WO2002009507A1

WO2002009507A1 - Somatischer klonierungs-gentransfer zur produktion von rekombinanten proteinen, zellen und organen

Info

Publication number: WO2002009507A1
Application number: PCT/EP2000/007239
Authority: WO
Inventors: Gottfried Brem
Original assignee: Apogene Gmbh & Co. Kg
Priority date: 2000-07-27
Filing date: 2000-07-27
Publication date: 2002-02-07
Also published as: JP2004518405A; US8030537B1; AU2000265672A1; EP1303183A1; CA2416877A1; CA2416877C

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Stoffen, bei dem Zellen mit einer den Stoff codierenden Nukleotidsequenz transformiert werden, die transformierten Zellen einem Klonierungsprozess unterworfen werden, und die so erhaltenen Zellen in einen Empfängerorganismus eingebracht werden. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Nutzung des Verfahrens bei der Produktion rekombinanter Proteine, Zellen und Geweben. Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, bei dem Zellen eines Individuums isoliert werden, diese Zellen zum weiteren Wachstum in ein immuninkompetentes Tier eingebracht werden und die in dem Tier gewachsenen Zellen, Gewebe und/oder Organe wieder isoliert und in ein Individuum eingebracht werden.

Description

Somatischer Klonierungs-Gentransfer zur Produktion von rekombinanten Proteinen, Zellen und Organen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Stoffen, bei dem Zellen mit einer den Stoff codierenden Nukleotidsequenz transformiert werden, die transformierten Zellen einem Klonierungsprozess unterworfen werden, und die so erhaltenen Zellen in einen Empfängerorganismus eingebracht werden. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Nutzung des Verfahrens bei der Produktion rekombinanter Proteine, Zellen und Geweben. Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, bei dem Zellen eines Individuums isoliert werden, diese Zellen zum weiteren Wachstum in ein immuninkompetentes Tier eingebracht werden und die in dem Tier gewachsenen Zellen, Gewebe und/oder Organe wieder isoliert und in ein Individuum eingebracht werden.

Mit dem Aufkommen der rekombinanten Gentechnologie wurden zur Herstellung nützlicher Stoffe vermehrt biologische Systeme einbezogen. So werden gegenwärtig eine Vielzahl von Proteinen in in vitro Zellkultursystemen hergestellt. Aufgrund der Aufklärung der Nukleotid- sequenz des menschlichen Genoms ist zu erwarten, daß die Ermittlung neuer Proteme und deren Rolle im menschlichen Körper gefördert und beschleunigt wird, so daß in naher Zukunft eine Vielzahl neuer Stoffe für medizinische oder sonstige Zwecke zur Verfügung stehen werden, deren Herstellung gewünscht ist. Die Verwendung bestehender in vitro Zellkultursysteme zu diesem Zweck beinhaltet jedoch den Nachteil, daß bis zur optimalen Produktion der entsprechen- den Stoffe mindestens 1 bis 2 Jahre vergehen. Darüber hinaus sind derartige Systeme kompliziert zu handhaben, störanfällig und kostenintensiv. So ist beispielsweise eines der größten Schwierigkeiten im großen Maßstab betriebener Zellkultursysteme die Gefahr der Verunreinigung der Kulturlösung.

h den letzten Jahren wurden zur Produktion von industriell und pharmazeutisch interessanten Stoffen vermehrt Tiere einbezogen. Dazu wird neben der Erstellung sogenannter Keimbahn- transgener Tiere der somatische Gentransfer eingesetzt, bei dem eine einen bestimmten Stoff codierende DNA in somatische Zellen des Zielindividuums eingebracht wird. Dies kann entweder in vivo, d.h. im Gesamtorganismus erfolgen, oder in vitro, d.h. im Labor in Zellen, die aus dem Organismus gewonnen wurden und nach Einbringen des Konstrukts in diese Zellen wieder in diesen zurückgeführt werden. Das Konstrukt wird dann im Tier zur Expression gebracht, so daß der Stoff von Interesse in dem Tier seine Wirkung entfalten kann.

Ein dem Transfer von Genkonstrukten in somatische Zellen inhärenter Nachteil liegt jedoch darin, daß das eingebrachte Gen nur in dem behandelten Individuum zur Expression bzw. Wirkung kommt und auf die Lebensdauer der transformierten Zellen beschränkt ist. Eine Übertragung auf Folgegenerationen ist ausgeschlossen.

Beim somatischen Gentransfer zusätzlich auftretende Probleme sind insbesondere eine oft nur unter großen Mühen erreichbare ausreichend große Zahl an spezifischen Zielzellen mit stabiler Transfektion, sowie die Zufälligkeit der Integration des eingebrachten Konstrukts, die die Eigenschaften und/oder das Verhalten der Zielzellen negativ beeinflussen kann. Weiterhin treten häufig Probleme hinsichtlich einer ungenügenden Expression des durch das eingebrachte Konstrukt codierten Polypeptids auf, was neben den auf der DNA-Ebene liegenden Schwierigkeiten auch auf bestimmte intra- und extrazelluläre Barrieren zurückzuführen sein kann und jeweils aus- getestet werden muß. Die vorstehend beschriebenen Probleme schränken daher die Nutzung der Anwendungsmöglichkeiten des somatischen Gentransfers in der Biotechnologie im weitesten Sinne und in der Nutztierproduktion im speziellen erheblich ein.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden und ein neues Verfahren zur Herstellung von bestimmten interessanten Stoffen zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Stoffen, bei dem in einem ersten Schritt Zellen mit einer den Stoff codierenden Nukleotidsequenz transformiert werden, die transformierten Zellen einem Klonierungsprozess unterworfen werden, und die in dem Klonierungsschritt erhaltenen Zellen in einen Empfängerorganismus eingebracht werden. Die in dem ersten Verfahrensschritt eingesetzten Zellen können jedwede, aus einem Individuum isolierte Zellen sein, die einem Klonierungsprozess unterworfen werden können. Beispiele hierfür sind insbesondere fetale oder adulte Fibroblasten, primordiale Keimzellen, Granulosazellen, Thymozyten, Milzzellen, Leberzellen, Makrophagen, Hoden oder Ovarzellen etc.. Die Zellen können als solche, wie isoliert, oder in Kultur gehalten eingesetzt werden, wobei diese auch vor der Transformation einem Klonierungsverfahren unterworfen worden sein können.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die zur Transformation eingesetzten Zellen aus einem bereits vorhandenen Zeilklon, einer Zellkultur oder einem Organismus isoliert. Als Zellklon sollen im Sinne der Erfindung in vitro kultivierte, klonierte Zellen, Feten aus Klonierung oder Klontiere verstanden werden.

Die Zellen werden anschließend mit einer Nukleotidsequenz transformiert, die für den Stoff von Interesse codiert. Als Stoff werden dabei alle im Körper synthetisierbaren Stoffe verstanden, wie Proteine, Polysaccharide, Lipide etc., aber auch die Zellen, Gewebe und Organe, die die eingebrachte Nukleotidsequenz aufweisen. Die für den Stoff codierende Nukleotidsequenz ist daher nicht nur eine den Stoff direkt codierende Sequenz, sondernd auch eine Sequenz, die verschiedenen Polypeptide/Εnzyme codiert, die den Stoff von Interesse in den bzw. außerhalb der Zellen bilden. Als rekombinant werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Gene bezeichnet, die für das Tier entweder exogen sind oder auch endogen, jedoch mittels rekombinanter Gentechnologie in ihrem Expressionsmuster verändert wurden, wie beispielsweise in ihrem Differenzierungs-spezifϊschen Expressionsmuster oder der exprimierten Menge.

Zur Transformation können alle derzeit bekannten Techniken eingesetzt werden, wie physikalische, chemische oder virale Techniken. Im Hinblick auf eine gerichtete Integration des Konstrukts an bestimmten Stellen im Genom ist der Einsatz homologer Rekombination bevorzugt. Sollen große Gencluster in die Empfängerzelle eingebracht werden, so ist auch die Verwen- düng artifizieller Chromosomen möglich. Auch Zellhybride, wie sie für die Kartierung eingesetzt werden, können erstellt und darauf selektioniert werden, daß sie neben dem Nutztiergenom auch spezifische chromosomale Fragmente aus dem Zielgenom enthalten. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn ein gesamtes System des Zielgenoms, wie beispielsweise das Immunglobu- lingensystem, transferiert werden soll.

Die Zellen werden anschließend einem Klonierungsprozess unterworfen. Klonierungsverfahren sind mittlerweile bekannt und beispielsweise in der PCT/EP98/00230 (WO 99/36510), sowie der PCT/EP/00229 (WO ) beschrieben, die hier unter Bezugnahme mit aufgenommen wird. Die Monierten Zellen werden dann bis zu einem bestimmtn Entwicklungsstadium in vivo und/oder in vitro wachsen gelassen, beispielsweise bis zum Fetus, und dann in den Empfängerorganismus eingebracht (Schritt c) von Anspruch 1). Gleichermaßen können die klonierten Zellen soweit wachsen gelassen werden, daß eine bestimmte Ausdifferenzierung vorliegt, wobei bereits bestimmte, ausdifferenzierte Zellen in den Empfängerorganismus eingebracht werden.

Die klonierten Zellen werden anschließend in einen Empfängerorganismus eingebracht, der ein Tier, ein tierischer Fetus, ein tierisches Embryo bzw. ein tierisches Zellaggregat, sowie auch Monierte Tiere, klonierte tierische Feten, klonierte tierische Embryonen und Zellagregate sein kann. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Ausgangszellen, die transformiert und einem Klonierungsprozess unterworfen werden, vom gleichen Genotyp wie der Empfänger- organismuns.

Ein Vorteil einer derartigen Vorgehensweise ist darin zu sehen, daß ein bereits vorhandener, d.h. auf Vorrat hergestellter Empfängerorganismus in sehr kurzer Zeit mit Zellen, vorzugsweise vom gleichen Genotyp, versehen werden kann, die neu zu exprimierende Gene enthalten, und rekom- binante Stoffe produzieren. Die dabei im Vergleich zum konventionellen Keimbahngentransfer zu erzielende Zeitersparnis bis zum Erhalt produktionsreifer Tiere kann bis zu 5 Jahre betragen. Darüber hinaus ist das vorliegende Verfahren unabhängig von der Zeitersparnis und dem schneller zu erhaltenden Produktionssystem mit der einhergehenden Kostenersparnis auch effizienter, da die produzierenden Organismen kostengünstiger generiert werden können. So ist es möglich in vitro vorhandene Zellen eines Klons, zu dem auch bereits lebende Tiere vorhanden sind, als Ausgangszellen für die Transformation einzusetzen und diese nach Transformation und Klonierung in den Empfängerorganismus, welcher, da zum Klon gehörig, inhärent den gleichen Genotyp aufweist, einzubringen. Ein weiterer Vorteil des hier beschriebenen, als somatischer Klonierungs-Gentransfer bezeichneten Verfahrens ist auch darin zu sehen, daß auf neue Anforderungen bzw. Bedürfnisse bei der Expression rekombinanter Proteine schnell reagiert^" werden kann. Im Normalfall dauert es selbst bei Verwendung einer Nutztierspezies mit kurzem Generationsintervall, wie beispiels- weise bei einem Kaninchen, mindestens 7 Monate, bis nach Erstellung der Konstrukte ausreichend Material für die ersten Untersuchungen der exprimierten Gene vorhanden ist. Bis zur Produktion des gewünschten Polypeptids ist zusätzlich ein weiteres Jahr erforderlich. Beim Rind dauert der Vorgang, bis mittels transgener Tiere das Polypeptid von Interesse erhalten werden kann, mindestens 3 bis 4 Jahre. Demgegenüber ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine erhebliche Verkürzung der Zeit bis bei einem bereits vorhandenem Empfängerorganismus mit einem neuen Konstrukt Zellen transformiert und Expressionsklone geschaffen werden können (Dauer lediglich ein paar Monate).

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht daher in einer zu der in vitro Zellkultur vergleich- baren Zeitspanne zu ersten Proteinmengen für die Analyse zu kommen, wobei erfindungsgemäß zusätzlich bereits ein Produktionssystem zur Verfügung steht, mit dem die gewünschte Substanz produziert werden kann. Die Empfängerorganismen bzw. Tiere können daher schnell zur Herstellung der gewünschten Stoffe verwendet werden.

In bestimmten Fällen ist es vorteilhaft, den vorzugsweise auf Vorrat produzierten oder zu produzierenden Empfängerorganismus spezifisch auf den späteren somatischen Zell-Gentransfer vorzubereiten. Dies ist insbesondere dann erforderlich, wenn den applizierten transgenen oder anders aufbereiteten Zellen gegenüber den im Empfängerorgamsmus vorhandenen Zellen oder Strukturen einen Vorteil verschafft werden soll, um zu einer besseren Expression oder Ausprä- gung zu kommen.

Dazu können beispielsweise im Empfängerorganismus bestimmte Zellen, Gewebe oder Organe entfernt werden, was durch physikalische, chemische, immunologische, molekulargenetische oder chirurgische Verfahren erreicht werden kann. Darüber hinaus können Tiere bzw. Feten, die an entscheidenden Genorten homozygot negativ sind (Screen-out Konzept) gezüchtet bzw. auf Vorrat gehalten und nach Bedarf eingesetzt werden. Eine Möglichkeit zur Depletion von bestimmten Zellen, Geweben oder Organen im Empfängerorganismus besteht darin, bereits transgene Organismen einzusetzen, die ein Konstrukt enthalten, welches unter der Kontrolle eines Entwicklungsstadiums-spezifischen oder eines induzierbaren Promoters liegen. Im ersten Fall wird bei Aktivierung des Promoters während des bestimmten Entwicklungsstadiums automatisch und gewebespezifisch ein Protein gebildet, das zum Absterben/ Apoptose der entsprechenden Zellen führt, beispielsweise das Diphterie-Toxin. Im zweiten Fall wird ein "Suizid"-Genkonstrukt, das einen geeigneten Gewebe-spezifischen Promoter vorgeschaltet hat, durch Applikation eines spezifischen Agens, wie beispielsweise Tetrazyklin oder Ecdyson aktiviert, was zur zeitlich frei bestimmbaren, spezifischen Depletion der Zellen, Geweben oder Organen in dem Empfangerorganismus führt.

Eine einfache Möglichkeit zur Bereitstellung und Propagation derartiger Organismen stellt deren Klonierung dar, mit der das einmal in den Organismus eingebrachte Konstrukt stabil auf Nachkommen weitergegeben werden kann. Es ist klar, daß dadurch jedwede Zellen, Gewebe bzw. Organe in dem Organismus nach Bedarf in deren Proliferation bzw. Entwicklung beeinflusst werden kann.

Als Beispiel einer Depletion bestimmter Zellen kann die Entfernung von Zellen/Gewebe angeführt werden, aus denen normalerweise die Milchdrüse entsteht. Bei der Geburt eines Tieres sind relativ wenige dieser Zellen vorhanden. Diese bilden sich erst im Verlaufe der ersten Trächtigkeit und kurz vor der Geburt kommt es zu einer starken Proliferation und zur Bildung der funktioneilen Milchdrüse. Werden daher diese, im frühen Entwicklungsstadium des Empfängerorganismus nur in geringer Anzahl vorhandenen Stammzellen der Mammadrüse in einem tierischen Organismus entfernt und diese entfernten Zellen durch rekombinante (transformierte) Zellen dieses Typs, die eine zusätzliche Expressionskassette zur Synthese eines bestimmten rekombinanten Stoffes von Interesse tragen, ersetzt, so wird erreicht, dass in dem so erhaltenen tierischen Organismus die sich bildende Milchdrüse aus den applizierten transformierten Zellen gebildet wird. Als Folge wird in dem Nutztier auch der rekombinante Stoff in der eingebrachten Mamma- Anlage exprimiert. Die Zeitersparnis bei einem derartigen Vorgehen beträgt ca. 3 Jahre.

Ein weiteres Beispiel ist die totale oder teilweise Entfernung der Blutstammzellen oder der Stammzellen des immunologischen Systems aus dem Empfängerorganismus durch beispiels- weise Bestrahlung oder andere Verfahren und deren Ersatz durch transformierte Stammzellen, die erfindungsgemäß tranformiert und einem Klonierungsprozeß unterworfen wurden, und die beispielsweise die Expression humanisierter Antikörpern (AK) oder AK-Fragmente (beispielsweise bispezifische AK) oder anderen tierischen oder menschlichen Blutfaktoren ermöglichen. Werden bei den klonierten Stammzellen in-vitro die hnmunglobulingene des Tieres gegen diejenigen des Menschen ausgetauscht und werden diese Zellen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens in den Empfängerorganismus eingebracht, dann bilden diese Empfängerorganismen polyklonale humanidente Antikörper, die für die Therapie von menschlichen Erkrankungen von großem Wert sind.

Darüber hinaus kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens für Faktoren, die in den Tieren zwar vorhanden sind, für eine wirtschaftlich interessante Gewinnung jedoch in zu geringer Konzentration vorliegen, ein besonders effizientes und unproblematisches Produktionssystem erstellt werden. Ein Beispiel hierfür ist die Expression mehrerer Gene der Heparin- synthese unter sehr starken Promotoren. Da das Heparin natürlicherweise im Organismus vorhanden ist, würden weder gegen die Zellen, die vorzugsweise dem gleichen Genotyp angehören, noch gegen das Produkt irgendwelche immunologischen Reaktionen hervorgerufen werden.

Die Reklonierung von Zellen kann mindestens dreimal wiederholt werden. Es wurde diesseits gefunden, daß Zellen bis zu 150 Teilungen absolvieren können, d.h. die Zellen aus dem Klonierungsprozeß überleben wesentlich länger als normale Zellen und können deshalb auch nach mehreren Klonierungsvorgängen im Tier mindestens so lange überleben und Gene exprimieren, wie die Lebensspanne des Tieres ist.

In analoger Weise und Weiterentwicklung zu den vorstehenden Einsatzgebieten können von einem vorhandenen Tier Zellen gewonnen, und Embryonen, Feten und in vitro kultivierte Zelllinien erstellt werden. Diese Zelllinien werden mit bekannten Methoden genetisch modifiziert. Die Zellen werden dann direkt in der in-vitro-Kultur differenziert oder nach nochmaliger Klonierung aus Feten-Organen isoliert und als "transgene" aber sonst genotypisch herkunfts- gleiche Zellen in den adulten Ausgangsorganismus eingebracht. Da diese sich mit Ausnahme des Transgens immunologisch von diesem nicht unterscheiden, sind die Zellen in der Lage, sich im Tier zu etablieren und werden gemäß der genetischen Transformation beispielsweise rekombinante Stoffe produzieren.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von Zellen, Geweben oder Organen in tierischen Organismen, bei dem in einem ersten Schritt Zellen eines Individuums isoliert werden, die Zellen in einen immun-inkompetent tierischen Organismus eingebracht werden, der tierische Organismus gezüchtet wird, die in dem Organismus gewachsenen, Zellen des Individuums isoliert werden, und die isolierten Zellen in ein Individuum eingebracht werden.

Dieses Verfahren eignet sich insbesondere zum Züchten von Zellen, Geweben und Organen, vorzugsweise menschlichen Ursprungs, in tierischen Organismen, da die Zellen in dem tierischen Empfängerorganismus vermehrt werden bzw. auch zu Geweben und Organen wachsen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen des Ausgangsindividuums, bzw. die daraus gewachsenen Gewebe oder Organe wieder in das gleiche Individuum zurückgebracht, aus dem sie entnommen wurden, wobei Gewebe bzw. Organe zur Verfügung gestellt werden können, die bei einer Rückführung (Transplantation) in das Individuum nicht abgestoßen werden.

Als immun-inkompetenter tierischer Organismus wird jedes Tier, bzw. Fetus bzw. tierischer Embryo/Zellaggregat verstanden, das die von dem Ausgangsindividuum abgeleiteten Zellen nicht abstößt. Dazu eignen sich neben immun-defizient gemachten tierischen Organismen insbesondere Organismen, die sich in einer derart frühen Entwicklungsstufe befinden, während der das sich entwickelnde Immunsystem noch nicht gelernt hat zwischen eigen und fremd zu unterscheiden. Werden daher Zellen des Ausgangsindividuums in einen derartigen Empfängerorganismus eingebracht, dann werden diese Zellen nicht abgestoßen sondern im wesentlichen als eigen erkannt und entsprechend weiterentwickelt.

Als tierischer Empfangerorganismus eignen sich daher vorzugsweise tierische Organismen, die durch Klonierung erhalten wurden. So ist es möglich mehrere Feten bzw. Embryos oder

Zellaggregate auf Vorrat zu halten und nach Bedarf mit den Zellen des Ausgangsindividuums zu behandeln. Die Feten/Embryos/Zellaggregate werden anschließend bis zu einem Stadium wachsen gelassen, in dem sie die gewünschte Wirkung erbracht haben, beispielsweise bis zur Entwicklung des reifen Organs oder Gewebes oder auch bis zur Entwicklung einer ausreichenden Menge an Zellen des Ausgangsindividuums. Dieses Gewebe/Organ bzw. diese Zellen werden anschließend gewonnen, beispielsweise indem dem Tier das Organ entnommen wird, und in das Ausgangsindividuums überführt. Je nach Entfernung eines bestimmten Organs wird dies natürlich die Tötung des Tiers beinhalten.

Die Zellen des Ausgangsindividuums können in einen herkömmlichen Empfängerorganismus eingebracht werden. In diesem Fall ist zu erwarten, daß das Tier die Zellen/das Gewebe/das Organ chimär mit seinen eigenen Zellen/Gewebe/Organ ausbildet. Um sicherzustellen, daß in das Ausgangsindividuum nur seine "eigenen" Zellen zurückgeführt werden kann das entsprechende Gewebe/Organ/die Zellen insgesamt isoliert und die tierischen Zellen abgetrennt werden, was beispielsweise mittels Markierung unter Verwendung von gegen die tierischen Zellen gerichteter Antikörper sowie Auftrennung mittels FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) erreicht werden kann.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch die betreffenden Zellen/Gewebe/Organe aus dem Empfängerorganismus vorab entfernt, was wie vorstehend beschrieben erfolgen kann.

So werden beispielsweise bei einem fetalen Empfangerorganismus, bei dem die Organanlage entfernt wurde, die entsprechenden organspezifischen Stammzellen des Ausgangsindividuums, wie beispielsweise adulte humane Stammzellen, die direkt aus dem betroffenen Organ gewonnen werden, in den Fetus eingebracht und werden dann im Fetus die deputierten Zellen ersetzen und das entsprechende Organ bilden. Dadurch entsteht ein chimärer Organismus, der ein Xenoorgan enthält, das zur Transplantation geeignet ist. Das betreffende Organ stellt im tierischen Organismus ein Xenoorgan dar, das jedoch wegen der fehlenden Immunkompetenz des Fetus nicht abgestossen wird. Nach erfolgter Transplantation auf das Ausgangsindividuum, beispielsweise einen menschlichen Patienten, wird, wenn menschliche Stammzellen verwendet wurden, kein xeno genes sondern ein allo genes Transplantat vorliegen, oder ggf. sogar ein autologes Transplantat, wenn das Organ aus adulten Stammzellen eben dieses Individuums/Patienten entstanden ist, was bei bestimmten Organen und Krankheiten trotz des Zeitbedarfs von etwa einem Jahr möglich ist (z.B. Niere oder Leber).

Die Nutzung des vorliegenden Verfahrens erlaubt somit die Generierung von Zellen, Geweben bzw. Organen innerhalb einer kurzen Zeitspanne, so daß sogar bestimmte Patienten selbst schnell mit Organen mit einem im wesentlichen oder absolut gleichen MHC-Typ versorgt werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren löst daher die gegenwärtig bestehenden Probleme der Knappheit an verfügbaren Organen/Geweben für die Transplantation.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie einzuschränken. In den Beispielen wird die Gewinnung von bispezifischen Antikörpern aus dem Serum von nicht transgenen Klonkälbern mit transgenen Blutstammzellen beschrieben. Zur Generierung von Kälbern mit transgenen Knochenmarkszellen werden folgende Schritte durchgeführt, wobei für die Details auf die PCT/EP98/00230 bzw. PCT/EP98/0029 verwiesen wird, die hier unter Bezugnahme mit aufge- nommen werden.

1. Gewinnung und genetische Transformation von primären bovinen fetalen Fibroblasten

2. Klonierung durch Nukleustransfer und Transfer transgener Embryonen auf Empfängertiere

3. Gewinnung der Feten und Isolation transgener Knochenmarkstammzellen aus der fetalen Leber

4. Transfusion dieser transgenen Zellen in vorhandenen Klonkälber des gleichen chromosomalen Genotyps

5. Gewinnung von Serum durch Blutentnahme

6. Lyse von Tumorzellen mittels bispezifischer Antikörper

Beispiel 1

1. Gewinnung/genetische Transformation von primären bovinen fetalen Fibroblasten (BOFFs) a) Untersuchung der Sensivität von bovinen fetalen Fibroblasten (BOFFs) gegenüber verschie denen Antibiotika (Selektionsmarker)

BOFFs wurden semikonfluent ausplattiert und die Sensitivität gegenüber Neomycin (G418), Hygromycin und Puromycin in bezug auf Konzentration und Wirkung/Zeit untersucht. Verschie- dene Präparationen von BOFFs zeigten in Bezug auf die notwendigen Antibiotikakonzentrationen deutliche Unterschiede (bis 2-100x), um die LDι₀₀ zu erreichen. Die Zeit/Wirkungsfenster zwischen und innerhalb der Präparationen waren teilweise stark verschoben. Die besten Ergebnisse wurden mit Puromycin in einer Konzentration von 1,5 μg/ml erzielt (3 - 5 fache Konzentra- tion gegenüber Selektion von stabilen humanen oder murinen Fibroblastenzelllinien).

Verschiedene Transfektionsmethoden, die üblicherweise zur Transfektion von etablierten

Zelllinien verwendet werden, wurden auf ihre Effizienz (Antibiotika-resistente Klone/Trans- fektionsansatz) bei BOFFs getestet. Getestet wurden:

DOSPER (Röche, Lipofectin, polycationische Lipide);

LIPOFECTAMINETM (GBCOBRL Life Technologies, Lipofection, polycationische Lipide);

CLONfectinTM (Clontech, Lipofection, cationische und amophile Lipide);

TransFastTM (Promega, Lipofection, cationische und amphophile Lipide); Ca₃(PO₄)₂-DNA-Präzipitation.

Die besten Ergebnisse wurden mit Lipofectin mittels TransFastTM und Transfektion von Ca₃(PO₄)₂-DNA-Präzipitaten in Anwesenheit von 12% DMSO erzielt.

n Gegensatz zu etablierten Fibroblasten-Linien, die ohne Probleme in starker Verdünnung selektiert werden können, so dass Antibiotika-resistente Klone entstehen, können BOFFs nicht unter einer bestimmten kritischen Dichte plattiert werden. Bei der Selektion auf Einzelzell-Klone bzw. bei dem Wachstum aus extremer Verdünnung, um Einzelzell-Klone zu isolieren, sterben BOFFs entweder ab, oder durchlaufen eine oder mehrere Krisen, die zu Veränderungen der Moφhologie und/oder des Prohferationsverhaltens führen. Die Plattierungsdichte der BOFFs wurde daher derart gewählt, dass ein optimales Wachstum gewährleistet war. Daraus resultiert jedoch, dass die Antibiotika-resistenten Zellen eine Population darstellen und nicht klonalen Ursprungs sind. Durch anschließende Vereinzelung und Subklonierung werden transgene klonale Zelllinien generiert b) Transfektion mit ScFv und pJWόpuro in BOFFs

Verwendete Plasmide:

MAR::ScFv: die MAR Sequenzen (chicken lysozyme gene matrix attachment regions; Castilla et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998), 349) wurden mit ScFv in BlueScript (Stratagene) kloniert. p77 (Brem et al., Theriogenology 43 (1995), 175) in ρUC18 (Norrander et al., Gene 26 (1983), 101).

pJWόpuro (Morgenstern & Land, Nucleic Acids Res. 18, 1068) p77 und MAR:: ScFv wurden linearisiert, um eine funktionelle Integration der Konstrukte zu garantieren. Aufgrund der zur Verfügung stehenden Restriktionsenzymschnittstellen konnten dabei die Vektorsequenzen nicht von den Genkonstruktsequenzen getrennt werden. pJWόpuro wurde zirkulär/supercoiled transfiziert. Die verwendeten DNA-Mengen bzw. das Mischungsverhältnis ScFv : Selektions- marker betrug 8:1 (2,5 μg p77 + 2,5 μgMAR::ScFv + 0,6μgpJW6puro = 5,6 μg Gesamt-DNA) bzw. 3:1 (0,7 μg p77 + 0,9 μgMAR::ScFv + 0,6μg pJWόpuro = 2,2 μg Gesamt-DNA).

Dabei wurden BOFF #32330201 pl Zellen verwendet, aus denen mehr als ein Jahr vor der Transefektion bereits durch Klonierung Embryonen und nach Transfer auch Klonkälber (10 Kälber geboren) erstellt wurden. Nach der Trypsinbehandlung wurde die Zellsuspension in 10 mm Kulturschalen überführt und mit Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (Gibco, Grand Island, NY), ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum (Biochrom, Berlin), 2mM L-Glutamin, 10-4 mM 2-Mercaptoethanol, 2 mM nicht-essentielle Aminosäuren (Sigma, St. Louis, MO), 100 IU/ml Penicillin und lOOμg/ml Streptomycin, kultiviert. Die Zellen werden bei 37°C, in 5% CO₂ in Luft kultiviert, bis der Zellrasen subkonfluent war (2 bis 3 Tage) worauf ein Teil dieser "Passage 0" eingefroren (10% Dimethylsulfoxid, Sigma) und in flüssigem Stickstoff gelagert wurde.

Transfektionsansätze: BOFFs wurden vor der Transfektion sub-semi-konfluent (ca 5x10 - 10 Zellen) in 6-well Kultlirschalen (0 35 mm) plattiert (MEM, 15% FCS, lx Glutamin/Penicillin/Streptamycin). Die Transfektion erfolgte nach dem Absetzen und der Ausprägung der Fibroblasten-Moφhologie der Zellen. Pro 0 35 mm-Schale wurde ein Trans- fektionsexperiment durchgeführt. Transfast® Lipofection: Verhältnis DNA : Liposom = 1 : 2, Inkubationszeit 1,5 Std.

Ca₃(PO₄)₂-DNA-Präzipitat Transfektion:

Nach einer Inkubationszeit von 4 Std. wurde die Transfektionseffizienz durch Zugabe von 12% DMSO für 2 min erhöht (Müller et al., EMBO J. 12 (1993), 4221).

Selektion, Erstellung und Analyse von Transfektanten-Pools:

Das Selektionsmedium wurde 24 Std. nach der Transfektion zugegeben. Nach 2 Tagen Selektion in 6-well Kulturschalen wurden die Zellen eines 0 35 mm-wells 1 : 150 auf eine 24-well Schale aufgeteilt (Konzentration 2-8 x 10² Zellen/Schale). Die Selektion wurde fortgesetzt bis die Schale subkonfluent mit puro®-BOFFs bewachsen war (4-9 Tage). Die Pools wurden expandiert, kryo-konserviert und auf erfolgreiche Tranfektion mit p77 und MAR::ScFv mittels PCR getestet.

Screening nach ScFv Transfektanten: Primer 377L2/f 5'-CAGGTGTCCTCTCTGACATCG-3', und 377R2 S'CGCAGAGTCCACAGAGG-S'

(Annealing Temperatur, 66°C; 1 kb Amplifikat).

Screening nach p77 Transfektanten: Primer: 246 5'-GAAGACCCCATTTTGTCCCAAG-3', und

251 5'-GTCCCGAGGTAGATCTTCCC-3' (Annealing Temperatur, 62°C; 2,5 kb Amplifikat) bzw. Primer 248 5'-GATGCTTCTCTATTCCTCTG-3', und

251 5'-GTCCCGAGGTAGATCTTCCC-3* (Annealing Temperatur, 60°C; 1,2 kb Amplifikat)

PCR Ergebnisse:

Transfast® Lipofection: bei beiden getesteten DNA- Verhältnissen keine p77/MAR::ScFv positiven Pools. Ca₃(PO4)₂-DNA-Präzipitat Transfektion: DNA-of-Interest : Selektionsmarker = 3:1: keine p77/MAR::ScFv positiven Pools. Ca₃(PO₄)₂-DNA-Präzipitat Transfektion: DNA-of-Interest : Selektionsmarker = 8:1 (Pool 3): 6 von 24 Pools positiv für p77 und MAR::ScFv Bezeichnung der positiven Klone/Pools: A3, B2, B3, C2, C3, C6 (stärkstes Signal)

Beispiel 2 Die Tiere wurden gemäß dem in der PCT/EP98/00229 beschrieben Verfahren kloniert und die transgenen Embryonen auf die Empfängertiere tansferiert.

Beispiel 3

Gewinnung der Feten und Isolation transgener Knochenmarkstammzellen aus der fetalen Leber

Transgene Rinderfeten werden im zweiten Trimester der Gravidität gewonnen. In dieser Zeit, der hepato-linealen Periode der Fetalentwicklung, ist die Leber der Hauptort der Blutbildung und der

Sitz der Stammzellen aller Blutzellen, der Hämozytoblasten. Aus diesen Hämozytoblasten entwickeln sich nach Einwanderung in die Markhöhle der Knochen im Rahmen der Lymphocyto- poese auch die B-Lymphozyten. Die fetale Leber wird aseptisch gewonnen und in RPMI Medium mit 4 μg Gentamycinsulfat und 200 IU/ml Heparin als Antikoagulans aufgenommen. Eine

Separation in Einzelzellen erfolgt unter streng sterilen Kautelen.

Beispiel 4 Transfusion der transgenen Zellen in Klonkälber des gleichen chromosomalen Genotyps

Die Transplantation der fetalen Blutbildungszellen erfolgt in einer Suspension in physiologischer Kochsalzlösung oder Medium durch intravenöse Infusion mittels Katheter (14 Gauge, 1.7mm x 64 mm, Teruno Co. Ltd).

Beispiel 5

Gewinnung und Reinigung von Serum durch Blutentnahme

In regelmässigen Abständen nach Transfusion der transgenen Blutbildungszellen wird durch Punktion der Vena jugularis Blut gewonnen. Durch Zentrifugation des Blutes (lOOOxg, 30 min.) wird das Serum von den Blutzellen getrennt. Das Serum wird mit Natriumazid (Endkonzentration 0,02%) versetzt und durch Celluloseacetatfilter (0,22 μm) filtriert. Der Überstand wird mit 1 M NaOH auf pH 7,2 eingestellt. Zur bi-scFv-Molekülaufreinigung wird der Kulturüberstand über eine mit 0,1M Natriumposphatpuffer equilibrierte Protein L-Agarose Säule (# 20520 Pierce, Rockford II, USA) gegeben (Protein L bindet humanes IgG insbesondere auch Single chain variable elements (ScFv) aber nicht bovines IgGl und IgG2). Das Säulen-Bett wird nach dem Auftrag des Kulturüberstandes mit 0,1 M Phosphatpuffer gewaschen. Die gebundenen Proteine werden durch einen 0,1 M Glycin-Puffer stufenweise bei pH- Werten von 3,0 und 2,0 eluiert. Das aufgefangene Eluat wird über Nacht gegen PBS dialysiert, 0,22 μm sterilfiltriert und bei 4°C gelagert.

Beispiel 6 Lyse von Tumorzellen mittels bispezifischer Antiköφer

Die biologische Aktivität der bispezifischen Antiköφer wird im Zytotoxizitätstest mit 5000 SK- Mel63 oder M21 Tumozellen getestet. Diese beiden Melanom-Zellinien sind für das Target Antigen HMWG (high molecular weight glycoprotein), welches durch den monoklonalen Antiköφer (nur scFv- Anteil) 9.2.27 erkannt wird, stark positiv. Periphere Blut-Lymphozyten (PBLs frisch von gesundem humanem Spender gewonnen und durch Ficoll-Gradient isoliert) werden im Verhältnis 10:1 zu den Targetzellen zugegeben. Dann erfolgt eine Zugabe von 150 μg/ml chemisch konjugierten bs-F(ab')2 der Spezifität 9.2.27 x CD3 (Melanom x T-Lymphozyt in alle Zellkulturschalen zur panklonalen Stimulation aller T-Lymphozyten, zeigt bei dieser Konzentration allein keine mitogene Eigenschaft). Anschliessend werden die aus dem Serum gereinigten rekombinanten bi-scFv-Moleküle direkt zugegeben. Das Gesamtvolumen des Versuchsansatzes pro Zellkulturschale in der Mikrotiteφlatte ist 150 μl. Die Inkubation der Platte erfolgt für 5 Tage im Brutschrank bei 37°C/5% CO₂. Die nicht adhärenten Blut-Lymphozyten werden durch mehrfaches Waschen mit PBS entfernt, so dass nur noch die restlichen adhärenten Tumorzellen in den Zellkulturschalen verbleiben (visuelle Kontrolle), hl die Zellkulturschalen werden 100 μl frischen Medium und 10 μl des Cell Proliferation Reagent Farbstoffes WST (Boehringer Mannheim, Cat. No. 1644 807) zugegeben. Anschließend erfolgt eine erneute Inkubation (37°C/5% CO₂) im Brutschrank für 1 bis 4 Stunden und dann eine Auswertung per ELISA-Reader (480 nm). Die visuelle Auswertung und die niedrige optische Dichte zeigen ein Tumorzell-Killing von 100%. Damit ist gezeigt, dass rekombinante bispezifische Antiköφer, die in transgenen Blutzellen produziert werden, hocheffizient sind.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Stoffen, bei dem a) Zellen mit einer den Stoff codierenden Nukleotid-Sequenz transformiert werden, b) die transformierten Zellen einem Klonierungsprozess unterworfen werden, und c) die in Schritt b) erhaltenen Zellen in einen Empfängerorganismus eingebracht werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die in Schritt a) zu transformierenden Zellen vor der Transformation einem Klonierungsprozess unterworfen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die in Schritt a) zu transformierenden Zellen aus einem vorhandenen Zellklon oder einem vorhandenen Organismus isoliert werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Empfängerorganismus ein Tier, ein Fetus, ein Embryonen bzw. Zellaggregat ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem im Empfängerklon be- stimmte Zelltypen entfernt werden und diese durch rekombinante Zellen des gleichen

Typs ersetzt werden.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Empfängerorganismus den gleichen Genotyp aufweist, wie die zu transformierenden Zellen.

7. Verwendung von transgenen Tieren, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung von rekombinanten Stoffen.

8. Verfahren zur Herstellung von Zellen, Geweben oder Organen in tierischen Organismen, bei dem a) Zellen aus einem Individuum isoliert werden, b) die Zellen in einen immun-inkompetent tierischen Organismus eingebracht werden, c) der Organismus gezüchtet wird, d) die in dem Organismus gewachsenen, Zellen des Individuums isoliert werden, und e) die isolierten Zellen in ein Individuum eingebracht werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Zellen zu Geweben und/oder Organen wachsen und die gewachsenen Gewebe/Organe in das Individuum eingebracht werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, bei dem die Zellen von dem Individuum abgeleitet sind, in das sie zurückgebracht werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, bei dem der tierische Organismus durch Klonierung erhalten wurde.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 9, bei dem in dem tierischen Organismus endogene Zellen eines bestimmten Typs entfernt wurden.

13. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 8 bis 12 zur Herstellung von Transplantaten.

14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei menschliche Transplantate, insbesondere autologe menschliche Transplantate hergestellt werden.