KR20010015814A - 염증 질병의 형질전환된 모델 - Google Patents

염증 질병의 형질전환된 모델 Download PDF

Info

Publication number
KR20010015814A
KR20010015814A KR1020007005243A KR20007005243A KR20010015814A KR 20010015814 A KR20010015814 A KR 20010015814A KR 1020007005243 A KR1020007005243 A KR 1020007005243A KR 20007005243 A KR20007005243 A KR 20007005243A KR 20010015814 A KR20010015814 A KR 20010015814A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
cells
cell
organism
disease
Prior art date
Application number
KR1020007005243A
Other languages
English (en)
Inventor
고든 더블유. 더프
마틴 니클린
Original Assignee
인터레우킨 제네틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인터레우킨 제네틱스, 인코포레이티드 filed Critical 인터레우킨 제네틱스, 인코포레이티드
Publication of KR20010015814A publication Critical patent/KR20010015814A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0325—Animal model for autoimmune diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0368—Animal model for inflammation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 하나 이상의 인터루킨 유전자의 발현이 억제된 포유동물을 제공한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 인터루킨-1 수용체 길항제 유전자의 결실을 비활성화시켜서 내인성 유전자의 발현이 저하되거나 완전 억제된 녹아웃(knock-out) 사람 이외의 포유동물을 생성시키는 것에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 녹아웃 포유동물을 생성시키는 방법과 녹아웃 포유동물을 이용하여 인터루킨 경로의 불안정과 관련된 질병 또는 질환 치료용의 치료제 및 치료방법의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.

Description

염증 질병의 형질전환된 모델 {TRANSGENIC MODELS OF INFLAMMATORY DISEASE}
발명의 배경
질병에서의 IL-1 유전자
IL-1 유전자 클러스터는 사람 2번 염색체의 긴팔(long arm)상에 위치해 있으며(2q13), 430kb의 영역내에 적어도 IL-1α(IL1A), IL-1β(IL1B), 및 IL-1 수용체 길항제(antagonist)(IL-1RN)에 대한 유전자를 함유한다. 작용제(agonist) 분자인 IL-1α 및 IL-1β는 강력한 전-염증(pro-inflammatory) 활성을 가지며, 다수의 염증 캐스케이드(cascade)를 개시시킨다. IL-1α 및 IL-1β 단백질은 서로에 대한 상동성이 30% 미만이지만, 두 단백질 모두는 동일한 세포 표면 수용체에 결합하고, 시토킨으로서의 이들의 생물학적 활성은 유사한 것으로 여겨진다. IL-1 시토킨 활성은 2종의 천연 억제제인 IL-1 수용체 길항제와 IL-1 타입 II 수용체에 의해 길항된다. IL-1 수용체 길항제는 IL-1α 및 IL-1β과 구조적으로 상동이고 IL-1 타입 I 수용체에 결합하지만 생물학적으로 비활성이어서, 이것은 IL-1의 경합성 억제제로서 작용한다. 대조적으로, 인터루킨-1 타입 II 수용체는 타입 I 수용체에 대한 IL-1 결합을 경합적으로 억제시킴으로써 작용한다. 특정 세포 타입의 경우, IL-1 수용체 길항제 mRNA는 시그널 서열이 제거되도록 스플라이싱되어 분비되지 않지만, 세포내 IL-1 수용체 길항제의 기능은 알려져 있지 않다.
IL-1 수용체 길항제 및 IL-1 타입 II 수용체는 IL-1 기능의 천연 길항제로서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. IL-1의 부적절한 생성은 류마티스성 관절염, 염증성 배변 질환, 타입 I 당뇨병 및 건선을 포함하는 다수의 자기면역 질병 및 염증 질병의 병리학에서 중추적 역할을 하는 것으로 여겨진다. IL-1RN 2번 대립유전자는 골다공증(미국 특허 제 5,698,399호), 진성당뇨병에서의 신증(참조: Blakemore, et al., Hum. Genet., 97:369-74 (1996)), 원형 탈모증(참조: Cork, et al., J. Invest. Dermatol., 104(5 Supp.):15S-16S(1995)), 그레이브스병(참조: Blakemore, et al., J. Clin. Endocrinol., 80(1): 111-5 (1995)), 전신성 홍반성 루푸스(참조: Blakemore, et al., Arthritis Rheum., 37:1380-85 (1994)), 경화성 태선(참조: Clay, et al., Hum. Genet., 94:407-10 (1994)), 및 궤양성 대장염(참조: Mansfield, et al., Gastoenterol., 106(3):637-42 (1994))과 관련이 있다.
또한, 그 밖의 질병 및 질환이, 이들 질병 및 질환을 발병시킬 위험을 증가시키는 것과 관련된 특정 사람 다형성의 확인을 통해 IL-1 기능과 관련되어져 왔다. 예를 들어, 관상동맥 질병(PCT/US98/04725)은 IL-1B(-511) 2번 대립유전자 및 IL-1RN(VNTR) 2번 대립유전자와 관련이 있다. 당뇨병성 망막증(PCT/GB97/02790)은 IL1-RN(VNTR)과 관련이 있다. 출생시 저체중, 임신 합병증 및 중증 치근막 질병(미국 특허 제 5,686,246호)는 IL-1A(-889) 2번 대립유전자 및 IL-1B(3954) 2번 대립유전자와 관련이 있다. IL-1B(3954) 2번 대립유전자는 DR3/4 환자의 경우에 건선 및 인슐린 의존성 당뇨병과 관련이 있다 (참조: di Giovine, et al., Cytokine 7: 606 (1995); Pociot, et al., Eur J. Clin. Invest. 22: 396-402 (1992)). 또한, IL-1의 생성 속도에 있어서 개인간에 일정한 차가 존재하며, 이러한 편차중 일부는 IL-1 유전자좌의 유전자 차이에 의해 설명될 수 있다 (참조: Molvig, et al., Scand. J. Immunol., 27:705-16 (1988); Pociot, et al., Eur. J. Clin. Invest., 22:396-402 (1992)). 또한, IL-1RN(VNTR)의 2번 대립유전자는 북미 및 유럽의 코카서스인 주민(참조: Mansfield, J. et al., (1994) Gastroenterology 106:637-42), 특히 인종적으로 관련된 아시케나지 유대인 주민(PCT WO97/25445)에서의 궤양성 대장염과 관련이 있다. 따라서, IL-1 유전자는 다수의 염증 질병의 매개자인 것으로 여겨진다.
염증은 아테롬성 경화증의 병리학적 작용의 중요한 성분으로서 현재 일반적으로 간주되고 있다 (참조: Munro, Lab Invest., 58:249-261 (1988), Badimon, et al., Circulation, 87:3-16 (1993), Liuzzo, et al., N.E.J.M., 331(7):417-24 (1994), Alexander, N.E.J.M., 331(7):468-9 (1994)). IL-1β를 포함하는 몇몇 염증 생성물은 아테롬성 경화증 병변 또는 병에 걸린 관상 동맥의 상피에서 확인되어 왔다 (참조: Gelea, et al., Ath. Thromb. Vasc. Biol., 16:1000-6 (1996)). 또한, IL-1β의 혈청 농도는 관상 질병에 걸린 환자의 경우 증가한다 (참조: Hasdai, et al., Heart, 76:24-8 (1996)). 염증성 제제의 존재가 창상 또는 단핵세포 활성화에 대해 반응하는 것이라고 역사적으로 믿어졌다고 하더라도, 비정상적 염증 반응은 관상 동맥 질병을 야기시키거나 질병에 대한 감수성을 증가시킬 수 있는 것으로 현재 생각된다. 실제로, 특정 IL-1RN 및 IL-1B 대립유전자는 CAD에 걸린 환자에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다 (PCT/US98/04725).
형질전환된 동물 모델
유전자 조작된 게놈을 갖는 동물의 기본 유형은 두 가지이다. 종래의 형질전환된 포유동물은 게놈내로 변형된 유전자가 도입되거 있고, 변형된 유전자는 외인성 또는 내인성 기원을 가질 수 있다. "녹아웃" 포유동물은 유전자 조작을 통해 내인성 유전자의 발현이 억제됨을 특징으로 하는 형질전환된 포유동물의 특수 유형이다. 특정 내인성 유전자의 파괴는 유전자의 일부를, 결실시키거나 널(null) 대립유전자를 생성시키는 다른 서열로 치환시킴으로써 달성될 수 있다. 널 대립유전자를 갖는 이종교배된 동물은 유전자의 활성 복제물이 결여된 동형접합 포유동물을 출산한다.
다수의 이러한 포유동물이 발생되어 왔으며, 의학 발전에 매우 유용하게 이용되고 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,736,866호에는 종양유전자를 코드화하는 트랜스진(transgene)을 함유하는 마우스가 기재되어 있다. 미국 특허 제 5,175,383호에는 int-2/FGF 패밀리중의 유전자를 코드화하는 트랜스진을 함유하는 마우스가 기재되어 있다. 미국 특허 제 5,616,491호에는 CD28 및 CD45가 억제된 녹아웃 마우스가 기재되어 있다. 또한, 미국 특허 제 5,824,837호에는 사람 IL-1B 트랜스진을 발현시키는 형질전환된 마우스가 기재되어 있다. 이러한 형질전환된 마우스는 IL-1에 의해 매개되는 특정 염증 작용을 연구하는데 유용하다. 유사하게는, WO9723129호에는 IL-1 a에 의해 매개되는 염증 작용에 대한 치료법을 연구/개발하는데 사용될 수 있는 IL-1 a을 발현시키는 형질전환된 동물이 기재되어 있다.
IL-1 매개된 염증 질병의 형질전환된 동물 모델은 염증 질병을 치료하거나 예방할 수 있는 약제를 확인하는데 매우 유용할 것이다.
발명의 요약
한 가지 일면에 있어서, 본 발명은 염증 질환의 치료에 유용한 약물 또는 기타 치료법을 생체내 스크리닝하고 평가하는데 사용되는 형질전환된 사람 이외의 생물체 및 세포계통을 제공한다. 본 발명의 한 가지 구체예는 인터루킨-1 유전자가 표적화 파괴된 형질전환된 동물이다. 특히, 유전자는 IL-1RN 유전자이다. 동물은 파괴된 유전자에 대해 키메라성, 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다. 동형접합성 녹아웃 IL-1RN 포유동물은 류마티스성 관절염, 염증성 배변 질환, 타입 I 당뇨병, 건선, 골다공증, 진성당뇨병에서의 신증, 원형 탈모증, 그레이브스병, 전신성 홍반성 루푸스, 경화성 태선, 궤양성 대장염, 관상 동맥 질병, 동맥 질환, 당뇨병성 망막증, 출생시 저체중, 임신 합병증, 중증 치근막 질병, 건선 및 인슐린 의존성 당뇨병과 같은 염증성 질환을 발병시키려는 강력한 경향을 갖지만, 특히 동맥 병변을 특징으로 한다. 표적화 파괴는 이것이 IL-1ra 단백질의 생성을 억제시킨다는 요건을 만족시키기만 한다면 유전자중의 모든 부분에서 일어날 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 파괴는 야생형 유전자의 엑손 3의 EcoRV 부위 내지 엑손 4의 첫번째 XbaI 부위에서 일어난다. 형질전환된 동물은 임의의 종(사람을 제외한)일 수 있지만, 포유동물인 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 사람 이외의 동물은 인터루킨-1 수용체 길항제 유전자가 표적화 파괴되어 있으며, 상기 표적화 파괴는 야생형 인터루킨-1 수용체 길항제의 생성을 억제하여 표적화 파괴에 대해 동형접합성인 사람 이외의 포유동물의 표현형이 염증 질환을 특징으로 갖도록 한다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 인터루킨-1 수용체 길항제 유전자가 표적화 파괴된 세포 또는 세포계통을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에 있어서, 세포 또는 세포계통은 미분화된 세포, 예를 들어 간세포(stem cell), 배 간세포, 난모세포 또는 배세포이다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 인터루킨-1 유전자가 표적화 파괴된 사람 이외의 포유동물을 생성시키는 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, IL-1RN 녹아웃 구성물은 마커에 의해 치환된 상기 IL-1RN 유전자의 내부 일부를 갖는 IL-1RN 유전자의 일부에 의해 생성될 수 있다. 그 후, 녹아웃 구성물은 배 간 m(ES) 세포의 집단내로 트랜스펙션될 수 있다. 그 후, 트랜스펙션된 세포는 마커를 발현시키는 경우에 선택될 수 있다. 그 후, 트랜스펙션된 ES 세포는 상기 포유동물의 조상(ancestor)의 배내로 도입될 수 있다. 배는 배선내에 녹아웃 구성물을 갖는 키메라 포유동물이 생성될 때까지 발육될 수 있다. 상기 키메라 포유동물을 성장시키면 IL-1RN 유전자가 표적화 파괴된 이형접합성 포유동물을 생성시킬 것이다. 동형접합체는 이형접합체를 교배시킴으로써 발생될 수 있다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 상기 기술된 동물을 생성시키는데 사용될수 있는 IL-1RN 녹아웃 구성물을 특징으로 한다. 한 가지 구체예에 있어서, IL-1RN 구성물은 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1RN) 유전자의 일부를 포함할 수 있으며, 상기 IL-1RN 유전자의 내부 일부는 선택성 마커에 의해 치환된다. 바람직하게는, 마커는 neo 유전자이고, IL-1RN 유전자의 일부의 길이는 2.5kb 이상이거나 7.0 또는 9.5kb (치환된 일부 및 임의의 IL-1RN 플랭킹 서열을 포함함)이다. 내부 일부는 엑손의 일부 또는 전부를 커버하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는, 이것은 엑손 3의 EcoRV 부위로부터 엑손 4의 XbaI 부위까지이다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 제제를, 염증 질환을 치료하고/하거나 예방하는데 있어서의 효과에 대해 시험하는 방법을 특징으로 한다. 한 가지 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 상기 기술된 형질전환된 동물 또는 세포 계통을 사용할 수 있다. 예를 들어, 시험 제제는 형질전환된 동물에 투여될 수 있고, 염증 질환을 호전시키는 제제의 능력은 상기 염증 질환에 대해 효과를 갖는 경우에 기록될 수 있다. IL-1 성분과 관련된 임의의 염증 질환이 이들 포유동물을 사용하여 시험될 수 있지만, 특히, 동맥 병변을 특징으로 하는 질환이 실험된다. 또한, 본 발명의 방법은 IL-1 염증성 단백질 및 이들의 다운스트림 성분에 대해 효과적인 제제를 시험하는데 사용될 수 있다.
3. 도면의 간단한 설명
도 1은 마우스 IL-1 수용체 길항제(IL-1RN) 유전자의 DNA 서열을 도시한다 (GenBank Acc. No. L32838).
도 2는 마우스 I-1 타입 II 수용체의 엑손 DNA 서열을 도시한다 (GenBank Acc. No. X59769).
4. 발명의 상세한 설명
4.1 일반적 설명
일반적으로, 본 발명은 하나 이상의 IL-1 관련 유전자가 형질전환 클로닝 방법에 의해 변형된 형질전환된 동물을 제공한다. 이들 IL-1 형질전환된 동물은 IL-1 매개된 염증 작용을 수반하는 다수의 질병에 대한 동물 모델로서 유용하다. 대부분의 상기 기술된 염증 질병 및 질환이 복잡하고 다인자적인 병인학을 갖는 것으로 여겨진다고 하더라도, 이들은 모두 IL-1 매개된 염증 작용을 궁극적으로 수반하는 것으로 여겨진다. 또한, 본 발명은 이들 IL-1 매개된 염증 작용을 간섭하여 이러한 상이한 질병의 진행을 블록킹할수 있는 약제학적 화합물을 발견하기 위한 시약 및 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 마우스 2번 염색체상의 위치 10.0 cM에 함유된 마우스 IL-1RN(인터루킨-1 수용체 길항제) 유전자 (Mouse Genome Informatics, www.informatics.jax.org/)가 IL-1RN 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하도록 파괴되거나 결실되어 있는 형질전환된 "녹아웃" 마우스 계통을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 마우스 1번 염색체상의 위치 19.5 cM에 함유된 마우스 IL-1 타입 II 수용체(유인(decoy) 수용체) 유전자 (Mouse Genome Informatics, www.informatics.jax.org/)가 IL-1 타입 II 수용체의 발현을 감소시키거나 제거하도록 파괴되거나 결실되어 있는 형질전환된 "녹아웃" 마우스 계통을 특징으로 한다. IL-1RN 및 IL-1 타입 II 수용체 녹아웃 마어스 계통은 둘 모두 내인성 IL-1 길항제 분자의 손실로 인한 IL-1 시토킨 매개된 염증 작용의 증대를 특징으로 한다. 더욱 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 IL-1RN 유전자와 IL-1 타입 II 수용체 길항제 유전자 둘 모두의 발현 감소를 특징으로 하는 "이중(double)" 녹아웃 마우스 계통을 제공한다.
형질전환된 "녹아웃" 마우스 계통은 IL-1 매개된 염증 질병 및 질환을 연구하는데 사용될 수 있는 이형접합성 및 동형접합성 IL-1 길항제 유전자 녹아웃 마우스 둘 모두를 생성시키는데 유용하다. 예를 들어, IL-1 수용체 길항제 리간드가 손실되면 IL-1 매개된 염증 작용의 활동항진을 초래하며, IL-1 매개된 작용의 이러한 활동항진은 하기 질병을 포함하는 다수의 질병 및 질환의 병인학에 기여한다: 류마티스성 관절염, 염증성 배변 질환, 타입 I 당뇨병, 건선, 골다공증, 진성당뇨병에서의 신증, 원형 탈모증, 그레이브스병, 전신성 홍반성 루푸스, 경화성 태선, 궤양성 대장염, 관상 동맥 질병, 동맥 질환, 당뇨병성 망막증, 출생시 저체중, 임신 합병증, 중증 치근막 질병, 건선 및 인슐린 의존성 당뇨병, 및 동맥 병변.
이러한 염증성 질병 및 질환의 만성 및 급성 형태 둘 모두는 적당한 IL-1RN 녹아웃 동물 또는 동물 계통에서 재현될 수 있다. 예를 들어, IL-1RN 녹아웃 구성물에 대해 이형접합성인 동물은 인터루킨-1 수용체 길항제를 생성시키는 능력이 저하됨으로써, IL-1 매개된 염증성 작용의 상응하는 항진을 나타낸다. 따라서, 이형접합성 마우스 계통은 만성 염증성 질병 및 질환의 상태를 재현할 수 있다. 또한, 이들 이형접합성 동물 또는 세포계통은 내인성 IL-1 수용체 길항제의 감소된 풀(pool)의 발현 또는 활성을 항진시키는 작용을 하는 치료제를 발견하는데 매우 적합하다. 이러한 수용체 길항제 "작용제"는 예를 들어 IL-1RN 유전자의 잔여 복제물의 발현을 증가시킬 수 있다. 대조적으로, 동형접합성 IL-1RN "녹아웃" 동물 및 계통은 IL-1RN 유전자 생성물을 생성시키는 능력이 없으며, 이로써, IL-1RN 매개된 작용의 상응하게 커다란 증대를 나타낸다. 따라서, 동형접합성 동물 및 세포계통은 급성 염증 질병에서 발생하는 비정상적 면역 기능을 재현할 수 있다. 또한, 이들 동형접합성 동물 및 계통은, 예를 들어 인터루킨-1 a 및/또는 인터루킨-1 b에 결합하여 인터루킨 수용체와 이들의 상호작용을 억제시킴으로써 인터루킨-1 수용체 길항제의 예를 들어 분자 의사체(mimics)로서 기능하는 치료적 IL-1RN 작용제를 발견하는데 매우 적합하다.
또한, 본 발명은 IL-1RN "녹아웃" 및 IL-1RN "녹인(knock-in)" 형질전환된 마우스 세포계통 및 형질전환된 마우스를 생성시키는데 유용한 다양한 핵산 구성물을 제공한다. 예를 들어, IL-1RN 파괴성 구성물은, 리포터 또는 마커 유전자(예를 들어 베타-갈락토시다아제 또는 녹색 형광성 단백질)를 유전자의 염색체 복제물내로 삽입시켜서 생성된 키메라 리포터 유전자가 이것의 발현에 대해 내인성 IL-1RN 유전자 프로모터에 의존성이 되게 하도록 공학처리될 수 있다. 이러한 "녹인" 구성물이 삽입된 형질전환된 세포계통 및 동물은, 화합물을, IL-1 수용체 길항제 유전자의 전사를 증가시킴으로써 IL-1 의존성 염증 작용을 억제시키는 이들의 능력에 대해 스크리닝하는데 특히 매우 적합하다. 또 다른 예에 있어서, 이종 조절성 프로모터가, IL-1 수용체 길항제 발현이 조절성 프로모터에 의해 조절되도록 IL-1RN 유전자좌에 대해 "녹인"될 수 있다. 조절성 프로모터는 유도성 프로모터, 억제성 프로모터 또는 발생적으로 조절되는 프로모터일 수 있다. 이러한 경우의 프로모터의 선택은 임박한 특정 실험에 대해 테일러화될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어 테트라사이클린 억제제 및 상응하는 오퍼레이터 서열의 몇몇 유도체에 의해 제공되는 억제성 프로모터 시스템(참조: Gossen et al. (1995) Science 268: 1766-9)은 IL-1RN 유전자가 정상 성장 및 발육 후의 일정 시점까지 발현되는 마우스 계통의 생성을 용이하게 한다. 그 후, IL-1RN 유전자의 기능은 IL-1RN 유전자의 전사 셧-다운(shut-down)을 초래하는 적합한 리간드(예를 들어, 테트라사이클린)를 투여함으로써 갑자기 정지될 수 있다. 이러한 유도성 IL-1 수용체 길항제 결핍은 다른 정상적으로 발육중인 동물에게서 IL-1 매개된 염증 질환을 유도시킨다. 따라서, IL-1 수용체 길항제 결핍 유도된 염증 반응을 블록킹할 수 있는 화합물에 대한 약제학적 스크린이 고안될 수 있다. 그 밖의 구체예에 있어서, 조직 특이적 프로모터 엘리먼트가 IL-1RN 유전자에 대해 "녹인"될 수 있다. 생성된 동물은 조직 특이적 프로모터가 발현되지 않는 모든 체조직에서 IL-1 수용체 길항제를 생성시키지 않을 것이다. 이러한 형질전환된 동물은 특정 조직 세트를 침범하는 염증 작용을 연구하는데 특히 유용하다. 따라서, 비발현 조직에서 발생하는 IL-1 수용체 길항제 결핍 유도된 염증 반응을 블록킹할 수 있는 화합물에 대한 약제학적 스크린이 고안될 수 있다. 유사한 구체예에 있어서, cre/lox 트랜스진 치환 시스템이, Cre 재조합효소 단백질의 발현 후에 체세포 조직에서 유전자 결실되기 쉬운 수용체 길항제 녹인 구성물을 디자인하는데 사용될 수 있다. 조직 특이적 및/또는 유도성 프로모터에 의해 Cre 재조합효소가 트랜스진 발현되면 IL-1RN 유전자의 공간적으로 및/또는 시간적으로 표적화된 손실이 일어날 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 IL-1 수용체 길항제의 조직 특이적 결실 및 염증 작용의 상응하는 조직 특이적 활성화를 갖는 마우스를 생성시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 이들 형질전환된 마우스 계통은 생물체의 일생중의 특정 시점에서 특정 조직(들)을 침범하는 IL-1 매개된 염증 질병을 연구하는데 사용될 수 있다. 사람에서의 유사한 조직 특이적 염증 질병을 치료하거나 예방하는 화합물을 발견하기 위해, 약제학적 스크린이 이러한 형질전환된 마우스로 이루어 질 수 있다.
따라서, 본 발명의 IL-1 형질전환된 마우스 및 세포계통은 이러한 IL-1 매개된 질병 및 질환을 치료하거나 예방하는데 유용한 약제를 개발하는데 사용될 수 있다.
4.2 정의
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 용어 및 표현의 의미를 하기 규정한다.
본원에 사용된 용어 "작용제"는 IL-1 생체활성을 의사하거나 상향조절(예를 들어, 증강 또는 보충)하는 제제를 나타내고자 한다. IL-1 작용제는 야생형 IL-1의 하나 이상의 생체활성, 예를 들어 수용체 결합 활성을 갖는 야생형 IL-1 단백질 또는 이것의 유도체일 수 있다. 또한, IL-1 치료제는 IL-1 유전자의 발현을 상향조절하거나 IL-1 단백질의 하나 이상의 생체활성을 증가시키는 화합물일 수 있다. 또한, 작용제는 IL-1 폴리펩티드와 또 다른 분자, 예를 들어 인터루킨 수용체의 상호작용을 증가시키는 화합물일 수 있다. 작용제는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질 또는 이들의 조합물을 포함하는 임의의 종류의 분자, 바람직하게는 작은 분자일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "길항제"는 하나 이상의 IL-1 생체활성을 하향조절(예를 들어, 억제)하는 제제를 나타내고자 한다. IL-1 길항제는 IL-1 단백질과 또 다른 분자, 예를 들어 IL-1 수용체와 같은 수용체 사이의 상호작용을 억제하거나 감소시키는 화합물일 수 있다. 따라서, 바람직한 길항제는 IL-1 수용체에 대한 결합을 억제하거나 감소시켜서 IL-1 수용체의 후속 활성화를 블록킹시키는 화합물이다. 또한, 길항제는 IL-1 유전자좌의 발현을 하향조절하거나 존재하는 IL-1 단백질의 양을 저하시키는 화합물일 수 있다. 길항제는 IL-1 폴리펩티드의 우성 네거티브 형태, 예를 들어 IL-1 수용체와 같은 표적 펩티드를 간섭할 수 있지만 IL-1 수용체의 활성화를 촉진시키지 않는 IL-1 폴리펩티드의 형태일 수 있다. 또한, IL-1 길항제 는 IL-1 폴리펩티드의 우성 네거티브 형태를 코드화하는 핵산, IL-1 안티센스 핵산, 또는 IL-1 RNA와 특이적으로 상호작용할수 있는 리보자임일 수 있다. 다른 IL-1 길항제는 IL-1 폴리펩티드에 결합하고 이것의 작용을 억제시키는 분자이다. 이러한 분자로는 펩티드, 예를 들어 생물학적 활성을 갖지 않으며 IL-1 또는 IL-1 수용체에 의한 결합을 억제하는 IL-1 표적 펩티드의 형태가 있다. 따라서, 이러한 펩티드는 IL-1의 활성 부위에 결합하여, IL-1이 표적 펩티드, 예를 들어 IL-1 수용체와 상호작용하는 것을 억제한다. 다른 IL-1 길항제로는 IL-1 분자의 에피토프와 특이적으로 상호작용하여, 결합이 IL-1 좌 폴리펩티드의 생물학적 기능을 간섭하는, 항체가 있다. 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, IL-1 길항제는 작은 분자, 예를 들어 IL-1 폴리펩티드와 표적 IL-1 수용체 사이의 상호작용을 억제할 수 있는 분자이다. 대안적으로, 작은 분자는 IL-1 수용체 결합 부위 이외의 부위와 상호작용함으로써 길항제로서 작용할 수 있다.
본원에서 "대립유전자 변형체"와 같은 의미로 사용되는 용어 "대립유전자"는 유전자의 또 다른 형태 또는 이것의 일부를 나타낸다. 대립유전자는 상동 염색체상에 동일한 좌 또는 위치를 차지한다. 대상이 유전자의 두개의 동일한 대립유전자를 갖는 경우, 대상은 유전자 또는 대립유전자에 대해 동형접합성이라고 일컬어진다. 대상이 유전자의 두개의 상이한 대립유전자를 갖는 경우, 대상은 유전자 또는 대립유전자에 대해 이형접합성이라고 일컬어 진다. 특정 유전자의 대립유전자는 하나 또는 수 개의 누클레오티드가 서로 다를 수 있고, 누클레오티드의 치환, 결실, 및 삽입을 포함할 수 있다. 자주 일어나는 서열 변이로는 트랜지션 돌연변이(즉, 퓨린 대 퓨린 치환 및 피리미딘 대 피리미딘 치환, 예를 들어 A 대 G 또는 C 대 T), 트랜스버젼 돌연변이(즉, 퓨린 대 피리미딘 및 피리미딘 대 퓨린 치환, 예를 들어 A 대 T 또는 C 대 G), 및 반복 DNA 서열에서의 변화(예를 들어, 삼중누클레오티드 반복체 및 그 밖의 탠덤 반복체 서열의 신장 및 수축)이 있다. 또한, 유전자의 대립유전자는 돌연변이 함유 유전자의 형태일 수 있다. "IL-1 유전자의 다형성 영역의 대립유전자 변형체"는 다른 개체중의 유전자의 영역에서 발견된 1개 또는 수 개의 누클레오티드 서열 차이를 갖는 IL-1 유전자좌의 영역을 나타낸다.
본원에 사용된 표현 "염증 성분을 갖는 동맥 질병" 또는 "동맥 질병"은 경화증을 특징으로 하는 동맥 질병의 군을 나타낸다. 이들로는 관상 동맥 질병 및 발작(stroke)이 있지만 이들에 제한되는 것은 아니다.
본원에 같은 의미로 사용된 용어 "생물학적 활성" 또는 "생체활성" 또는 "활성" 또는 "생물학적 기능"은 IL-1 폴리펩티드(이것의 천연 형태이든지 변성된 형태이든지) 또는 이것의 임의의 서브시퀀스(subsequence)에 의해 직접 또는 간접 수행되는 이펙터 또는 항원성 기능을 의미한다. 생물학적 활성으로는 표적 펩티드, 예를 들어 IL-1 수용체에 결합하는 것이 있다. IL-1 생체활성은 IL-1 폴리펩티드에 직접 작용함으로써 조절될 수 있다. 대안적으로, IL-1 생체활성은 IL-1 폴리펩티드의 수준을 조절함으로써, 예를 들어 IL-1 유전자의 발현을 조절함으로써 조절될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "IL-1 폴리펩티드의 생체활성 단편"은 온길이 IL-1 폴리펩티드의 단편으로서, 단편이 야생형 IL-1 폴리펩티드의 활성을 의사하거나 길항하는 단편을 나타낸다. 생체활성 단편은 인터루킨 수용체와 상호작용할 수 있는 단편인 것이 바람직하다.
IL-1과 같은 폴리펩티드의 활성에 대해 적용되는 용어 "비정상적 활성"은 야생형 또는 천연 폴리펩티드의 활성과 다르거나, 건강한 대상의 폴리펩티드의 활성과 다른 활성을 나타낸다. 폴리펩티드의 활성은, 이것이 이것의 천연 대응물의 활성 보다 강력하기 때문에 비정상일 수 있다. 대안적으로, 활성은 이것이 이것의 천연 대응물의 활성 보다 약하거나 전혀 없기 때문에 비정상일 수 있다. 또한, 비정상적 활성은 활성의 변화일 수 있다. 예를 들어, 비정상적 폴리펩티드는 상이한 표적 펩티드와 상호작용할 수 있다. 세포는 IL-1 좌 폴리펩티드를 코드화하는 IL-1 유전자좌의 과발현 또는 저발현으로 인해 비정상적 IL-1 활성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 표현 "관상 동맥 질병"은 심장을 담당하는 대크기 및 중간크기의 동맥내의 아테롬의 침착과 관련하여 당업자에 의해 일반적으로 인식된 질환을 나타낸다. 따라서, 관상 동맥 질병은 관상 동맥 아테롬의 병리학을 기본으로 하는 임상학적 증후군(안지나, 심근경색, 불안정성 안지나, 및 돌연 허혈성 치사가 있지만 이들에 제한되지 않음)을 의미한다.
"세포", "숙주 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 같은 의미호 사용되는 용어들이다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손도 나타내는 것으로 이해된다. 세대를 이어가는 도중에 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 어떤 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손는 모세포와 실제로 동일할 수 없지만, 본원에 사용된 용어의 범위내에는 여전히 포함된다.
"키메라 폴리펩티드" 또는 "융합 폴리펩티드"는 대상 IL-1 좌 폴리펩티드의 하나를 코드화하는 첫 번째 아미노산 서열과, IL-1 폴리펩티드의 임의의 도메인과 실질적으로 비상동이며 외래인 도메인(예를 들어, 폴리펩티드 부분)을 규정하는 두 번째 아미노산 서열의 융합체이다. 키메라 폴리펩티드는 첫 번째 폴리펩티드를 또한 발현하는 생물체내에서 발현되는 외래 도메인(상이한 폴리펩티드 형태이지만)을 제공할 수 있거나, 이것은 상이한 종류의 생물체에 의해 발현된 폴리펩티드 구조의 "종간(interspecies)", "유전자간(intergenic)" 등의 융합체일 수 있다. 일반적으로, 융합 폴리펩티드는 일반식 X-IL-1-Y로 표현될 수 있으며, 여기서, IL-1은 IL-1 폴리펩티드로부터 유도된 폴리펩티드의 일부를 나타내고, X와 Y는 독립적으로 부재하거나 천연 변이체를 포함하여 생물체중의 IL-1 서열과 관련되지 않은 아미노산 서열을 나타낸다.
표현 "서열 x에 나타난 누클레오티드 서열과 상보적인 누클레오티드 서열"은 서열 x를 갖는 핵산 가닥의 상보적 가닥의 누클레오티드 서열을 나타낸다. 용어 "상보적 가닥"은 용어 "상보체"와 본원에서 같은 의미로 사용된다. 핵산 가닥의 상보체는 코딩 가닥의 상보체 또는 비코딩 가닥의 상보체일 수 있다. 이중 가닥 핵산을 언급하는 경우, 서열 x를 갖는 핵산의 상보체는 서열 x를 갖는 가닥의 상보적 가닥 또는 서열 x의 상보적 가닥의 누클레오티드 서열을 갖는 임의의 핵산을 나타낸다. 누클레오티드 서열 서열 x를 갖는 단일 가닥 핵산을 언급하는 경우, 이러한 핵산의 상보체는 서열 x의 서열과 상보적인 누클레오티드 서열을 갖는 핵산이다. 누클레오티드 서열 및 이것의 상보적 서열은 항상 5'에서 3' 방향으로 제시된다.
"전달 복합체"는 표적화 수단(예를 들어, 표적 세포 표면에 대한 유전자, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 고친화성 결합 및/또는 표적 세포에 의한 증가된 세포 또는 핵 흡수를 유도시키는 분자)을 의미할 것이다. 표적화 수단의 예로는 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤), 지질(예를 들어, 양이온성 지질, 비로솜 또는 리포솜), 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 및 레트로바이러스) 또는 표적 세포 특이적 결합 제제(예를 들어, 표적 세포 특이적 수용체에 의해 인식되는 리간드)가 있다. 바람직한 복합체는 표적 세포에 의한 내부화 전에 현저한 언커플링(uncoupling)을 방지할 정도로 생체내에서 충분히 안정하다. 그러나, 복합체는 세포내에서 적당한 조건 하에 분해되어, 유전자, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드가 기능성 형태로 방출된다.
널리 공지된 바와 같이, 유전자는 개체의 게놈내에서 하나 또는 다수의 복제물로 존재할 수 있다. 이러한 중복 유전자는 동일할 수 있거나, 누클레오티드 치환, 첨가 또는 결실을 포함하지만 모두 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드를 여전히 코딩하는 특정 변형을 가질 수 있다. 따라서, 용어 "IL-1 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열"은 특정 개체내에서 하나 이상의 유전자를 나타낼 수 있다. 더욱이, 대립유전자라고 일컬어지는 누클레오티드 서열의 어떤 차이가 개개의 생물체 사이에 존재할 수 있다. 이러한 대립유전자 차이는 코드화된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 차이를 유도시키거나 유도시키지 않을 수 있지만, 여전히 동일한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드화한다.
표현 "유전자의 파괴" 및 "표적화 파괴" 또는 다른 유사한 표현는 유전자의 야생형 복제물과 비교하여 세포내의 유전자의 발현을 억제시키도록 천연 DNA 서열을 부위 특이적 단절시키는 것을 나타낸다. 단절은 유전자에 대한 결실, 삽입 또는 변형 또는 이들의 임의의 조합에 의해 야기될 수 있다.
용어 "반수체형(haplotype)"은 함께 유전되어 군을 형성하는(연쇄 불균형 형태로) 대립유전자의 세트를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 반수체형은 통계학적으로 현저한 수준(Pcorr≤0.05)으로 발생하는 반수체형을 포함하도록 규정된다. 본원에 사용된 바와 같이, 표현 "IL-1 반수체형"은 IL-1좌 중의 반수체형을 나타낸다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 개의 펩티드 또는 두 개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 상동성은 비교를 목적으로 배열될 수 있는 각각의 서열중의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교되는 서열 중의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되어 있는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다. 핵산 서열 사이의 상동성 또는 유사성 또는 동일성의 정도는 핵산 서열들에 의해 공유되는 위치에서의 동일하거나 매칭하는 서열의 개수의 함수이다. 아미노산 서열의 동일성의 정도는 아미노산 서열에 의해 공유되는 위치에서의 동일한 아미노산의 개수의 함수이다. 아미노산 서열의 상동성 또는 유사성의 정도는 아미노산 서열에 의해 공유되는 위치에서의 아미노산(즉, 구조적으로 관련된)의 개수의 함수이다. "관련없는" 또는 "비상동성" 서열은 40% 미만의 동일성, 바람직하게는 본 발명의 IL-1좌 서열중의 하나와 25% 미만의 동일성을 공유한다.
본원에 사용된 용어 "염증 질병"은 원인 또는 병인학과 무관하게 조직 손상으로 인해 개체에서 발생하는 질병 또는 질환을 나타낸다. 이러한 조직 손상은 미생물 침입, 자기면역 작용, 조직 또는 기관 동종이식편 거부, 종양형성, 특발성 질병 또는 열, 냉, 복사 에너지, 전기적 또는 화학적 자극과 같은 창상성 외부 영향, 또는 기계적 외상으로부터 유래될 수 있다. 원인이 무엇이든 간에, 결과적인 염증 반응은 미세순환, 유체의 이동, 및 염증 세포(예를 들어, 백혈구)의 유입과 활성화의 변화를 포함하는 기능성 및 세포성 조정의 복잡한 세트로 구성된다는 점에서 매우 유사하다. 이러한 질병 및 질환의 예로는, 관상 동맥 질병, 골다공증, 진성 당뇨병에서의 신증, 원형 탈모증, 그레이브스병, 전신성 홍반성 루푸스, 경화성 태선, 궤양성 대장염, 당뇨병성 망막증, 치근막 질병, 연소성 만성 관절염(예를 들어, 만성 홍채모양체염), 건선, DR 3/4 환자에서의 인슐린 의존성 당뇨병, 천식, 만성 염증성 간 질병, 만성 염증성 폐 질병, 폐 섬유증, 간 섬유증, 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염, 및 중추신경계(CNS), 위장계, 피부 및 관련 구조, 면역계, 간담즙계 또는 병리학이 염증 성분에 의해 일어날 수 있는 임의의 부위의 그 밖의 급성 및 만성 염증 질병이 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "염증 질환"은, 류마티스성 관절염, 염증성 배변 질환, 타입 I 당뇨병, 건선, 골다공증, 진성당뇨병에서의 신증, 원형 탈모증, 그레이브스병, 전신성 홍반성 루푸스, 경화성 태선, 궤양성 대장염, 관상 동맥 질병, 동맥 질환, 당뇨병성 망막증, 출생시 저체중, 임신 합병증, 중증 치근막 질병, 건선 및 인슐린 의존성 당뇨병을 포함하는, IL-1 성분과 관련된 임의의 질병을 추가로 포함한다.
본원에 사용된 용어 "상호작용"은 사실상 단백질-단백질, 단백질-핵산, 핵산-핵산, 및 단백질-작은 분자 또는 핵산-작은 분자 사이의 상호작용과 같은 분자 사이의 검출성 관계 또는 결합(예를 들어, 생화학적 상호작용)을 포함하고자 한다.
본원에 사용된 용어 "IL-1 관련된"은 사람 2번 염색체상의 사람 IL-1좌 유전자(2q 12-14)와 관련된 모든 마우스와 사람 유전자를 포함하고자 한다. 이들로는 2번 염색체에 위치한 사람 IL-1 유전자 클러스터의 IL-1 유전자(2q 13-14)가 있으며, 여기에는 인터루킨-1a를 코드화하는 IL-1 유전자, 인터루킨-1b를 코드화하는 IL-1B 유전자, 및 인터루킨-1 수용체 길항제를 코드화하는 IL-1RN(또는 IL-1ra)가 포함된다. 또한, 이들 IL-1 관련된 유전자로는 사람 2번 염색체상에 위치한 타입 I 및 타입 II 사람 IL-1 수용체 유전자(2q12) 및 마우스 1번 염색체상의 위치 19.5 cM에 위치한 이들의 마우스 상동체가 있다. 인터루킨-1a, 인터루킨-1b, 및 인터루킨-1RN은 이들 모두가 IL-1 타입 I 수용체에 결합한다는 점에서 매우 관련이 있지만, 인터루킨-1a 및 인터루킨-1b만이 IL-1 타입 I 수용체를 활성화시키는 작용제 리간드인 반면에 인터루킨-1RN은 천연 길항제 리간드이다.
용어 "IL-1"이 유전자 생성물 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우, 이것은 사람 2번 염색체상의 인터루킨-1 좌(2q 12-14)에 의해 코드화된 모든 유전자 생성물 및 이들의 상응하는 마우스 상동체를 나타내고자 한다. 따라서, 용어 IL-1은 IL-1a과 IL-1b와 같은 염증 반응을 촉진시키는 분비된 폴리펩티드 뿐만 아니라 IL-1 수용체 길항제와 IL-1 타입 II(유인) 수용체와 같은 염증 반응을 길항하는 분비된 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "IL-1 수용체" 또는 "IL-1R"은 IL-1좌 코드화된 리간드에 결합할 수 있고/있거나 IL-1좌 코드화된 리간드로부터 시그널을 변환시킬 수 있는 다수의 세포막 결합된 단백질 수용체를 나타낸다. 이 용어는 인터루킨-1(IL-1)분자와 결합할 수 있고, 포유동물 혈장막 단백질과 같은 이들의 천연 형태로서 아마도 세포에 대해 IL-1에 의해 제공된 시그널을 변환시키는 역할을 하는 임의의 단백질에 적용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 이 용어는 IL-1 결합 또는 시그널 변환 활성을 갖는 천연 단백질의 유사체를 포함한다. 예로는 미국 특허 제 4,968,607호에 기재되어 있는 사람 및 쥐과동물 IL-1 수용체가 있다. 용어 "IL-1 핵산"은 IL-1 단백질을 코드화하는 핵산을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "IL-1 길항제"는 IL-1 수용체 길항제 및 IL-1 타입 II(유인) 수용체 둘 모두의 유전자 및 상응하는 유전자 생성물을 포함하고자 한다.
용어 "IL-1 폴리펩티드" 및 "IL-1 단백질"은 도 1, 2 및 3에 도시된 IL-1 게놈 DNA 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이것의 단편, 및 이들의 상동체를 포함하고자 하며, 작용제 및 길항제 폴리펩티드가 있다.
용어 "IL-1 치료제"는 천연 IL-1 폴리펩티드의 효과를 의사하거나, 증강(아고나이징(agonizing))시키거나 억제(길항)함으로써 IL-1 수용체 상호작용과의 상호작용과 같은 IL-1 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 조절할 수 있는, 다수의 형태의 IL-1 폴리펩티드 뿐만 아니라 펩티도의사물질, 핵산, 또는 작은 분자를 나타낸다. 야생형 IL-1 폴리펩티드의 활성을 의사하거나 증강시키는 IL-1 치료제는 "IL-1 작용제"이다. 반대로, 야생형 IL-1 폴리펩티드의 활성을 억제하는 IL-1 치료제는 "IL-1 길항제"이다.
DNA와 RNA와 같은 핵산에 대해 본원에 사용된 용어 "단리된"은 거대분자의 천연 공급원에 존재하는 그 밖의 DNA 또는 RNA로부터 각각 분리된 분자를 나타낸다. 예를 들어, 대상 IL-1 폴리펩티드중의 하나를 코드화하는 단리된 핵산은 바람직하게는 게놈 DNA 중의 IL-1 유전자를 천연적으로 직접 플랭킹하는 핵산 서열의 10킬로염기(kb) 이하, 더욱 바람직하게는 천연 플랭킹 서열의 5kb 이하, 가장 바람직하게는 천연 플랭킹 서열의 1.5kb 미만을 포함한다. 또한, 본원에 사용된 용어 "단리된"은 재조합 DNA 기법에 의해 생성되는 경우 세포성 물질, 바이러스 물질 또는 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없는 핵산 또는 펩티드를 나타낸다. 더욱이, "단리된 핵산"은 단편으로 천연적으로 존재하지 않고, 천연 상태로 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하고자 한다. 또한, 용어 "단리된"은 다른 세포성 단백질로부터 단리된 폴펩티드를 나타내기 위해 본원에서 사용되며, 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드 둘 모두를 포함하고자 한다.
용어 "녹아웃"은 내인성 유전자의 발현의 부분적 또는 완전한 억제를 나타낸다. 이것은 유전자의 일부를 결실시키거나 일부를 제 2의 서열로 치환시킴으로써 일반적으로 달성되지만, 유전자에 대한 다른 변형, 예를 들어 정지 코돈의 도입, 중요한 아미노산의 돌연변이, 인트론 접합부의 제거 등에 의해 또한 야기될 수 있다.
용어 "녹아웃 구성물"은 세포내에서 내인성 DNA 서열에 의해 코드화되는 단백질의 발현을 저하시키거나 억제시키는데 사용될 수 있는 핵산 서열을 나타낸다. 간단한 예로서, 녹아웃 구성물은 IL-1RN 유전자와 같은 유전자로서, 유전자의 중요한 일부가 결실되어 활성 단백질이 그로부터 발현될 수 없는 유전자로 구성된다. 대안적으로, 다수의 종결 코돈이 천연 유전자에 첨가되어, 단백질의 초기 종결을 유도시킬 수 있거나 인트론 접합부가 비활성화될 수 있다. 전형적인 녹아웃 구성물의 경우, 유전자의 몇몇 부분이 선택성 마커(예를 들어, neo 유전자)로 치환되어, 유전자가 하기와 같이 나타날 수 있다: IL-1RN 5'/neo/IL-1RN 3', 여기서, IL-1RN5' 및 IL-1RN3'는 IL-1RN 유전자의 일부에 대해 각각 업스트림 및 다운스트림에 있는 게놈 또는 cDNA 서열을 나타내며, neo는 네오마이신 내성 유전자를 나타낸다. 또 다른 녹아웃 구성물의 경우, 제 2의 선택성 마커가 플랭킹 위치내에 첨가되어, 유전자가 하기와 같이 나타날 수 있다: IL-1RN/neo/IL-1RN/TK, 여기서, TK는 전술된 IL-1RN5' 또는 IL-1RN3' 서열에 첨가될 수 있고, 적당한 배지에서 역선택될 수 있는(즉, 네거티브 선택성 마커) 티미딘 키나아제 유전자이다. 이러한 두가지 마커 구성물은, 플랭킹 TK 마커를 TK 서열을 전형적으로 보유하는 비상동 재조합으로부터 분리시키는 상동 재조합의 선택을 가능하게 한다. 유전자 결실 및/또는 치환은 엑손, 인트론, 특히 인트론 접합부, 및/또는 프로모터와 같은 조절 영역으로부터 이루어질 수 있다.
용어 "녹아웃 포유동물" 등은 주어진 유전자가 녹아웃 구성물과의 재조합에 의해 억제된 형질전환된 포유동물을 나타낸다. 이 용어는 모든 자손 세대를 포함하도록 의도된다는 것이 강조된다. 따라서, 창시자(founder) 동물 및 모든 F1, F2, F3 등, 및 이들의 자손가 포함된다.
용어 "키메라", "모자이크", "키메라 포유동물" 등은 이것의 게놈 함유 세포의 일부에서 녹아웃 구성물을 갖는 형질전환된 동물을 나타낸다.
용어 "이형접합체", "이형접합성 포유동물" 등은 이것의 게놈 함유 세포 중의 염색체쌍의 하나상에 녹아웃 구성물을 갖는 형질전환된 포유동물을 나타낸다.
용어 "동형접합체", "동형접합성 포유동물" 등은 이것의 게놈 함유 세포 중의 염색체쌍의 둘 모두상에 녹아웃 구성물을 갖는 형질전환된 포유동물을 나타낸다.
"연쇄 불균형"은 주어진 대조 집단에서의 각각의 대립유전자의 개별적 발생 빈도로부터 예측되는 것 보다 높은 빈도로 두 개의 대립유전자가 동시유전되는 것을 나타낸다. 독립적으로 유전되는 두 개의 대립유전자의 예측된 발생 빈도는 첫 번째 대립유전자의 빈도에 두 번째 대립유전자의 빈도를 곱한 값이다. 예측된 빈도에서 동시 발생하는 대립유전자는 "연쇄 균형"이라고 일컬어진다.
용어 "마커" 또는 "마커 서열" 또는 유사한 표현은 선택성 유전자형 또는 바람직하게는 선택성 표현형을 생성시키는 임의의 유전자를 의미한다. 이것은 neo 유전자, 녹색 형광성 단백질(GFP) 유전자, TK 유전자, β-갈락토시다아제 유전자 등과 같은 예를 포함한다. 마커 서열은 이들 목적을 충족시키는 당업자에게 공지된 임의의 서열일 수 있지만, 전형적으로 마커 서열은 항생제 내성 유전자와 같은 선택성 특징을 부여하는 단백질, 또는 검출될 수 있고 세포에서 전형적으로 발견되지 않는 효소를 코드화하는 서열일 것이다. 또한, 마커 서열은 단백질의 발현을 조절하는 프로모터 또는 인핸서와 같은 조절 영역을 포함할 수 있다. 그러나, 내인성 조절 서열을 사용하여 마커를 또한 전사시킬 수 있다. 한 가지 구체예에 있어서, 마커는 예를 들어, 형광 표지된 항체를 사용하거나 GFP와 같은 형광 단백질을 발현시킴으로써, 형광 활성화된 세포 분류에 의해 트랜스펙션된 세포를 트랜스펙션되지 않은 세포와 분리시키는 것을 용이하게 한다. 이들 서열로는 전사 개시 및 종결 시그널, 번역 시그널, 번역후 수식 시그널, 인트론 스플라이싱 접합부, 리보솜 결합 부위, 및 폴리아데닐화 시그널 등 몇몇이 더 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 마커 서열은 서열을 표적 유전자에 추가하기 위해 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 정지 코돈을 추가하여, IL-1RN 번역을 트렁케이팅(truncate)시킬 수 있다. 선택성 마커의 사용은 당 분야에 널리 공지되어 있으므로, 본원에 상세히 설명할 필요가 없다. 본원에 사용된 용어 "조절"은 상향조절(즉, 활성화 또는 자극 (예를 들어, 아고나이징 또는 증강시킴으로써)) 및 하향조절(즉, 억제 (예를 들어, 길항, 저하 또는 억제시킴으로써)) 둘 모두를 나타낸다.
용어 "변이된 유전자"는 변이된 유전자를 갖지 않는 대상에 비해 변이된 유전자를 갖는 대상의 표현형을 변화시킬 수 있는 유전자의 대립유전자 형태를 나타낸다. 대상이 이러한 변이에 대해 변화된 표현형을 갖도록 동형접합성인 경우, 변이는 열성인 것으로 일컬어진다. 변이된 유전자의 한 복제물이 대상의 유전자형을 변화시키기에 충분한 경우, 변이는 우성인 것으로 일컬어진다. 대상이 변이된 유전자의 한 복제물을 갖고, 동형접합성 대상의 표현형과 이형접합성 대상의 표현형 사이의 중간체적인 표현형을 갖는 경우 (그 유전자에 대해), 변이는 공동 우성인 것으로 일컬어진다.
본 발명의 "사람 이외의 동물"로는 설치류, 사람 이외의 영장류, 양, 개, 소와 같은 포유류, 닭, 양서류, 파충류 등이 있다. 바람직한 사람 이외의 동물은 래트 및 마우스를 포함하는 설치류과로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 마우스이지만, 제노푸스속의 일원과 같은 형질전환된 양서류, 및 형질전환된 닭이 예를 들어 배형성 및 조직 형성에 영향을 줄 수 있는 제제를 이해하고 확인하기 위한 중요한 도구를 또한 제공할 수 있다. 용어 "키메라 동물"은 재조합 유전자가 발현되거나, 재조합 유전자가 동물의 모든 세포는 아니지만 일부 세포에서 발현되는 동물을 나타내기 위해 본원에 사용된다. 용어 "조직 특이적 키메라 동물"은 재조합 IL-1 유전자의 하나가 일부 조직이지만 다른 조직은 아닌 조직에 존재하고/하거나 이러한 조직에서 발현되거나 파괴됨을 나타낸다. 용어 "사람 이외의 포유동물"은 사람을 제외한 포유류강의 임의의 일원을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 및 적당한 경우, 리보핵산(RNA)과 같은 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드를 나타낸다. 또한, 이러한 용어는 균등물로서 누클레오티드 유사체로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체 및 기술하려는 구체예에 적용되는 경우, 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리누클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "다형성"은 유전자의 한 가지를 넘는 형태 또는 이들의 일부(예를 들어, 대립유전자 변형체)의 공존을 나타낸다. 두 가지 이상의 상이한 형태, 즉, 두가지 상이한 누클레오티드 서열이 존재하는 유전자의 일부는 "유전자의 다형성 영역"으로서 언급된다. 다형성 영역은 하나의 누클레오티드일 수 있고, 이것의 동일성은 상이한 대립유전자면에서 다르다. 또한, 다형성 영역의 길이는 수 개의 누클레오티드일 수 있다.
"다형성 유전자"는 하나 이상의 다형성 영역을 갖는 유전자이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 프로모터에 작동적으로 결합된 선택된 DNA 서열의 발현을 조절하고, 세포내에서 선택된 DNA 서열의 발현을 수행하는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 용어는 "조직 특이적" 프로모터, 즉, 특정 세포(예를 들어, 특정 조직의 세포)에서만 선택된 DNA 서열을 발현시키는 프로모터를 포함한다. 또한, 이러한 용어는 하나의 조직에서 선택된 DNA의 발현을 주로 조절하지만, 또한 다른 조직에서의 발현을 유도시키는 소위 "리키(leaky)" 프로모터를 포함한다. 또한, 이러한 용어는 조직 비특이적 프로모터 및 구성적으로 발현시키거나 유도성인(즉, 발현 수준이 조절될 수 있는) 프로모터를 포함한다.
용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 유전자 생성물을 언급하는 경우에 본원에서 같은 의미로 사용된다.
용어 "재조합 단백질"은, 일반적으로 IL-1 폴리펩티드를 코드화하는 DNA를 적합한 발현 벡터내로 삽입시킨 후에 이것으로 숙주 세포를 형질전환시켜서 이종 단백질을 생성시키는, 재조합 DNA 기법에 의해 생성된 본 발명의 폴리펩티드를 나타낸다. 더욱이, 재조합 IL-1 유전자에 대해 사용된 표현 "~로부터 유도된"은 "재조합 단백질"의 의미속에 천연 IL-1 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 폴리펩티드의 천연 형태의 치환 및 삽입(트렁케이션을 포함함)을 포함하는 변이에 의해 생성된 이와 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하고자 한다.
본원에 사용된 "작은 분자"는 분자량이 약 5kD 미만, 가장 바람직하게는 약 4kD 미만인 조성물을 나타내고자 한다. 작은 분자는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드의사물질, 탄수화물, 지질 또는 다른 유기(탄소 함유) 또는 무기 분자일 수 있다. 다수의 약제 회사는 화학적 및/또는 생물학적 혼합물, 종종 IL-1 생체활성을 조절하는 화합물을 확인하기 위해 본 발명의 검정법 중의 어느 하나에 의해 스크리닝될 수 있는 진균, 박테리아 또는 조류 추출물의 광대한 라이브러리를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 하이브리드화하는" 또는 "특이적으로 검출하는"은 척추동물의 약 6개, 12개, 20개, 30개, 50개, 100개, 150개, 200개, 300개, 350개, 400개 또는 425개 이상의 연속 누클레오티드, 바람직하게는 IL-1 유전자에 하이브리드화하는 본 발명의 핵산 분자의 능력을 나타낸다.
"전사 조절 서열"은 작동적으로 결합되어 단백질 코딩 서열의 전사를 유도시키거나 조절하는 개시 시그널, 인핸서 및 프로모터와 같은 DNA 서열을 나타내기 위해 명세서 전체에서 사용된 일반적 용어이다. 바람직한 구체예에 있어서, IL-1 유전자의 하나의 전사는 발현이 의도된 세포-타입에서 재조합 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 서열(또는 그 밖의 전사 조절 서열)의 조절하에 있게 된다. 재조합 유전자는 IL-1 폴리펩티드의 천연 형태의 전사를 조절하는 서열과 같거나 다른 전사 조절 서열의 조절하에 있을 수 있는 것으로 또한 이해될 것이다.
본원에 기재된 용어 "트랜스펙션"은 핵산 중재된 유전자 전달에 의해서 수용세포 내로, 예를 들어, 발현벡터를 통해서 핵산이 도입됨을 의미한다. 본 기술분야에 공지된 형질전환의 방법에는 전기적, 자기적, 물리적, 생물학적 또는 화학적 방법이 포함된다. 본원에 기재된 용어 "트랜스펙션"은 다른 방법 중에서도 전기영동, 자기영동, Ca++처리, 주입, 충격(Bombardment), 레트로바이러스성 감염 및 지질감염과 같은 특정의 기술을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "형질전환"은 세포의 유전형이 외인성 DNA 또는 RNA의 세포 흡수로 인해서 변화되는 과정을 나타내는데, 예를 들어, 형질전환된 세포는 IL-1 폴리펩티드의 재조합 형태를 발현하거나, 이전된 유전자에 의한 안티-센스 발현의 경우에는, IL-1 폴리펩티드의 천연형의 발현이 중단된다.
본원에 사용된 용어 "트랜스진(transgene)"은 세포 내로 도입되는 핵산서열(예를 들어, IK-1 폴리펩티드중 하나 또는 안티센스 전사체의 암호화)을 의미한다. 트랜스진은 트랜스진이 도입되는 형질전환된 동물 또는 세포에 대해 부분적으로 또는 전체적으로 이종성, 즉, 외래일 수 있거나, 트랜스진이 도입되는 형질전환된 동물 또는 세포의 내인성 유전자와는 동종성이지만, 세포에 삽입되어 그 세포의 게놈을 변경시키도록 하는 방법으로 동물의 게놈내로 삽입되거나 삽입되게 디자인된다(예를 들어, 트랜스진은 천연 유전자의 위치와는 상이한 위치에 삽입되거나, 트랜스진의 삽입이 녹아웃을 유발시킨다). 트랜스진은 에피좀의 형태로 세포에 존재할 수 있다. 트랜스진은 하나 이상의 전사 조절서열 및 어떠한 다른 서열, 예컨대, 소정의 핵산의 최적 발현에 요구될 수 있는 인트론을 포함할 수 있다.
"형질전환된 동물"은 하나 이상의 세포가 본 기술 분야에 공지된 형질전환 기법과 같은 사람 개입에 의해 도입된 이종성 핵산을 함유하는 모든 동물, 바람직하게는 사람 이외의 포유류, 조류 또는 양서류를 의미한다. 핵산은 재조합 바이러스를 주입하거나 미세 주입하는 바와 같은 계획된 유전 조작 방법에 의한 세포의 전구체내로의 직접 또는 간접적인 도입에 의해서 세포내로 도입된다. 용어 유전조작은 전통적인 교잡육종, 또는 시험관내 수정을 포함하지 않으며, 재조합 DNA 분자의 도입에 관한 것이다. 이러한 분자는 염색체내에서 통합되거나, 염색체외적인 복제 DNA일 수 있다. 본원에 기재된 전형적인 형질전환된 동물에서, 트랜스진은 세포가 IL-1 폴리펩티드, 예를 들어, 효능성 또는 길항성 형태중의 어느 하나의 재조합 형태를 발현하게 한다. 그러나, 재조합 IL-1 유전자가 유지 유전자인 형질전환된 동물이 또한, 예를 들어, 이하 기재되는 FLP 또는 CRE 재조합효소 의존성 구성물로서 사료되고 있다. 또한, "형질전환된 동물"은 하나 이상의 IL-1 유전자의 유전자 파괴가 재조합 또는 안티센스 기술을 포함한 사람에 의한 중재에 의해 유발되는 재조합 동물을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "처리"는 상태 또는 질환중의 하나 이상의 증상을 완화시키는 것 뿐만 아니라 치유하는 것을 포함한다.
용어 "벡터"는 다른 핵산에 결합되어 그 핵산을 수송할 수 있는 핵산분자를 나타낸다. 바람직한 벡터중 한 가지 형태는 에피좀, 즉, 염색체외 복제를 할 수 있는 핵산이다. 바람직한 벡터는 핵산에 결합되어 그 핵산의 자발적인 복제 및/또는 발현을 가능하게 하는 벡터이다. 유전자에 작동적으로 결합되어 그 유전자의 발현을 유도할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현벡터"라 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서의 유용성이 있는 발현벡터는 벡터 형태에서 염색체에 결합되지 않는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 나타내는 "플라스미드"의 형태이다. 본원에서는 "플라스미드" 및 "벡터"가 서로 대체적으로 사용되는데, 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이다. 그러나, 본 발명은 동일한 기능을 나타내고 이하 본원에서 기술분야에 공지하고 있는 다른 형태의 발현벡터를 포함한다.
용어 "야생형 대립유전자"는 대상 내에서 두 개의 복사체로 존재하는 경우에 야생형 표현형을 생성시키는 유전자의 대립유전자를 의미한다. 특이적 유전자의 몇가지 상이한 야생형 대립유전자가 존재할 수 있는데, 그 이유는 유전자에서의 특정의 누클레오티드 변화가 누클레오티드 변화와 함께 두 개의 유전자 복사체를 지닌 대상의 표현형에 영향을 주지 않을 수 있기 때문이다.
4.3 표적 인터루킨-1 길항제 유전자
녹아웃되는 유전자는 인터루킨 경로 또는 케스케이드와 관련된 어떠한 유전자일 수 있으며, 단, 중단되는 DNA상의 적어도 약간의 서열 또는 지도화 정보는 녹아웃 구성물 및 스크리닝 프로브 둘 모두를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명자들은 IL-1RN 유전자를 사용함으로써 본 발명을 예시하였지만, IL-1 유전자 클러스터로부터의 다른 유전자는 진뱅크 수납번호(GenBank accession no.) L32838에서 얻을 수 있는 IL-1 유전자 클러스터에 대한 서열 및 지도화 정보를 근거로 표적화될 수 있다[문헌: Zahedi, et al, Cytokine, 6:1-9 (1994)]. 클론은 또한 문헌[Ausubel, et al. (Eds), Current Protocols in Molecular Biology (1997, J. Wiley, NY)]에 기재된 방법과 같은 본 기술분야에 공지된 방법 및 이용 가능한 서열 정보를 사용함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 위치 10.0 cM의 염색체 2 상의 마우스 IL-1RN 유전자(www.informatics.jax.org/, accession MGI:96547)가 중단을 위해 표적화된다. 쥐의 IL-1RN 유전자의 게놈성 DNA 서열을 도 1에 도시한다[문헌: Matsushime et al. (1991) Blood 78:616-23; and Shuck et al. (1991) Eur J Immunol 21:2775-80]. 사람, 마우스 및 래트 IL-1RN에 대한 유전자는 인트론-엑손 구성에서의 IL-1 알파 및 IL-1 베타에 대한 유전자와 유사하여, 공통의 진화론적 기원의 유사성을 나타낸다[문헌: Eisenberg et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:5232-6]. 이러한 공통의 인트론-엑손 구조는 적합한 종-특이적 표적 유전자 구성물의 디자인을 용이하게 한다. 이러한 표적 유전자 구성물에는 본 발명의 각각의 다양한 구체예에서 특이적으로 조절되는 IL-1RN 표적 유전자 녹아웃 및 녹인 구성물이 포함된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서는, 위치 19.5cM의 염색체 1 상의 마우스 IL-1 타입 II 수용체 유전자(www.informatics.jax.org/ acession MGI:96546)이 중단을 위해 표전화된다. 쥐 IL-1 타입 II 수용체 유전자는, 사람 염색체 2 의 일부에 신테닉(syntenic)인 영역내에서, 염색체 1의 중심 단부에 대한 상호 특이적 역교배로 제한 단편 길이 다형성을 분석함으로써 작도되고 있다. 쥐 Il-1rl 유전자는 쥐 염색체 2 상에 놓여 있는 IL-1 유전자로부터 분리된다[문헌: Copeland (1991) Genomics 9:44-50]. 이러한 유전자의 엑손 서열이 도 2에 도시되어 있다[문헌: McMahan et al. (1991) EMBO J 10:2821-32]. 표적 유전자 구성물에는 이하 기재되는 바와 같이 본 발명의 각각의 다양한 구체예에서 특이적으로 조절되는 IL-1 타입 II 수용체 표적 유전자 녹아웃 및 녹인 구성물이 포함된다.
4.4 인터루킨-1 표적 유전자 구성물
본 발명의 한가지 구체예에서, 녹아웃 구성물을 생성시키는데 사용되는 클론은 유전자내의 한 위치를 절단하여 마아커 유전자가 그 위치에 삽입될 수 있도록 선택된 제한 효소에 의해 분해된다. 또 다른 구체예에서, DNA 서열은 유전자내의 단일의 제한 효소 절단으로 랜덤 누클레아제에 의한 부분적인 분해에 의해서 제거될 수 있다.
마아커 유전자 삽입에 적절한 위치는 본래의 유전자의 발현을 억제시키는 위치이다. 이러한 위치는 서열(엑손, 인트론 또는 프로모터)이 표적화되는 위치(즉, 프로모터 기능을 억제하거나 본래의 엑손의 합성을 억제하는데 요구되는 정확한 삽입 위치) 및 서열내의 용이한 제한 부위의 이용성을 포함한 다양한 인자에 좌우될 것이다. 어떠한 경우에 있어서는, 마아커 유전자가 녹아웃 유전자 내로 삽입되어야 하는 경우에 최초의 게놈성 서열과 비교될 수 있는 녹아웃 구성물의 길이가 유지되도록 대부분의 유전자를 제거하는 것이 요구될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 엑손 3 내의 EcoRV 부위로부터 번역 정지 코돈의 하류에 있는 엑손 4내의 처음 XbaI 부위까지의 누클레오티드가 삭제된다.
마아커 유전자는 본 기술 분야의 전문가에게는 공지되어 있고 검출가능하고/거나 검정 가능한 모든 핵산서열일 수 있다. 전형적으로는 항생성 내성 유전자가 사용되거나, 게놈내에서의 발현 또는 존재가 용이하게 검출될 수 있는 그 밖의 모든 유전자가 사용될 수 있다. 마아커 유전자는 활성이거나 이러한 유전자가 삽입되는 세포에서 용이하게 활성화될 수 있는 어떠한 공급원으로부터의 프로모터에 작동적으로 결합할 수 있다. 그러나, 마아커 유전자는 자체의 프로모터를 지니지 않는데, 그 이유는 표적된 유전자의 프로모터를 사용함으로써 전사될 수 있기 때문이다. 또한, 마아커 유전자는 정상적으로는 유전자의 전사 종결을 위해서 유전자의 3' 단부에 결합된 폴리 A 서열을 지닐 것이다. 바람직한 마아커 유전자는 아미노글리코시드 포스포트랜스페라제 유전자(aph), 하이그로마이신 B 포스포트랜스페라제 유전자, 또는 녹아웃 기술에 마아커로서 유용한 것으로 공지된 어떠한 항생성 내성 유전자이다.
선형 녹아웃 구성물은 배 간세포내로 직접 트랜스펙션되거나(이하 설명), 삽입되기 전에 먼저 증폭의 위한 적합한 벡터내로 위치될 수 있다. 적합한 벡터는 본 기술분야의 전문가에게는 공지되어 있다. 바람직한 벡터는 이. 콜라이(E. coli)로부터 적합한 양을 생성시키는 벡터이다. 이러한 벡터에는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, pBluescript II SK 벡터(Stratagene, San Diego, Calif.), 또는 pGEM7(Promega Corp., Madison, Wis.)이 있다. 그러나, 구성물이 큰 파아지 또는 코스미드(cosmid)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
4.5 형질전환된 동물
본 발명은 또한 다양한 목적, 예를 들어, IL-1 중재된 염증성 질환에 대한 치료제를 동정하는데 사용될 수 있는 형질전환된 동물을 제공한다. 본 발명의 형질전환된 동물은 IL-1 프로모터의 조절하에 또는 이종성 프로모터의 조절하에 이종성 IL-1 유전자 또는 이의 단편을 함유하는 사람 이외의 동물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 형질전환된 동물은 야생형 IL-1 단백질의 돌연변이체 및 이의 다형성 변이체를 포함한, 야생형 IL-1 단백질 또는 이의 단편 또는 이의 변이체를 암호하는 트랜스진을 발현하는 동물이다. 이러한 동물은 특이적 부위에서 IL-1 단백질의 발현 효과를 측정하는데 사용되거나, IL-1 치료제를 동정하거나 생체내 이들의 활성을 확인하는데 사용될 수 있다.
형질전환된 동물은 또한 IL-1 프로모터 또는 이의 단편의 조절하에 수용체 유전자와 같은 트랜스진을 함유하는 동물일 수 있다. 이러한 동물은, 예를 들어, IL-1 유전자 발현의 조절에 의해서 IL-1의 생성을 조절하는 IL-1 약물을 동정하는데 유용하다. IL-1 유전자 프로모터는 예를 들어 IL-1 cDNA 단편으로 게놈성 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리되며, 본 기술분야에 공지된 방법에 따라서 특성화된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, IL-1 수용체 유전자를 함유하는 형질전환된 동물은 IL-1 발현을 조절하는 능력에 대해서 스테로이드 호르몬으로 공지된 생활성 분자의 종류를 스트리닝하는데 사용된다. 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, IL-1 발현 조절 활성에 대해 스크리닝된 스테로이드 호르몬은 안드로겐으로 공지된 그룹에 속한다. 본 발명의 보다 더 바람직한 구체예에서, 스테로이드 호르몬은 테스토스테론 또는 테스토스테론 유사체이다. 본 발명의 범위에 속하는 또 다른 사람 이외의 동물은 내인성 IL-1 유전자의 발현이 돌연변이되거나 "녹아웃"된 동물을 포함한다. "녹아웃" 동물은 특정의 유전자 또는 유전자들의 동종접합 또는 이종접합 삭제를 지니는 동물이다. 이러한 동물은 IL-1의 부재가 특이적 표현형을 생성시키는지, 특히, 이러한 마우스가 심장질환 또는 암에 대한 높은 민감성과 같은 특이적 질환을 같거나 발생되기 쉬운지를 측정하는데 유용할 수 있다. 또한 이러한 동물은 이하 기술된 바와 같은 IL-1 유전자의 돌연변이에 의해서 발생되는 질환 상태를 완화시키거나 약화시키는 약물을 스크리닝하는데 유용하다. 이러한 동물은 또한 Il-1 유전자에서 특이적 아미노산 차이 또는 대립유전자성 변이의 효과를 측정하는데 유용하다. 즉, IL-1 녹아웃 동물은 예를 들어 IL-1의 돌연변이된 형태 또는 대립유전자성 변이체를 발현하는 형질전환된 동물과 교배되어, 단지 돌연변이된 단백질만을 발현하며 야생형 IL-1 단백질은 발현하지 않는 동물을 생성시킬 수 있다. 이러한 관점의 본 발명의 바람직한 구체예에서, 염색체중 하나 또는 둘 모두 상에서 돌연변이된 IL-1 유전자좌를 지니는 형질전환된 IL-1 녹아웃 마우스가 IL-1 발현의 상실에 기인되는 상태에 대한 트랜스진 또는 약물 치료를 위한 모델 시스템으로 사용된다.
형질전환된 동물 및 녹아웃 사람 이외의 동물을 얻는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 녹아웃 마우스는 유전자를 녹아웃되게 암호하는 마우스 배 간세포 염색체내로 "녹아웃" 구성물을 동종성 삽입시킴으로써 생성된다. 한가지 바람직한 구체예에서, 동종 재조합을 이용하여 동물의 게놈을 변화시키는 방법인 유전자 표적화는 변화체를 배양된 배 간세포내로 도입시키는데 사용될 수 있다. ES 세포내의 목적 IL-1 유전자를 표적화함으로써, 이러한 변화체가 동물의 생식세포주내로 도입되어 키메라를 생성시킬 수 있다. 유전자 표적화 과정은 표적 IL-1 유전자좌에 동종성인 단편을 포함하며 IL-1 게놈성 서열에 대한 의도된 서열 변화(예, 삽입, 삭제, 포인트 돌연변이)를 포함하는 DNA 표적화 구성물을 조직배양 세포내로 도입함으로써 수행된다. 표적화된 세포는 이어서 적절하게 표적되는 세포를 동정하고 분리하도록 정확한 표적화를 위해 스크리닝된다.
배 간세포에서의 유전자 표적화는 사실 하나 이상의 IL-1 게놈성 서열로 동종 재조합을 수행하도록 고안된 표적화 트랜스진 구성물을 사용함에 의한 IL-1 유전자 기능을 중지시키는 수단으로 본 발명에 의해 계획된 구성이다. 표적화 구성물은, IL-1 유전자의 구성요소에 의한 재조합시에 양성 선택 마아커가 유전자의 암호 서열내로 삽입(또는 대체)되도록 배열될 수 있다. 삽입된 서열은 기능적으로 IL-1 유전자를 중단시키면서, 또한 양성 선택 특징을 생성한다. 예시 목적으로 IL-1 표적화 구성물이 이하 상세히 기재된다.
일반적으로는, 녹아웃 동물을 생성시키는데 사용된 배 간세포(ES 세포)는 생성되는 녹아웃 동물과 동일한 종일 것이다. 따라서, 예를 들어, 마우스 배 간세포는 일반적으로 녹아웃 마우스의 생성에 사용될 것이다.
배 간세포는 문헌[Doetschman et al. (1985) J. Embryol. Exp. Mol. Biol. 87:27-45]에 기재된 방법과 같은 본 기술분야의 전문가에게는 공지된 방법을 사용함으로써 생성되고 유지된다. 모든 ES 세포주가 사용될 수 있지만, 세포주는 전형적으로는 녹아웃 구성물의 생식세포주 전달을 생성하도록 발생 배의 생식세포주 내로 삽입되고 그의 일부가 되는 세포의 능력에 대해서 선택된다. 따라서, 이러한 능력을 지니는 것으로 사료되는 모든 ES 세포주가 본 발명에서의 사용에 적합할 수 있다. ES 세포의 생성에 전형적으로 사용되는 전형적인 한 가지의 마우스 스트레인은 129J 스트레인이다. 또 다른 ES 세포주는 쥐 세포주 D3이다(American Type Culture Collection, catalog no. CKL 1934). 또 다른 바람직한 ES 세포주는 WW6 세포주이다[문헌: Ioffe et al. (1995) PNAS 92:7357-7361]. 세포는 문헌[Robertson, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J.Robertson, ed. IRL Press, Washington, D.C. (1987)]; 문헌[Bradley et al. (1986) Current Topics in Devel. Biol. 20:357-371]; 및 문헌[Hogan et al. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1986)]에 기재된 바와 같은 본 기술분야의 전문가에게는 공지된 방법을 사용함으로써 녹아웃 구성물 삽입을 위해 배양되고 제조된다.
녹아웃 구성물은 간세포주 내로 도입되고 목적 유전자의 염색체 유전자좌에서 게놈과 재조합되어 돌연변이되게 하는 핵산의 독특하게 형성된 단편을 나타낸다. 따라서, 주어진 녹아웃 구성물은 중단을 위해 표적되는 주어진 유전자에 특이적이다. 그럼에도 불구하고, 많은 공통의 구성요소가 이러한 구성물에 존재하며, 이러한 구성요소가 본 기술분야에 공지되어 있다. 전형적인 녹아웃 구성물은 돌연변이되는 유전자를 암호하는 게놈성 유전자좌의 5' 및 3' 단부 둘 모두로부터의 약 0.5kb 미만 뿐만 아니라 약 10.0kb 이상의 핵산 단편을 함유한다. 이러한 두 개의 단편은 내오마이신 내성 유전자(neoR)와 같은 양성 선택 가능한 마아커를 암호하는 핵산의 중재 단편에 의해 분리된다. 목적하는 게놈성 유전자좌의 최말단 3' 단부로부터의 핵산에 결합되게 되어 연결되는 양성 선택 가능한 마아커를 암호하는 핵산에 결합된 게놈성 유전자좌의 최말단 5' 단부로부터의 핵산으로 구성되는, 핵산 단편은 녹아웃 되는 IL-1 또는 다른 목적 유전자에 대한 대부분의 암호서열이 생략되어 있다. 생성되는 구성물이 이러한 유전자좌에서의 염색체로 동종성으로 재조합되는 경우에, 게놈성 유전자좌로부터의 구조성 유전자로 공지된 생략된 암호서열이 상실된다. 이러한 희귀성 동종 재조합이 수행되는 간세포는 양성 선택 가능한 마아커를 암호하는 유전자의 핵산의 게놈내로의 안정한 삽입 방법 및 이어지는 적절한 약물(본 예에서는 네오마이신)의 존재하에 이러한 마아커 유전자를 발현하는 세포에 대한 선택 방법에 의해 선택된다.
이러한 기본적인 기술에 대한 변화가 또한 있으며, 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, "녹인" 구성물은 양성의 선택 가능한 마아커를 암호하는 핵산에 결합된 5' 게놈성 유전자좌 단편을 암호하는 핵산의 동일한 기초 배열을 나타내는데, 상기 양성의 선택 가능한 마아커는 3' 게놈성 유전자좌 단편을 암호하는 핵산에 결합되게 되지만, 어떠한 암호 서열도 생략되지 않아서 사용된 5' 및 3' 게놈성 단편이 양성의 선택 가능한 마아커 유전자를 암호하는 핵산의 도입에 의해 중단되기 전에 연속성이다. 구성물의 이러한 "녹인" 타입은 단일의 엑손과 같은 돌연변이되는 유전자의 게놈성 유전자좌의 제한된 영역만이 클로닝 및 유전 조작되는 경우에 돌연변이 형질전환된 동물의 구성에 아주 유용하다. 또한, "녹인" 구성물은 표적된 유전자의 단일의 기능성 도메인을 특이적으로 제거하는데 사용되어 하나의 기능이 불완전한 표적 유전자의 폴리펩티드를 발현하는 형질전환된 동물을 생성시키면서, 암호된 폴리펩티드의 그 밖의 도메인의 기능이 보유되게 할 수 있다. 이러한 타입의 "녹인" 돌연변이는 종종 소위 "우세한 음성" 돌연변이의 특성을 지니는데, 그 이유는, 특히 동종 다형화되는 단백질의 경우에, 돌연변이가 야생형 유전자의 폴리펩티드의 활성(또는 "독성")을 특이적으로 차단할 수 있기 때문이다. 녹인 기술을 변화시키는 경우에, 마아커 유전자가 목적하는 게놈성 유전자좌에 삽입되어 마아커 유전자의 발현이 표적된 유전자의 전사 조절 구성요소의 조절하에 진행되게 한다. 마아커 유전자는 활성이 삭제된 효소(예, β-갈락토시다제)를 암호하는 유전자이며, 효소 기질은 적합한 조건하에 세포에 첨가될 수 있으며, 효소활성이 또한 분석될 수 있다. 본 기술 분야의 전문가라면 주어진 세포에서 다른 유용한 마아커 및 이들의 존재를 검출하는 방법에 익숙할 것이다. 예를 들어, 그러한 또 다른 마아커는 그린 형광 단백질(GFP)이다. GFP 마아커는 각각의 생존 가능한 세포에서 유전자 발현의 검사에 특히 유용하다. 따라서, GFP 및 관련된 마아커는 "녹인" 유전자의 발현 수준을 시험관내 분석하는데 특히 유용하다. 이러한 모든 마아커는 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
상기된 바와 같이, 상기된 "녹아웃" 및 "녹인" 구성물의 동종 재조합은 아주 드물며, 종종 그러한 구성물은 삭제에 대해 표적화는 유전자에 영향이 없는 경우 및 변경시키고자 하는 유전자가 아닌 다른 유전자가 중단되도록 효능적으로 재조합될 수 있는 경우에 게놈의 랜덤 영역내로 비동종성으로 삽입된다. 이러한 비동종 재조합은 상기된 녹아웃 및 녹인 구성물을 변화시켜서 이들이 어느 한 단부에서 음성의 선택 가능한 마아커에 의해서 (특히 티미딘 키나아제 유전자의 두 가지 대립 유전자 변이체, 즉, 본 기술분야에 공지된 적절한 조직 배양 배지에서 세포주를 발현하는데 선택될 수 있는 폴리펩티드 생성물, 즉, 5-브로모데옥시우리딘과 같은 약물을 함유하는 생성물을 사용함으로써) 플랭킹되도록 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명의 이러한 녹아웃 또는 녹인 구성물의 바람직한 구체예는 양성의 선택 가능한 마아커의 핵산에 결합된 게놈성 유전자좌의 5' 단부를 암호하는 핵산에 결합된 음성의 선택 가능한 마아커를 암호하는 핵산으로 구성되는데, 상기 양성의 선택 가능한 마아커의 핵산은 동일한 게놈성 유전자좌의 3' 단부를 암호하는 핵산에 결합되고, 상기 게놈성 유전자좌의 3' 단부는 음성의 선택 가능한 마아커를 암호하는 제 2 핵산에 결합된다. 생성되는 녹아웃 구성물과 게놈 사이의 비동종 재조합은 일반적으로 하나 또는 둘 모두의 음성의 선택 가능한 마아커 유전자의 안정한 삽입을 유도할 것이며, 그로 인해서 비동종 재조합이 진행되는 세포는 적절한 선택성 배지(예, 5-브로모데옥시우리딘과 같은 약물을 함유하는 배지)에서의 성장에 의해 선택될 수 있다. 양성의 선택 가능한 마아커 및 음성의 선택 가능한 마아커에 대한 동시 선택은 녹아웃 구성물이 돌변변이되는 유전자의 유전자좌에서 동종성으로 재조합되는 클론에 대하여 상당한 부화를 유발시킬 것이다. 생성되는 녹아웃 간세포주 내의 표적된 유전자좌에서의 예측된 염색체 변경의 존재는 본 기술분야에서는 잘 알려진 써던 블롯(Southern blot) 분석기술에 의해 확인될 수 있다. 또한, PCR이 이용될 수 있다.
세포 내로 삽입되는 각각의 녹아웃 구성물은 일단 선형이어야 한다. 따라서, 녹아웃 구성물이 벡터 내로 삽입되면(이하 기재됨), 벡터 서열 내에서만 절단하며 녹아웃 구성물 서열 내에서는 절단하지 않도록 선택된 적합한 제한 엔도누클레아제가 DNA를 분해시킴으로써 선형화가 수행된다.
삽입의 경우에, 녹아웃 구성물은 전문가에게는 공지된 삽입방법에 적절한 조건하에 ES 세포에 첨가된다. 예를 들어, ES 세포가 전기영동되는 경우에, ES 세포 및 녹아웃 구성물 DNA가 전기영동 기계를 사용하고 제작자의 사용안내에 따름으로써 전기 펄스에 노출된다. 전기영동 후에, ES 세포는 전형적으로는 적합한 인큐베이션 조건하에 수거된다. 세포는 이어서 상기 설명된 바와 같이 녹아웃 구성물의 존재에 대해 스크리닝된다. 하나 이상의 구성물이 ES 세포 내로 유도되는 경우에, 각각의 녹아웃 구성물은 동시에 도입되거나 일정한 시기에 한번에 도입될 수 있다.
적절한 위치내의 녹아웃 구성물을 함유하는 적합한 ES 세포가 상기된 선택기술에 의해 확인된 후에, 세포가 배내로 삽입될 수 있다. 삽입은 전문가에게는 공지된 다양한 방법으로 수행될 수 있지만, 바람직한 방법은 미세주입법이다. 미세주입의 경우에, 약 10 내지 30 세포가 미세 피펫내로 취해져서 적절한 발달 단계에 있는 배내로 주입되어 녹아웃 구성물을 함유하는 외래 ES 세포가 발달 단계의 배에 삽입되게 한다. 예를 들어, 형질전환된 ES 세포가 미분화배세포 내로 미세 주입될 수 있다. ES 세포의 주입에 사용된 배에 대한 적합한 발달단계는 종에 매우 의존적이지만, 마우스의 경우에, 약 3.5일이다. 배는 임신한 암컷의 자궁을 관류시킴으로써 얻는다. 이를 수행하는 적합한 방법은 전문가에게는 공지되어 있으며, 예를 들어, 상기 브래들리(Bradley et al.)등의 문헌에 기재되어 있다.
오른쪽 발달단계의 어떠한 배가 사용에 적합한 경우에, 배는 숫컷이다. 마우스에서, 바람직한 배는 또한 ES 세포 유전자에 의해 암호된 코우트 컬러와는 상이한 코우트 컬러를 암호하는 유전자를 지닌다. 이러한 방법으로, 새끼는 모자이크 코우트 컬러(ES 세포가 발달 배내로 혼입됨을 나타냄)를 찾음으로써 녹아웃 구성물의 존재에 대해서 용이하게 스크리닝될 수 있다. 따라서, 예를 들어, ES 세포주가 백색 털에 대한 유전자를 지니는 경우에, 선택된 배는 검거나 갈색에 대한 유전자를 지닐 것이다.
ES 세포가 배내로 도입된 후에, 배는 회임의 위한 위임신 양모의 자궁내로 이식될 수 있다. 양모는 전형적으로는 잘 기르고 재생하는 능력 및 새끼를 보호하는 능력에 대해서 스크리닝된다. 이러한 양모는 전형적으로는 정관 수술된 동일한 종의 숫컷과 교미시킴으로써 준비된다. 위임신 양모의 단계는 성공적인 이식에 중요하며, 종에 좌우된다. 마우스의 경우, 이러한 단계는 위임신 후 약 2 내지 3일이다.
양모에서 출생한 새끼는 코우트 컬러 선택 방법(상기 설명 및 첨부된 실시예)이 이용되는 경우에 초기에 모자이크 코우트 컬러에 대해서 스크리닝될 수 있다. 또한, 또 다른 방법으로는, 새끼의 꼬리 조직으로부터 얻은 DNA가 상기된 바와 같은 써던 블롯 및/또는 PCR을 사용함으로써 녹아웃 구성물의 존재에 대해서 스크리닝될 수 있다. 모자이크를 나타내는 새끼가 그들의 생식 세포주 내에 녹아웃 구성물을 지니는 것으로 사료되는 경우에, 동종접합 녹아웃 동물을 생성하도록 이들이 서로 교배될 수 있다. 동종접합체는 이종접합체로 공지된 마우스 및 야생형 마우스 뿐만 아니라 상기 교배에 의해 생성된 마우스로부터 얻은 동일한 양의 게놈성 DNA를 써던 블롯팅함으로써 확인될 수 있다.
녹아웃 새끼를 확인하고 특성화하는 다른 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 노턴 블롯이 녹아웃된 유전자, 마아커 유전자중 어느 하나, 또는 둘 모두를 암호하는 전사체의 존재 또는 부재에 대해서 mRNA를 검사하는데 사용될 수 있다. 또한 녹아웃된 IL-1 유전자가 발현되는 경우에, 웨스턴 블롯이 특정의 IL-1 단백질에 대한 항체, 또는 마아커 유전자 생성물에 대한 항체로 웨스턴 블롯을 검사함으로써 새끼의 다양한 조직내에서 녹아웃된 IL-1 유전자의 발현 수준을 검정하는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 새끼로부터 얻은 다양한 세포의 동일반응계내 분석(세포 고정 및 항체에 의한 표지) 및/또는 FACS(형광 활성화된 세포 소팅(sorting)) 분석방법이 녹아웃 구성물 유전자 생성물의 존재 또는 부재를 검사하도록 적합한 항체를 사용함으로써 수행될 수 있다.
녹아웃 또는 분단 형질전환된 동물을 생성시키는 또 다른 방법이 또한 일반적으로 공지되어 있다. 문헌[Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986]. 재조합효소 의존성 녹아웃이 또한 생성될 수 있는데, 예를 들어, 표적 서열이 삽입되도록 동종 재조합시켜서, IL-1 유전자 불활성화의 조직 특이적 및/또는 일시적 조절이 재조합효소 서열(이하 설명)에 의해 조절될 수 있게 함으로써 생성될 수 있다.
하나 이상의 녹아웃 구성물 및/또는 하나 이상의 트랜스진 발현 구성물을 함유하는 동물은 몇 가지 방법 중의 어떠한 방법에 의해서 준비된다. 바람직한 방법은 요구되는 형질전환된 표현형의 하나를 각각 함유하는 일련의 포유동물을 생성시키는 것이다. 그러한 동물은 녹아웃 구성물(들) 및/또는 트랜스진(들)의 존재를 제외하고는 야생형과 동일한(유전적으로 동일한) 경우에, 최종적으로는 모든 바람직한 녹아웃 구성물 및/또는 발현 구성물을 함유하는 단일의 동물이 생성되도록 일련의 교배, 역교배 및 선택을 통해서 함께 성장한다.
IL-1 트랜스진은, 안티센스 구성물 뿐만 아니라 효능제 및 길항제 둘 모두를 포함한, 야생형 단백질을 암호하거나, 이의 동족체를 암호할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 트랜스진의 발현은 예를 들어 요구되는 패턴으로의 발현을 조절하는 시스-작용 서열을 사용함으로써 세포, 조직 또는 발달 단계의 특정 서브세트로 제한된다. 본 발명에서, IL-1 단백질의 그러한 모자이크 발현은 많은 형태의 선형 분석에 기본이 될 수 있으며, 추가적으로 예를 들어 또 다른 정상의 배내의 작은 조직 패취내에서의 발달을 전체적으로 변화시킬 수 있는 IL-1 발현의 결핍 효과를 검정하는 수단을 제공할 수 있다. 그 결과, 조직 특이적 조절 서열 및 상태 조절 서열이 특정의 공간 패턴내에서 트랜스진의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 또한, 발현의 일시적인 패턴이, 예를 들어, 상태 조합 시스템 또는 원핵 전사조절 서열에 의해 제공될 수 있다.
트랜스진의 발현을 가능하게 하는 유전 기술은 본 기술분야의 전문가에게는 공지된 생체내 부위 특이적 유전 조작법을 통해서 조절될 수 있다. 예를 들어, 표적 서열의 유전적 재조합을 촉진하는 재조합효소의 조절된 발현을 가능하게 하는 유전 시스템이 이용될 수 있다. 본원에 기재된 용어 "표적 서열"은 재조합효소에 의해 유전적으로 재조합된 누클레오티드 서열을 의미한다. 표적 서열은 재조합효소 인식 서열에 의해 플랭킹되며, 일반적으로 재조합효소 활성을 발현하는 세포에서 절제되거나 전환된다. 재조합효소 촉진된 재조합은 표적 서열의 재조합이 목적 IL-1 단백질중의 한 단백질의 발현을 활성화 또는 억제하도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 길항성 동족체 또는 안티센스 전사체를 암호하는 유전자와 같은 재조합 IL-1 유전자의 발현을 간섭하는 표적 서열의 절제는 그 유전자의 발현을 활성화하도록 디자인될 수 있다. 단백질의 발현에 의한 이러한 간섭은 프로모터 구성요소 또는 내부 정지 코돈으로부터 IL-1 유전자를 공간적으로 분리시키는 바와 같은 다양한 메카니즘에 의해 발생된다. 게다가, 유전자의 암호 서열이 재조합효소 인식서열에 의해 플랭킹되며 프로모터 구성요소에 관하여 3' 내지 5' 배향으로 세포내로 트랜스펙션되는 트랜스진이 제조될 수 있다. 그러한 예에서, 표적 서열의 전환은 프로모터 유도된 전사 활성을 가능하게 하는 프로모터 구성요소에 관한 배향으로 암호서열의 5' 단부를 대체함으로써 목적 유전자를 재배향시킬 것이다.
본 발명의 형질전환된 동물은 다양한 그들의 세포내에 본 발명의 트랜스진을 모두 포함하며, 그러한 트랜스진은 세포 성장, 치사 및/또는 분화의 조절에 관하여 "숙주 세포"의 표현형을 변경시킨다. 본원에 기재된 하나 이상의 트랜스진 구성물을 사용함으로써 본 발명의 형질전환된 유기체를 생성시킬 수 있기 때문에, 형질전환된 생물체의 생성에 관한 일반적인 설명은 외인성 유전물질을 참조함으로써 이해할 수 있을 것이다. 이러한 일반적인 설명은 특정의 트랜스진 서열을 상기된 방법 및 물질을 사용함으로써 유기체내로 혼입시키기 위해서 본 기술분야의 전문가에 의해 조절될 수 있다.
예시적인 구체예에서, 박테리오파아지 P1의 cre/loxP 재조합효소 시스템[문헌: Lakso et al. (1992) PNAS 89:6232-6236; Orban et al. (1992) PNAS 89:6861-6865] 또는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 FLP 재조합 시스템[문헌: O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355; PCT publication WO 92/15694]이 생체내 부위 특이적 유전성 재조합 시스템을 생성시키는데 사용될 수 있다. Cre 재조합효소는 loxP 서열들 사이에 위치한 중재 표적 서열의 부위 특이적 재조합을 촉진한다. loxP 서열은 Cre 재조합효소가 결합하는 34 염기쌍 누클레오티드 반복 서열이고, Cre 재조합효소 중재된 유전성 재조합에 요구된다. loxP 서열의 배향은 Cre 재조합효소가 존재하는 경우에 중재 표적서열이 절제되거나 전환되는지를 측정하여[문헌: Abremski et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:1509-1514]; loxP 서열이 직접적인 반복체로서 배향되는 경우에 표적서열의 절제를 촉진하고, loxp 서열이 전환된 반복체로서 배향되는 경우에 표적 서열의 전환을 촉진한다.
따라서, 표적 서열의 유전적 재조합은 Cre 재조합효소의 발현에 좌우된다. 재조합효소의 발현은 조절성 조절, 예를 들어, 외부에서 첨가된 제제에 의해서 조직 특이적, 발달단계 특이적, 유도 가능한 또는 억제 가능한 조절의 대상인 프로모터 구성요소에 의해 조절될 수 있다. 이러한 조절된 조절은 재조합효소 발현이 프로모터 구성요소에 의해 중재되는 세포에서만 표적 서열의 유전성 재조합을 발생시킬 것이다. 따라서, 재조합 IL-1 단백질의 활성화 발현은 재조합효소 발현의 조절에 의해 조절될 수 있다.
재조합 IL-1 단백질의 발현을 조절하는데 cre/loxP 재조합효소 시스템을 사용하면 Cre 재조합효소와 대상 단백질 모두를 암호하는 트랜스진을 함유하는 형질전환된 동물의 구성이 요구된다. Cre 재조합효소 및 재조합 IL-1 유전자 모두를 함유하는 동물은 "이중" 형질전환된 동물의 구성에 의해서 제공될 수 있다. 그러한 동물을 제공하는 편리한 방법은 각각 트랜스진, 예를 들어, IL-1 유전자 및 재조합효소 유전자를 함유하는 두 마리의 형질전환된 동물을 교미시키는 것이다.
재조합효소 중재된 발현 가능한 형태에서 IL-1 트랜스진을 함유하는 형질전환된 동물을 초기에 구성시킴으로써 유도되는 한 가지 이점은 효능성이든 길항성이든 목적 단백질이 형질전환된 동물에서의 발현시에 유해할 수 있다는 점으로부터 유도된다. 이러한 예에서, 목적 트랜스진이 모든 조직에서 유지 상태인 최초 개체군은 전파되고 유지될 수 있다. 이러한 최초 개체군의 각각은 예를 들어, 하나 이상의 조직 및/또는 요구되는 일시적인 패턴으로 재조합효소를 발현하는 동물과 교배될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 길항성 IL-1 트랜스진이 휴지상태인 최초 개체군의 발생은 특정의 조직 또는 특정의 발달 단계에서 IL-1 중재된 유도의 중단이 예를 들어 치사 표현형을 발생시킬 수 있는 최초 개체군으로부터 자손을 연구하는 것을 가능하게 할 것이다.
유사한 조건부 트랜스진이 IL-1 트랜스진의 발현을 촉진하도록 동시에 발현되는 원핵 단백질을 요구하는 원핵 프로모터 서열을 사용함으로써 제공될 수 있다. 예시 목적의 프로모터 및 상응하는 트랜스 활성화 원핵성 단백질이 미국특허 제4,833,080호에 기재되어 있다.
게다가, 조건부 트랜스진의 발현은 트랜스 활성화 단백질, 예를 들어, 재조합효소 또는 원핵성 단백질을 암호하는 유전자가 세포 특이적 방법에서와 같이 조직에 전달되고 발현되게 되는 유전자 치료 유사 방법에 의해 유도될 수 있다. 이러한 방법에 의하면, IL-1A 트랜스진은 트랜스 활성화제의 유도에 의해 "턴드 온(turned-on)"될 때까지 성인기내로 휴지된 상태로 유지될 수 있다.
예시목적의 구체예에서, 본 발명의 "형질전환된 사람 이외의 동물"이 사람 이외의 동물의 생식세포주내로 트랜스진을 도입함으로써 생성된다. 다양한 발달단계의 배 표적세포가 트랜스진을 도입하는데 사용될 수 있다. 상이한 방법이 배 표적 세포의 발달단계에 따라 사용될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 사용된 동물의 특이적 세포주(들)이 일반적인 양호한 건강, 양호한 배 생성율, 배내에서의 양호한 전핵 가시성, 및 양호한 재생 적합성에 대해서 선별된다. 또한, 하플로타입(haplotype)이 중요한 인자이다. 예를 들어, 형질전환된 마우스가 생성되는 경우에, C57BL/6 또는 FVB 주와 같은 스트레인이 종종 사용된다(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). 바람직한 스트레인은 C57BL/6 또는 DBA/1과 같은 H-2b, H-2d, 또는 H-2q하플로타입을 지닌 스트레인이다. 본 발명을 실시하는데 사용된 주(들)은 자체가 트랜스진일 수 있고/거나 녹아웃(즉, 부분적으로 또는 완전히 억제된 하나 이상의 유전자를 지니는 동물로부터 얻음)일 수 있다.
한 가지 구체예에서, 트랜스진 구성물은 단일 단계의 배에 도입된다. 접합체는 미세주입에 대한 최선의 표적이다. 마우스에서, 수컷 전핵은 DNA 용액의 1-2pl의 재생 가능한 주입을 가능하게 하는 직경내에서 약 20 마이크로메터의 크기에 달한다. 유전자 전달에 대한 표적으로 접합체를 사용하는 것은 대부분의 경우에 주입된 DNA가 첫 번째 분열전에 숙주 유전자내로 혼입될 것이라는 점에서 중요한 이점이 있다[문헌: Brinster et al. (1985) PNAS 82:4438-4442]. 그 결과, 형질전환된 동물의 모든 세포가 혼입된 트랜스진을 지닐 것이다. 이러한 결과는 일반적으로 50%의 생식 세포가 트랜스진을 지닐 것이기 때문에 최초 개체군의 새끼에 대한 트랜스진의 효과적인 전달을 반영하는 것이다.
정상적으로는 수정된 배가 전핵이 나타날 때까지 적합한 배지에서 인큐베이션된다. 대체로 이러한 시점에서, 트랜스진을 포함하는 누클레오티드 서열은 상기된 암컷 또는 숫컷내로 도입된다. 마우스와 같은 일부의 종에서는, 숫컷 전핵이 바람직하다. 외인성 유전물질이 난자의 핵 또는 접합체 암컷 전핵에 의해서 처리되기 전에 접합체의 숫컷 DNA 보충물에 첨가되는 것이 가장 바람직하다. 난자 핵 또는 암컷의 전핵은, 아마도 숫컷 DNA의 프로타민을 히스톤으로 대체함으로써 숫컷 DNA 보충물에 영향을 주는 분자를 방출하여서, 암컷과 숫컷 DNA 보충물의 조합을 촉진하여 2 배체 접합체가 형성되게 하는 것으로 사료된다.
따라서, 외인성 유전물질이 암컷 전핵에 영향을 받기 전에 숫컷 DNA 보충물 또는 어떠한 다른 DNA의 보충물에 첨가되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 외인성 유전 물질은 숫컷과 암컷 전핵이 분리되고 둘 모두가 세포막에 근접되어 위치되는 때인 숫컷 전핵의 형성후에 가능한 한 빨리 초기의 숫컷 전핵에 첨가된다. 또한, 외인성 유전물질은 탈응축이 진행되도록 유도된 후에 정자의 핵에 첨가될 수 있다. 외인성 유전물질을 함유하는 정자는 이어서 난자에 첨가되거나, 탈응축된 정자가 난자에 첨가되고 그 후에 트랜스진 구성물이 가능한 한 빨리 첨가될 수 있다.
트랜스진 누클레오티드 서열을 배에 도입하는 것은, 예를 들어, 미세주입, 전기영동, 또는 지질감염과 같은 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 트랜스진 누클레오티드 서열을 배에 도입한 후에, 배는 시험관내에서 다양한 시간동안 인큐베이션되거나, 대리숙주내로 재이식될 수 있다. 한 가지 일반적인 방법은 종에 따라서 배를 시험관내에서 약 1 내지 7일 동안 인큐베이션시키고, 이들을 대리 숙주내로 재이식하는 것이다.
본 발명의 목적을 위해서, 접합체는 기본적으로는 완전한 유기체로 발달할 수 있는 2 배체 세포의 형성을 수행한다. 일반적으로는, 접합체는 배우자 또는 배우자들로부터의 두 개의 2배 핵의 융합에 의해서 자연적이거나 인공적으로 형성된 핵을 함유하는 에그(egg)를 포함할 것이다. 따라서, 배우자 핵은 자연적으로 양립성인 핵, 즉, 분화를 진행할 수 있으며 기능화 유기체로 발달할 수 있는 생존 가능한 접합체를 생성하는 핵이어야 한다. 일반적으로는, 정배수체 접합체가 바람직하다. 이수체 접합체가 얻어지는 경우에, 염색체의 수는 배우자가 기원되는 유기체의 정배수체 수에 관하여 하나 이상으로 변하지 않아야 한다.
유사한 생물학적 고찰에 추가로, 물리적인 방법이 또한 접합체의 핵 또는 접합체 핵의 일부를 형성하는 유전 물질에 첨가될 수 있는 외인성 유전물질의 양(예, 용적)을 조절한다. 유전물질이 제거되지 않는 경우에, 첨가될 수 있는 외인성 유전 물질의 양은 물리적으로 차단되지 않으면서 흡수될 수 있는 양에 의해 제한된다. 일반적으로는, 삽입된 외인성 유전물질의 용적은 약 10 피코리터를 초과하지 않을 것이다. 물리적인 첨가효과는 접합체의 생존성을 물리적으로 파괴할 만큼 크지 않아야 한다. DNA 서열의 수 및 다양성에 대한 생물학적 한계는 외인성 유전물질의 기능 및 특정 접합체에 따라 다양할 것이며, 본 기술분야의 전문가에게는 자명할 수 있는데, 그 이유는 외인성 유전물질을 포함한 생성되는 접합체의 유전물질이 기능성 유기체로의 접합체의 분화 및 발달을 생물학적으로 개시시키고 유지시킬 수 있어야 하기 때문이다.
접합체에 첨가되는 트랜스진 구성물의 복사체의 수는 첨가된 외인성 유전물질의 전체적인 양에 좌우되며, 유전성 형질전환이 가능하게 하는 양일 것이다. 이론적으로는, 하나의 복사체만이 요구되지만; 일반적으로는, 하나의 복사체가 기능성이 되게 하기 위해서는 다수의 복사체, 예를 들어, 1,000 내지 20,000의 트랜스진 구성물이 사용된다. 본 발명과 관련하여, 외인성 DNA 서열의 표현형 발현을 증진시키도록 각각의 삽입된 외인성 DNA 서열의 하나 이상의 기능화 복사체를 지니는 것이 유리할 것이다.
외인성 유전물질을 핵성 유전물질내로 첨가하는 것을 가능하게 하는 어떠한 기술이 세포, 핵 막 또는 다른 기존의 세포 또는 유전 구성물을 파괴하지 않는 한 사용될 수 있다. 외인성 유전물질은 미세주입에 의해 핵성 유전물질내로 우선적으로 삽입된다. 세포 및 세포성 구성물의 미세주입은 본 기술분야에 공지되어 있으며 사용되고 있다.
재이식은 표준방법을 사용함으로써 수행된다. 일반적으로, 대리 숙주가 마취되고, 배가 수정관내로 삽입된다. 특정의 숙주내로 이식되는 배의 수는 종에 따라 다양하지만, 일반적으로는 종이 자연적으로 생산하는 새끼의 수와 비교될 수 있을 것이다.
대리 숙주의 형질전환된 새끼는 어떠한 적합한 방법에 의해서 트랜스진의 존재 및/또는 발현에 대해서 스크리닝될 수 있다. 스크리닝은 종종 트랜스진의 적어도 일부를 보충하는 프로브를 사용함으로써 써던 블롯 또는 노턴 블롯 분석에 의해 수행된다. 트랜스진에 의해 암호된 단백질에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석이 트랜스진 생성물의 존재를 스크리닝하는 또 다른 방법 또는 추가의 방법으로 사용될 수 있다. 전형적으로는, DNA는 꼬리 조직으로부터 제조되며, 트랜스진을 위한 써던 분석 또는 PCR에 의해서 분석된다. 또한, 어떠한 조직 또는 세포형이 분석에 이용될 수 있지만, 가장 높은 수준으로 트랜스진을 발현하는 것으로 사료되는 조직 또는 세포가 써던 분석 또는 PCR을 이용한 트랜스진의 존재 및 발현에 시험된다.
트랜스진의 존재를 평가하는 또 다른 방법 또는 추가의 방법에는 효소 및/또는 면역학적 검정법, 특정의 마아커 또는 효소 활성에 대한 조직적인 염색법, 및 흐름 세포계수 분석 등과 같은 적합한 생화학적 검정법이 제한 없이 포함된다. 혈액을 분석하는 것이 다양한 형태의 혈액 세포 및 그 밖의 혈액 구성물의 수준에 대한 트랜스진의 효과를 평가할 뿐만 아니라 혈액중의 트랜스진 생성물의 존재를 검출하는 것이 유용할 수 있다.
형질전환된 동물의 자손은 형질전환된 동물을 적합한 파트너와 교미시키거나, 형질전환된 동물로부터 얻은 에그 및/또는 정자를 시험관내 수정시킴으로써 얻을 수 있다. 파트너와의 교미가 수행되는 경우에, 파트너는 트랜스진이고/거나 녹아웃일 수 있거나 그렇지 않을 수 있으며; 파트너가 트랜스진인 경우, 동이하거나 상이한 트랜스진 또는 그들 둘 모두를 함유할 수 있다. 또한, 파트너는 모체주일 수 있다. 시험관내 수정 방법이 이용되는 경우에, 수정된 배가 대리 숙주내로 이식되거나 시험관내 인큐베이션되거나, 상기 두 방법 모두가 수행될 수 있다. 상기 방법중 어느 한 방법을 이용하는 경우, 자손은 상기된 방법 또는 다른 적절한 방법으로 트랜스진의 존재에 대해서 평가될 수 있다.
본 발명에 따라 생성된 형질전환된 동물은 외인성 유전물질을 포함할 것이다. 상기된 외인성 유전물질은 특정의 구체예에서 IL-1 단백질(효능성 또는 길항성중의 어느 한 특성), 및 안티센스 전사체, 또는 IL-1 돌연변이체를 생성하는 DNA 서열일 수 있다. 또한, 그러한 구체예에서, 서열은 바람직하게는 특정 타입의 세포에서 트랜스진 생성물의 발현을 가능하게 하는 전사 조절 구성요소, 예를 들어, 프로모터에 결합될 수 있다.
레트로바이러스 감염법이 또한 사람 이외의 동물내로 트랜스진을 도입하는데 사용될 수 있다. 발달중의 사람 이외의 동물의 배는 시험관내에서 배반포 단계로 배양될 수 있다. 이러한 시간 동안에, 할구는 레트로바이러스 감염에 표적일 수 있다[문헌: Jaenich, R. (1976) PNAS73:1260-1264]. 할구의 효율적인 감염은 효소처리에 의해서 조나 펠루시다(zona pellucida) (Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986)를 제거함으로써 얻어진다. 트랜스진을 도입하는데 사용된 바이러스성 벡터 시스템은 전형적으로는 트랜스진을 함유하는 복제 결함 레트로바이러스이다[문헌: Jahner et al. (1985) PNAS 82:6927-6931; Van der Putten et al. (1985) PNAS 82:6148-6152]. 트랜스펙션은 바이러스 생성 세포의 단일층상에서 할구를 배양함으로써 용이하고 효율적으로 얻어진다[문헌: Van der Putten, supra, Stewart et al. (1987) EMBO J. 6:383-388]. 또한, 감염은 후기 단계에서 수행될 수 있다. 바이러스 또는 바이러스 생성 세포가 할강내로 주입될 수 있다[문헌: Jahner et al. (1982) Nature 298:623-628]. 대부분의 최초 개체군은 트랜스진에 대해 모자이크인데, 그 이유는 혼입이 형질전환된 사람 이외의 동물을 형성한 세포의 서브세트에서만 발생하기 때문이다. 또한, 최초 개체군은 일반적으로 새끼를 분리하는 게놈내의 상이한 위치에서 트랜스진의 다양한 레트로바이러스 삽입부를 함유할 것이다. 또한, 중회임 배의 자궁내 레트로바이러스성 감염에 의해서 생식세포주내로의 트랜스진의 도입이 가능할 수 있다(Jahner et al. (1982) supra).
트랜스진을 도입하기 위한 세 번째 형태의 표적 세포는 배성 간세포(ES)이다. ES 세포는 시험관내 배양되고 배와 융합된 예비 이식 배로부터 얻어진다[문헌: Evans et al. (1981) Nature 292:154-156; Bradley et al. (1984) Nature 309:255-258; Gossler et al. (1986) PNAS 83:9065-9069; and Robertson et al. (1986) Nature 322:445-448]. 트랜스진가 DNA 트랜스펙션 또는 레트로바이러스 중재된 형질도입에 의해서 ES 세포내로 효율적으로 도입될 수 있다. 이러한 형질전환된 ES 세포는 그 후에 사람 이외의 동물로부터의 할구와 합해질 수 있다. ES 세포는 이어서 배를 콜로니화하고, 생성되는 키메라 동물의 생식세포주에 기여한다[문헌: Jaenisch, R. (1988) Science 240:1468-1474].
4.6 약제학적 스크린
4.6.1 일반적인 설명
본 발명은 약제학적 스크린이 수행되어 IL-1 중재된 염증성 과정을 억제할 수 있는 화합물을 동정하는 다양한 형질전환된 세포주 및 유기체를 제공한다. 상기된 형질전환된 세포주 및 유기체는 하나 이상의 내인성 IL-1 길항화 유전자 활성이 결핍되게 조작된다. 내인성 IL-1 효능제 활성(예, IL-1 알파 및 IL-1 베타)의 증가는 일반적으로 "급성상 반응"을 유도한다. 이러한 급성상 반응은 또한 상기된 다양한 염증성 질환 및 상태의 특징이 있는 과정을 포함한 염증성 과정을 개시시킨다. 이러한 급성상 반응은 혈청 단백질 SAP(마우스에서) 및 CRP(사람에서)를 포함한 다양한 급성상 마아커의 생성에 의해서 특성화된다. 이러한 다양한 염증성 질환 과정을 개시시키는데 있어서의 급성상 반응의 생식 특성이 IL-1 중재된 염증성 질환 과정을 길항할 수 있는 피검 약물 화합물 검정에서 급성상 마아커의 사용을 가능하게 한다.
4.6.2 급성상 반응
급성상 반응은 염증성 자극에 대한 반응으로 활성화된 단핵 식세포, 임파구 및 그 밖의 분화된 세포형에 의해 생성된 시토킨에 의해 트리거(triggered)된다. 시토킨은 추가의 시토킨을 생성하는 일부의 세포를 포함한 표적 세포를 국소적으로 및 전신적으로 회복시키고 활성화시키는 작용을 한다. 이러한 작용은 유도된 다양한 시토킨에 의해서 기본적으로 조절되고 조화된 케스케이드를 생성시킨다. 표적 세포 및 조직의 이어지는 활성화 및 증식과 함께 세포 표현형에서의 변화는 염증성 제제를 중화시키고 복구과정 및 항상성으로의 복귀를 촉진함으로써 숙주의 생존을 증진시킨다. 이러한 부분이 인터루킨-1(IL-1)을 포함한 염증성 시토킨의 부분 및 전신 효과에 대한 본 발명자들의 이해가 집중되는 부분이다.
인터루킨-1은 일반적으로 급성상 반응의 개시 및 유지에 가장 중요한 전염증성 시토킨으로 여겨진다. 열을 유도하는 능력을 근거로 하여 본래 '내인성피로겐'이라 명명되었던 IL-1은, 과거 20 여년 이상에 걸쳐서, 이의 다수의 생물학적 활성을 근거로 하여 다른 두문자 용어를 가지고 있다. 이러한 용어에는 흉선세포 활성화 및 증식을 유도하는 이의 능력을 반영하는 임파구 활성화 인자, 흉선세포 증식 인자, 및 헬퍼 피크-1(helper peak-1); 혈장세포의 직접적인 활성화를 자극하는 이의 능력을 반영하는 B 세포 활성화 인자; 급성상 단백질 합성을 유도하는 이의 능력을 반영하는 백혈구 내인성 중재제; 및 광범위한 범위의 추가의 생리학적 과정에서의 역할을 반영하는 단핵 세포 인자, 모노컷(monocute) 유도된 회복 활성, 분해산물, 파골세포 활성화 인자, 및 헤모포이에틴-I이 포함된다. 상기 작용 모두는 결과적으로는 포괄적으로 인터루킨-I이라 일컬어지는 17.5kDa 단백질에 기인된다[문헌: Aarden, et al. (1979) J. Immunol, 123:2928-9]. 사람 IL-1의 두 가지 이소형, 즉, pI 5.0의 IL-Iα 및 pI 7.0의 IL-Iβ가 있다. 두 가지 모두의 이소형은 클로닝되고 서열화되어, 두 가지 모두의 분자가 성숙한 1.75kDa 생성물로 처리되는 약 31 kDa의 프로펩티드로서 합성된다. 프로펩티드로부터의 성숙한 IL-1β 분자의 생성에는 최근 분자 수준으로 정의된 특이적인 독특한 효소, 즉 인터루킨-1β 전환 효소에 의해 중재되는 단백질 가수분해 분열이 요구된다. 이러한 효소의 존재는 이러한 시토킨의 활성형의 생성을 조절하는 정확한 조절 메카니즘을 포함하며, 이의 생성 및 다른 활성 염증성 중재제가 특이적 및 미세하게 동조된 조절 경로에 대한 대상이라는 것을 나타낸다.
IL-1은 일차적으로는 적절한 자극 시그날이 주어진 활성화된 단핵 식세포의 생성물로 여겨지지만, 임파구(헬퍼 T 세포, B 세포, NK 세포, 호중구, 및 거대 과립성 립프구); 혈관 세포(평활근 및 내피세포); 각막 및 흉선의 상피세포; 피부세포(케라틴세포, 랑게르한스 세포); 뇌세포(성상세포, 소교 세포, 교종 세포); 수지상 세포; 신장의 맥관막 세포; 섬유아세포; 및 연골세포를 포함한 많은 다른 분화된 세포형에 의해서 합성된다. 단핵 식세포는 T 세포(항원 존재 동안), 바이러스, 박테리아, 항원-항체 복합체 및 어떠한 화학약품과의 접촉과 같은 많은 활성화 자극에 의해서 IL-1을 생성하도록 자극될 수 있다.
IL-1은 또한 시상하부를 자극하고 프로스타글란딘으로 상승작용시킴으로써 중추신경계(CNS)상에서 직접적으로 작용하여, 뇌에서의 열조절 뉴우런의 작용속도를 조절하고 열을 발생시킨다. 이러한 결과는 글루코코르티코스테로이드(glucocorticosteroid)를 합성시키는 부신피질자극 호르몬(ACTH)과 코르티코트로핀 방출 인자(CRF)의 생성을 유도한다. IL-1에 의한 글루코코르티코스테로이드의 상승된 수준의 유도는 이어서 음성 피드백 조절 루프를 생성시키는데, 그 이유는 활성화된 대식세포내의 IL-1 합성이 글루코코르티코스테로이드에 의해서 억제되기 때문이다. 상기 케스케이드 및 이의 전염증성 속발증의 개시가, 중단되지 않는 경우, 항상성으로의 회복을 유도하는 프로그램을 구성한다. 현저하게는, 뇌에서의 인터루킨-1의 또 다른 활성은 베타-아밀로이드 전구체 프로모터의 자극이며[문헌: Donnelly et al. (1990) Cell Mol Neurobiol, 10:485-95], 이러한 사항은 알쯔하이머 질환과 IL-1 중재된 염증성 과정 사이의 관련을 제시한다.
항상성으로의 복귀는 또한 인터루킨-I 수용체 길항제 단백질(IL-1RN/IL-1 ra/IRAP)의 유도, 가능하게는 IL-1 자체에 의한 유도에 의해서 촉진될 것이다. IL-1RN은 표적 세포상의 IL-1 수용체에 대한 결합에 의해서 IL-1 효능제 활성을 억제하여, 수용체를 통한 IL-1의 결합 및 이어지는 시그날의 형질도입을 차단한다[문헌: Hannum et al. (1990) Nature 343:336-41]. IL-1RN은 급성상 반응물의 간장성 합성이 최대인 때에 실험적으로 유도된 염증을 진행하는 마우스의 간에서 증가된 수준으로 합성된다[문헌: Zahedi, et al. (1991) J Immunol, 146:4228-33]. 길항제의 유도는 따라서 IL-1(및 다른 시토킨)의 전염증성 역할이 충족되는 경우에 전신성 급성상 반응과 함께 일어난다.
급성상 반응 동안에, IL-1은 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포상에서 직접적으로 작용하거나, 표적세포에 추가의 양성 또는 음성 조절 시그날을 제공할 수 있는 다른 시토킨의 합성을 간접적으로 유도함으로써 표적 세포를 자극하여 세포 중재된 반응, 호르몬 반응 및 천연의 면역 반응을 트리거한다. IL-1은 또한 B 세포 성숙 및 항체 생성에 중요하다. 순환성 IL-1은 성숙한 호중구를 골수로부터 혈류내로 방출하는 것을 촉진하고 화학유인제로서 작용하여 호중구, T 세포 및 염증성 부위에 대한 단구를 유인함으로써 세포성 유통을 조절한다. 염증성 부위에서, IL-1은 섬유아세포 및 상피세포의 증식을 유도하고 내피세포와 상피세포상에서 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 합성을 유도함으로써 조직손상 부위에 대한 임파구의 유착을 증진시킨다. IL-1은 응고인자, 플라스미노겐 활성화제 및 이의 억제제, 응혈촉진제, 혈소판 활성화 인자, 교원질 및 교원효소의 합성을 자극함으로써 상처 치유를 촉진한다.
간단히 설명하면, IL-1은 일반적으로 더 많은 IL-1 및/또는 다른 시토킨을 제조하는 다양한 세포를 신호하고; CNS를 자극하고; 간장성 APR 합성을 유도하고; 염증의 부위에서 신호하는 국소 세포를 조절함으로써 다수 기능성 호르몬으로 작용한다.
시토킨은 먼저 표적 세포 표면상의 특이적 수용체에 결합함으로써 표적 세포에서 유전자 발현을 조절한다. 리간드 수용체 복합체가 이어서 혈장 막의 내면으로부터 핵으로 형질도입되는 시그날을 제공한다. 이러한 시그날이 형질도입되는 메카니즘은 표적세포에 특이적일 수 있다.
IL-1에 대한 두 가지의 독특한 막 수용체[문헌: Chizzonite, et al. (1989) Proc Nat Acad Sci USA 86:8029-33], 즉, T 세포, 섬유아세포 및 연결성 조직 세포상에 존재하는 80kDa(타입 1) 수용체와 B 세포상에서만 발견되는 67 kDa (타입 2) 수용체가 있다. 두 수용체 모두가 세포외 도메인, 짧은 경막 도메인, 및 세포질성 도메인을 지닌다. 둘 모두가 IL-1α와 IL-1β와 결합하지만, 80 kDa 수용체만이 IL-1 수용체 길항제 단백질(IL-1RN)과 상호작용할 수 있다[문헌:Hannum et al. (1990) Nature 343:336-41].
시토킨은 둘 이상의 주요 경로를 통해서 단백질 키나제를 활성화시킴으로써 세포활성을 조절한다. 하나의 경로는 ATP를 cAMP, 즉 막 아데닐 시크라제에 의해 생성되는 제 2 메신저로 전환시키는데 관련이 있다. 다른 메카니즘은 디아실글리세롤(DAG)과 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트(IP3)을 생성하는 포스포리파제 C에 의해서 막 지질 플리오스파티딜이노시톨-4,5-트리포스페이트의 가수분해와 관련이 있다. 포스포이노시티드 가수분해는 단백질 키나아제 C에 결합하는 DAG를 생성시킨다. 활성화된 cAMP와 DAG는 각각 단백질 키나아제 A와 C의 활성을 변화시킬 수 있다. IL-1 시그날 형질도입에 있어서, 일부 연구자들은 제 2 메신저로서 cAMP 또는 DAG의 관련을 보고하고 있는데, 다른 연구자들은 둘 중 어느 하나의 관련을 논의하고 있다. 이러한 반대 의견은 IL-1 반응성 유전자의 활성화가 상이한 세포형에서의 상이한 시그날링 경로를 통해서 발생되는지 그렇지 않은지에 까지 확대되고 있다. 최근의 증거는 섬유아세포와 결합성 조직 세포에서 IL-1 반응성 유전자의 활성화를 유도하는 시그날 형질도입 경로가 세린 키나아제에 의해 중재된 포스포릴화와 관련됨을 제시하고 있다[문헌: Kanakaraj, et al. (1998) J Exp Med 15:2073-9].
많은 수용체-리간드 복합체가 GTP와 결합하고 시그날을 채워진 수용체로부터 아데닐레이트 시클라제, 포스포리파제 C 또는 포스포리파제 A2와 같은 이펙터 효소로 형질도입하는 구아노신 누클레오티드 결합 단백질(G 단백질, 예를 들어, Gs, Gi, Go, Gt)에 결합된다. G 단백질은 포스포리파제 C 활성의 조절에 의한 DAG의 생성을 중재하는데 관련이 있다. G 단백질의 활성화는 증진된 GTP 결합 및 GTPase 활성에 의해 수행되며, IL-1 시그날 형질도입에서의 이들의 역할은 방사성 표지된 GTP 유사체를 사용하거나 IL-1 처리된 세포 또는 막 제제에서 GTP 가수분해를 측정함으로써 실험적으로 분석할 수 있다. 대부분의 수용체-리간드 복합체의 경우에, 백일해 독소(IAP)로 세포를 전처리하면 G 단백질이 분리된다. 이러한 분리는 '전형적인' G 단백질의 경우에 있어서 독소의 A 서브단위에 의한 ADP의 리보실화에 기인된다. IL-1α와 IL-1β는 GTP(64)에 대한 증가된 친화성에 기인된 흉선종 세포로부터 제조된 막에서 G 단백질의 작용 및 GTPase 활성을 증가시킨다. 무상의 백일해 독소로 B 세포와 흉선종을 전처리하면 IL-1 유도된 G 단백질 활성이 부분적으로 억제된다. 그러나, ADP 리보실화 활성을 지니지 않는 독소의 B 서브단위가 무상의 백일해 독소 만큼 효율적으로 G 단백질 활성화를 억제한다. IL-1에 의한 G 단백질 활성화의 억제는 그로 인해서 ADP 리보실화에 기여하지 않는다. 따라서, IL-1 시그날 형질도입의 백일해 독소 억제는 G 단백질의 불활성화와 관련이 없지만, 일부 다른 'G-유사' 단백질의 불활성화에 기인될 수 있는 듯하다. 그러한 비전형적인 백일해 민감성 G 단백질 활성화가 IL-2, TNF, 및 GM-CSF 시그날링 메카니즘을 입증하고 있다.
IL-1 시그날 형질도입에 요구된 초기 시그날은 논쟁에 대상이 되고 있지만, IL-1 수용체 상호작용에 이어지는 APR RNA의 증가된 전사는 IL-1 반응성 유전자의 5' 조절 영역에 결합하는 인자의 활성화를 요구한다. 세포질 전사 인자 핵 인자 카파 B (NFκB)의 활성화는 IL-1 유도된 포스포릴화 및 이와 연관된 억제제 단백질 IκB의 분해를 통해서 이루어져서, 핵이 유입되게 하고 DNA에 결합되게 한다. NFκB는 다수의 APR 유전자의 IL-1 유도된 유전자 활성화에서 중요하게 관련된다. 따라서, IL-1 시그날링은 기존의 전사 인자의 유통을 포함한다. 또한, IL-1 반응성 유전자에서의 유전자 발현의 도입은 프로모터내의 AP1 부위에 결합하는 전사 인자 c-fos/c-jun을 활성화하는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)로 달성될 수 있다. PMA와 IL-1 둘 모두는 이들 DNA 결합 단백질의 합성을 자극할 수 있기 때문에, 전사인자의 절대적인 수준을 증가시키는 IL-1의 능력은 유전자발형의 추가의 조절 수단이다.
급성상 반응의 가장 중요한 결과중 하나는 라디칼적으로 변경된 간의 생합성 특징이다. 정상적인 상태에서, 간은 특정 범위의 혈장 단백질을 일정한 상태의 농도로 합성한다. 많은 이러한 단백질은 급성상 반응 동안 요구되며 이어서 염증성 자극후에 유도되는 중요한 기능을 지닌다. 반면에, 특정의 알부민에서 다른 것들은 하향 조절되어 유도된 '급성상 반응물'(APR)을 합성하는 간의 능력을 향상시킨다. APR은 숙주 방어에 기여하는 광범위한 활성을 지니며; 면역반응을 자극하고 그에 관여하며; 기본적인 보조인자와 세포형을 격리시키고 그들을 조직손상 부위로 유도하며; 염증성 제제를 직접적으로 중화시키고, 조직손상의 범위를 국소적으로 최소화하는데 도움을 주며; 조직 복구 및 재생에 관여한다.
급성상 동안에 혈장 농도를 증가시키는 보충, 응고, 및 접촉(키닌 형성) 케스케이드에 관여하는 단백질은 침습하는 미세 유기체를 파괴하는 숙주의 능력을 증진시키고 기본적인 혈액 응고 성분을 제공한다. 유도된 보충 성분에는 C2, C3, C4, C9, C4 결합 단백질(C4bp), 및 인자 B가 포함된다. 이들의 세포용해 활성에 추가로, 보충 단백질은 천연의 면역성에서 광범위한 범위의 활성을 지닌다. 보충 케스케이드의 활성화는 궁극적으로는 감염성 제제의 치사, 외래물질의 및 숙주세포 단편의 제거, 및 손상된 조직의 복구에 관여하는 호중구, 대식세포 및 혈장 단백질의 국소 축적을 유도한다. 피브리노겐, 즉, 응혈 형성 단백질 피브린의 전구체의 혈장 수준은 급성상 반응 동안에 증가하여[문헌: Mossensson and Doolite (1983) Ann NY Acad Sci, 408: 1-672], 국소 조직 손상 및 병원체의 유입을 제한하고, 상처 치유를 촉진하는데 관련된 중요한 단백질중의 한 단백질의 앰플 공급원을 제공한다. 피브리노겐 수준은 또한 '적혈구 침강율', 즉 염증의 중요한 지표를 측정하는데 임상적으로 유용한데, 그 이유는 피브리노겐의 절대적인 농도가 적혈구가 침강하는 비율과 관련되기 때문이다.
다양한 단백질분해효소 억제제로는 α1-항트립신, α1-안티키모트립신, α2-안티플라스민, Cl 억제제, 및 인터-α-트립신 억제제가 있다. 이들 억제제는 대식세포 및 호중구의 유입 및 활성화후에 분비된 리포좀성 가수분해효소를 중화시키는 것을 돕는다. 따라서, 건강한 숙주 조직에 대한 부적절한 부차적인 손상이 최소 상태로 유지되게 한다.
합토글로린, 헤모펙신 및 세룰로플라스민과 같은 금속 수송 단백질의 혈장 수준은 급성상 반응 동안 증가된다. 합토글로빈과 헤모펙신은 각각 헤모글로빈과 헴(haem) 잔기와 결합하고 감염 및 손상 동안 철의 손실을 방지한다. 또한, 이들은 박테리아에 의해 흡수될 수 있는 헴 철의 수준을 최소화하여, 필수 영양소중의 감염성 제제를 탈취하고, 또한 감염에 대한 숙주내성을 증가시킨다. 세룰로플라스민은 구리 및 철의 수송에 관여하고 추가의 조직 손상을 유발시키는 대식세포 및 호중구에 의해 방출된 산소 유리 라디칼의 제거를 위한 스캐빈저로 작용한다.
혈장 단백질 알부민, 전알부민, 트랜스페린, 아포리포단백질 A1, 및 아포리포단백질 AII는 급성상 반응 동안에 증가하고, 그로 인해서 '음성 APRs'라 일컬어진다.
APRs의 서브세트는 대량으로 유도된다. 종에 따라서 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA) 및 펜트락신 중 하나, C-반응성 단백질(CRP) 또는 혈청 아밀로이드 P 성분(SAP)중의 어느 하나가 염증 동안에 천배까지 증가한다. 이러한 '주요' APRs는 뒷부분에서 보다 상세히 설명된다.
각각의 APRs의 혈장 농도의 변화는 가변성이며, 급성상 반응에 효과적으로 관여하는데 요구되는 각각의 단백질의 양의 차이를 반영할 수 있다. APR 혈장 농도의 증가량은 단지 50%(세룰로플라스민, C3)로부터, 중간적으로는 2 내지 4배(단백질분해효소 억제제, 합토글로빈, 피브리노겐)까지, 또한 1000 배(CRP, SAA) 이상까지 다양하다[문헌: Kushner et al. (1982) Ann NY Acad Sci, 389:235-74]. 사람 APR 유도의 운동학은 처음 급성 자극 후 12 시간 이내의 CRP, SAA, 및 α1-안티키모트립신의 증가된 혈장수준, 이어지는 24 시간 후에 증가하는 α1-안티트립신, α1-산 당단백질, 합토글로빈, 및 인자 B 수준에 의해서 특성화된다. CRP 및 SSA 단백질은 아주 짧은 반감기(5 내지 7일)를 나타내는 반면에, 대부분의 APRs는 3 내지 5일의 반감기를 나타낸다[문헌: Laurent (1989) Acute phase proteins in the acute phase response (Springer-Verlag) pp. 150-160]. 급성상 반응 후에, APRs의 혈장 농도는 이들의 정상적인 값으로 회복되지만; APRs는 만성 염증의 경우에 무한하게 상승된 수준으로 유지된다. 다양한 감염성 질환 및 염증성 상태에서의 급성상 반응의 패턴은 다른 연구자들에 의해서 광범위하게 검토되고 있다.
상이한 종에서의 APR은 고도의 구조 및 기능적 동족성을 공유하지만, APR 유도 프로필은 종들 사이에서 아주 상이하다. 예를 들어, 인체에서는 SAP가 아닌 CRP가 주요 APR이고; 반면에, 마우스(실험적으로 유도된 염증)에서는, SAP가 주요 APR이며, CRP는 단지 마이너 APR이다[문헌: Pepys and Baltz (1983) Adv Immunol 34: 141-212]. 사람, 마우스 및 토끼는 급성상 반응 동안에 상당한 SAA 유도를 나타내지만, 래트는 그렇지 못하다. 게다가, 단백질분해효소 억제제 α2-고분자글로불린은 급성상 반응 동안에 사람에서는 혈장농도가 증가하지 않지만, 마우스 및 래트에서는 APR이 현저하게 유도된다[문헌:Lonberg-Hom et al. (1987) J Biol Chem 262: 438-45].
IL-1 중재된 염증을 억제하는데 있어서 피검 약물 화합물의 효과를 모니터링할 수 있는 이용 가능한 급성상 반응 마아커를 하기 표 1에 요약한다. 바람직한 급성상 마아커는 IL-1 유도 후에 발현을 최대로 증진시키는 마아커이다.
급성상 반응물 및 급성상 반응 동안 혈장농도의 상대적인 변화
급성상 반응물 변화 배수
보충 및 응혈 성분C2C3C4C4 결합 단백질(C4bp)C9인자 B(FB)피브리노겐(FGN) ++++++++++++++
단백질분해효소 억제제α2-안티플라스민(α22AP)α1-안티트립신(α1AT)α1-안티키모트립신(α1ACT)Cl 억제제(Clinh)인터-α-트립신 억제제(IαTinh) ++++++++++++
금속 수송 단백질세룰로플라스민(CER)합토글로빈(HP)헤모펙신(HXN) +++++++
주요 APRα1-산 당단백질(α1AGP)C-반응성 단백질(CRP)혈청 아밀로이드(SAA) +++++++++++
음성 APR알부민(Alb)아포리포단백질 AI(ApoAI)아포리포단백질 AII(ApoAII)트랜스페린(TFN) ----
+, <1.5-배 증가; ++, 1.5 내지 2-배 증가;+++, 2 내지 5-배 증가; ++++, >1000-배 증가;-1.5 내지 2-배 감소
생체내 염증성 자극에 의한 APR 생합성의 양 및 운동학은 대부분 절지 설치류 모델을 시용한 연구를 근거로 한다. 초기의 연구에서는, 토끼와 마우스에게 테레빈, 아조카제인, 또는 티오글리콜레이트와 같은 염증성 화학 자극제 또는 박테리아성 리포폴리사카라이드(LPS)를 주입하여, APR 단백질 및 MRNA의 혈장 및 조직 수준을 측정하였다. 정제된 시토킨 및 재조합 시토킨이 그 후에 이용 가능하게 되며, 일반적으로 급성상 반응, 및 APR 합성에 대한 각각의 시토킨의 효과가 생체내 분석되게 하였다. 그러나, 이들의 연구는 시험 하에서의 제제의 적접적인 효과에 이차적이거나 속발성인 반응 스펙트럼(상기 기재됨)을 생성하는 시토킨에 의해 유발된 추가의 염증성 과정에 의해서 복잡하다. 일차적인 간세포 배양은 많은 연구자들에 의해서 사용되었지만; 간 세포 배양물이 시험 시토킨에 의해 자극되어, 분석되는 중재자와 상승작용하거나 이를 억제할 수 있는 추가의 인자를 생성하게 할 수 있는 섬유아세포 및 쿠퍼(Kupffer) 세포와 같은 많은 다른 세포형을 함유할 수 있기 때문에 이들의 연구에서 일차적인 효과와 이차적인 효과 사이를 구분하는 것이 어려울 때가 있다. PLC/PRF/5, HepG2, Hep3B, 및 HuH-7과 같은 배양된 간암 세포주는 배양 조건하에 염증성 중재제에 의한 각각의 APR 유전자를 연구하기에 유용한 모델을 제공한다. 그러나, 이들 세포주에 의해서 발현된 APR은 유도되는 이들의 능력 및 이들의 유도량에 있어서 시토킨 처리에 대해 아주 상이하게 반응할 수 있으며, 일부의 경우에는 다른 연구자들이 동일한 세포주를 사용하여 대립되는 결과를 보고한 바 있다. 사람 간암/간 세포 배양물은 그럼에도 불구하고 w 한정된 시토킨 단독으로 일반적인 메카니즘 연구에 대한 유용한 모델을 제공하거나, 조합물로 사람 APR 유전자 발현을 변화시킨다.
상이한 염증성 중재제에 대한 각각의 APR의 분화 반응이 표 2에 요약되어 있다[문헌:Gauldie (1989) Acute phase proteins in the acute phase response. pp. 1-22 Springer-Verlag]. IL-1, IL-6, 및 TNF는 각각 많은 사람 APR(예, α1-안티키모트립신, α1- 산 당단백질, 세룰로플라스민, C3, 인자 B, SAA)의 생합성을 유도하고, 다른 것들(예, 알파 태아 단백질)의 생합성을 감소시킬 수 있다. IL-6 또는 TNF는 아니지만 IL-1은 또한 사람 간암 세포내의 Cl 억제제 및 SAP의 합성을 감소시킨다. 다른 APR의 합성에 관해서는, 각각의 이들 시토킨에 대한 간암 세포의 반응은 이종성이며; 일부 APRS에 있어서는, 생합성이 IL-1이 아닌 IL-6에 의해서만 유도된다(예, C4bp, SAP, 헤모펙신, 합토글로빈, 피브리노겐). 세포를 IL-1과 IL-6로 공동 처리하면 일부 APR 유전자에 대해서 추가 또는 상승성 효과가 있다(α-산 당단백질, CRP, C3, 인자 B, 합토글로빈, SAA). 또한 하나의 시토킨은 유도성 시토킨의 작용을 압도하는 억제효과를 나타낼 수 있는데; 예를 들어, IL-1 및 TNF는 각각 IL-6에 의해서 Cl 억제제 및 SAP 합성의 상향 조절을 억제하고, CRP, 합토글로빈, 피브리노겐, 및 SAA 합성의 상향 조절을 억제할 수 있다.
상이한 시토킨에 의한 다양한 급성상 반응물의 조절
IL-1 IL-6 TNFA TGFβ IFNγ
α1ACTα1AGPα1ATαFPAlbApoAIApoAIIClinhC2C3C4C4bpCERCRPFBFGNFNH PHXN1αtinhSAASAPTEN ++----+++++++-- +++--+++++++--++++-- +++++++----+-- +-------- --+--++++--+
+, 상향 조절; --, 하향 조절. 부호가 없는 것은 변화가 없거나 시험되지 않은 것이다. 약자에 대해서는 표 1을 참조하면 된다.
글루코코르티코스테로이드 덱사메타손은 일반적으로 자체상에서 APR을 유도할 수는 없지만, 세포배양 시스템(80)에서 시토킨에 대한 일부의 APR 반응을 증진시킨다. 이러한 결과는 급성상 반응의 중요한 특징을 증폭시키는 것인데: 상기된 바와 같이, IL-1은 CNS를 자극하여서, 간에서 APR 합성을 유도하는 IL-1의 능력을 증진시켜는 글루코코르티코스테로이드를 생성시키면서, 활성화된 단구에 의한 추가의 IL-1 합성을 하향 조절한다. 덱사메타손, 즉, 합성 글루코코르티코스테로이드는 따라서 실험적 시토킨 처리원안에 적절한 생리학적 농도로 통상적으로 포함되어 이들의 유도성 효과를 증명한다.
IFNγ는 APR 합성에 대해서 IL-1, IL-6, 및 TNF 보다 제한된 효과를 나타낸다. IFNγ APR 유도에 대한 대부분의 연구는 목적하는 APR 유전자로 트랜스펙션된 마우스 L 세포를 사용한다. 이들의 연구에서, SAA, C2 및 인자 B, 및 C4의 생합성이 유도될 수 있다. IFNY는 또한 일차 단구에서 사람 인자 B 및 C2 유전자의 합성을 유도한다. IFNγ가 세포성 시토킨 수용체의 수를 조절함으로써 간접적으로 간 세포 반응성을 변경하는 것으로 제시되고 있다. TGFβ는 또한 많은 APR의 합성을 조절하는 것으로 최근에 밝혀졌다.
혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA), C-반응성 단백질(CRP), 및 혈청 아밀로이드 P 성분(SAP)은 급성상 동안에 이들의 정상적인 혈장 농도의 천배까지 유도될 수 있으며[문헌: Kushner, et al. (1982) Ann NY Acad Sci 389:235-74], 그로 인해서, 독특한 APR의 서브그룹을 구성한다. 이들은 종종 '주요' 급성상 단백질이라 일컬어진다. SAA, CRP, 및 SAP에 대한 연구는 APR 발현의 구성, 구조, 기능 및 조절에 관한 연구에 의한 많은 도전을 예시하고 있다. 이들 주요 APR의 생합성에서의 극단적인 변화는 이들이 상당한 생물학적 특징이 있다는 것을 나타낸다. 이들의 정확한 생리학적 역할은 아직 밝혀지지 않았으며 상당한 논쟁의 대상이지만, 이들의 짧은 반감기(약 6시간, 다른 APR의 반감기는 일수로 측정됨)와 함께 급성상 자극 후의 이들의 유도 속도 및 양은 숙주방어의 확립에서 아주 초기에 이들 단백질에 대한 특정의 요건이 있다는 것을 시사한다. 따라서 이들은 임상적으로 상당히 중요한 듯하며 중요한 보호 역할을 하는 듯하다.
CRP와 SAP는 펜트락신(pentraxin), 즉, 디스크로 배열된 특이적 오량체 형태의 5개의 서브단위를 지닌 단백질이다. 일반적으로 단지 하나의 펜트락신이 주어진 종에서 주요 APR이고, 다른 것들은 기본적으로 구성적으로 발현된다. 사람[문헌: Kushner, et al. (1978) J Clin Invest 61:235-42]과 토끼에서는 CRP가 유도 가능한 펜트락신이지만, 마우스에서는 SAP이다[문헌: Pepys et al. (1979) Nature 278:259-61]. 펜트락신의 종 특이적 또다른 발현의 자명한 패러독스는 염증 동안의 급성상 펜트락신에 대한 요건이 유도된 특정 분자에서 조사된 어떠한 공통적인 생리학적 활성과 부합되는 듯하지만, 풀리지 않고 있다. 이러한 공통의 기능이 아직 밝혀지지 않고 있다.
CRP는 본래 폐렴구균의 C-폴리사카라이드를 결합하는 이의 능력과 관련하여 명명되었다. 후에 이것은 박테리아, 기생충, 및 면역 복합체에 대한 옵소닌으로 시험관내 작용하는 것으로 밝혀졌으며; 또한, 보충 케스케이드를 개시할 수 있고, 대식세포 종양치사 활성을 증진시킬 수 있다. 급성 상 자극에 대한 CRP의 정확한 반응성과 이의 광범위한 농도범위는 각각의 측정치와 함께, 염증의 중증도 및 질환치료 효율을 정확하게 모니터링하는데 사용되는 CRP 혈장 수준을 유도한다.
SAP는 본래 혈청에서 발견되고 아밀로이드 P(AP) 성분(90)의 순환형이기 때문에 명명된 명칭이었다. AP는 만성의 재발성 염증성 질환 범위의 가끔 발생되는 결과인 아밀로이드 침착의 두 가지의 주요 구성물중 하나이다. 이것은 기저막의 정상적인 성분이며 피브로넥틴에 결합하는 능력을 보유하고 있다. CRP와는 달리, AP는 면역 관련된 기능이 명백하지 않다.
CRP와 SAP는 약 50%의 아미노산 상동성을 나타내어, 이들의 전체 구조적인 유사성에 관한 관련성을 확인시키고 있다. CRP와 SAP를 암호하는 유전자는 사람과 마우스에서 밀접한 물리적 및 유적적 관련을 지니고 있다. 이들은 두 종 모두에서 신테닉(syntenic) 영역으로서, 사람과 마우스에서 각각 염색체 1의 밴드 q2.1과 염색체 1의 후위 일부을 지도로 나타내고 있다. 두 종 모두에서의 플랭킹 유전자좌는 면역 및 염증 관련된 역할을 하는 많은 유전자를 포함한다: 오늘날 까지의 모든 Fc 수용체가 마우스에서 인터페론 유도 가능한 생성물의 그룹을 지니는 바와 동일한 영역으로 지도화되어 있다. 따라서 펜트락신 유전자 주위의 전체적인 영역은 본 발명의 발명자들 및 다른 연구자들에 의해서 입증되고 있다. 많은 포유동물 종으로부터의 CRP와 SAP가 클로닝되고 서열화되어 있다. 컴퓨터 기재 진화 분석에서는 이들의 유전자가 포유동물 진화에서 초기에 공통 조상(약 2 억만년전, 우경학적 포유류와 유대류의 분기 시점 전에)의 펜트락신 유전자로부터 복제되었을 가능성을 밝히고 있다. 단백질은 포유류에서 유전자 복제의 대부분의 다른 생성물의 속도에 2배로 진화한다. 급성상 반응 동안에 보호 기능을 부여하는데 기본적인 추정성 펜트락신 활성을 확인하기 위한 추가의 연구는 따라서 전체로서 CRP와 SAP에 의해 나타난 것보다 더 높은 수준의 유사성을 보유하는 분자의 영역에 대해서 이루어져야 한다. 한가지 피검 활성은 크로마틴에 결합하는 두 가지 모두의 펜트락신의 능력에 의해 제시되고 있다. 염증 동안 회저성 조직으로부터 방출된 핵 물질에 결합하고 그을 제거하는 능력은 핵 항원에 대해서 유도된 자가면역과정의 개시를 방해하는 효율적인 수단을 제공할 수 있으며, 적어도 부분적으로 염증 동안의 높은 순환 수준의 펜트락신의 요구된 존재를 설명할 수 있다.
CRP와 SAP의 급성상 발현이 생체내 및 시험과내에서 광범위하게 연구되고 있다. 최근의 연구에서는, 예를 들어, 티오글리콜레이트의 복강내 주입 또는 아조카제인의 피하주입을 통한 일회 실험의 급성상 자극이 주어진 마우스는 2 내지 4 시간 내에 간장 SAP mRNA 수준의 상당한 증가 및 8 내지 12 시간에서의 피크 농도를 나타낸다. 이들은 24 내지 36 시간 주위에서 최대를 나타내는 상당히 상승된 순환 SAP 단백질 수준을 나타낸다. 간장 mRNA 및 혈장 단백질 둘 모두의 바탕 수준은 급성상 반응의 일시적인 특성에 따라서 72 시간까지 회복된다. SAP MRNA 및 단백질 유도의 양 및 운동학은 자극 특이적이어서, 시토킨 케스케이드 및 후속 전염증성 시그날링을 변화시키고 감소시키며 중단시키는 역균형 조절은 그 자체가 정확한 조절에 대한 대상이고 단순히 예비설정 프로그램을 따르지 않는다는 것을 나타낸다.
단구 조절된 배지와 재조합 IL-1β 및 재조합 IL-6와 같은 염증성 중재제로 처리된 사람 간암 배양물을 사용한 시험관내 연구는 펜트락신 발현 수준을 측정하는데 있어서 중요한 고유의 유전적 구성요소와 생합성 조절자중의 일부를 밝혀내고 있다. 이러한 연구에서 CRP mRNA와 단백질 합성은 IL-6에 의해 유도된다. IL-1β 단독으로 현저한 변화는 유도되지 않지만, IL-6와의 조합에서는 IL-6 단독에 의한 반응과는 비교되는 상당히 증진된 반응이 일어난다. IL-6 반응 구성요소의 위치는 CRP 프로모터에서 작도된다. SAP mRNA는 재조합 IL-6로 처리된 사람 PLC/PRF/5 세포에서 유도될 수 있으며; 재조합 IL-1β에 의한 처리는 SAP mRNA 합성을 하향 조절하며, 둘 모두의 시토킨이 존재하는 경우에 효과가 우세하다. 이러한 결과는 사람 SAP가 상당한 급성상 단백질로 여겨지는 것은 아니지만, 특히 국소 부위에서 존재하는 상대적인 시토킨 비율이 증가된 비간장성 SAP 합성을 촉진할 수 있는 조건이 있을 수 있다. 상기 시험관내 결과는 동족의 간 생성물의 시토킨 특이적 반응이 급성상 반응 동안 다르다는 것을 나타낸다. 종 사이의 동족의 동일한 간 생성물의 차등 반응이 일반적으로 고유의 유전 조절 요소에 좌우된다는 것은 내인성 마우스 시토킨, 시그날 형질도입, 및 세포성 생합성 경로를 이용하여 대부분 사람 CRP 트랜스진을 유도하는 마우스의 능력에 의해서 예시되는데, 상기 마우스에서 CRP는 아주 소량의 APR이다.
SAA는 대부분의 포유동물 종에서 주요한 급성상 단백질이며 가장 많이 유도되는 단백질이다. 생체내 마우스의 연구에서 상이한 염증성 자극에 의한 유도 운동학은 SAP에 대한 상기된 운동학과 유사하다. SAA는 급성상 반응 동안 고밀도 리포단백질(HDL), 특히 HDL3과 결합하는 작은 아포리포단백질(인체에서 104 아미노산)이다. SAA는 HDL3과 결합된 우세한 아포리포단백질이 되어, 아포리포단백질 AI을 능가한다. SAA는 몇 가지 종에서 다중의 동종 유전자의 생성물이다. 이들 유전자는 공통의 유기체, 즉 몇 가지의 다른 아포리포단백질 유전자를 암시하는 4개의 엑손과 세 개의 인트론을 지닌다. 인체에서 두 개의 급성상 SAA(A-SAA) 유전자가 설명되고 있는데: SAA1과 SAA2는 이들의 특이화된 생성물의 일차적인 구조, 이들의 유전자 구성 및 서열, 및 이들의 발현 방식에 있어서는 거의 동일하다. 이들은 의심할 여지없이 선조의 유전자 복제에 이어진 조절성 유전자 전환의 결과물이다. 또한, MRNA 또는 단백질 생성물이 기재된 바 없는 세 번째 유전자(SAA3)이 있다. 이 유전자는 본래 확실하게 전사된 유전자의 구조 전체를 지니는 것으로 보고되었지만, 인-프래임(in-frame) 정지 코돈의 존재가 후에 입증되어, 이 유전자는 사실 위유전자임을 나타냈다. 최근, 본 발명의 발명자들은 4번째 SAA 유전자 생성물을 확인하였는데: C-SAA('추정성'SAA)가 정상의 HDL3상에 존재하며, 급성 염증 동안, 유도되기는 하는데 미량으로 유도된다. 이의 발현은 따라서 A-SAA의 발현과는 라디칼적으로 다르다. C-SAA cDNA 클론은 SAA1 및 SAA2 단백질과 단지 55% 상동성을 지닌 112 아미노산의 성숙한 분자를 예보한다. C-SAA내에 존재하는 가외의 8 아미노산이 잔기 69와 70 사이의 A-SAA 서열에 호응하여 위치되는 옥타펩티드에 위치한다. 서열 상동성과 함량 및 유도 능력을 근거로 하면, C-SAA가 A-SAA 유전자 SAA1 및 SAA2 보다 더 멀게 동족인 SAA 수퍼패밀리의 구성원이지만, 그럼에도 불구하고 이들 유전자와 밀접하게 연계된다. 본 발명자들은 SAA2 유전자좌로부터 9kb 하류에 위치된 SAA4 유전자좌 대한 C-SAA 유전자를 작도하였다. 또한, SAA1 유전자좌는 SAA2/SAA4 결합된 쌍과 동일한 350kb NotI 제한 단편상에 위치된다. SAA3 위유전자는 추정성 제 5 SAA 유전자를 지니는 염색체 11의 짧은 아암(G. C. Sellar and A. S. W., 공개되지 않음)으로 작도되지만, 상기 제한 단편에 없다(G. C. Sellar and A. S. W., 공개되지 않음). 따라서, 상이한 종족성의 정도 및 상이한 유도 특성을 나타내는 광범위한 SAA 수퍼패밀리 유전자의 클러스터가 존재하는 듯하다. 이러한 클러스터의 존재는 두 가지의 주요 급성상 SAA 유전자(SAA1 및 SAA2)의 마우스 염색체 7의 신테닉 영역, 소량의 급성상 유전자(SAA3) 및 SAA위유전자(ψSAA)에 대한 밀접한 연계에 의해 지지되고 있으며, 처음의 세 개는 이들의 유사하게 번호 주어진 사람 대응부와 거의 유사하다. C-SAA는 오늘날까지 마우스에서 확인되지 않고 있다. 그러나, 사람 C-SAA에 존재하는 위치와 유사한 위치에 있는 옥타펩티드가 개, 고양이, 말 및 밍크를 포함한 광범위한 종의 대량으로 유도된 A-SAA에 존재한다. 다른 포유동물의 옥타펩티드 함유 A-SAA와 비교하는 경우, C-SAA는 패러독스를 나타내는데, 그 이유는 유일하게 구성적으로 발현되는 것이기 때문이다.
SAA 수퍼패밀리 구성원의 차등 발현은 APR 유전자 및 이들의 생성물에서 비교 조절 메카니즘을 연구하는데 최상의 시스템중 한 시스템을 구성한다. 우(Woo)등[문헌: Woo et al. (1987) J biol Chem 262:15790-5]은 IL-1이 사람 SAA2 유전자의 마우스 섬유아세포내로의 트랜스펙션 후에 사람 A-SAA의 발현을 유도할 수 있음을 입증하였다. 이어서 SAA2 프로모터 영역의 IL-1 반응성 영역이 NFκB 결합 부위를 함유함이 입증되었고 이러한 전자 인자가 유전자의 발현을 조절하는데 친밀하게 관련됨이 입증되었다. 사람 간암 세포주 PLC/PRF/5에서의 SAA 발현의 분석은, IL-1β와 동일한 양은 아니지만, IL-6가 또한 SAA mRNA 및 단백질 발현을 유도할 수 있음을 나타냈다. IL-1β와 IL-6가 함께 사용되는 경우, 이들은 비교적 생리학적 자극이 있는 단구 조절된 배지에 의해 생성된 양 및 운동력학과 동인한 양 및 운동학으로 상당한 상승 작용적 유도는 나타낸다. 이러한 결과는 A-SAA의 경우에 조합된 IL-1β와 IL-6이 최대의 유도에 필요충분한 시토킨이라는 것을 입증하고 있다. PLC/PRF/5 세포에 의한 이들 연구는 염증성 자극 후에 SAA 발현의 조절을 수행하는 원리적인 수단이 mRNA의 증가된 전사 및 축적을 통해서 이루어짐을 입증하고 있다. 유도된 SAA mRNA 수준이 이들의 최대일 때에는, 그러나, SAA 단백질을 합성하는 세포의 능력이 초기의 자극 후와 비교할 경우에 축적된 SAA mRNA의 절대적인 수준의 정확한 비율로부터 기대될 수 있는 능력보다 약하다. 이러한 변화는 CRP의 경우에 자극후 상이한 시점에서 세포의 A-SAA 배출 능력에서의 점진적인 차이에 기인되거나, 페리틴 중쇄 mRNA와 경쇄 mRNA의 경우에 세포성 번역장치, 즉, 리보누클레오단백질, 모노좀, 및 폴리좀에 의한 A-SAA mRNA의 차등 결합에 기인되는 것으로 여겨지지 않는다. A-SAA mRNA의 세포성 수준은 이들의 최대 수준에 도달한 후에 신속하게 감소하지만, A-SAA mRNA 자체는 고유하게 안정하다. A-SAA의 생합성을 규정하는 본 발명자들의 연구는 유도된 mRNA 농도의 출현시에 존재하는 길이로부터 점진적이며 조절된 상태로 짧아지는 mRNA 폴리(A) 테일에 집중되고 있다: 이는 특이적 mRNA 분해 과정 및/또는 이의 번역 효율성에 영향을 줄 수 있다. A-SAA와는 대조적으로, C-SAA는 IL-1β와 IL-6에 의해서 최소로 유도된다. 이의 유전적 구성은 A-SAA 유전자의 구조와 전체적으로 동일하지만, 이의 프로모터 영역과 인트론내에 함유된 서열 및 모티프가 라디칼적으로 상이하다. A-SAA와 C-SAA 프로모터 활성의 비교 분석은 주요 APR의 유도에 요구되는 고유의 유전 요소를 추가로 한정하는데 유용할 것이다. SAA와 SAP는 일시적인 급성상 반응에는 유익하지만 만성의 염증에는 유해한 효과를 나타내는 혈장 단백질의 전형적인 예이다. 많은 임상 조건에서 주요 급성상 단백질의 원인성 또는 연관성 관련은 이하 개괄되는 바와 같이 직접적이거나 부수적으로 관련되고 있다.
속발성이거나 반응성인 유전분증은 이따금 있는 많은 만성 및 재발성 염증 질환[문헌: Cohen, et al. (1959) Nature, 183:1202-3], 예를 들어, 나병, 결핵, 전신 홍반성 낭창 및 류머티스 관절염의 결과이다. 이는 비장, 간 및 신장을 포함한 다양한 조직에서의 불용성 원섬유의 최후에는 치명정이며 점진적인 침착으로 특성화된다. 이차적인 아밀로이드 침착은 SAP의 편재된 형태인 아밀로이드 P 성분(AP)와 관련하여 전구체 SAA로부터 단백질가수분해에 의해서 유도되는 듯한 아밀로이드 A(AA)로 구성된다. 속발성 유전분증의 병인은 거의 이해되지 않고 있지만, AA는 엘라스타제 억제제로 작용할 수 있는 것으로 밝혀진 β-플리트 시이트(β-pleated sheet) 및 AP로서 침작되며, 단백질가수분해 효소에 의한 분해에 대한 침착을 방지할 수 있다. 또한, SAP는 피브로넥틴에 대한 결합을 통해서 원섬유 침착에서 핵화제로 작용할 수 있다. 정확한 메카니즘이 무엇이든, 만성 실험적 염증이 진행되고 있는 마우스에서 유지된 바와 같은 SAA와 SAP의 높은 순환 및 편재 수준은 유전분증 생성에 기여하는 것으로 여겨지는 것이 명백하다. 최근의 연구는 속발성 유전분증을 앓고 있는 환자내의 순환과 침작 사이에 SAP의 역학적인 상호변화가 있으며, 일부 환자에서의 침착에 대한 논의할 만한 많은 퇴화 및 제거 보고서가 있음을 입증하고 있다. 따라서 만성 염증동안에 SAA 및/도는 SAP를 특이적으로 하향 조저가는 방법을 발명하여, 아밀로이드 침착의 진행을 정지시키거나 완화시킬 뿐만 아니라, 주요 APR의 농도를 저하시켜서 '아밀로이드발생 문턱'을 낮추고, 존재하는 정확한 생리학적 작용 및 명백한 메카니즘이 명백하게 하는 것이 중요하다.
SAA가 HDL3과 연관됨은 만성의 고농도의 SAA가 임상질환을 촉진할 수 있는 또 다른 영역을 제시한다. 상승된 HDL 수준은 아테롬성동맥경화증에 대한 민감성과 역으로 상호 관련된다. HDL은 역 콜레스테롤 수송의 과정에 중요하며, 염증 동안에 혈장 HDL 콜레스테롤이 현저하게 감소된다. 염증 동안에 A-SAA가 HDL과 결합하는 것은 입자를 변화시키고, 이러한 입자가 압도적인 단기간 요건이 있는 보호성 숙주 방어 역할을 갖추게 한다. HDL3에 대한 높은 SAA 수준은 아포리포단백질의 소비로 달성되며, 이와 관련된 농도는 상당히 감소된다. HDL은 콜레스테롤 에스테르화와 관련된 중요한 효소중의 하나인 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스페라제(LCAT)에 대한 주요 기질이다. 아포리포단백질 AI는 LCAT 반응에 대한 활성화제로서 요구된다. A-SAA는 염증 동안에 HDL 대사를 라디칼적으로 변화시킬 수 있는 HDL 입자로부터 apoAI를 치환(직접 또는 간접적으로)시킴으로써 이러한 반응을 억제할 수 있다. 따라서 SAA는 역 콜레스테롤 수송에 대한 HDL의 능력을 최소화시킬 수 있다. 본 발명자들은 정상의 HDL에 대한 C-SAA가 역 콜레스테롤 수송에서 이의 정상적인 생리학적 역할에 기여한다고 생각하고 있다. ks성 염증성 질환에서 HDL에 대한 A-SAA의 만성 내성은 상당한 기간 동안에 걸친 HDL의 작용을 포함할 수 있다. 이러한 사항은 전체 HDL의 수반 지속된 감소와 함께 아테롬성동맥경화증의 발전에 대한 주요한 위험 인자를 구성할 수 있으며, 활성의 전신성 류머티스 관절염을 앓고 있는 환자에서 관찰된 심근 질환에 의한 증가된 사망에 대한 분자적인 설명을 제공할 수 있다.
최근, 토끼 SAA3 분자가 포르볼 에스테르 또는 IL-1과 함께 유도될 수 있는 활액 섬유아세포의 생성물임이 밝혀졌다. 토끼 SAA3은 오토크린(autocrine) 도전 유도인자로 작용한다. 도전은 류머티스 관절염과 골관절염 환자의 결합 조직내의 콜라겐 I, II, 및 III의 효소적 퇴행과 연관된 중추적인 성분이기 때문에, 어떠한 SAA는 상기 질환의 병인에서 중요한 역할을 할 수 있다. 다른 SAA 수퍼패밀리 구성원이 또한 국소 또는 전신 시그날 분자라면, 이들의 유도에 대한 신속성 및 양은 이들이 급성상 반응을 유도하고 만성 염증에서 잠재적으로 유해한 과정이 계속되는 것을 중재하는데 중요할 것임을 시사한다.
요약하면, SAA 수퍼패밀리의 구성원 모두의 구조, 발현 및 분자의 전체를 시험하는 것은 따라서 생물학적으로나 임상학적으로 상당히 중요한 듯하다.
급성상 반응은 항상성을 유지하는 정상의 대사과정과는 라디칼적 거리를 나타낸다. 물리적인 도전에 신속하고 효과적으로 반응하는 유기체의 능력은 단기간 생존 방법으로 진화한다. 그러한 도전 후에 즉발적으로 수행하는 많은 생리학적 변화는 시토킨의 복잡한 네트워크에 의해서 개시되고, 유지되고 조절된다. 이들 시토킨은 이들 자체의 합성을 조절하고 신체의 주요 시스템중 어떠한 시스템: 면역, 헤모생성(haemopoietic), CNS, 및 간의 대사 및 생합성 특징을 변화시키는데 동조 작용한다. 급성상의 혼합된 효과는 자극의 전염증성 작용을 중화시키고; 자극화제 및 자극에 의해 생성된 조직 단편을 물리적으로 치사 및/또는 제거하고; 조직 복구를 촉진하고; 항상성으로의 신속한 회복을 용이하게 하는 것이다. 연구자들은 이제 일련의 자극화제에 의해 유도된 반응의 가변성 및 급성상 반응의 복잡성을 이해하고 있으며, 이러한 사항은 임상적으로나 과학적으로 아주 중요하다는 것을 알기 시작하고 있다. 감염성 질환 및 외상의 치료를 최상으로 할 수 있도록 급성상 반응을 보다 완전하게 밝혀내는 파라메타를 정의하고자 하는 많은 연구가 계속될 것이다. 또한, 어떠한 급성상 과정이 의료 및 사회적 결과를 압도하면서 만성의 염증 질환에서 계속 작용하게 하는 메카니즘에 대해 보다 더 상세하게 밝혀내는 것이 요구되고 있다.
4.6.3 인터루킨-1
인터루킨-1(IL-1)은 활성화된 대식세포 및 많은 그 밖의 세포에 의해 생성된 두 가지의 관련된 단백질, 즉, IL-1α와 IL-1β를 나타내는 용어이다. IL-1의 두 가지 형태 모두가 독특한 유전자 생성물이지만, 이들은 동일한 세포표면 수용체에 의해 인식되며 기능이 유사하다. 역사적으로는, IL-1은 내인성 피로겐으로 발견되었고, 후에 렉틴 자극된 흉선세포의 성장을 촉진하는 보조 자극인자로 동정되었다. IL-1은 이제 감염증 및 그 밖의 외상 형태에 대한 숙주 반응의 중요한 조절인자인 것으로 여겨진다. IL-1에 기인될 수 있는 많은 조절 역할에는 세포 및 호르몬성 면역반응, 염증, 열, 급성상 반응 및 헤모생성의 조절이 포함된다. 이의 생물학적 효과는 특정의 세포 계통으로 제한되지 않지만, IL-1은 면역 시스템과 다른 세포성 시스템내의 다양한 세포에서 작용하는 다기능성 시토킨이다.
IL-1은 두 가지의 다른 펩티드 호르몬, 즉, IL-6와 TNFα와 함께 감염증 동안, 특히 그램 음성 박테리아에 의한 감염중에 발현되는 시토킨의 그룹을 형성한다. IL-1의 생물학적 성질은 TNFα의 성질, 가장 주지할 만하게는, 열, 염증 및 헤모역학적 쇼크의 유도 성질이 상당히 유사하다. IL-1 또는 TNFα에 대한 거의 모든 반응은 둘이 함께 투여되는 경우에 증진될 수 있다. IL-1 및 TNFα와 유사한 IL-6는 급성상 단백질의 합성을 증가시키며 열을 유발시킨다. 따라서, 연구가 IL-1에 중점을 두고 있지만, IL-1은 이의 발현 및 생물학적 성질이 IL-6 및 TNFα에 영향을 받고 있는 시토킨 네트워크의 일부임을 주지해야 한다.
많은 관심은 질환의 중재인자로서의 IL-1에 집중되고 있다. 상승된 순환 수준의 IL-1은 패혈증성 쇼크를 포함한 많은 임상 상황과 관련되고 있다. 게다가, 만성 염증에서 중재인자로서 IL-1의 역할은 동물 및 사람 연구에서 추론될 수 있으며, 급성 류머티스 관절염에서 특히 강조된다. 따라서, IL-1은 질환 뿐만 아니라 숙주 방어의 중재인자로 여겨질 수 있다.
IL-1의 효능적이고 의미있는 생물학적 효과 때문에, 이의 활성이 주지할 만하게는 전사, 번역, 및 분비 수준으로 정확하게 조절된다는 것은 놀라운 일이 아니다. 추가의 조절 메카니즘은 다른 시토킨의 동반작용, 표적 세포상에서의 IL-1 수용체의 발현에서의 차이, 및 예를 들어 최근 동정된 IL-1 수용체 길항인자(IL-IRN)로서 천연 억제성 단백질의 생성에 의해서 제공된다[문헌: Seckinger, et al. (1987) J Immunol 139:1546-9]. 게다가, 생체내 IL-1 활성을 조절하는 정확한 메카니즘을 이해하는데는 독특한 미세-환경과 해부학적 구역화와 같은 추가의 파라메타의 이해가 요구된다.
상보성 DNA(cDNA) 클로닝, 단백질 정제, 및 서열화 연구는 사람과 마우스를 포함한 몇 가지 종에 존재하는 두 가지 형태의 IL-1, 즉, IL-1α(pI 5.0) 및 IL-1β(pI 7.0)를 분리한다[문헌: Lomedico, et al.(1984) Nature 312:458-62]. 사람 IL-1α와 IL-1β에 대한 유전자는 서열화되고 염색체 2의 긴 아암으로 제한되었다. 사람 IL-1α와 IL-1β 유전자의 크기는 각각 10.5kb 및 7.8kb이다. 각각의 IL-1 유전자는 일곱 가지의 엑손을 함유하지만, 이들은 이들의 핵산서열에서 45% 동족성을 공유한다.
IL-1α mRNA는 길이가 약 2.3kb이지만, IL-1β mRNA의 보고된 크기는 1.4 내지 1.8kb의 범위이다. IL-1 mRNA 둘 모두는 약 31kDa의 폴리펩티드(IL-1α에 대한 271 아미노산 및 IL-1β에 대한 269 아미노산)내로 번역된다. 그러나, 대식세포로부터의 배양 상등액과 생물학적 유체내의 두 IL-1 단백질의 우세한 분자량은 단지 약 17.5kDa이다. 이러한 데이터는 IL-1α와 IL-1β가 후속적으로 변화되어 세포외 저분자량 IL-1 폴리펩티드를 생성하는 전구체 단백질로 합성됨을 나타낸다. N-말단 단백질 서열 데이터를 각각의 cDNA 서열과 비교한 결과, 두 가지 형태의 IL-1 모두에서, 이것은 활성 IL-1로서 배양 상등액에 존재하는 분자의 카르복시말단 부분임이 밝혀졌다. 수용체 결합 및 전체 생물학적 활성은 IL-1α에서의 잔기 128 내지 267과 IL-1β에서의 잔기 120 내지 266을 스패닝하는 최소 아미노산 서열을 요한다.
사람 IL-1β는 결정화되며, 구조는 핵자기공명 분광분석에 의해 분석된다. 이들의 연구에 따르면, IL-1β는 사면체 구조를 하고 있으며 세 개의 위대칭성 형상 단위내에 배열된 12β-가닥으로 구성되어 있다.
아미노산 수준에서, IL-1의 세포외 형태 뿐만 아니라 IL-1α와 IL-1β 전구체 사이의 서열 상동성은 25 내지 30%이다. 그러나 이들의 생물학적 활성은 유사하며, 두 IL-1α와 IL-1β는 다양한 표적 세포상의 공통의 수용체에 경쟁적으로 결합한다. 게다가, 두 가지 형태의 IL-1은 IL-1α와 IL-1β 둘 모두가 분비가 예정된 단백질로 기대될 수 있는 분비성 시그날 펩티드를 함유하지 않는다는 점이 구조적인 특정의 특징이다.
IL-1α와 IL-1β는 de nove RNA와 단백질 합성에 의해서 발생된다. 단구/대식세포 계통의 세포는 IL-1의 중요한 공급원이지만, IL-1은 이제 아주 다양한 유임파구 및 비-유임파구 세포에 의해 생성되는 것으로 밝혀졌다. 피부 각질세포를 제외하고는, 두 가지 형태의 IL-1의 생성은 구성적이아니지만, 다른 시토킨, 보충 성분, 면역 복합체, 포르볼, 박테리아 및 몇 가지 미생물을 포함하는 다양한 자극에 의해 단지 일시적으로 유도된다[문헌: Dinarello (1991) J Infect Dis, 163: 1177-84]. 이들 중 최상으로 연구된 것은 10 pg/ml 만큼 낮은 농도에서 IL-1 생성을 자극하는 리포폴리사카라이드(LPS)이다.
두 가지 형태의 IL-1은 별도의 전사 조절 하에 있는 듯하다. 인체 단구에서 두 IL-1 유전자는 LPS에 의한 자극 후에 15분내에 전사된다. 그러나, 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)로 세포를 자극하면 IL-1β는 유도하지만, IL-1α는 전사하지 않는다. 또한, IL-1α와 IL-1β의 차등 발현이 다양한 세포형에서 관찰되고 있다.
IL-1 유전자의 전사 활성화 메카니즘은 거의 정의되어 있지 않다. 그러나, 단백질키나제 C(PKC)의 활성화는 시그날 전달과 관련이 있으며:PKC 활성화 포르볼 에스테르(예, PMA)는 인체 단구에서 IL-1β 발현을 유도하고, IL-1α와 IL-1β의 LPS 유도된 발현은 PKC 억제제에 의해 하향 조절될 수 있다.
IL-1의 생성은 mRNA 안정성 및 번역 수준으로 조절된다. IL-1α 유전자가 배양(숙성)된 단구에서 전사되지만, 그러한 세포에서의 IL-1α mRNA의 검출 가능한 수준은 없어서, IL-1α mRNA가 신속하게 분해됨을 나타낸다. 게다가, 모노컷이 글래스 또는 플라스틱에 유착되는 것은 IL-1 유전자 발현을 트리거하면서, IL-1 단백질로 번역되지 않게 한다. 그러나 후자는 LPS 또는 보충 성분 C5a에 의해 제공된 2차 시그날에 의해 유도될 수 있다. 다라서, IL-1의 전사 및 번역은 별도로 조절되는 듯하다.
IL-1 생성을 유도하는 시토킨은 IL-1(α 및 β) 자체, TNFα, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 및 대식세포-CSF를 포함한다. IL-1 생성의 억제는 IL-4, IL-6, IL-10, 및 형질전환 성장 인자-β(TGFβ)의 존재 하에 관찰된다. IFNγ는 이중 역할을 하는데, 이는 LPS에 의해 유도된 IL-1 생성을 증가시키지만, IL-1에 의해 유도된 IL-1 생성은 억제한다.
IL-1α와 IL-1βmRNA는 분비 동안에 또는 분비 후에 프로테아제에 의해 분해되는 31kDa의 전구체 단백질(프로-IL-1α 및 프로-IL-1β)로 번역된다. IL-1α는 미립체 막을 가로질러 전위될 수 없다. 서브세포 분별화 연구 뿐만 아니라 면역전자현미경에서 어떠한 형태의 IL-1도 내부원형질 망상질 또는 골지체(Golgi apparatus)에서 검출되지 않음이 입증되었다. 이러한 결과는 N-말단 시그날 펩티드의 자명한 결핍과 연관이 있다. 따라서, 모든 지표는 시토졸성 단백질인 IL-1α와 IL-1β를 나타낸다.
IL-1 단백질이 다른 세포 기관과 연관되고 있음은 리소좀과 미토콘드리아에 대해서 보고되고 있다. 많은 연구에서는 IL-1β는 아니지만 IL-1α는 활성화된 대식세포상에 막 단백질로서 존재하며, 막 IL-1은 파라포름알데히드 고정된 쥐 대식세포상에서 IL-1 활성을 측정함으로써 검출됨을 제시하고 있다. 그 후에, 대부분의 측정된 생활성이 고정된 세포로부터의 IL-1α의 누출에 기인되어, 대식세포의 파라포름알데히드에 의한 고정은 막형 IL-1의 존재를 입증하기에 충분함이 밝혀졌다. 그러나 IL-1α는 형광 표지화 및 세포표면 요오드와를 이용함으로써 단구 및 대식세포의 막에서 검출되었다. IL-1α가 막에 고정되는 메카니즘은 측정되어야 할 것으로 남아있다. IL-1α 전구체는 세린 잔기 90에서 포스포릴화되며 포스포릴화된 프로-IL-1α는 칼슘의 존재하에 단구의 막 베지클에 결합한다. 따라서, 포스포릴화가 메카니즘으로 작용하여, 프로-IL-1α가 세포막과 상호작용하는 것을 용이하게 한다. 또한, 프로-IL-1α를 막에 고정하는 것은 렉틴 유사 결합에 의한 것으로 제시되고 있는데, 그 이유는 D-만노오즈가 막으로부터의 프로-IL-1α를 분리시키기 때문이다.
IL-1이 어떻게 세포로부터 수송되며, 이의 생활성 펩티드로 어떻게 분해되는지는 명확하지 않다. IL-1α는 트립신-유사 효소에 의해서 무상의 대식세포로부터 방출되며, 막 IL-1은 IL-1α의 분비에 선결요건인 것으로 제안되고 있는데, 그 이유는 칼슘 활성화된 중성 프로테아제가 프로-IL-1α를 처리하는 것으로 기재되고 있기 때문이다. 대식세포로부터의 IL-1β의 분비가 IL-1α의 분비 보다 더 먼저이면서 빨리 발생되어서, 두 가지 형태의 IL-1의 분비가 별도의 메카니즘(들)에 의해 조절됨을 제시하고 있다. 프로-IL-1β는 생활성이 결여되어 있으며; 이것은 엘라스타제와 플라스민을 포함한 다양한 효소에 의해서 분비되고 비처리되며 단지 후에 분해된다. 단구 특이적 프로테아제는 알라닌 위치 117에서 프로-IL-1β를 특이적으로 분해하는 것으로 기재되어 있다. 분비된 프로-IL-1β의 불완전한 처리는 자발적인 이황화물 중재된 단백질 폴딩에 기인될 수 있다.
cDNA는 특이적으로 IL-1β의 프로-형을 성숙한 형태로 가수분해하는 효소를 암호하는 사람 단구 세포주로부터 클로닝된다. 효소는 404 아미노산을 지니며 공지된 계열의 프로테아제에 속하지 않는다. 전환 효소에 대한 유전자는 11q23 밴드의 염색체 11에 편재된다. 이러한 밴드는 사람 백혈병과 임파종에서 재배열과 종종 관련되는 것으로 확인되었고, 이러한 효소는 세포성장을 조절하는데 기능적 역할을 할 수 있다는 것이 제시되고 있다.
IL-1의 다양한 생물학적 활성은 많은 세포 표면상의 특이적 수용체에 의해 중재된다[문헌: Bomsztyk, et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:8034-8]. IL-1의 결합은 특이적이며 포화 가능하고, 높은 친화성으로 발생된다; 5x10-10내지 5x10-11M의 Kd. 오늘날까지, 두 가지의 독특한 단일쇄 수용체가 동정되었다: 80kDa인 하나는 IL-1 수용체 타입 I(IL-1R 타입 I)이라 일컬어지고, T 세포, 섬유아세포, 및 상피세포에서 발현되고[문헌: Sims, et al.(1988) Science 241:585-9]; 68kDa의 다른 하나는 IL-1R 타입 II라 일컬어지고, B 세포, 호중구, 및 대식세포에서 발현된다. 두 가지 타입의 IL-1R은 클로닝되고 서열화되었으며 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리에 속한다[문헌: Dower et al. (1990) J Leukoc Biol 1:103-7]. 상이한 세포에서 발현되는 것 이외에도, 이들 두 IL-1R은 이들의 결합 친화성 및 표면 발현의 조절에 관하여 다르다. IL-1α와 IL-1β는 IL-1R 타입 I에 이해서 동일하게 인식되지만, IL-1α는 타입 I 수용체에 보다 더 양호하게 결합하지만, IL-1β는 타입 II 수용체에 그렇지 못하다. 사실, IL-1β는 생체내 B 세포를 트리거하지만, IL-1α는 그렇지 않다는 증거가 있다. 이러한 사실에 의해서, IL-1α는 IL-1β의 면역자극성 성질의 경쟁성 억제제로 작용할 수 있음이 제시된다. 수용체에 결합하는 IL-1으로부터의 시그날이 세포내적으로 형질도입되는 분자 메카니즘은 완전히 이해되지 않고 있다.
IL-1의 많은 생물학적 특성은 감염에 대한 숙주 방어에서의 비특이적 면역성과 특이적 면역성 둘 모두에서 기초적인 역할을 한다는 것을 입증한다. 동물에게 투여되는 경우에, IL-1은 감염에 대한 급성상 반응을 의태하는 일련의 생리학적 변화를 유도한다[문헌: Dinarello, et al. (1988) Rev Infect Dis, 10: 168-69]. 열, 간에서의 급성상 반응물의 증가된 합성, 및 혈장 철의 감소를 포함한 이들 변화는 미생물의 옴소닌화를 증가시키고 미생물 성장을 억제시킴으로써 숙주에 유익한 것으로 사료된다. IL-1은 후속되는 생체내 호중구 이동 및 과립화를 자극하는 IL-8, IL-9 및 대식세포 염증성 단백질과 같은 호중구 및 단구 화학주성 시토킨의 유전자 발현을 유도한다. 또한, IL-1은 혈관 내피세포에 대한 호중구 및 임파구 유착을 촉진하는 유착분자의 발현을 유도한다. 내피세포에 대한 이러한 효과는 이들이 감염의 확산을 제한하고 또한 백혈구가 통과하여 염증부위에 유지되게 한다는 점에서 임상적으로 중요하다. 따라서, IL-1의 합성 및 분비가 급성 감염에 대한 첫 번째 방어 라인을 나타내는 경우, 이의 국소 및 전신적인 효과는 비특이적 방어 메카니즘을 동원하는 것을 도울 수 있다.
항-미생물 내성을 동원하는 능력에 대해서 IL-1을 평가하기 위해서, 동물을 다양한 감염성 질환 모델에서 IL-1으로 처리하였다. 저용량으로 주입되는 경우에, IL-1은 박테리아 및 기생충에 기인된 치사성 감염증으로부터 마우스를 보호한다. 대부분의 경우에, 급성 감염후의 생존의 최대 증진은 IL-1 처리가 적어도 4시간 선행되는 경우에 관찰된다. IL-1이 항미생물내성을 증진시키는 메카니즘은 추가로 밝혀져야 한다. IL-1 처리는 효중구를 유도하지만, 병원체의 수의 감소는 모든 모델에서 검출되지 않아서, IL-I 유도된 보호는 증가된 살균 메카니즘에만 기인되지는 않는다는 것을 제시한다.
그램 음성 박테리아 감염증에서, 유해 및 치사 효과는 TNFα에 의해 중재되며, 이의 수용체 발현은 IL-1에 의해 하향 조절된다. 따라서, IL-1 유도된 보호는 YNFα의 작용에 기인한 탈민감성을 포함하는 듯하다. 또한, 쥐의 대뇌 말라리아에서 기생충혈증의 IL-1 유도된 억제는 T 세포에 의해서 방출된 IFNγ에 의해서 부분적으로 중재된다.
세포 중재된 면역성은 세포내 병인에 대한 숙주 방어에서 중요한 역할을 한다. 감염된 대식세포의 항미생물 활성을 증진시키는데 요구되는 시토킨중의 하나는 활성화된 T 세포에 의해 생성된 IFNYγ이다. 모든 지표는 TH2 세포라 명명된 T 헬퍼 세포의 서브셋의 활성화에서 중요한 성분인 IL-1을 선호한다. 그러나, IL-1은 단지 항원 표현 내용에서 IL-2와 IL-2R 발현을 유도하는 보조 자극제로서 작용한다.
세포외 병원체는 일반적으로 항체 중재된 메카니즘에 의해 충분하게 처리된다. IL-1은 B 세포 활성화 및 Ig 생성에 대한 보조 자극제이며, 특히 IL-4와 IL-6과 함께 작용하고, 그로 인해서, 항체 중재된 항미생물 방어에 기여한다.
감염 동안에 IL-1의 작용에 대한 추가의 이해를 얻기 위해서는, 몇 가지 의문사항이 해결되어야 한다. 첫 번째로는, 어떠한 세포가 IL-1(α 및 β)를 생성하고 언제 이들이 생성하는가 이다. 두 번째로는, 미세-환경이 IL-1 유전자의 발현에 영향을 주는가 이다. 세 번째로는, IL-1 생성 세포가 TNFα와 IL-6을 합성하는가 이다. 네 번째로는, 어떠한 세포가 정상 및 질환 감염된 조직에서 IL1에 대한 수용체를 지니는가 이다.
국소 감염 부위에서의 IL-1의 유도를 조사하기 위해서, 본 발명자들은 예르시니아증(yersiniosis)의 마우스 동물 모델을 사용하였다. 이러한 감염 모델의 이점은 예르시니아 엔테로콜리티카 08(Yersinia enterocolitica 08), 즉, 장내병원성 박테리아의 능력을 포함하여 경구 감염 후에 후위 회장의 페이어 패치(Peyer's Patch)를 선호적으로 침습하는 것이다. 감염 6일 후에 마우스로부터 제조된 페이어 패치의 인접 조직 단편을 면역과산화효소로 염색함으로써 IL-1α와 IL-1β 생성 세포를 편재시키면 IL-1α 또는 IL-1β에 대한 항혈청에 의해 인식된 세포들 사이의 명백한 특징이 나타난다. IL-1α 생성 세포는 성숙한 대식세포이지만, IL-1β 생성 세포는 단구이다(Beuscher, 미공개됨). IL-1α와 IL-1β 면역반응성 세포 표현의 운동학을 비교해보면, IL-1α의 유도가 24 시간 이상까지 지연됨이 명백하다. 또한, 자극된 페이어 패치에서 IL-1α와 IL-1β의 생성은 기존 세포에서 기원되지 않지만, 조직으로의 순환에 의해 이동하는 단구에서 기원된다. 본 발명자들은 이러한 결과에 의해서 IL-1α와 IL-1β의 차등 생성이 활성화된 대식세포에 대한 활성화된 단구의 분화에 의해 조절된다고 결론을 내리고 있다.
IL-1과 TNFα의 상승된 순환 수준이 다양한 미생물에 기인된 패혈증을 앓고 있는 환자와 동물을 보고하고 있으며, 둘 모두의 시토킨의 방대적인 양이 치사 균혈증 동안에 저혈압과 관련되어, 이러한 환경하에서 IL-1β와 IL-6가 TNFα의 조절하에 있음을 나타낸다. 이들 데이터는 패혈증 쇼크 증후군의 발달에 대한 IL-1과 TNFα의 중요성을 강조한다. 따라서, IL-1과 TNFα 활성의 조화된 조절을 가능하게 하는 물질은 치료제로서 효능적으로 유일할 수 있다.
IL-1 활성을 억제하는 현재 이해되고 있는 방법이 있다. 본원에서 검토된 바와 같이, 아라키돈산염 대사의 리포옥시게나제 경로를 차단하는 코르티코스테로이드 또는 제제에 의한 IL-1 합성의 감소 또는 억제가 소염 치료제에 대한 중요한 방법을 제공할 수 있다. 또한, TGFβ와 같은 시토킨과 IL-10은 IL-1 합성을 유도하는데 유용할 수 있다.
예를 들어, 패혈성 쇼크 동안과 같은 이미 순환으로 방출된 IL-1의 억제가 별도의 방법을 요구한다. IL-1R 타입 I에 대한 항체에 의한 IL-1R 차단은 숙주 염증성 반응을 감쇠시키고, LPS와 IL-1 유도된 급성 염증으로부터 마우스를 보호하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 동물에게 IL-1R 타입 I(가용성 IL-1R 단백질)의 세포외 도메인을 투여하면 염증반응이 감소되는 듯하다. IL-1에 특이적으로 결합하는 항체는 지금까지 시험되지 않았지만, TNFα에 대한 항체는 내독소중독증 및 이. 콜라이(Escherichia coli) 패혈증으로부터 마우스를 보호하는 것으로 밝혀졌다.
자연적으로 발생하는 IL-1 활성의 억제제의 존재는 시험관내 및 생체내에서 확고하게 입증되었다. 이들 억제제는 두 가지의 그룹으로 분류되는데, 이들중 하나는 IL-1 활성을 억제하는 물질, 예를 들어, α2-고분자글로불린과 리포단백질로 구성되지만, 이들은 IL-1과 관련이 없는 다른 단백질과 상호작용한다. 두 번째 그룹은 IL-1 활성을 특이적으로 억제하는 폴리펩티드로 구성된다. 이들 그룹의 IL-1 억제제의 구성원이 최근 클로닝되고 IL-1R 길항제(IL-1R)로 일컬어지고 있다. cDNA 서열은 17-3kDa의 폴리펩티드를 암호한다. 천연 IL-1RN 폴리펩티드(23kDa)와 유사하게, 재조합 IL-1RN은 IL-1R 타입 I에만 적극적으로 결합하고, 그 자체의 시그날을 유도하지 않으면서 IL-1의 결합을 직접적으로 차단함으로써 시그날 형질도입을 억제한다. IL-1α, IL-1β, 및 IL-1ra에 대한 유전자의 인트론-엑손 구성과 추정된 단백질 서열을 비교하면 세 개의 IL-1R 리간드가 공통의 진화 조상임을 나타낸다.
동물 모델에서, IL-1ra를 투여하면 내독소 쇼크에 의한 치사를 억제하고, 이. 콜라이-유도된 저혈압을 유도한다. 또한, IL-1ra는 활액 세포로부터의 IL-1 유도된 PGE2합성과 연골세포로부터의 콜라게나제 합성을 차단한다.
IL-1은 IL-6 및 TNFα와 밀접하게 관련된 다기능성 시토킨이다. IL-1은 염증성 반응을 중재하고, B 세포 및 T 세포를 활성화하고, 헤모생성을 자극한다. 또한, IL-1은 세 가지 분자의 상승작용을 강화하는 IL-6와 TNFα의 주요 유도인자이다.
IL-1의 분자클로닝은 유사한 활성 스펙트럼을 공유하는 두 가지의 독특한 IL-1 단백질, 즉, IL-1α와 IL-1β의 특성을 유도한다. IL-1α와 IL-1β는 특정의 세포 타입에서 상이하게 발현되며, 각각 T 세포와 B 세포상에서 발현된 IL-1 수용체에 대한 이들의 결합 친화성이 다르다. 그러나, 현재, 두 가지 형태의 IL-1의 존재에 대한 중요성을 이해하는 것은 어렵다.
4.6.4 치료 및 예방 화합물
IL-1 중재된 염증성 과정을 억제하는데 유용한 것으로 상기 설명된 화합물은, 예를 들어, 핵산(예, DNA, RNA 또는 PNA), 단백질, 펩티드, 펩티드의태체, 소분자, 또는 이의 유도체일 수 있다. 바람직한 화합물은 IL-1 유전자 또는 단백질에 결합할 수 있고, 이들의 전사, 번역, 처리 또는 활성을 억제할 수 있다. 이들의 예에는 안티센스, 리보좀 또는 3중 핵산, 소분자 리간드, 항체 또는 항체 유사 결합 단편이 있다. 또 다른 화합물은 IL-1 타입 1 수용체에 결합하여 세포표면상의 IL-1 알파 및 베타 단백질의 결합을 억제하기에 충분한 사람 또는 마우스 IL-1의 일부와 같이 IL-1 중재된 염증과 관련된 단백질의 경쟁성 억제제이다.
이러한 화합물의 독성과 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 과정에 의해서 측정될 수 있는데, 예를 들어, Ld50(개체군중의 50% 치사용량)과 Ed50(50%의 개체군에 치료학적으로 유효한 용량)을 측정함으로써 측정될 수 있다. 독성 및 치료효과 사이의 용량비율은 치료학적 지표이며, LD50/ED50의 비율로 표현된다. 상당한 치료효과를 유도하는 화합물이 바람직하다. 독성의 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수는 있지만, 비감염된 세포의 가능한 손상을 최소화하고 부작용을 감소시키기 위해서, 감염된 조직 부위로 그러한 화합물을 집중시키는 전달 시스템을 구성시키는 주의가 요망된다.
세포 배양물 검정 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인체에 사용하기 위한 일정 범위의 용량으로 제형하는데 이용될 수 있다. 이러한 화합물의 용량은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위내에 있다. 이러한 용량은 사용되는 용량형 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 어떠한 화합물의 경우에, 치료학적 유효 용량은 먼저 세포배양 검정에 의해서 산정될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 측정된 IC50(즉, 증상을 최대의 절반을 억제하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 하는 동물 모델로 제형될 수 있다. 이러한 정보는 인체에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 혈장에서의 수준은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 약제학적 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하는 통상의 방법으로 제형될 수 있다. 따라서, 화합물 및 이들의 생리학적으로 허용되는 염 및 용매가 예를 들어 주입, 흡입 또는 취입(입 또는 코를 통해서), 또는 경구, 구강, 비경구 또는 직장 투여에 의한 투여용으로 제형될 수 있다.
이러한 치료의 경우에, 본 발명의 화합물은 전신, 국소 또는 편재된 투여를 포함한 다양한 부하 투여용으로 제형할 수 있다. 기술과 제형방법은 일반적으로 레밍턴스 파마슈티컬 사이언스(Remmington's Pharmaceutical Science, Meade Publishing Co., Easton, PA)에서 알 수 있다. 전신 투여의 경우에, 근육내, 정맥내, 복강내 및 피하를 포함한 주입이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 액체 용액, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액, 예컨대, 행크 용액(Hank's solution) 또는 링게르 용액(Ringer's solution)으로 제형될 수 있다. 또한, 화합물은 고형으로 제형되고 사용 직전에 재용해되거나 현탁될 수 있다. 동결 건조된 형태가 또한 포함된다.
경구 투여의 경우에, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제, 예컨대, 결합제(예, 선젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오즈); 충전제(예, 락토오즈, 미세결정상 셀룰로오즈 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 중해제(예, 토마토 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤화제(예, 나트륨 라우릴 술페이트)로 통상의 방법에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태일 수 있다. 정제는 본 기술 분야에 공지된 방법으로 피복될 수 있다. 경구 투여용의 액체 제제는, 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태이거나, 사용전에 물 또는 다른 적합한 비히클과 재구성되는 건조 생성물로서 존재할 수 있다. 이러한 액체 제제는 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예컨대, 현탁제(예, 소르비톨 시럼, 셀룰로오즈 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클(예, 아티온드 오일, 오일성 에스테르, 에틸알콜 또는 분별된 식물성 오일); 및 보존제(예, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)으로 통상의 방법에 의해서 제조될 수 있다.
경구 투여용 제제는 활성 화합물을 조절 방출하도록 적합하게 제형될 수 있다. 구강 투여의 경우에, 조성물은 통상의 방법으로 제형된 정제 또는 로젠지의 형태일 수 있다. 흡입 투여의 경우에, 본 발명에 따른 사용되는 화합물은 통상적으로는 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스을 사용하는 가압된 팩 또는 분사기에 에어로졸 시럽으로 존재하는 형태일 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에, 용량 단위는 계량된 양을 전달하는 벨브를 제공함으로써 특정될 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 화합물과 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 염의 분말 혼합물을 함유하도록 제형될 수 있다.
본 발명의 화합물은 주입, 예를 들어, 거환 주입 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형될 수 있다. 주입 투여는, 예를 들어, 첨가된 보존제와 함께 앰플 또는 다수 용량 용기에 단위 용량형으로 존재할 수 있다. 이러한 조성물은 오일성 또는 수성 비히클내에 현탁액, 용액 또는 에멀션과 같은 형태로 존재할 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형제를 함유할 수 있다. 또한, 활성 성분은 적합한 비히클, 예를 들어, 무균의 피로겐 유리 물에 의해 사용전에 구성되는 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한, 예를 들어, 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드와 같은 통상의 좌약 베이스를 함유하는 좌제 또는 보유 관장제와 같은 직장용 조성물로 제형될 수 있다.
상기된 제형에 추가로, 본 발명의 화합물은 또한 저장용 제제로서 제형될 수 있다. 그러한 장시간 작용 제형은 이식(예, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주입에 의해서 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 화합물은 적합한 중합체 또는 소수성 물질(예, 허용되는 오일중의 에멀션) 또는 이온 교환 수지로 제형되거나, 거의 불용성의 유도체, 예를 들어, 거의 불용성의 염으로 제형될 수 있다. 다른 적합한 전달 시스템에는 연장된 기간에 걸쳐서 약물의 국소 비침습성 전달을 가능하게하는 미소구체가 포함된다. 이러한 기술은 관상동맥 카테테르를 통해서 염증 또는 허혈을 유발시키지 않으면서, 예를 들어, 심장 또는 그 밖의 기관의 소정의 부분내로 주입될 수 있는 포세관 크기의 미소구체를 이용한다. 투여된 치료제는 이들 미소구체로부터 서서히 방출되며 조직 세포(예, 내피세포)를 둘러쌈으로써 흡수된다.
전신 투여는 점막 투과 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 점막 투과 또는 경피 투여의 경우에, 투과되는 방벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 그러한 침투제는 일반적으로 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 점막 투과 투여의 경우에 담즘염 및 후시딘산 유도체를 포함한다. 또한, 세정제가 침투를 용이하게 하도록 사용될 수 있다. 점막 투과투여는 비내 스프레이를 통하거나 좌제를 사용함으로써 수행될 수 있다. 국소 투여의 경우에, 본 발명의 올리고머는 본 기술분야에 일반적으로 공지된 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형된다. 세척 용액이 상처 또는 염증을 처리하는데 국소적으로 사용되어 치유를 촉진시킬 수 있다.
치료제가 유전자인 경우에, 유전자 전달 시스템이 분 기술 분야에서는 친숙한 많은 방법중 어떠한 방법에 의해서 환자에게 도입될 수 있다. 예를 들어, 유전자 전달 시스템의 약제학적 제제는 정맥내 주입에 의해서 전신에 도입될 수 있으며, 표적 세포에의 단백질의 특이적 형질도입은 유전자 전달 비히클에 의해 제공된 트랜스펙션의 특이성, 수용체 유전자의 발현을 조절하는 전사 조절 서열에 기인된 세포형 또는 조직형 발현, 또는 이의 조합으로부터 선호적으로 발생된다. 또 다른 구체예에서, 재조합 유전자의 초기 전달은 편재되는 동물내로의 도입에 의해 제한된다. 예를 들어, 유전자 전달 비히클은 카테테르(미국특허 제5,328,470호) 또는 입체기술 주입법[문헌: Chen et al. (1994) PNAS 91:3054-3057]에 의해 도입될 수 있다. 안티센스 RNA 또는 리보자임을 암호하는 유전자와 같은 치료 유전자는, 예를 들어, 문헌[Dev et al. (1994) Cancer Treat Rev 20:105-115]에 기재된 기술을 사용한 전기 영동에 의해서 유전자 치료 구성물로 전달될 수 있다.
유전자 치료 제제는 허용되는 희석제중의 유전자 전달 시스템으로 구성될 수 있거나, 유전자 전달 비히클 또는 화합물이 함침된 서방성 매트릭스를 포함할 수 있다. 또한, 완전한 유전자 전달 시스템은 재조합 세포, 예를 들어, 레트로바이러스성 벡터로부터 무상으로 제조될 수 있는 경우에, 약제학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생성하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
요구되는 경우, 조성물은 활성성분을 함유하는 하나 이상의 단위 용량형을 함유할 수 있는 팩 또는 분산 장치로 존재할 수 있다. 팩은 예를 들어 발포된 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 분산 장치는 투여 설명서에 의해서 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 제한하고자 구성되는 것이 아닌 하기 실시예에 의해서 추가로 예시되고 있다. 본원 전체에서 인용된 바와 같은 참조된 문헌, 허여된 특허, 공개된 특허원을 포함한 모든 인용된 참고문헌의 내용은 본원에서 참조로 인용된다. 본 발명의 실시는, 달리 설명되지 않는 한, 본 기술 분야의 전문가에게는 자명한 세포 생물학, 세포배양, 분자생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 이용하고 있다. 이러한 기술은 하기 문헌에 상세히 설명되어 있다. 참조예[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ndEd., ed. by Sambrook, Fritsh and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent No:4,683,195; Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds 1984); Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); the treatise, Methods In enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols, 154 and 155(Wu et al. eds), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986].
실시예 1
녹아웃 구성물 및 녹아웃 포유동물의 제조
본 발명자들은 인터루킨-I 수용체 길항제(IL-1RN) 유전자의 불활성화된 삭제부를 함유하는 마우스의 군을 생성시켰다. 유전자의 삭제는 엑손 3 내의 EcoRV 부위로부터 번역 중지 코돈의 하류에 있는 엑손 4 내의 첫 번째 XbaI 부위를 삭제함으로써 수행하였다. 녹아웃 구성물은 NheI로 선형화되는 경우에 하기된 바와 같이 작도되는 환형 플라스미드였다:
NheI는 서열(인트론)의 위치 916과 상응하였다. 첫 번째 IL-1RN동족성 단편은 위치 916으로부터 위치 3530의 EcoRV까지 뻣어있다. 중단은 전단백질의 코돈 100의 전사체를 파괴하여, 성숙한 IL-1 수용체 길항제에 대한 암호서열의 절반만을 무상으로 유지시켰다. IL-1 수용체 길항제(서열의 산재된 부분이 단백질의 구조를 지지하는 단일의 폴디드 도메인)의 구조가 주어지는 경우, 본 발명자들은 이 전사체의 단백질 생성물이 기능적일 수 없는 것으로 판단했다.
선형화된 마아커 서열(전체 길이 4.4kb)는, 순서대로, 1) 프레임내 번역 중지 코돈을 함유하는 링커 서열; 2) 아미노글리코시드 포스포트랜스페라제(aph) a/k/a를 유도하는 베타-액틴 프로모터, 네오마이신, 카나마이신 또는 G418 내성 유전자로 구성되는 전화된 마아커 유전자; 3) 베타-락타마이즈 유전자(이. 콜라이에서 플라스미드 선택을 위한 암피실린 내성)를 포함하는 플라스미드의 본체; 이어서, 4) 링커 서열을 함유하였다. 마아커 서열은 위치 4791의 XbaI 부위에서 시작하는 나머지 IL-11RN 유전자에 이어졌다. 제 2 동족성 부분은 엑손 4내의 위치 4791로부터 유전자의 서열화된 DNA의 단부를 지나 NheI 부위까지 연장되었다. NheI 부위는 상기된 자헤디(Zahedi)등의 문헌에 넘버링을 이용함으로써 약 11800으로 작도되었다. 따라서, 전체 동족성 서열은 2.5kb + 7.0kb =9.5kb였다. 환형 플라스미드에서, 두 곳의 NheI 부위가 단위화되어, 플라스미드의 어떠한 부분을 분리해낼 필요가 없이 구성물 생성된 형질 감염 가능한 녹아웃 구성물을 선형화시켰다.
선형화된 녹아웃 구성물을 전기영동에 의해서 ES 세포(129/Olac)내로 형질 감염시켰으며, 형질 감염된 세포를 항생성 G418에서 인큐베이션함으로써 선택하였다. 양성 세포를 MF1 수용 배내로 주입하였다. 키메라를 동정하고 이계 교배된 알비노주(MF1)과 교배시켰다. 형질전환된 이종접합체를 동정하고 서로 교배시켜서 동종접합 마우스를 생성시켰다. 그때부터 모든 동물을 동종 번식시켰다.
실시예 2
IL-1RN 녹아웃 포유동물
본 발명자들은 염증성 질환을 찾기 위해서 IL-1RN 녹아웃 동종접합체의 군을 연구하였다. 한가지 두드러진 상태는 하기 설명된 바와 같은 광범위한 동맥염 병변의 상태였다. 그러나, 연구는 다른 염증성 병인을 동정하기 위해서 계속 진행하였다.
약 1년 이상 이래로 정상의 동물 우리 조건에서, 분 발명자들은 60 마리의 동종접합 동물과 56 마리의 이종접합체의 개체군을 사육하였다. 40마리의 동종접합체 및 54 마리의 이종접합체의 그룹을 출생후 300일까지 동시 사육하였다. 그 기간 동안 2 마리의 이종접합체(5%)와 42 마리의 동종접합체(78%)가 사망하거나 질환으로 실험을 중단시켰다. 동종접합체의 사망 중간 일령은 156일이었다. 40 마리의 동종접합 마우스에 대해서 해부를 수행하였으며, 36 마리에서 명확한 동맥염을 발견하면서, 15마리는 파열된 동맥류로부터의 출혈로 사망하였음을 발견하였다. 전체적으로, 85 마리의 동종접합체와 5 마리의 이종접합체가 자발적으로 사망하거나 질환이 억제되도록 중단되었다. 장래에 사망하거나, 질병으로 인해서 중단되거나 자발적으로 사망하였든지, 해부가 수행된 모든 동종접합체를 검사하여 보면, 48마리중에 43마리가 동맥염 병변을 앓고 있는 것으로 밝혀졌다.
관찰된 동맥염은 동물 거대 세포 동맥염과 유사한 하기 특성을 나타냈다:
큰 혈관과 중간의 혈관에 영향을 주고 광범위하게 분포되고 있다.
동맥내막은 영향을 받지 않으면서 탄성층이 붕괴되고 사라졌다.
방대한 염증 침윤이 전체 혈관벽에 걸쳐서 발견된다.
병변은 관상 동맥을 포함한 주요 동맥의 가지부, 분기부 및 만곡부에 집중되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 발명자들은 그 때까지 시험된 17 마리의 장래에 사망한 이종접합 동물중 8 마리에서 동맥염 병변이 검출되었지만, 이종접합 동물은 아직 명백하게 동맥염의 결과로 사망하지 않았다. 병변은 심각하지 않으며, 회복과 반흔의 증거는 있으면서 동맥류의 증거는 없다. 반면, 유사한 연령의 8 마리의 야생형 한배 새끼들에서는 병변이 관찰되지 않았다.
이러한 발견은 동맥 항상성에서의 IL-1 시스템에 대한 중요한 역할을 나타낸다. 특히, IL-1 활성의 IL-1 수용체 길항제 억제제를 생성하는 능력이 결여된 마우스에서의 저지되지 않은 IL-1 활성은 동종접합 IL-1RN 삭제 돌연변이 동물에서 과다한 치사율을 유발시키는 병인성 동맥 염증을 유도한다. 이들 동물은 동맥 질환을 예방하거나, 동맥질환의 진행을 중지시키거나, 동맥질환의 병리학적 변화를 전환시키고자 하는 새로운 제제, 기존의 제제 및 그 밖의 치료방법을 발견하고 시험하는데 중요한 모델일 수 있다.
또한, 이들 동물은 IL-1 유전자 생성물 및 IL-1 케스케이드를 직접적으로 목표로 하는 제제를 연구하고, 강한 IL-1 성분에 의한 그 밖의 염증성 상태를 연구하는데 유용할 것이다.

Claims (24)

  1. 형질전환된 사람 이외의 생물체로서, 생물체가 내인성 인터루킨-1 수용체 길항제 유전자의 표적화된 파괴를 함유하여, 생물체가 작용성 IL-1ra 단백질을 발현시키지 못하도록 하는 생물체.
  2. 제 1항에 있어서, 인터루킨-1 수용체 길항제 유전자가 사람 인터루킨-1 수용체 길항제 유전자임을 특징으로 하는 생물체.
  3. 제 1항에 있어서, 생물체가 인터루킨-1 수용체 길항제 유전자의 표적화된 파괴에 대해 이형접합성임을 특징으로 하는 생물체.
  4. 제 1항에 있어서, 생물체가 인터루킨-1 수용체 길항제 유전자의 표적화된 파괴에 대해 동형접합성임을 특징으로 하는 생물체.
  5. 제 4항에 있어서, 동물이 염증 질환의 특징이 되는 표현형을 나타냄을 특징으로 하는 생물체.
  6. 제 5항에 있어서, 염증 질환이 류마티스성 관절염, 염증성 배변 질환, 타입 I 당뇨병, 건선, 골다공증, 진성당뇨병에서의 신증, 원형 탈모증, 그레이브스병, 전신성 홍반성 루푸스, 경화성 태선, 궤양성 대장염, 관상 동맥 질병, 동맥 질환, 당뇨병성 망막증, 출생시 저체중, 임신 합병증, 중증 치근막 질병, 건선 및 인슐린 의존성 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 생물체.
  7. 제 5항에 있어서, 표현형이 동맥 병변의 존재임을 특징으로 하는 생물체.
  8. 제 1항에 있어서, 파괴가 야생형 유전자의 엑손 3의 EcoRV 부위 내지 엑손 4의 첫 번째 XbaI 부위에서 일어남을 특징으로 하는 생물체.
  9. 제 1항에 있어서, 생물체가 포유동물임을 특징으로 하는 생물체.
  10. 제 9항에 있어서, 포유동물이 마우스임을 특징으로 하는 생물체.
  11. 형질전환된 사람 이외의 생물체로부터의 세포 또는 세포계통으로서, 세포 또는 세포계통이 인터루킨-1 수용체 길항제 유전자의 표적화된 파괴를 함유하여, 생물체가 작용성 IL-1ra 단백질을 발현시키지 못하도록 하는 세포 또는 세포계통.
  12. 제 11항에 있어서, 미분화되거나 탈분화된 세포임을 특징으로 하는 세포 또는 세포계통.
  13. 제 12항에 있어서, 미분화된 세포가 간세포, 배 간세포, 난모세포 및 배세포로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 세포 또는 세포계통.
  14. 제 11항에 있어서, 파괴가 야생형 유전자의 엑손 3의 EcoRV 부위 내지 엑손 4의 첫 번째 XbaI 부위에서 일어남을 특징으로 하는 세포 또는 세포계통.
  15. 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1RN) 유전자가 표적화 파괴된 사람 이외의 포유동물을 생성시키는 방법으로서,
    a. IL-1RN 유전자의 일부와, 마커에 의해 치환된 IL-1RN 유전자의 내부에 있는 일부를 포함하는 녹아웃 구성물을 생성시키는 단계;
    b. 녹아웃 구성물을 배 간세포의 집단내로 트랜스펙션시키고, 마커를 발현시키는 트랜스펙션된 ES 세포를 선택하는 단계;
    c. 트랜스펙션된 ES 세포를 포유동물의 조상의 배내로 도입시키는 단계;
    d. 배를, 배선중에 녹아웃 구성물을 갖는 키메라 포유동물이 생성될 때까지 발육시키는 단계; 및
    e. 키메라 포유동물을 성장시켜서, IL-1RN 유전자가 표적화 파괴된 이형접합성 포유동물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 사람 이외의 생물체가 포유동물임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 사람 이외의 생물체가 마우스임을 특징으로 하는 방법.
  18. 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1RN) 유전자의 일부를 포함하는 IL-1 수용체 길항제 녹아웃 구성물로서, IL-1RN의 내부에 있는 일부가 선택성 마커에 의해 치환되어 있는 구성물.
  19. 제 18항에 있어서, 선택성 마커가 티미딘 키나아제, 네오마이신, 녹색 형광성 단백질 및 히그로마이신 B 포스포트란스페라제로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코드화하는 유전자임을 특징으로 하는 구성물.
  20. 제 18항에 있어서, 내부에 있는 일부가 엑손 3의 EcoRV 부위 내지 엑손 4의 XbaI 부위에 존재하고, 마커가 네오마이신 내성 유전자임을 특징으로 하는 구성물.
  21. a. 인터루킨-1 널(null) 대립유전자에 대해 동형접합성인 형질전환된 포유동물을 수득하고,
    b. 제제를 형질전환된 동물에게 투여하고,
    c. 염증 질환을 호전시키는 제제를, 염증 질환에 대해 효과를 갖는 것으로서 선택하는 것을 포함하여, 제제를 염증 질환에 대한 효과에 대해 시험하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 염증 질환이 류마티스성 관절염, 염증성 배변 질환, 타입 I 당뇨병, 건선, 골다공증, 진성당뇨병에서의 신증, 원형 탈모증, 그레이브스병, 전신성 홍반성 루푸스, 경화성 태선, 궤양성 대장염, 관상 동맥 질병, 동맥 질환, 당뇨병성 망막증, 출생시 저체중, 임신 합병증, 중증 치근막 질병, 건선 및 인슐린 의존성 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 인터루킨-1 널 대립유전자가 IL-1RN 널 대립유전자임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 21항에 있어서, 염증 질환이 동맥 병변임을 특징으로 하는 방법.
KR1020007005243A 1997-11-13 1998-11-13 염증 질병의 형질전환된 모델 KR20010015814A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9723835.6A GB9723835D0 (en) 1997-11-13 1997-11-13 Interleukin knockout
GB9723835.6 1997-11-13
PCT/US1998/024287 WO1999025857A2 (en) 1997-11-13 1998-11-13 Transgenic models of inflammatory disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20010015814A true KR20010015814A (ko) 2001-02-26

Family

ID=10821919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020007005243A KR20010015814A (ko) 1997-11-13 1998-11-13 염증 질병의 형질전환된 모델

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP1030926A2 (ko)
JP (1) JP2001523467A (ko)
KR (1) KR20010015814A (ko)
AU (1) AU1796699A (ko)
BR (1) BR9814142A (ko)
CA (1) CA2309807A1 (ko)
GB (1) GB9723835D0 (ko)
HU (1) HUP0004352A2 (ko)
IL (1) IL136013A0 (ko)
NO (1) NO20002477L (ko)
PL (1) PL340829A1 (ko)
TR (1) TR200001356T2 (ko)
WO (1) WO1999025857A2 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030067204A (ko) * 2002-02-07 2003-08-14 한국생명공학연구원 퍼록시레독신-ⅱ 유전자 결손 생쥐 및 이의 생산방법
WO2019235839A1 (ko) * 2018-06-05 2019-12-12 사회복지법인 삼성생명공익재단 그레이브스 안병증 표현형 동물 모델, 그의 제조방법 및 그레이브스 안병증 치료물질 스크리닝 방법

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6437216B1 (en) 1997-11-13 2002-08-20 Interleukin Genetics Inc. Transgenic models of inflammatory disease
WO2001056606A1 (fr) * 2000-01-31 2001-08-09 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Remedes pour troubles ophtalmiques
WO2005078098A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-25 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Modified cells that co-express blimp1 and a reporter molecule and methods of using the same
JP2009183176A (ja) * 2008-02-05 2009-08-20 Univ Of Tokyo Ｉｌ−１タイプｉｉレセプター遺伝子の欠損変異体マウス
JP5186637B2 (ja) * 2009-07-30 2013-04-17 国立大学法人富山大学 トランスジェニック非ヒト哺乳動物およびその利用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1269989B (it) * 1994-09-21 1997-04-16 Dompe Spa Antagonisti recettoriali di il-1 ad aumentata attivita' inibitoria
JPH10507637A (ja) * 1994-10-20 1998-07-28 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド インターロイキン−１β欠損トランスジェニック動物
US6210877B1 (en) * 1997-03-10 2001-04-03 Interleukin Genetics, Inc. Prediction of coronary artery disease

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030067204A (ko) * 2002-02-07 2003-08-14 한국생명공학연구원 퍼록시레독신-ⅱ 유전자 결손 생쥐 및 이의 생산방법
WO2019235839A1 (ko) * 2018-06-05 2019-12-12 사회복지법인 삼성생명공익재단 그레이브스 안병증 표현형 동물 모델, 그의 제조방법 및 그레이브스 안병증 치료물질 스크리닝 방법

Also Published As

Publication number Publication date
GB9723835D0 (en) 1998-01-07
IL136013A0 (en) 2001-05-20
BR9814142A (pt) 2000-10-03
JP2001523467A (ja) 2001-11-27
AU1796699A (en) 1999-06-07
TR200001356T2 (tr) 2000-08-21
NO20002477D0 (no) 2000-05-12
WO1999025857A3 (en) 1999-07-15
PL340829A1 (en) 2001-02-26
NO20002477L (no) 2000-07-12
EP1030926A2 (en) 2000-08-30
CA2309807A1 (en) 1999-05-27
HUP0004352A2 (en) 2001-03-28
WO1999025857A2 (en) 1999-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230189772A1 (en) Humanized il-15 animals
Horai et al. Production of mice deficient in genes for interleukin (IL)-1α, IL-1β, IL-1α/β, and IL-1 receptor antagonist shows that IL-1β is crucial in turpentine-induced fever development and glucocorticoid secretion
Ernst et al. Defective gp130-mediated signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling results in degenerative joint disease, gastrointestinal ulceration, and failure of uterine implantation
Parkins et al. Lethal β-thalassaemia in mice lacking the erythroid CACCC-transcription factor EKLF
Fülöp et al. Impaired cumulus mucification and female sterility in tumor necrosis factor-induced protein-6 deficient mice
Wei et al. Altered immune responses and susceptibility to Leishmania major and Staphylococcus aureus infection in IL-18-deficient mice
Horai et al. Production of Mice Deficient in Genes for Interleukin (IL)-1�, IL-1�, IL-1�/�, and IL-1 Receptor Antagonist Shows that IL-1� Is Crucial in Turpentine-induced Fever Development and Glucocorticoid Secretion
Davy et al. Ephrin-B1 forward and reverse signaling are required during mouse development
Clarke et al. Myeloid‐specific gene expression
JP2002500039A (ja) 機能あるヒトリポタンパク質（ａ）を発現するトランスジェニックウサギ
AU2009201840A1 (en) Transgenic Non-Human Mammal comprising a polynucleotide encoding human or humanized C5aR
US6437216B1 (en) Transgenic models of inflammatory disease
JPH10513359A (ja) サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ４およびＣＤＫ６のインヒビター、ＩｎＫ４ｃ−ｐ１８およびＩｎＫ４ｄ−ｐ１９、ならびにそれらの使用
US20020173460A1 (en) Use of recombinant human uteroglobin in treatment of inflammatory and fibrotic conditions
KR20010015814A (ko) 염증 질병의 형질전환된 모델
JP2006519588A (ja) 間質性肺疾患の診断および治療方法
US6172278B1 (en) Ikaros transgenic cells and mice
Chien et al. Toward molecular strategies for heart disease past, present, future
WO2006016692A1 (ja) ノックアウト非ヒト動物
US20050125851A1 (en) Methods of diagnosis and treatment of interstitial lung disease
MXPA00004597A (en) Transgenic models of inflammatory disease
JP4484708B2 (ja) 自己免疫疾患を治療する方法および自己免疫疾患の治療化合物をスクリーニングする方法
JP2000209980A (ja) インタ―ロイキン―１関連疾患モデルノックアウト動物
US6010694A (en) Fibrillin 1 gene comprising duplication mutation and compositions and kits using the same
Born et al. The calcitonin peptide family: what can we learn from receptor knock out and transgenic mice

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application