激することによっておよびプロスタグランジンと一
緒に相乗作用することによって中枢神経系（ＣＮＳ）にも直接的に作用し、それ
によって、脳の体温調節ニューロンの発射速度を調節し、発熱を引き起こす。こ
れは、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）および副腎皮質刺激ホルモン（
ＡＣＴＨ）の生産をもたらし、その結果、グルココルチコステロイド合成が起こ
る。活性マクロファージ中のＩＬ−１合成はグルココルチコステロイドによって
阻害されるので、ＩＬ−１による高レベルのグルココルチコステロイドの誘導は
、順次に、負のフィードバック調節ループを作る。上のカスケードの開始および
その前炎症続発症は、したがって、中断されなければホメオスタシスへの復帰を
導くプログラムをセットする。有意なことに、脳におけるインターロイキン−１
のもう一つの活性は、βアミロイド前駆体プロモーターの刺激（Ｄｏｎｎｅｌｌ
ｙら（１９９０）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，１０：４８５−９５
）であり、アルツハイマー病とＩＬ−１に媒介される炎症過程との間の関連が示
唆される。
【０１２２】 ホメオスタシスへの復帰は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストタン
パク質（ＩＬ−１ＲＮ／ＩＬ−１ｒａ／ＩＲＡＰ）の、おそらくはＩＬ−１自体
による誘導によっても促進されると考えられる。ＩＬ−１ＲＮは、標的細胞上の
ＩＬ−１受容体に結合し、それによってＩＬ−１の関与を、および結果的に受容
体によるシグナルの伝達を直接的にブロックすることによってＩＬ−１アゴニス
ト活性を阻害する（Ｈａｎｎｕｍら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３：３３６
−４１）。ＩＬ−１ＲＮは、実験的に引き起こされた炎症に苦しむマウスの肝中
において、急性期反応性タンパク質の肝合成が最大である時点で増加したレベル
で合成される（Ｚａｈｅｄｉら（１９９１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４６：４２
２８−３３）。したがって、そのアンタゴニストの誘導は、ＩＬ−１（および他
のサイトカイン）の前炎症の役割が果たされた場合の全身の急性期応答のピーク
と一致する。
【０１２３】 急性期応答中に、ＩＬ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞に直接的に作用
することにより、またはこれら標的細胞を、更に別の正のまたは負の調節シグナ
ルをそれらに与えうる他のサイトカインの合成を誘導することによって間接的に
刺激することにより、細胞性、体液性および先天性の免疫応答を引き起こす。Ｉ
Ｌ−１は、Ｂ細胞成熟および抗体産生にも重要である。循環性ＩＬ−１は、骨髄
から血流中への成熟好中球の放出を促進することによって、および好中球、Ｔ細
胞および単球を炎症部位に引き出す誘因物質として作用することによって細胞の
動態化を協調させる。炎症部位において、ＩＬ−１は、線維芽細胞および上皮細
胞の増殖を引き起こし、内皮細胞および上皮細胞上で細胞間接着分子−１（ＩＣ
ＡＭ−１）を合成させることによって組織損傷部位へのリンパ球の接着を促進す
る。ＩＬ−１は、凝血因子プラスミノーゲン活性化因子およびその阻害剤、プロ
コアグラント、血小板活性化因子、コラーゲンおよびコラゲナーゼの合成を刺激
することによって創傷治癒を促進する。
【０１２４】 要するに、ＩＬ−１は、概して、より多くのＩＬ−１および／または他のサイ
トカインを作るようにいろいろな細胞にシグナルを与えることによって；ＣＮＳ
を刺激することによって；肝ＡＰＲ合成を引き起こすことによって；および炎症
部位で局所細胞シグナリングを協調させることによって多機能ホルモンとして作
用する。
【０１２５】 サイトカインは、標的組織中において、その標的細胞表面上の特異的受容体に
最初に結合することによって遺伝子発現を調節する。次に、リガンド−受容体複
合体は、形質膜の内面から核へ伝達されるシグナルを与える。このシグナルが伝
達される機序は、標的細胞に特異的でありうる。
【０１２６】 ＩＬ−１には二つの異なった膜受容体、すなわち、Ｔ細胞、線維芽細胞および
結合組織細胞上に存在する８０ｋＤａ（１型）受容体およびＢ細胞上にだけ見ら
れる６７ｋＤａ（２型）受容体がある（Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅら（１９８９）Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：８０２９−３３）。どちら
の受容体も、細胞外ドメイン、短い膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有す
る。両方ともＩＬ−１αおよびＩＬ−１βを結合するが、しかしながら、８０ｋ
Ｄａ受容体だけは、ＩＬ−１受容体アンタゴニストタンパク（ＩＬ−１ＲＮ）と
相互作用しうる（Ｈａｎｎｕｍら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３：３３６−
４１）。
【０１２７】 サイトカインは、少なくとも二つの主要経路によってプロテインキナーゼを活
性化させることにより細胞活性を調節する。一つの経路は、膜アデニル酸シクラ
ーゼによって生じる第二メッセンジャーであるｃＡＭＰへのＡＴＰの変換を必要
とする。もう一つの機序は、膜脂質ホスファチジルイノシトール−４，５−トリ
リン酸のホスホリパーゼＣによる加水分解を必要とし、それは、ジアシルグリセ
ロール（ＤＡＧ）およびイノシトール−１，４，５−トリリン酸（ＩＰ３）を生
じる。ホスホイノシチド加水分解は、プロテインキナーゼＣにＤＡＧを結合させ
る。活性ｃＡＭＰおよびＤＡＧは、プロテインキナーゼＡおよびＣそれぞれの活
性を変更することができる。ＩＬ−１シグナル伝達に関して、若干の研究者らは
、ｃＡＭＰまたはＤＡＧの第二メッセンジャーとしての関与を報告しているが、
他の研究者らはどちらの関与にも異議を唱えている。この論争は、ＩＬ−１応答
性遺伝子の活性化が、異なった細胞種類において異なったシグナリング経路によ
って起こるか否かへと広がっている。最近の証拠は、線維芽細胞および結合組織
細胞中のＩＬ−１応答性遺伝子活性化を導くシグナル伝達経路が、セリンキナー
ゼによって媒介されるリン酸化反応を必要とすることを示唆している（Ｋａｎａ
ｋａｒａｊら（１９９８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５：２０７３−９を参照され
たい）。
【０１２８】 多数の受容体−リガンド複合体は、ＧＴＰを結合し且つその占有された受容体
からアデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣまたはホスホリパーゼＡ２などの
エフェクター酵素へシグナルを伝達するグアノシンヌクレオチド結合タンパク質
（Ｇタンパク質、例えば、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｔ）に共役する。Ｇタンパク質
は、ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーションによってＤＡＧの生成を媒介する
のに関与していた。Ｇタンパク質の活性化は、増加したＧＴＰ結合およびＧＴＰ
アーゼ活性を伴い、ＩＬ−１シグナル伝達におけるそれらの役割は、放射性標識
されたＧＴＰ類似体を用いてまたはＩＬ−１で処理された細胞若しくは膜標品中
のＧＴＰ加水分解を測定して実験的に分析することができる。大部分の受容体−
リガンド複合体について、百日咳毒素（ＩＡＰ）を用いた細胞の前処理は、Ｇタ
ンパク質を共役させない。これは、‘古典的’Ｇタンパク質の場合、その毒素の
ＡサブユニットによるＡＤＰのリボシル化のためである。ＩＬ−１αおよびＩＬ
−１βは、ＧＴＰに関して増加した親和性のために（６４）、胸腺腫細胞から調
製された膜中において増加したＧＴＰアーゼ活性およびＧタンパク質の活性化を
もたらす。自然のままの百日咳毒素を用いた胸腺腫細胞およびＢ細胞の前処理は
、ＩＬ−１に誘導されるＧタンパク質活性を部分的に阻害する。しかしながら、
その毒素のＢサブユニットは、ＡＤＰリボシル化活性がなく、自然のままの百日
咳毒素と同程度に効率よくＧタンパク質活性を阻害する。ＩＬ−１によるＧタン
パク質活性化の阻害は、したがって、ＡＤＰリボシル化に起因しえない。したが
って、ＩＬ−１シグナル伝達の百日咳毒素阻害は、古典的Ｇタンパク質の失活を
必要としないが、若干の他の‘Ｇ様’タンパク質の失活によることがありうると
考えられる。このような非古典的な百日咳感受性Ｇタンパク質活性化は、ＩＬ−
２、ＴＮＦおよびＧＭ−ＣＳＦシグナリング機序について示されてきた。
【０１２９】 ＩＬ−１シグナル伝達に必要な初期シグナルはまだ検討中であるが、ＩＬ−１
受容体相互作用に伴うＡＰＲ ＲＮＡの増加した転写は、ＩＬ−１応答性遺伝子
の５′調節領域に結合する因子の活性化を必要とする。細胞質転写因子核因子κ
Ｂ（ＮＦκＢ）の活性化は、ＩＬ−１に誘導されるリン酸化およびその結合した
阻害剤タンパク質ＩκＢの解離によることによって、それを核に入れ且つＤＮＡ
に結合させる。ＮＦκＢは、多数のＡＰＲ遺伝子のＩＬ−１に支配される遺伝子
活性化に中心的に関与している。したがって、ＩＬ−１シグナリングは、既存の
転写因子の動態化を必要とする。更に、ＩＬ−１応答性遺伝子の遺伝子発現の誘
導は、プロモーター中のＡＰ１部位に結合する転写因子ｃ−ｆｏｓ／ｃ−ｊｕｎ
を活性化させるホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）を用いて行うこと
ができる。ＰＭＡもＩＬ−１も、これらＤＮＡ結合タンパク質の合成を刺激する
ことができるので、転写因子の絶対レベルを増加させるＩＬ−１の能力は、遺伝
子発現の制御の追加手段である。
【０１３０】 急性期応答の最も劇的な結果の一つは、根本的に変更された肝臓の生合成プロ
フィールである。普通の条件下において、肝臓は、特徴的な範囲の血漿タンパク
質を定常状態濃度で合成する。これらタンパク質の多くは、急性期応答中に必要
とされ、結果的に炎症刺激後にもたらされる重要な機能を有する。逆に、他のも
の、特にアルブミンは、誘導される‘急性期反応性タンパク質’（ＡＰＲ）を合
成する肝臓の能力を増加させるようにダウンレギュレーションされる。ＡＰＲは
、宿主防御に寄与する広範囲の活性を有し；それらは、免疫応答を刺激し且つそ
れに関与し；必須補助因子および細胞種類を封鎖し、それらを組織損傷部位に向
かわせ；炎症性物質を直接的に中和し、組織損傷の範囲を局所的に最小限にする
のを助け；そして組織修復および再生に関与する。
【０１３１】 急性期中の血漿濃度を増加させる補体、凝固および接触（キニン形成）のカス
ケードに関与するタンパク質は、侵入した微生物を破壊する宿主の能力を増大さ
せ、必須の血液凝固成分を与える。誘導される補体成分には、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４
、Ｃ５、Ｃ９、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）およびＢ因子が含まれる。それ
らの細胞溶解活性に加えて、補体タンパク質は、先天性免疫において広範囲の活
性を有する。補体カスケードの活性化は、最終的には、感染性物質の致死、異物
および宿主細胞破片のクリアランスおよび損傷組織の修復に関与する好中球、マ
クロファージおよび血漿タンパク質の局所蓄積を引き起こす。血餅形成タンパク
質フィブリンの前駆体であるフィブリノーゲンの血漿レベルは、急性期応答中に
増加して（ＭｏｓｓｅｓｓｏｎおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８３）Ａｎｎ
ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，４０８：１−６７２）、局所組織損傷および病原体の
侵入を制限すること、および創傷治癒を促進することに関与する臨界的タンパク
質の一つを充分に供給させる。フィブリノーゲンレベルは、更に、‘赤血球沈降
速度’を測定する場合に臨界的に有用であったが、フィブリノーゲンの絶対濃度
としての炎症の重要な指標は、赤血球が沈降する速度と相関する。
【０１３２】 多数のプロテイナーゼインヒビターは、α１アンチトリプシン、α１アンチキ
モトリプシン、α２アンチプラスミン、Ｃ１インヒビターおよびインターαトリ
プシンインヒビターを含めたＡＰＲＳである。これらインヒビターは、マクロフ
ァージおよび好中球の浸潤および活性化後に放出されるリソソームヒドロラーゼ
を中和するのに役立つ。したがって、健康な宿主組織への不適当な付帯的損傷は
最小限に保たれる。
【０１３３】 ハプトグロビン、ヘモペキシンおよびセルロプラスミンなどの金属輸送タンパ
ク質の血漿濃度は、急性期応答中に増加する。ハプトグロビンおよびヘモペキシ
ンは、ヘモグロビンおよびヘム残基をそれぞれ結合し、感染および傷害の際に鉄
損失を防止する。更に、それは、細菌による取込みに利用可能なヘム鉄のレベル
を最小限にし、それによって必須栄養素から感染性物質を奪い、そして感染への
宿主の抵抗性を更に増加させる。セルロプラスミンは、銅および鉄輸送に関与し
、マクロファージおよび好中球によって放出されて組織損傷を更に引き起こすこ
とがありうる酸素フリーラジカルを除去するためのスカベンジャーとして作用す
る。
【０１３４】 血漿タンパク質アルブミン、プレアルブミン、トランスフェリン、アポリポタ
ンパク質ＡＩおよびアポリポタンパク質ＡＩＩは、急性期応答中に減少し、した
がって、‘負の’ＡＰＲと称される。
【０１３５】 ＡＰＲのサブセットは、多量に誘導される。血清アミロイドＡタンパク質（Ｓ
ＡＡ）、およびペントラキシンの、種によってＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）か
または血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）の一方は、炎症の際に１０００倍まで増
加する。これら‘主要’ＡＰＲは、後でより詳細に考察される。
【０１３６】 個々のＡＰＲの血漿濃度の変化は多様であり、急性期応答に効率よく関与する
のに必要とされるそれぞれのタンパク質の量の違いに反映されると考えられる。
ＡＰＲ血漿濃度の増加（または減少）の大きさは、僅か５０パーセント（セルロ
プラスミン、Ｃ３）から中程度の２−４倍まで（プロテイナーゼインヒビター、
ハプトグロビン、フィブリノーゲン）、１０００倍を越えるまで（ＣＲＰ、ＳＡ
Ａ）ある（Ｋｕｓｈｎｅｒら（１９８２）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，３
８９：２３５−７４に概説された）。ヒトＡＰＲ誘導の速度論は、急性刺激後最
初の１２時間以内に増加したＣＲＰ、ＳＡＡおよびα１アンチキモトリプシンの
血漿レベル、続いて約２４時間後に増加するα１アンチトリプシン、α１酸性糖
タンパク質、ハプトグロビンおよびＢ因子のレベルによって特徴付けられる。Ｃ
ＲＰおよびＳＡＡタンパク質は、極めて短い半減期（５−７時間）を有するが、
大部分のＡＰＲは、３−５日間の半減期を有する（Ｌａｕｒｅｎｔ（１９８９）
Ａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｕｔｅ ｐｈ
ａｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）１５０−１６０
頁に概説された）。急性期応答後、ＡＰＲの血漿濃度はそれらの正常値に戻るが
、しかしながら、若干のＡＰＲは、慢性炎症の場合、いつまでも上昇したままで
ある。様々な感染症および炎症状態における急性期応答のパターンは、他で充分
に概説されている。
【０１３７】 ＡＰＲ誘導プロフィールは、種間で大きく異なるが、異なった種でのＡＰＲは
、高度の構造的および機能的相同性を共有している。例えば、ヒトの場合、ＳＡ
ＰではなくＣＲＰが主要ＡＰＲであるが；逆に、（実験的に引き起こされた炎症
に苦しむ）マウスでは、ＳＡＰが主要ＡＰＲであり、ＣＲＰは少ない方のＡＰＲ
にすぎない（ＰｅｐｙｓおよびＢａｌｔｚ（１９８３）Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ
３４：１４１−２１２に概説された）。ヒト、マウスおよびウサギは、急性期
応答中にＳＡＡの劇的な誘導を示すが、ラットは示さない。更に、プロテイナー
ゼインヒビターα２マクログロブリンは、ヒトの場合、急性期応答中に血漿濃度
が増加しないが、マウスおよびラットでは、それが有意に誘導されるＡＰＲであ
る（Ｌｏｎｂｅｒｇ−Ｈｏｍら（１９８７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：
４３８−４５）。
【０１３８】 ＩＬ−１に媒介される炎症を阻害する場合の候補薬化合物の有効性を監視する
のに利用可能な急性期応答マーカーの要約を下の表１に示す。好ましい急性期マ
ーカーは、ＩＬ−１誘導後に最大の発現増加を示すものである。
【０１３９】
【表１】
【０１４０】 ｉｎ ｖｉｖｏ炎症刺激に応答したＡＰＲ生合成の速度論および大きさは、主
に、齧歯類動物モデルを用いた研究に基づいている。初期の研究では、ウサギお
よびマウスに、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）またはテルペンチン、アゾセセイン（ａ
ｚｏｃａｅｓｅｉｎ）若しくはチオグリコラートなどの炎症性化学刺激薬を注射
し、ＡＰＲタンパク質およびＭＲＮＡの血漿および組織のレベルを測定した。精
製されたおよび組換え体のサイトカインは、その後入手可能になり、一般的には
急性期応答、具体的にはＡＰＲ合成への個々のサイトカインの作用をｉｎ ｖｉ
ｖｏで分析可能にした。しかしながら、これら研究は、試験中の物質の直接的作
用に二次的であるすなわち伴う広範囲の応答（初めに詳述されたような）を生じ
るサイトカインによって引き出される他の炎症過程によって複雑になっている。
初代肝細胞培養は多数の研究者によって用いられてきたが、しかしながら、肝細
胞培養物は、分析されているメディエーターと一緒に相乗作用しうるまたはそれ
を阻害しうる別の因子を生じる試験サイトカインによって刺激された状態になり
うる線維芽細胞およびクッパー細胞などの多数の他の細胞種を含有しうるので、
これら研究で一次と二次の作用を区別することも難しいことが多い。ＰＬＣ／Ｐ
ＲＦ／５、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３ＢおよびＨｕＨ−７などの培養された肝癌細胞
系は、培養条件下の炎症メディエーターによる個々のＡＰＲ遺伝子の研究に有用
なモデルを提供する。しかしながら、これら細胞系によって発現されるＡＰＲは
、それらの誘導される能力および誘導の大きさによって、サイトカイン処理に対
して極めて異なった応答をすることがあり、いくつかの状況においては、いろい
ろな研究者が同様の細胞系を用いて相反する結果を報告している。ヒト肝癌／肝
細胞培養物は、それにもかかわらず、ヒトＡＰＲ遺伝子発現を調節する単独また
は組合せの一定のサイトカインによる一般的な機序の研究に有用なモデルとなっ
ている。
【０１４１】 種々の炎症メディエーターに対する個々のＡＰＲの示差的応答を表２に要約す
る（Ｇａｕｌｄｉｅ（１９８９）Ａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｉｎ ｔｈｅ ａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．１−２２頁，Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇに概説された）。ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ
はそれぞれ、多数のヒトＡＰＲ（例えば、α１アンチキモトリプシン、α１酸性
糖タンパク質、セルロプラスミン、Ｃ３、Ｂ因子、ＳＡＡ）の生合成を引き起こ
すことができ、他（例えば、αフェトプロテイン）の生合成の減少を引き起こす
ことができる。ＩＬ−６を除くＩＬ−１、またはＴＮＦは、ヒト肝癌細胞におい
てＣ１インヒビターおよびＳＡＰの合成も減少させる。他のＡＰＲの合成に関し
て、これらサイトカインそれぞれに対する肝癌細胞の応答は不均一であり；若干
のＡＰＲＳについての生合成はＩＬ−６によってのみ誘導され、ＩＬ−１によっ
て誘導されない（例えば、Ｃ４ｂｐ、ＳＡＰ、ヘモペキシン、ハプトグロビン、
フィブリノーゲン）。ＩＬ−６を加えたＩＬ−１を用いた細胞の同時処理は、若
干のＡＰＲ遺伝子（α酸性糖タンパク質、ＣＲＰ、Ｃ３、Ｂ因子、ハプトグロビ
ン、ＳＡＡ）に相加的または相乗的作用を有する。或いは、一つのサイトカイン
が、誘導サイトカインの作用に優先する阻害作用を及ぼすことがあり、例えば、
ＩＬ−１およびＴＮＦは、それぞれ、Ｃ１インヒビターおよびＳＡＰの合成の、
およびＣＲＰ、ハプトグロビン、フィブリノーゲンおよびＳＡＡの合成のＩＬ−
６によるアップレギュレーションを阻害することがありうる。
【０１４２】
【表２】
【０１４３】 グルココルチコステロイドデキサメタゾンは、細胞培養系（８０）においてサ
イトカインに対する若干のＡＰＲの応答を大きく増加させるが、一般的には、そ
れだけでＡＰＲ合成を誘導することはできない。これは、急性期応答の重要な特
徴を強調しており、初めに論じられたように、ＩＬ−１はＣＮＳを刺激して、肝
中のＡＰＲ合成を誘導するＩＬ−１の能力を増大させ、同時に活性単球による追
加のＩＬ−１合成をダウンレギュレーションするグルココルチコステロイドを生
じる。合成グルココルチコステロイドであるデキサメタゾンは、したがって、し
ばしば日常的に、それらの誘導作用を増加させる実験的サイトカイン処理プロト
コールにおいてほぼ生理学的濃度で包含される。
【０１４４】 ＩＮＦγは、ＡＰＲ合成について、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦより制限
された作用を有する。ＩＮＦγ ＡＰＲ誘導についての大部分の研究は、目的の
ＡＰＲ遺伝子を用いてトランスフェクションされたマウスＬ細胞を用いてきた。
これら研究では、ＳＡＡ、Ｃ２およびＢ因子、およびＣ４の生合成が誘導されう
る。ＩＮＦＹは、初代単球においてヒト因子ＢおよびＣ２遺伝子の合成も引き起
こす。ＩＮＦγは、細胞のサイトカイン受容体の数を調節することによって間接
的に肝細胞応答性を変化させることが示唆されている。ＴＧＦβは、多数のＡＰ
Ｒの合成を調節することが最近になって分かってきた。
【０１４５】 血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）およ
び血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）は、急性期中にそれらの正常血漿濃度の１０
００倍まで誘導されることがあり（Ｋｕｓｈｎｅｒら（１９８２）Ａｎｎ ＮＹ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ，３８９：２３５−７４に概説された）、したがって、ＡＰ
ＲＳの別のサブグループを構成している。それらは、しばしば、‘主要’急性期
タンパク質と称される。ＳＡＡ、ＣＲＰおよびＳＡＰの研究は、ＡＰＲＳの発現
の体制、構造、機能および制御の研究によって提示される難題の多くを詳しく説
明する。これら主要ＡＰＲの生合成の極端な変化は、それらが生物学的にかなり
興味深いことを示している。それらの正確な生理学的役割はまだ明確でないまま
であり、考慮すべき論争の主題であるが、急性期刺激後のそれらの誘導の大きさ
および速さは、それらの短い半減期（他のＡＰＲの半減期は日数で測定されるの
に、約６時間）と共に、宿主防御の決定において極めて初期に、これらタンパク
質が特に要求されていることを示唆している。それらは、したがって、臨床的に
かなり重要であると考えられ、臨界的な防御の役割を有すると考えられる。
【０１４６】 ＣＲＰおよびＳＡＰは、円盤のように配置された５個のサブユニットを有する
特徴的な五量体形状のタンパク質ペントラキシンである。概して、ある与えられ
た種においては、一つのペントラキシンだけが主要ＡＰＲであり、他はほとんど
構成要素として発現される。ヒト（Ｋｕｓｈｎｅｒら（１９７８）Ｊ Ｃｌｉｎ
Ｉｎｖｅｓｔ ６１：２３５−４２）およびウサギの場合、ＣＲＰは誘導性ペ
ントラキシンであるが、マウスの場合、それはＳＡＰである（Ｐｅｐｙｓら（１
９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２７８：２５９−６１）。ペントラキシンの種特異的交
互発現の明らかな逆説は未解決であるが、炎症の際の急性期ペントラキシンへの
要求は、誘導される特定の分子に与えられるある種の共通の生理学的活性によっ
て満たされると考えられる。このような共通の機能は、まだ確認されていない。
【０１４７】 ＣＲＰは、最初、肺炎球菌のＣ多糖を結合するその能力に関して命名された。
次に、それは、細菌、寄生生物および免疫複合体に関してオプソニンとしてｉｎ
ｖｉｔｒｏで機能することが分かったが；更に、それは、補体カスケードを開
始し且つマクロファージ殺腫瘍活性を増加させることができる。急性期刺激への
ＣＲＰの絶妙な応答性およびその広い濃度範囲は、測定の容易さと共に、炎症の
重症度および疾患治療技術の効力を正確に監視するのに用いられるＣＲＰ血漿レ
ベルをもたらした。
【０１４８】 ＳＡＰは、最初、それが血清中で見出され、アミロイドＰ（ＡＰ）成分の循環
型であることから命名された（９０）。ＡＰは、一定範囲の慢性の再発性炎症性
疾患の偶発的結果であるアミロイド沈着物の二つの主成分の内の一つである。そ
れは、基底膜の正常成分であり、フィブロネクチンに結合する能力を有する。Ｃ
ＲＰとは異なり、それには、明瞭な免疫関連機能がない。
【０１４９】 ＣＲＰおよびＳＡＰは、約５０パーセントのアミノ酸同一性を示し、それらの
全体の構造類似性によって暗示される関連性が確認される。ＣＲＰおよびＳＡＰ
をコードしている遺伝子は、ヒトおよびマウスにおいて物理的および遺伝的に密
接に連鎖した状態のままであった。それらは、両種のシンテニー領域まで、すな
わち、ヒトおよびマウスにおいてそれぞれ染色体１のバンドｑ２．１および染色
体１の遠位部分が地図で示される。両種の隣接した遺伝子座には、免疫および炎
症に関係した役割を有する多数の遺伝子が含まれ；これまでのところ、Ｆｃ受容
体の全てが、マウスにおいてインターフェロン誘導産物の群を有するのと同様の
領域まで地図で示された。したがって、ペントラキシン遺伝子付近の領域全体は
、科学的および臨床的にかなり重要であろうと考えられ、微細な地図作成研究は
、著者らのおよび他の実験室で着手されている。多数の哺乳動物種からのＣＲＰ
およびＳＡＰは、クローン化され且つ配列決定されている。計算機に基づく進化
分析により、それら遺伝子が、おそらくは、哺乳動物の進化の初期に（真獣哺乳
動物および有袋動物の分岐時以前の約２００万年前）共通祖先のペントラキシン
遺伝子から２倍になったことが示された。それらタンパク質は、哺乳動物におい
て遺伝子重複の他の産物の大部分の２倍の速度で進化している。急性期応答中に
防御機能を与える場合に不可欠である推定上のペントラキシン活性を確認するた
めの今後の研究は、したがって、全体としてＣＲＰおよびＳＡＰによって示され
るよりも遙かに高い類似性レベルを保持していた分子の領域に対して向けられる
べきである。一つの候補活性は、クロマチンに結合する両方のペントラキシンの
能力によって示唆される。炎症中の壊死組織から放出される核物質に結合し且つ
そのクリアランスを行う能力は、核抗原に対して向けられた自己免疫過程の開始
を妨げる有効な手段を与えると考えられるし、少なくとも部分的には、炎症中に
必要とされる高循環レベルのペントラキシンの存在を説明すると考えられる。
【０１５０】 ＣＲＰおよびＳＡＰの急性期発現は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ
で広範囲に研究されてきた。最近の研究では、単一の実験的急性期刺激を、例え
ば、チオグリコラートの腹腔内注射またはアゾセセインの皮下注射によって与え
られたマウスが、２−４時間以内に肝ＳＡＰ ｍＲＮＡレベルのかなりの増加を
示し、８−１２時間までにピーク濃度を示している。これらは、約２４−３６時
間でピークに達する劇的に増加した循環性ＳＡＰタンパク質レベルによって抑制
される。肝ｍＲＮＡおよび血漿タンパク質両方のバックグラウンドレベルは、急
性期応答の一時的な性質によって、７２時間までに再度確立される。ＳＡＰ ｍ
ＲＮＡおよびタンパク質誘導の大きさおよび速度論は、刺激特異的であり、結果
としての前炎症シグナリングを変更し、減少させおよび終結させるサイトカイン
カスケードおよび反対平衡制御は、それら自体が絶妙に制御され、予め設定され
たプログラムに単に従うことはない。
【０１５１】 単球ならし培地および組換え体ＩＬ−１βおよび組換え体ＩＬ−６などの炎症
メディエーターを用いて処理されたヒト肝癌培養物を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ研
究により、ペントラキシン発現レベルを測定する場合に重要である固有の遺伝因
子および生合成制御のいくつかが示された。このような研究において、ＣＲＰ
ｍＲＮＡおよびタンパク質合成はＩＬ−６によって引き起こされる。ＩＬ−１β
単独では有意の変化がもたらされないが、ＩＬ−６との組合せでは、ＩＬ−６単
独と比較してかなり増加した応答がある。ＩＬ−６応答要素の位置は、ＣＲＰプ
ロモーター中に微細に地図で示されている。ＳＡＰ ｍＲＮＡは、組換え体ＩＬ
−６を用いた処理によってヒトＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞中で誘導されることがあ
り； 組換え体ＩＬ−１βを用いた処理は、ＳＡＰ ｍＲＮＡ合成をダウンレギ
ュレーションし、その作用は、両方のサイトカインが存在する場合に優先的に存
在する。これは、ヒトＳＡＰが有意の急性期タンパク質であるとは考えられない
ことを示唆し、特に局所部位では、存在する相対サイトカイン比率が、増加した
非肝ＳＡＰ合成を促進すると考えられる条件が存在しうる。上のｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ結果は、関連した肝生産物のサイトカイン特異的応答が、急性期応答中に異な
ることを示している。同様の肝タンパク質の種間の示唆的応答が、概して、固有
の遺伝制御因子によるということは、ＣＲＰが極めて少ないＡＰＲであるマウス
の、内因性マウスサイトカイン、シグナル伝達および細胞生合成経路を用いてヒ
トＣＲＰトランスジーンを大きく誘導するその能力によって詳しく説明される。
【０１５２】 ＳＡＡは、大部分の哺乳動物種で主要な急性期タンパク質であり、最も劇的に
誘導される。マウスｉｎ ｖｉｖｏ研究におけるいろいろな炎症刺激によるその
誘導の速度論は、ＳＡＰについて上に論じされたものと平行している。ＳＡＡは
小形アポリポタンパク質（ヒトの場合１０４アミノ酸）であり、急性期応答中に
、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、特に、ＨＤＬ３と結合する。ＳＡＡは、Ｈ
ＤＬ３と結合した、アポリポタンパク質ＡＩより大きい優勢なアポリポタンパク
質になりうる。ＳＡＡは、いくつかの種において多数の関連遺伝子の産物である
。これら遺伝子は、共通の体制、４個のエクソンおよび３個のイントロンを有し
、これは、いくつかの他のアポリポタンパク質遺伝子を暗示させる。ヒトの場合
、２種類の急性期ＳＡＡ（Ａ−ＳＡＡ）遺伝子が記載されており、ＳＡＡ１およ
びＳＡＡ２は、それらの明記された生産物の一次構造、それらの遺伝子体制およ
び配列、およびそれらの発現様式に関してほぼ一致する。それらは、疑う余地な
く、調節遺伝子変換現象後の先祖遺伝子重複の結果である。更に、ＭＲＮＡもタ
ンパク質産物も記載されていない第三の遺伝子（ＳＡＡ３）が存在する。それは
、最初、真正転写遺伝子の構造的完全さを有すると報告されたが、引き続き、イ
ンフレーム停止コドンの存在が確認され、実際はそれが偽遺伝子であることが示
された。最近になって、本発明者は、第四のＳＡＡ遺伝子の産物を識別したが；
Ｃ−ＳＡＡ（‘構成性’ＳＡＡ）は正常ＨＤＬ３上に存在し、あったとしても、
急性炎症の際に最小限に誘導される。その発現は、したがって、Ａ−ＳＡＡＳの
発現とは根本的に異なる。Ｃ−ＳＡＡ ｃＤＮＡクローンの配列分析は、ＳＡＡ
１およびＳＡＡ２タンパク質と僅か５５パーセントしか一致しない１１２アミノ
酸の成熟分子を予想させる。Ｃ−ＳＡＡ中に存在する余分の８アミノ酸は、残基
６９と７０との間にＡ−ＳＡＡ配列に相対して位置するオクタペプチド中にある
。配列同一性および含量、および誘導能力に基づいて、Ｃ−ＳＡＡは、Ａ−ＳＡ
Ａ遺伝子ＳＡＡ１およびＳＡＡ２より遠縁のＳＡＡスーパーファミリーメンバー
であるが、それにもかかわらず、それはこれら遺伝子に密接に連鎖している。本
発明者は、Ｃ−ＳＡＡ遺伝子をＳＡＡ２遺伝子座から９ｋｂ下流に位置するＳＡ
Ａ４遺伝子座まで地図で示している。更に、ＳＡＡ１遺伝子座は、ＳＡＡ２／Ｓ
ＡＡ４連鎖対と同様の３５０ｋｂ ＮｏｔＩ制限フラグメント上に位置している
。ＳＡＡ３偽遺伝子は、このフラグメント上にはないが、推定上の第五ＳＡＡ遺
伝子を有するように（Ｇ．Ｃ．ＳｅｌｌａｒおよびＡ．Ｓ．Ｗ．，未公表）染色
体１１の短アームまで地図で示されている（Ｇ．Ｃ．ＳｅｌｌａｒおよびＡ．Ｓ
．Ｗ．，未公表）。したがって、いろいろな程度の関連性および異なった誘導特
性を示すＳＡＡスーパーファミリー遺伝子の広範囲のクラスターが存在すると考
えられる。このようなクラスターの存在は、二つの主要な急性期ＳＡＡ遺伝子（
ＳＡＡ１およびＳＡＡ２）、少ない方の急性期遺伝子（ＳＡＡ３）およびＳＡＡ
偽遺伝子（ΨＳＡＡ）を有するマウス染色体７のシンテニー領域上の密接な連鎖
によって支持され、最初の三つは、同様に番号付けされたヒト相対物とほぼ同様
である。これまでのところ、マウスでＣ−ＳＡＡは識別されていない。しかしな
がら、ヒトＣ−ＳＡＡ中に存在するのと同様に位置のオクタペプチドは、イヌ、
ネコ、ウマおよびミンクを含めた一定範囲の種の多量に誘導されたＡ−ＳＡＡ中
に存在する。他の哺乳動物のオクタペプチド含有Ａ−ＳＡＡと比較した場合、ヒ
トＣ−ＳＡＡは、構成的に発現される唯一のものであるので、それは逆説を与え
る。
【０１５３】 ＳＡＡスーパーファミリーメンバーの示差的発現は、ＡＰＲ遺伝子およびそれ
らの産物における比較制御機序の研究のための最良のシステムの一つとなる。Ｗ
ｏｏら（（１９８７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：１５７９０−５）は、
ＩＬ−１が、ヒトＳＡＡ２遺伝子のマウス線維芽細胞中へのトランスフェクショ
ン後にヒトＡ−ＳＡＡの発現引き起こすことができることを示している。引き続
き、ＳＡＡ２プロモーター領域のＩＬ−１応答領域がＮＦκＢ結合部位を含有す
ることが示され、この転写因子は、その遺伝子の発現を制御するのに密接に関与
することが確認された。ヒト肝癌細胞系ＰＬＣ／ＰＲＦ／５におけるＳＡＡ発現
の分析により、ＩＬ−６は、ＳＡＡ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を引き起こ
すこともできるが、ＩＬ−１βと同様の大きさではないことが示された。ＩＬ−
１βおよびＩＬ−６を一緒に用いる場合、それらは、比較的生理的な刺激である
単球ならし培地によって生じるのと同様の大きさおよび速度論の劇的な相乗作用
誘導を示す。これは、Ａ−ＳＡＡに関して、組合せのＩＬ−１βおよびＩＬ−６
が、両方とも最大誘導に必要且つ充分であるサイトカインであるということを確
証した。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５を用いたこれら研究により、炎症刺激後のＳＡＡ発
現の制御を行う主な手段は、増加した転写およびｍＲＮＡの蓄積によることが確
認された。誘導ＳＡＡ ｍＲＮＡレベルがピークにある時点では、しかしながら
、ＳＡＡタンパク質を合成する細胞の能力は、刺激後のより早い時点と比較した
場合、蓄積したＳＡＡ ｍＲＮＡの絶対レベルの厳密に比例した使用から予想さ
れるよりも少ない。これは、転写後制御のために調節する役割を示唆している。
このモジュレーションは、ＣＲＰの場合のような、刺激後のいろいろな時点の細
胞のＡ−ＳＡＡ輸出能力の漸進的変化、またはフェリチン重鎖および軽鎖ｍＲＮ
Ａの場合のような、細胞翻訳装置、すなわち、リボ核タンパク質、モノソーム、
ポリソームによるＡ−ＳＡＡ ｍＲＮＡの示差的関与のためであるとは考えられ
ない。Ａ−ＳＡＡ ｍＲＮＡの細胞レベルは、ピークに達した後、速やかに減少
するが、Ａ−ＳＡＡ ｍＲＮＡ自体は、本質的に安定である。Ａ−ＳＡＡの生合
成を定義する本発明者の現在の努力は、誘導ｍＲＮＡ濃度の出現の時点に存在す
る長さから漸進的な制御された短縮を示すｍＲＮＡポリ（Ａ）テイルに焦点を合
わせており；これは、特異的ｍＲＮＡ分解過程および／またはその翻訳の効率に
影響を与えることがありうる。Ａ−ＳＡＡとは対照的に、Ｃ−ＳＡＡは、ＩＬ−
１βおよびＩＬ−６によって最小限に誘導される。その遺伝的体制は、全体的に
Ａ−ＳＡＡ遺伝子の場合と同様であるが、そのプロモーター領域中に含まれる配
列およびモチーフおよびイントロンは根本的に異なる。Ａ−ＳＡＡおよびＣ−Ｓ
ＡＡプロモーター活性の比較分析は、主要ＡＰＲの誘導に必要な固有の遺伝因子
を更に定義する場合に有用であろう。ＳＡＡおよびＳＡＰは、一時的な急性期応
答では有益であるが、慢性炎症では有害な作用を有する血漿タンパク質の典型的
な例である。多数の臨床的異常におけるこれら主要な急性期タンパク質の原因と
なるまたは関連した関与は、下に簡単に概説されるように直接的にまたは付随的
に関わっていた。
【０１５４】 続発性すなわち反応性のアミロイドーシスは、多数の慢性および再発性の炎症
性疾患、例えば、らい病、結核、全身性エリテマトーデスおよび慢性関節リウマ
チの偶発的結果である（Ｃｏｈｅｎら（１９５９）Ｎａｔｕｒｅ，１８３；１２
０２−３）。それは、脾臓、肝臓および腎臓を含めた種々の組織中における不溶
性原線維の最終的に致命的な進行性沈着を特徴とする。続発性アミロイド沈着物
は、ＳＡＰの局在型であるアミロイドＰ成分（ＡＰ）と一緒に、前駆体ＳＡＡか
ら、おそらくはタンパク質分解によって誘導されるアミロイドＡ（ＡＡ）から主
に成る。続発性アミロイドーシスの病原は、充分に理解されていないが、しかし
ながら、ＡＡはβプリーツシートとして沈着し、そしてエラスターゼインヒビタ
ーとして作用しうることが分かっているＡＰは、タンパク質分解酵素による分解
からそれら沈着物を保護しうる。或いは、ＳＡＰは、フィブロネクチンに結合す
ることによって、原線維沈着における核形成剤として作用しうる。いかに正確な
機序でも、長期の実験的炎症に苦しむマウスで維持されているようなＳＡＡおよ
びＳＡＰの高い循環および局所レベルは、アミロイド形成の原因となると考えら
れることは明らかである。ヒトの場合の主要ＡＰＲではないが、上述のように、
ＳＡＰは、サイトカインのいろいろな組合せによって局所的または全身的に誘導
されうる。最近の研究により、続発性アミロイドーシスの患者には、循環と沈着
物との間にＳＡＰの動的交換があり、若干の患者では、沈着物の後退および消失
さえも逸話的に報告されていることが示されている。したがって、アミロイド沈
着の進行を止めるまたは遅くするためのみならず、これら主要ＡＰＲの濃度を‘
アミロイド形成閾値’未満に減少させ且つ存在する生理学的矯正およびクリアラ
ンスの機序の作用を優先させるために、慢性炎症の際にＳＡＡおよび／またはＳ
ＡＰを特異的にダウンレギュレーションさせる戦略を考案することは重要である
。
【０１５５】 ＨＤＬ３とＳＡＡの結合は、長期にわたる高ＳＡＡ濃度が臨床的疾患を促すこ
とがありうる別の部分を示唆している。高ＨＤＬレベルは、アテローム性動脈硬
化症への感受性と逆に相関している。ＨＤＬは、逆コレステロール輸送過程の中
心であり、炎症の際に血漿ＨＤＬコレステロールが有意に減少する。炎症の際の
ＨＤＬとＡ−ＳＡＡの結合は、粒子を変化させ、それを、最優先の短期要求が存
在する保護的宿主防御の役割に備えると考えられる。ＨＤＬ上の高ＳＡＡレベル
は、アポリポタンパク質ＡＩの消費で達せられ、その結合濃度は大きく減少する
。ＨＤＬは、コレステロールエステル化に関与する臨界的酵素の一つであるレシ
チン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の主要基質である
。アポリポタンパク質ＡＩはＬＣＡＴ反応の活性化因子として必要であるので、
Ａ−ＳＡＡは、炎症の際のＨＤＬ代謝を根本的に変化させうるＨＤＬ粒子からア
ポＡＩを（直接的にまたは間接的に）置換することによってこの反応を妨げるこ
とができる。したがって、ＳＡＡは、逆コレステロール輸送のためのＨＤＬの機
能的容量を減少させるかもしれない。本発明者は、更に、正常ＨＤＬ上のＣ−Ｓ
ＡＡが、逆コレステロール輸送においてその正常な生理学的役割に寄与している
と推測したい。慢性の炎症性疾患におけるＨＤＬ上のＡ−ＳＡＡの長期持続性は
、かなりの期間にわたってＨＤＬの機能を危うくすることがありうる。付随した
全ＨＤＬの持続的減少と共に、これは、アテローム性動脈硬化症の発症の主要危
険因子となると考えられるし、活性な全身性慢性関節リウマチの患者で認められ
る心臓血管病による増加した死亡率について分子的に説明しうると考えられる。
【０１５６】 最近、ウサギＳＡＡ３分子は、ホルボールエステルかまたはＩＬ−１を用いて
誘導されうる滑膜線維芽細胞の生産物であることが分かった。そのウサギＳＡＡ
３は、自己分泌コラゲナーゼ誘導物質として機能すると考えられる。コラゲナー
ゼは、慢性関節リウマチおよび変形性関節症の患者の結合組織においてコラーゲ
ンＩ、ＩＩおよびＩＩＩの酵素分解に関与する中心的成分であるので、若干のＳ
ＡＡは、これら疾患の病原において臨界的役割を果たしているかもしれない。他
のＳＡＡスーパーファミリーメンバーが、局所または全身性シグナル分子でもあ
るとしても、それらの誘導の速さおよび大きさは、それらが急性期応答を駆動さ
せる場合におよび慢性炎症の潜在的に有害な過程の続行を媒介する場合に重要で
あると考えられることを示唆する。
【０１５７】 要約すると、ＳＡＡスーパーファミリーのメンバー全部についての構造、発現
および分子遺伝学の徹底的な検討は、したがって、臨床的にも生物学的にもかな
り重要であると考えられる。
【０１５８】 急性期応答は、ホメオスタシスを維持する正常な代謝過程からの根本的逸脱で
ある。物理的刺激に対して迅速且つ効果的に応答する生物の能力は、短期生存戦
略として進化してきた。このような刺激の直後に起こる多数の生理学的変化は、
主にサイトカインの複雑なネットワークによって開始され、維持され、協調され
る。これらサイトカインは、それら自体の合成を調節するようにおよび主な生体
系、すなわち、免疫、造血、ＣＮＳおよび肝臓のいくつかの代謝および生合成プ
ロフィールを変化させるように協力して作用する。急性期の複合作用は、刺激の
前炎症作用を中和すること；刺激性物質および刺激によって生じる組織破片を物
理的に致死させるおよび／または除去すること；組織修復を促進すること；およ
びホメオスタシスへの迅速な復帰を容易にすることである。研修者らは、今よう
やく、急性期応答の複雑さおよび一定範囲の刺激性物質によって引き起こされる
反応の順応性を理解し、それが臨床的にも科学的にも大いに関心を呼ぶことを了
解し始めている。感染症および外傷の治療を最適にできるように、急性期応答を
より複雑にしているパラメーターを定義するためのかなりの努力が続けられるで
あろう。更に、本発明者は、慢性の炎症状態において破滅的な医学的および社会
的結末を伴う、若干の急性期過程が作用し続ける機序についてもっと発見する必
要がある。
【０１５９】 ４．６．３ インターロイキン−１ インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、活性マクロファージおよび多数の他の
細胞によって生産される二つの関連したタンパク質ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β
に関する用語である。どちらの型のＩＬ−１も別個の遺伝子産物であるが、それ
らは、同様の細胞表面受容体によって認識され、機能が似ている。歴史的には、
ＩＬ−１は、内因性発熱物質として発見されたが、後に、レクチンで刺激された
胸腺細胞の成長を促進する補助刺激物質として識別された。ＩＬ−１は、現在、
感染および他の形の外傷に対する宿主応答の中心的メディエーターであると考え
られている。ＩＬ−１に起因する多数の調節的役割には、細胞性および体液性免
疫応答、炎症、発熱、急性期応答および造血の制御が含まれる。その生物学的作
用は、特定の細胞系統に制限されないが、それよりも、ＩＬ−１は、免疫系およ
び他の細胞系両方の範囲内の種々の細胞に作用する多機能性サイトカインである
。
【０１６０】 ＩＬ−１は、２種類の他のペプチドホルモン、すなわち、ＩＬ−６およびＴＮ
Ｆαと一緒に、感染、特にグラム陰性細菌による感染の際に発現されるサイトカ
インの群を形成している。ＩＬ−１の生物学的性質は、ＴＮＦαの性質との顕著
な類似点、特に、発熱、炎症および血行力学的ショックの誘導を共有している。
ＩＬ−１かまたはＴＮＦαへの応答はほとんど全て、それら二つが一緒に投与さ
れた場合に増加しうる。ＩＬ−６は、ＩＬ−１およびＴＮＦαのように、急性期
タンパク質の合成を増加させ、発熱を引き起こす。したがって、この概説はＩＬ
−１に焦点を合わせているが、読者は、ＩＬ−１は、その発現および生物学的性
質がＩＬ−６およびＴＮＦαによって影響されるサイトカインネットワークの一
部分であるということに留意すべきである。
【０１６１】 多くの関心は、疾患のメディエーターとしてのＩＬ−１に集中している。ＩＬ
−１の高循環レベルは、敗血症ショックを含めた種々の臨床状態と相関している
。更に、慢性炎症のメディエーターとしてのＩＬ−１の役割は、動物およびヒト
の研究から推論されうるが、特に、急性リウマチ性関節炎で強調される。したが
って、ＩＬ−１は、宿主防御の、更には疾患のメディエーターとして考えること
ができる。
【０１６２】 ＩＬ−１の強力な且つ深遠な生物学的作用のために、その活性が、特に、転写
、翻訳および分泌のレベルで厳密に調節されるのは驚くことではない。更に別の
調節機序は、他のサイトカインの不随作用、標的細胞上のＩＬ−１受容体の発現
の違い、および天然の阻害タンパク質、例えば、最近識別されたＩＬ−１受容体
アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＮ）などの生産によって与えられる（Ｓｅｃｋｉｎ
ｇｅｒら（１９８７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３９：１５４６−９）。更に、ｉ
ｎ ｖｉｖｏでＩＬ−１活性を調節する正確な機序を理解することは、異なった
微環境および解剖学的分画化などの追加のパラメーターの考察に必要である。
【０１６３】 相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローニング、タンパク質精製、および配列決定研
究では、ＩＬ−１α（ｐＩ５．０）およびＩＬ−１β（ｐＩ７．０）と称される
二つの型のＩＬ−１が単離されたが、それらは、ヒトおよびマウスを含めたいく
つかの種に存在している（Ｌｏｍｅｄｉｃｏら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１
２：４５８−６２を参照されたい）。ヒトＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの遺伝子
は配列決定され、染色体２の長アームに局在した。ヒトＩＬ−１αおよびＩＬ−
１β遺伝子の寸法は、それぞれ１０．５ｋｂおよび７．８ｋｂである。それぞれ
のＩＬ−１遺伝子は７個のエクソンを含有するが、それらの核酸配列は僅か４５
パーセント相同性しか共有しない。
【０１６４】 ＩＬ−１α ｍＲＮＡは約２．３ｋｂ長さであるが、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの
報告された寸法は１．４−１．８ｋｂである。両方のＩＬ−１ ｍＲＮＡを約３
１ｋＤａのポリペプチド（ＩＬ−１αに２７１アミノ酸およびＩＬ−１βに２６
９アミノ酸）中に翻訳する。しかしながら、マクロファージからの培養物上澄み
中および体液中の２種類のＩＬ−１タンパク質の優先的に存在する分子量は、僅
か約１７．５ｋＤａである。そのデータは、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βが、前
駆体タンパク質として合成され、それらが引き続き修飾されて細胞外低分子量Ｉ
Ｌ−１ポリペプチドを生じることを示している。Ｎ末端タンパク質配列データの
それぞれのｃＤＮＡ配列との比較により、ＩＬ−１の両方の型について、それが
、活性ＩＬ−１として培養物上澄み中に存在している分子のカルボキシル末端部
分であることが更に示された。受容体結合および完全生物活性は、ＩＬ−１α中
の残基１２８−２６７およびＩＬ−１β中の残基１２０−２６６にわたる最小ア
ミノ酸配列を必要とする。
【０１６５】 ヒトＩＬ−１βを結晶化させて、その構造を核磁気共鳴分光法によって分析し
た。これら研究によれば、ＩＬ−１βは四面体のようであり、三つの擬対称性ト
ポロジー単位で配置された１２β鎖から成る。
【０１６６】 アミノ酸レベルにおいて、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β前駆体間の、更には細
胞外型のＩＬ−１間の配列同一性は、僅か２５−３０パーセントの程度である。
それでもなお、それらの生物学的活性は類似し、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは
両方とも、いろいろな標的細胞上の共通の受容体に競合的に結合する。更に、Ｉ
Ｌ−１αもＩＬ−１βも、分泌に予定されたタンパク質について予想されるよう
な分泌シグナルペプチドを含有していないという点で、二つの型のＩＬ−１は、
構造的に特に興味深い。
【０１６７】 ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、ｄｅ ｎｏｖｏ ＲＮＡおよびタンパク質合
成によって生じる。単球／マクロファージ系統の細胞は、なお重要なＩＬ−１源
であるが、ＩＬ−１は、現在、大多数のリンパ様および非リンパ様細胞によって
生産されることが知られている。皮膚ケラチノサイトを除いては、両方の型のＩ
Ｌ−１の生産は構成要素ではないが、他のサイトカイン、補体成分、免疫複合体
、ホルボールエステル、細菌およびいくつかの微生物生産物を含めたいろいろな
刺激によって単に一時的に誘導される（概説については、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ（
１９９１）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，１６３：１１７７−８４を参照されたい
）。これらの内で最もよく研究されたのはリポ多糖（ＬＰＳ）であり、これは、
１０ｐｇ／ｍｌ程度の低い濃度でＩＬ−１生産を刺激する。
【０１６８】 二つの型のＩＬ−１は、別々の転写制御下にあると考えられる。ヒト単球の場
合、どちらのＩＬ−１遺伝子も、ＬＰＳを用いた刺激後１５分以内に転写される
。しかしながら、ホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）を用いた細胞の
刺激は、ＩＬ−１βを誘導するが、ＩＬ−１α転写を誘導しない。更に、ＩＬ−
１αおよびＩＬ−１βの示差的発現は、様々な細胞種類で認められてきた。
【０１６９】 ＩＬ−１遺伝子の転写活性化機序は充分に定義されていない。しかしながら、
プロテインキナーゼ（ＰＫＣ）の活性化がシグナル伝達に関与しているという証
拠があり、ＰＫＣ活性化ホルボールエステル（例えば、ＰＭＡ）はヒト単球にお
いてＩＬ−１β発現を引き起こし、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β両方のＬＰＳに
誘導される発現は、ＰＫＣインヒビターによってダウンレギュレーションするこ
とができる。
【０１７０】 ＩＬ−１の生産は、ｍＲＮＡ安定性および翻訳のレベルでも調節される。ＩＬ
−１α遺伝子は培養された（加齢した）単球中で転写されるが、このような細胞
中に検出可能なレベルのＩＬ−１α ｍＲＮＡが存在することはなく、ＩＬ−１
α ｍＲＮＡは急速に分解されるということが示される。更に、単球のガラスま
たはプラスチックへの付着は、ＩＬ−１タンパク質への翻訳を伴わないＩＬ−１
遺伝子発現を引き起こす。しかしながら、ＩＬ−１タンパク質への翻訳は、ＬＰ
Ｓによってまたは補体成分Ｃ５ａによって与えられる二次シグナルによって引き
起こすことができる。したがって、ＩＬ−１の転写および翻訳は、別個に調節さ
れると考えられる。
【０１７１】 ＩＬ−１生産を引き起こすサイトカインには、ＩＬ−１（αおよびβ）自体、
ＴＮＦα、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびマ
クロファージ−ＣＳＦが含まれる。ＩＬ−１生産の抑制は、ＩＬ−４、ＩＬ−６
、ＩＬ−１０およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）の存在下で認
められてきた。ＩＦＮγは、二重の役割を有し、ＬＰＳによって引き起こされる
ＩＬ−１生産を増加させるが、ＩＬ−１によって引き起こされるＩＬ−１生産を
抑制する。
【０１７２】 ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β ｍＲＮＡは、分泌中かまたは分泌後にプロテア
ーゼによって切断される３１ｋＤａの前駆体タンパク質（プロＩＬ−１αおよび
プロＩＬ−１β）に翻訳される。ＩＬ−１αは、ミクロソーム膜を越えて輸送さ
れることはできない。免疫電子顕微鏡法、更には、細胞下分画法研究により、ど
ちらの型のＩＬ−１も、小胞体中でもゴルジ装置中でも検出できないことが確認
された。これは、明らかに、Ｎ末端シグナルペプチドの見かけ上の欠如に関係し
ている。したがって、全ての指標は、サイトゾルタンパク質であるようなＩＬ−
１αおよびＩＬ−１βに好都合である。
【０１７３】 ＩＬ−１タンパク質の他の細胞オルガネラとの関連は、リソソームおよびミト
コンドリアについて報告されている。多数の研究により、ＩＬ−１βを除くＩＬ
−１αが、活性マクロファージ上に膜タンパク質として最初に存在することが示
唆され、膜ＩＬ−１は、パラホルムアルデヒドで固定されたネズミマクロファー
ジについてＩＬ−１活性を測定することによって検出された。後に、測定される
生物活性の大部分は、おそらくは、固定された細胞からのＩＬ−１αの漏出のた
めであったということが分かっており、パラホルムアルデヒドを用いたマクロフ
ァージの固定は、膜型ＩＬ−１を存在させるのに不適当であることが示される。
しかしながら、ＩＬ−１αは、蛍光標識および細胞表面ヨウ素化を用いて単球お
よびマクロファージの膜上で検出された。ＩＬ−１αを膜に固定させることがで
きる機序は、まだ確認されていない。ＩＬ−１α前駆体は、セリン残基９０でリ
ン酸化されるが、リン酸化されたプロＩＬ−１αは、カルシウムの存在下で単球
の膜小胞に結合する。したがって、リン酸化は、プロＩＬ−１αの細胞膜との相
互作用を容易にする機序として役立ちうると考えられる。或いは、プロＩＬ−１
αの膜への固定は、Ｄ−マンノースがプロＩＬ−１αを膜から解離させることか
ら、レクチン様結合によると考えられている。
【０１７４】 ＩＬ−１を細胞から輸送する方法およびそれを切断してその生物活性ペプチド
にする方法は明らかではない。ＩＬ−１αは、自然のままのマクロファージから
トリプシン様酵素によって放出させることができるが、カルシウムで活性化され
た中性プロテアーゼがプロＩＬ−１αをプロセッシングすると記載されているこ
とから、膜ＩＬ−１はＩＬ−１αの分泌の前提条件であるということが考えられ
ている。ＩＬ−１βのマクロファージからの分泌は、ＩＬ−１αの分泌よりはる
かに先に且つ速く起こり、二つの型のＩＬ−１の分泌は、別々の１種類または複
数の機序によって制御されていることが示唆される。プロＩＬ−１βには生物学
的活性がなく；それは、プロセッシングされないまま分泌され、エラスターゼお
よびプラスミンを含めた種々の酵素によってもっと後にようやく切断される。単
球特異的プロテアーゼは、プロＩＬ−１βを１１７位アラニンで特異的に切断す
ると記載されている。分泌されるプロＩＬ−１βの不完全なプロセッシングは、
自発的なジスルフィドに媒介されたタンパク質折りたたみのためであるかもしれ
ない。
【０１７５】 ｃＤＮＡは、プロ型のＩＬ−１βを特異的に加水分解して成熟型にする酵素を
コードするヒト単球細胞系からクローン化されている。その酵素は、４０４アミ
ノ酸を有し、プロテアーゼの既知のファミリーのいずれにも属さない。その変換
酵素の遺伝子は、染色体１１の１１ｑ２３バンドに局在していた。このバンドは
、ヒト白血病およびリンパ腫の再配列にしばしば関与していると確認されていて
、この酵素は、細胞成長を調節する場合の機能的役割を有するかもしれないこと
が示唆されている。
【０１７６】 ＩＬ−１の様々な生物学的活性は、多数の細胞の表面上の特異的受容体によっ
て媒介される（Ｂｏｍｓｚｔｙｋら（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：８０３４−８）。ＩＬ−１の結合は特異的で且つ飽和
可能であり、５ｘ１０-10−５ｘ１０-11Ｍ程度のＫｄの高親和性で起こる。これ
までに、二つの異なった単鎖受容体が識別されている。８０ｋＤａのものはＩＬ
−１受容体Ｉ型（ＩＬ−１Ｒ Ｉ型）と称され、Ｔ細胞、線維芽細胞および上皮
細胞上で発現され（Ｓｉｍｓら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５８５−
９）；６８ｋＤａのもう一つはＩＬ−１Ｒ ＩＩ型と称され、Ｂ細胞、好中球お
よびマクロファージ上で発現される。両方の型のＩＬ−１Ｒは、クローン化され
且つ配列決定されており、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する
（Ｄｏｗｅｒら（１９９０）Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ １：１０３−７）。
異なった細胞で発現される他に、その二つのＩＬ−１Ｒは、それらの結合親和性
および表面発現の調節に関して異なる。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、ＩＬ−
１Ｒ Ｉ型によって同等に認識されるが、ＩＬ−１αはＩ型受容体により多く結
合し、ＩＬ−１βはＩＩ型受容体により多く結合する。実際に、ＩＬ−１βはｉ
ｎ ｖｉｖｏでＢ細胞を誘発するが、ＩＬ−１αは誘発しないという証拠がある
。この場合、ＩＬ−１αは、ＩＬ−１βの免疫刺激性の競合的阻害剤として作用
しうることが示唆されている。ＩＬ−１のその受容体への結合から得られるシグ
ナルが細胞内で伝達される分子機序は、完全には理解されていない。
【０１７７】 ＩＬ−１の生物学的性質の多くは、それが感染に対する宿主防御において非特
異的免疫および特異的免疫両方の基本的な役割を有することを立証している。動
物中に投与された場合、ＩＬ−１は、感染への急性期応答によく似た一連の生理
学的変化を引き起こす（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏら（１９８８）Ｒｅｖ Ｉｎｆｅｃ
ｔ Ｄｉｓ，１０：１６８−６９）。これら変化には、発熱、肝中の急性期反応
性タンパク質の増加した合成および血漿鉄の減少を含めたこれら変化は、微生物
のオプソニン作用を増加させることによっておよび微生物成長を阻止することに
よって宿主に有益であると考えられ、ＩＬ−１は、ＩＬ−８、ＩＬ−９、および
ｉｎ ｖｉｖｏで好中球遊走および脱顆粒を順次刺激するマクロファージ炎症性
タンパク質のような、好中球および単球走化性サイトカインの遺伝子発現を引き
起こす。更に、ＩＬ−１は、血管内皮への好中球およびリンパ球接着を促す接着
分子の発現を引き起こす。これら内皮細胞への作用は、それらが感染の拡大を制
限し、しかも炎症部位に白血球を通過させ且つ保持させるという点で臨床的に重
要である。したがって、ＩＬ−１の合成および分泌が急性感染に対する防御の第
一線であるならば、その局所および全身作用は、非特異的防御機序を動員するの
に役立つかもしれない。
【０１７８】 ＩＬ−１の抗微生物耐性を動員する能力について評価するために、様々な感染
症モデルでＩＬ−１を用いて動物を処置してきた。低用量で注射した場合、ＩＬ
−１は、細菌および寄生生物による致死感染からマウスを防御すると考えられる
。ほとんどの場合、ＩＬ−１処置を感染の少なくとも４時間前までに行った場合
に、急性感染後の生存率の最大増加が認められた。ＩＬ−１が抗微生物耐性を増
加させる１種類または複数の機序には、更に解明されるべきことが残っている。
ＩＬ−１処置は、明らかに好中球増加症を引き起こすが、全てのモデルにおいて
多数の病原体の減少は検出不能であり、ＩＬ−１誘導防御は、増加した微生物の
機序のためだけではないことが示唆される。
【０１７９】 グラム陰性細菌感染の場合、有害な作用および致死作用さえも、ＴＮＦαによ
って媒介され、その受容体発現はＩＬ−１によってダウンレギュレーションされ
る。したがって、ＩＬ−１誘導防御は、ＴＮＦαの作用による脱感作を伴うと考
えられる。更に、ネズミ大脳マラリアの場合の寄生虫血症のＩＬ−１誘導抑制は
、少なくとも部分的に、Ｔ細胞によって放出されたＩＮＦγによって媒介されて
いるという証拠がある。
【０１８０】 細胞性免疫は、細胞内病原体に対する宿主防御において主要な役割を果たして
いる。感染マクロファージの抗微生物活性を増加させるのに必要なサイトカイン
の一つは、活性Ｔ細胞によって生産されるＩＦＮＹγである。全ての指標は、Ｔ H ２細胞と称されるＴヘルパー細胞のサブセットの活性化において重要な成分で あるようなＩＬ−１に好都合である。しかしながら、ＩＬ−１は、抗原提示の場
合には、ＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒ発現を引き起こす補助刺激物質として役立つ
にすぎない。
【０１８１】 細胞外病原体は、通常、抗体に媒介される機序によって不適当に扱われる。Ｉ
Ｌ−１は、Ｂ細胞活性化およびＩｇ生産のための補助刺激物質であり、それは 、特に、ＩＬ−４およびＩＬ−６と一緒に作用するので、抗体に媒介される抗微
生物防御に寄与する。
【０１８２】 感染の際のＩＬ−１の作用を更に洞察するためには、いくつかの問題に答える
必要がある。第一に、どの細胞がＩＬ−１（αおよびβ）を生産するのかおよび
それら細胞がいつそれを生産するのか。第二に、微環境はＩＬ−１遺伝子の発現
に影響を与えるのか。第三に、ＩＬ−１生産性細胞はＴＮＦαおよびＩＬ−６も
合成するのか。第四に、正常組織および罹患組織中のどの細胞がＩＬ−１の受容
体を有するのか。
【０１８３】 局所感染部位におけるＩＬ−１の誘導を研究するために、本発明者は、エルジ
ニア症のマウスモデルを用いている。この感染モデルの利点には、腸病原性細菌
であるＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ０８の、経口感染後
に遠位回腸のパイアー斑に選択的に侵入する能力が含まれる。感染から６日後の
マウスから調製されたパイアー斑の隣接組織切片のイムノペルオキシダーゼ染色
によるＩＬ−１αおよびＩＬ−１β生産性細胞の局在化は、ＩＬ−１αかまたは
ＩＬ−１βに対する抗血清によって認識される細胞間で明確な相違を示した。Ｉ
Ｌ−１α生産性細胞は成熟マクロファージであるが、ＩＬ−１β生産性細胞は単
球である（Ｂｅｕｓｃｈｅｒ，未公開）。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β免疫反応
性細胞の出現の速度論を比較する場合、ＩＬ−１αの誘導は少なくとも２４時間
遅れることが明らかである。更に、炎症を起こしたパイアー斑でのＩＬ−１αお
よびＩＬ−１βの生産は、内在細胞から生じるのではなく、むしろ、循環から組
織中に遊走した単球による。本発明者は、これら結果から、ＩＬ−１αおよびＩ
Ｌ−１βの示差的生産が、活性単球の活性組織マクロファージへの分化によって
制御されていると結論する。
【０１８４】 高循環レベルのＩＬ−１およびＴＮＦαは、種々の微生物による敗血症の患者
および動物において報告されており、双方のサイトカインの相対レベルは、致死
的菌血症の際の低血圧症の度合いと相関し、これらの状況下において、ＩＬ−１
βおよびＩＬ−６はＴＮＦαの制御下にあることが示される。これらデータは、
敗血症ショック症候群の発症に関するＩＬ−１およびＴＮＦαの重要性を強調し
ている。したがって、ＩＬ−１およびＴＮＦα活性の協調モジュレーションを可
能にする考えられる物質は、治療薬として潜在的に有益であると考えられる。
【０１８５】 ＩＬ−１活性を阻害するための現在理解されている戦略がいくつかある。他で
概説されているように、コルチコステロイドかまたは、アラキドン酸代謝のリポ
キシゲナーゼ経路を阻止する物質によるＩＬ−１合成の減少すなわち予防は、抗
炎症療法への重要なアプローチを与えることができる。更に、ＴＧＦβおよびＩ
Ｌ−１０などのサイトカインも、ＩＬ−１合成を減少させるのに有用でありうる
。
【０１８６】 既に循環中に放出されたＩＬ−１の阻害は、例えば敗血症の際のように、別の
戦略を必要とする。ＩＬ−１Ｒ Ｉ型への抗体を用いたＩＬ−１Ｒ遮断は、宿主
炎症応答を減衰させ且つＬＰＳおよびＩＬ−１に誘導された急性炎症からマウス
を防御することが示されている。更に、ＩＬ−１Ｒ Ｉ型の細胞外ドメイン（可
溶性ＩＬ−１Ｒタンパク質）の動物への投与は、炎症応答を減少させると考えら
れる。ＩＬ−１に特異的に結合する抗体は、これまで試験されていないが、ＴＮ
Ｆαへの抗体は、内毒素血症および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
）敗血症からマウスを防御することが分かった。
【０１８７】 ＩＬ−１活性の天然に存在する阻害剤の存在は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで確定されている。これら阻害剤は二つの群に分けることができ、そ
の一つは、ＩＬ−１活性を阻害する物質、例えば、α2マクログロブリンおよび リポタンパク質から成るが、それらは、ＩＬ−１とは無関係の他のタンパク質と
も相互作用する。第二群は、ＩＬ−１活性を特異的に阻害するポリペプチドから
成る。ＩＬ−１阻害剤のこの群のメンバーは、最近クローン化されて、ＩＬ−１
Ｒアンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＮ）と称されている。そのｃＤＮＡ配列は、１７
−３ｋＤａのポリペプチドをコードしている。天然に存在するＩＬ−１ＲＮポリ
ペプチド（２３ｋＤａ）と同様、組換え体ＩＬ−１ＲＮはＩＬ−１Ｒ Ｉ型にだ
け強く結合し、ＩＬ−１の結合をそれ自体のシグナルを誘導することなく直接的
に阻止することによってシグナル伝達を妨げると考えられる。ＩＬ−１α、ＩＬ
−１βおよびＩＬ−１ｒａの遺伝子の推定のタンパク質配列およびイントロン−
エクソン体制の比較は、それら３種類のＩＬ−１Ｒリガンドが共通の進化論上の
祖先を有することを示している。
【０１８８】 動物モデルの場合、ＩＬ−１ｒａの投与は、内毒素ショックによる致死を防止
し、大腸菌に誘導される低血圧症を減少させる。更に、ＩＬ−１ｒａは、滑膜細
胞からのＩＬ−１に誘導されるＰＧＥ２合成および軟骨細胞からのコラゲナーゼ
合成を阻止する。
【０１８９】 ＩＬ−１は、ＩＬ−６およびＴＮＦαと近縁の多機能性サイトカインである。
ＩＬ−１は、炎症反応を媒介し、Ｂ細胞およびＴ細胞を活性化し、造血を刺激す
る。更に、ＩＬ−１は、ＩＬ−６およびＴＮＦαの主要な誘導物質であり、それ
ら３種類の分子の相乗作用を増強する。
【０１９０】 ＩＬ−１の分子クローニングは、二つの異なったＩＬ−１タンパク質、すなわ
ち、類似の活性スペクトルを有するＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの特性決定をも
たらしている。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、いくつかの細胞種類で別個に発
現されると考えられるが、Ｔ細胞およびＢ細胞上でそれぞれ発現されるＩＬ−１
受容体への結合親和性も異なる。しかしながら、今なお、それら二つの型のＩＬ
−１の存在の意義を理解することはなお難しい。
【０１９１】 ４．６．４ 治療的および予防的化合物 ＩＬ−１に媒介される炎症過程を予防するのに有用であると上で確認された化
合物は、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）、タンパク質、
ペプチド、ペプチド模擬体、小分子またはそれらの誘導体でありうる。好ましい
化合物は、ＩＬ−１遺伝子またはタンパク質に結合することができ、その転写、
翻訳、プロセッシングまたは活性を阻害することができる。例には、アンチセン
ス、リボザイムまたは三重らせん核酸、小分子リガンド、抗体または抗体様結合
フラグメントが含まれる。代わりの化合物は、ＩＬ−１ Ｉ型受容体に結合し且
つ細胞表面上のＩＬ−１αおよびβタンパク質の結合を妨げるのに充分なヒトま
たはマウスＩＬ−１の一部分のような、ＩＬ−１に媒介される炎症に関与するタ
ンパク質の競合的阻害剤である。
【０１９２】 このような化合物の毒性および治療的効力は、細胞培養物または実験動物にお
いて標準の薬学的手順によって決定することができ、例えば、Ｌｄ５０（集団の
５０％への致死量）および（集団の５０％での治療的有効量）を決定する。毒性
と治療効果との間の用量比が治療指数であり、それはＬｄ５０／Ｅｄ５０比とし
て表すことができる。大きい治療的誘導を示す化合物が好適である。毒性副作用
を示す化合物を用いてよいが、未感染の細胞に起こりうる損傷を最小限にし、そ
れによって副作用を減少させるために、罹患した組織部位へこのような化合物を
集中させるデリバリーシステムを設計するように注意すべきである。
【０１９３】 細胞培養検定および動物実験から得られるデータは、ヒトに用いるための用量
範囲を製剤化する場合に用いることができる。このような化合物の用量は、好ま
しくは、毒性を全くまたは僅かしか伴わないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内であ
る。その用量は、用いられる剤形および利用される投与経路によってこの範囲内
で変化しうる。本発明の方法で用いられるいずれの化合物についても、治療的有
効量は、細胞培養検定から最初に概算することができる。用量は、細胞培養物中
で決定されるＩＣ50（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度
）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルで製剤化されうる。この
ような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するのに用いることが
できる。血漿中レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定
することができる。
【０１９４】 本発明によって用いるための医薬組成物は、慣用法において１種類またはそれ
以上の生理的に許容しうる担体または賦形剤を用いて製剤化することができる。
したがって、それら化合物並びにそれらの生理学的に許容しうる塩および溶媒和
化合物は、例えば、注射、吸入または吹入（口かまたは鼻を介する）または経口
、口腔内、非経口または直腸投与による投与用に製剤化することができる。
【０１９５】 このような治療のために、本発明の化合物は、全身性および局所性すなわち限
局された投与を含めた様々な投与負荷に関して製剤化することができる。技法お
よび製剤は、概して、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，イース
トン，ＰＡに見出されうる。全身性投与には、筋肉内、静脈内、腹腔内および皮
下を含めた注射が好適である。注射用には、本発明の化合物を液体溶液中で、好
ましくは、ハンクス液またはリンガー液のような生理学的に適合しうる緩衝液中
で製剤化することができる。更に、それら化合物は、固体で製剤化され、使用直
前に再溶解させるかまたは懸濁させることができる。凍結乾燥された形も含まれ
る。
【０１９６】 経口投与用には、それら医薬組成物は、結合剤（例えば、プレゲル化トウモロ
コシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カル
シウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）
；崩壊剤（例えば、バレイショデンプンまたはナトリウムデンプングリコラート
）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容しう
る賦形剤と一緒に慣用的な手段によって製造される、例えば錠剤またはカプセル
剤の形をとることができる。錠剤は、当該技術分野において周知の方法によって
コーティングされていてよい。経口投与用の液状製剤は、例えば、液剤、シロッ
プ剤または懸濁剤の形をとることができ、またはそれらは、使用前に水または他
の適当なビヒクルを用いて組成するための乾燥製品として与えられてもよい。こ
のような液状製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトール液、セルロース誘導体ま
たは水素添加食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非
水性ビヒクル（例えば、ａｔｉｏｎｄ油、油状エステル、エチルアルコールまた
は精留植物油）；および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたは
プロピル、またはソルビン酸）などの薬学的に許容しうる添加剤と一緒に慣用的
な手段によって製造することができる。
【０１９７】 経口投与用製剤は、活性化合物を制御放出するように適当に製剤化することが
できる。口腔内投与用には、それら組成物は、慣用法で製剤化される錠剤または
口中錠の形をとりうる。吸入による投与用には、本発明によって用いるための化
合物は、加圧式パックまたはネブライザーからのエアゾルスプレー提示の形で、
適当な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン
、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスの使用を伴
って好都合に供給される。加圧式エアゾルの場合、その用量単位は、計量された
量を供給するバルブを与えることによって決定することができる。吸入器または
吹入器で用いるための、例えばゼラチンのカプセル剤およびカートリッジは、化
合物およびラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤の粉末配合物を含有
して製剤化することができる。
【０１９８】 それら化合物は、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投
与用に製剤化することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプル
またはバイアルビン中で追加の保存剤と一緒に与えることができる。それら組成
物は、油状または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳化剤のような形をとる
ことができるし、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような配合剤を含
有してよい。或いは、その活性成分は、使用前に適当なビヒクル、例えば、滅菌
発熱物質不含水を用いて組成するための粉末の形であってよい。
【０１９９】 それら化合物は、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの慣用的な坐剤
基剤を含有する坐剤または保持浣腸剤などの直腸用組成物中で製剤化してもよい
。
【０２００】 前記の製剤の他に、それら化合物は、デポ製剤として製剤化することもできる
。このような長期作用製剤は、植込み（例えば、皮下または筋肉内）によってま
たは筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、それら化
合物は、適当なポリマー性または疎水性物質（例えば、許容しうる油中のエマル
ジョンとして）またはイオン交換樹脂と一緒に、またはやや溶けにくい誘導体と
して、例えば、やや溶けにくい塩として製剤化することができる。他の適当なデ
リバリーシステムには、長期間にわたる薬物の局所非侵襲性デリバリーを可能に
するミクロスフェアが含まれる。この技術は、炎症または虚血を引き起こすこと
なく、例えば心臓または他の器官の任意の選択された部分に冠状動脈カテーテル
によって注入することができる毛細血管前寸法のミクロスフェアを利用する。投
与された治療薬は、これらミクロスフェアから徐々に放出され、周囲の組織細胞
（例えば、内皮細胞）によって吸収される。
【０２０１】 全身性投与は、経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮
投与用には、透過されるべき障壁に適当な浸透剤を製剤中で用いる。このような
浸透剤は、概して、当該技術分野において知られており、例えば、経粘膜投与用
には、胆汁塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。更に、透過を促進するために
界面活性剤を用いることができる。経粘膜投与は、鼻腔スプレー剤によってよい
しまたは坐剤を用いてよい。局所投与用には、本発明のオリゴマーを、当該技術
分野において一般的に知られているような軟膏剤、塗剤、ゲル剤またはクリーム
剤に製剤化することができる。洗浄液は、傷害または炎症を処置して治癒を促す
ために局所に用いることができる。
【０２０２】 治療薬が遺伝子である場合、当該技術分野においてそれぞれ公知の多数の方法
のいずれかによって、遺伝子デリバリーシステムを患者に導入することができる
。例えば、その遺伝子デリバリーシステムの医薬製剤は、全身的に、例えば、静
脈内注射によって導入することができ、標的細胞中でのタンパク質の特異的形質
導入は、遺伝子デリバリービヒクルによって与えられるトランスフェクションの
特異性、受容体遺伝子の発現を制御する転写調節配列による細胞型または組織型
発現、またはそれらの組合せから優先的に生じる。他の実施態様において、組換
え体遺伝子の初期デリバリーは、完全に局在化されている動物中への導入を用い
て更に制限される。例えば、その遺伝子デリバリービヒクルは、カテーテルによ
って（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）または定位注射によっ
て（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５７）導
入することができる。アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードしている遺
伝子などの治療的遺伝子は、例えば、Ｄｅｖら（（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｔ
ｒｅａｔ Ｒｅｖ ２０：１０５−１１５）によって記載された技法を用いるエ
レクトロポレーションによって遺伝子治療構築物中で供給することができる。
【０２０３】 遺伝子治療製剤は、本質的には、許容しうる希釈剤中の遺伝子デリバリーシス
テムから成ることができるし、またはその遺伝子デリバリービヒクルまたは化合
物が埋め込まれている徐放マトリックスを含むことができる。或いは、完全な遺
伝子デリバリーシステムを組換え体細胞、例えば、レトロウイルスベクターから
そのまま生じることができる場合、その医薬製剤は、その遺伝子デリバリーシス
テムを生じる１種類またはそれ以上の細胞を含むことができる。
【０２０４】 それら組成物は、所望ならば、活性成分を含有する一つまたはそれ以上の単位
剤形を含有しうるパックまたは調剤装置中で与えることができる。そのパックは
、例えば、ブリスターパックのように、金属またはプラスチック箔を含んでいて
よい。そのパックまたは調剤装置は、投与用の取扱説明書を添付されていてよい
。
【０２０５】 本発明を次の実施例で更に詳しく説明するが、いずれにせよ、それらを制限と
して解釈すべきではない。全ての引例（本出願中に引用される参考文献、発行特
許、公開特許出願を含めた）の内容は、本明細書中にそのまま援用される。本発
明の実施は、特に断らない限り、当該技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養
、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換え体ＤＮＡおよび免
疫学の慣用的な技法を用いるであろう。このような技法は、文献中に充分に説明
されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ監修，Ｆｒｉｔｓｃｈおよ
びＭａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＩおよびＩＩ巻（
Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ監修，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ監修，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら，米国
特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ監修，１９８４）
；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈ
ａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ監修，１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏ
ｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌ
ｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ
Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ
Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ
ｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ監修，１９８７，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４および１５５巻（Ｗｕら監修）；Ｉｍｍｕｎ
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ｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ
．Ｙ．，１９８６）を参照されたい。
【０２０６】 実施例１．ノックアウト構築物の製造およびノックアウト哺乳動物 本発明者は、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＮ）遺
伝子の不活性欠失を含有するマウス集団を作った。遺伝子の欠失は、翻訳停止コ
ドンの下流である、エクソン３中のＥｃｏＲＶ部位からエクソン４中の最初のＸ
ｂａＩ部位まで欠失させることによって行った。ノックアウト構築物は、Ｎｈｅ
Ｉを用いて線状化した場合に次のように地図で示される環状プラスミドであった
。
【０２０７】 ＮｈｅＩは、配列の９１６位に対応した（イントロン１）。最初のＩＬ−１Ｒ
Ｎ相同セグメントは、９１６位から３５３０位のＥｃｏＲＶ部位まであった。分
断は、プロタンパク質のコドン１００で転写物を切断し、そのままの成熟ＩＬ−
１受容体アンタゴニストのコーディング配列の半分だけを残した。ＩＬ−１受容
体アンタゴニストの構造が与えられると（配列の散在部分がタンパク質の構造を
支持する単一のフォールディングされたドメイン）、本発明者は、この転写物の
タンパク質産物が機能性でありうる見込みが全くないと推定した。
【０２０８】 線状化されたマーカー配列（４．４ｋｂの全長）は、順に、（１）インフレー
ム翻訳停止コドンを含有するリンカー配列；（２）アミノグリコシドホスホトラ
ンスフェラーゼを駆動するβアクチンプロモーター（ａｐｈ）ａ／ｋ／ａ、ネオ
マイシン、カナマイシンまたはＧ４１８耐性遺伝子から成る逆方向マーカー遺伝
子；（３）βラクタマーゼ遺伝子（大腸菌中のプラスミド選択のためのアンピシ
リン耐性）を含むプラスミドのボディー；続いて（４）リンカー配列を含有した
。そのマーカー配列の後には、４７９１位のＸｂａＩ部位で開始するＩＬ−１Ｒ
Ｎ遺伝子の残りが続いた。次の相同部分は、エクソン４中の４７９１位から、そ
の遺伝子の配列決定されたＤＮＡの末端を越えてＮｈｅＩ部位まであった。Ｎｈ
ｅＩ部位は、Ｚａｈｅｄｉら，上記の番号付けを用いてほぼ１１８００まで地図
で示された。したがって、全相同配列は、２．５ｋｂ＋７．０ｋｂ＝９．５ｋｂ
であった。環状プラスミドの場合、二つのＮｈｅＩ部位が結合したので、その構
築物の線状化は、プラスミドのどの部分も分離除去することを必要とすることな
く、トランスフェクション可能なノックアウト構築物を生じた。
【０２０９】 線状化したノックアウト構築物を、エレクトロポレーションによってＥＳ細胞
（１２９／Ｏｌａｃ）中にトランスフェクションし、トランスフェクションされ
た細胞を抗生物質Ｇ４１８中のインキュベーションによって選択した。陽性細胞
をＭＦ１受容胚中に注射した。キメラを識別し、異系交配アルビノ系（ＭＦ１）
と交雑させた。トランスジェニックヘテロ接合体を識別し、互いに交雑させてホ
モ接合マウスを生じた。その後、全ての動物を同系交配させた。
【０２１０】 実施例２．ＩＬ−１ＲＮノックアウト哺乳動物 本発明者は、炎症状態の兆候を期待してＩＬ−１ＲＮノックアウトホモ接合体
の集団を研究した。一つの顕著な異常は、下記のような広範囲の動脈炎病変のも
のであった。しかしながら、研究は他の炎症病変を継続して確認している。
【０２１１】 標準動物収容条件において、少なくとも約１年以来、本発明者は、６０匹のホ
モ接合動物および５６匹のヘテロ接合動物の集団を交配させた。４０匹のホモ接
合体および５４匹のヘテロ接合体の群を、誕生から３００日まで追跡してきた。
その期間中、２匹のヘテロ接合体（５％）と４２匹のホモ接合体（７８％）が致
死したまたは病気のために実験を終了した。ホモ接合体の平均致死齢は１５６日
であった。４０匹のホモ接合マウスについて剖検を行ったが、３６例の明白な動
脈炎が見られ、１５匹は、明らかに破裂性大動脈瘤からの出血によって致死して
いた。合計で、８５匹のホモ接合体および５匹のヘテロ接合体が自然に致死した
または苦しませないために実験を終了した。剖検されたホモ接合体全てを、将来
を見越して屠殺するか、病気のために終了させるかまたは自然に致死するかどう
か判断すると、４８匹の内４３匹が、動脈炎病変に苦しんでいることが判った。
【０２１２】 認められた動脈炎は、ヒト巨細胞動脈炎に似た次の特徴を有した。 それは、大中血管に影響を及ぼし、広く分布している。
【０２１３】 それは、弾性膜の崩壊および消失を示すが、血管内膜は影響を受けていない。 重症の炎症浸潤が血管壁全体にわたって見られる。
【０２１４】 病変は、冠状動脈を含めた主要動脈の枝、分岐および曲に集中していることが
判る。
【０２１５】 本発明者は、これまでに調べた１７匹の将来を見越して屠殺されるヘテロ接合
動物の内８匹で動脈炎病変を検出したが、ヘテロ接合動物で、明らかに動脈炎の
結果として致死したものはまだなかった。それら病変は重症ではなく、修復およ
び瘢痕の形成があり、動脈瘤の形跡はない。対照的に、同様の齢の８匹の野生型
同腹子では、病変が見られなかった。
【０２１６】 これら知見は、動脈のホメオスタシスにおけるＩＬ−１系の重要な役割を示し
ている。特に、ＩＬ−１活性のＩＬ−１受容体アンタゴニスト阻害剤を生産する
能力を欠くマウスにおける対立するものがないＩＬ−１活性は、ホモ接合ＩＬ−
１ＲＮ欠失突然変異マウスで過度の致死速度を引き起こす病原性動脈炎症をもた
らす。これら動物は、動脈性疾患を予防する、または動脈性疾患の進行を止める
、または動脈性疾患の病理学的変化を逆行させることを目的とした新規および既
存の物質並びに他の治療的アプローチの発見および試験に有効なモデルであろう
。
【０２１７】 同様に、これら動物は、ＩＬ−１遺伝子産物およびＩＬ−１カスケードに直接
的に集中する物質を研究する場合におよび強力なＩＬ−１成分を用いて他の炎症
状態を研究する場合に有用であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 マウスＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＮ）遺伝子（ジーンバンク
寄託番号Ｌ３２８３８）のＤＮＡ配列を示す。
【図２】 マウスＩＬ−１タイプＩＩ受容体（ジーンバンク寄託番号Ｘ５９７６９）のエ
キソンＤＮＡ配列を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年５月１７日（２０００．５．１７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 5/00 Ａ 15/09 ＺＮＡ Ｂ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ニックリン，マーティン イギリス国エス10・４ジージー シェフィ ールド，，ブルックランズ・クレッセント 118 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 CA10 DA02 EA04 FA10 GA14 GA18 GA27 4B065 AA91X AA91Y AB01 AC20 BA02 BA03 BA16 BA25 CA43 CA44 CA46 4C084 AA17 ZA332 ZA362 ZA662 ZA672 ZA812 ZA892 ZA922 ZA972 ZB052 ZB112 ZB152 ZC352 4C085 HH20 KB88 4H045 AA10 BA10 CA40 DA01 EA20 EA50 FA74

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 トランスジェニック非ヒト生物であって、インターロイキン
    −１受容体アンタゴニスト遺伝子中にターゲティングした破壊を含み、このため
    機能性ＩＬ−１ｒａタンパク質を発現しない生物。
  2. 【請求項２】 インターロイキン−１受容体アンタゴニスト遺伝子がヒトイ
    ンターロイキン−１受容体アンタゴニスト遺伝子である、請求項１記載のトラン
    スジェニック非ヒト生物。
  3. 【請求項３】 生物が、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト遺伝子
    中のターゲティングした破壊に関してヘテロ接合性である、請求項１記載のトラ
    ンスジェニック非ヒト生物。
  4. 【請求項４】 生物が、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト遺伝子
    中のターゲティングした破壊に関してホモ接合性である、請求項１記載のトラン
    スジェニック非ヒト生物。
  5. 【請求項５】 動物が炎症状態に特徴的な表現型を示す、請求項４記載のト
    ランスジェニック非ヒト生物。
  6. 【請求項６】 炎症状態が、リウマチ様関節炎、炎症性腸障害、Ｉ型糖尿病
    、乾癬、骨粗鬆症、糖尿病における腎障害、円形脱毛症、グレーブズ病、全身性
    エリテマトーデス、硬化性苔癬、潰瘍性大腸炎、冠動脈疾患、動脈炎性障害、糖
    尿病性網膜症、出産時低体重、妊娠合併症、重症歯周疾患、乾癬およびインスリ
    ン依存性糖尿病よりなる群から選択される、請求項５記載のトランスジェニック
    非ヒト生物。
  7. 【請求項７】 表現型が動脈炎性病変の存在である、請求項５記載のトラン
    スジェニック非ヒト生物。
  8. 【請求項８】 破壊が野生型遺伝子のエキソン３中のＥｃｏＲＶ部位からエ
    キソン４中の第１ ＸｂａＩ部位まで起きる、請求項１記載のトランスジェニッ
    ク非ヒト生物。
  9. 【請求項９】 生物が哺乳動物である、請求項１記載のトランスジェニック
    非ヒト生物。
  10. 【請求項１０】 哺乳動物がマウスである、請求項９記載のトランスジェニ
    ック非ヒト生物。
  11. 【請求項１１】 トランスジェニック非ヒト生物由来の細胞または細胞系で
    あって、その細胞または細胞系がインターロイキン−１受容体アンタゴニスト遺
    伝子中にターゲティングした破壊を含み、このため生物が機能性ＩＬ−１ｒａタ
    ンパク質を発現しない細胞または細胞系。
  12. 【請求項１２】 未分化の、または脱分化した細胞である、請求項１１記載
    の細胞または細胞系。
  13. 【請求項１３】 未分化の細胞が、幹細胞、胚性幹細胞、卵母細胞および胚
    細胞よりなる群から選択される、請求項１２記載の細胞または細胞系。
  14. 【請求項１４】 破壊が野生型遺伝子のエキソン３中のＥｃｏＲＶ部位から
    エキソン４中の第１ ＸｂａＩ部位まで起きる、請求項１１記載の細胞または細
    胞系。
  15. 【請求項１５】 インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒ
    Ｎ）遺伝子中にターゲティングした破壊を含む非ヒト哺乳動物の形成方法であっ
    て、 ａ．ＩＬ−１ＲＮ遺伝子の内部部分がマーカーで置換されたＩＬ−１ＲＮ遺伝
    子の一部を含むノックアウト構築体を形成し； ｂ．このノックアウト構築体を胚性幹細胞集団内へトランスフェクションし、
    そして前記マーカーを発現するトランスフェクションされたＥＳ細胞を選択し； ｃ．このトランスフェクションされたＥＳ細胞をその哺乳動物の祖先の胚に導
    入し； ｄ．その胚を満期まで発生させて、その生殖細胞系列中に前記ノックアウト構
    築体をもつキメラ哺乳動物を形成し； ｅ．そのキメラ哺乳動物を繁殖させて、ＩＬ−１ＲＮ遺伝子中にターゲティン
    グした破壊をもつヘテロ接合性哺乳動物を形成する 工程を含む方法。
  16. 【請求項１６】 非ヒト生物が哺乳動物である、請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 非ヒト生物がマウスである、請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒ
    Ｎ）遺伝子の一部を含み、このＩＬ−１ＲＮ遺伝子の内部部分が選択マーカーで
    置換されている、ＩＬ−１受容体アンタゴニストノックアウト構築体。
  19. 【請求項１９】 選択マーカーが、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、緑色
    蛍光性タンパク質およびハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼよりなる
    群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１８記載のＩＬ
    −１受容体アンタゴニストノックアウト構築体。
  20. 【請求項２０】 内部部分がエキソン３のＥｃｏＲＶ部位からエキソン４の
    ＸｂａＩ部位までであり、かつマーカーがネオマイシン耐性遺伝子である、請求
    項１８記載のＩＬ−１受容体アンタゴニストノックアウト構築体。
  21. 【請求項２１】 物質を炎症状態に対する有効性について試験する方法であ
    って、 ａ．インターロイキン−１ヌル対立遺伝子に関してホモ接合性であるトランス
    ジェニック哺乳動物を入手し； ｂ．物質をこのトランスジェニック動物に投与し；そして ｃ．炎症状態を軽減する物質を、炎症状態に対する有効性をもつものとして選
    択する ことを含む方法。
  22. 【請求項２２】 炎症状態が、リウマチ様関節炎、炎症性腸障害、Ｉ型糖尿
    病、乾癬、骨粗鬆症、糖尿病における腎障害、円形脱毛症、グレーブズ病、全身
    性エリテマトーデス、硬化性苔癬、潰瘍性大腸炎、冠動脈疾患、動脈炎性障害、
    糖尿病性網膜症、出産時低体重、妊娠合併症、重症歯周疾患、乾癬およびインス
    リン依存性糖尿病よりなる群から選択される、請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 インターロイキン−１ヌル対立遺伝子がＩＬ−１ＲＮヌル
    対立遺伝子である、請求項２１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 炎症状態が関節炎性病変を特徴とする、請求項２１記載の
    方法。
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