WO2002002159A1

WO2002002159A1 - Materiaux de base pour regeneration de tissus, materiaux de transplantation, et procede de fabrication

Info

Publication number: WO2002002159A1
Application number: PCT/JP2000/008350
Authority: WO
Inventors: Nobuhiko Yui; Tooru Ooya; Masakazu Kato
Original assignee: Japan Tissue Engineering Co., Ltd.
Priority date: 2000-07-03
Filing date: 2000-11-27
Publication date: 2002-01-10
Also published as: DE60036029D1; JP4753525B2; EP1316321A4; US20030124168A1; EP1316321B1; KR20030020895A; EP1316321A1; KR100714742B1; AU2001215528A1; DE60036029T2; CN1208094C; CN1454100A

Description

明細書組織再生用基材、移植用材料及びその製法技術分野

本発明は、整形外科、口腔外科、形成外科などの医療分野に広く利用可能な組織再生用基材、移植用材料及びその製法に関する。背景技術

近年、ヒ卜組織を再形成、再構築させることによって治療を行う組織工学（Tissue Engineering) の分野が急速に発展してきている。このような組織工学では、 1 9 8 0年代初期より、整形外科分野等において皮痛、軟骨あるいは神経細胞を分解 ·非分解性材料中で培養する試みがなされてきた。

組織工学では、組織再生の足場となるマトリクスを生体内に移植し、生体内（in vivo) で細胞を増殖させることで治療を行う方法や、マトリクスを足場とした細胞の培養、増殖を生体外（in vitro) で行った後、培養した細胞（組織）を生体内にマトリクスとともに、あるいは再生組織単独で移植する方法などが知られている。

また、組織再生の足場となるマトリクスに関しても種々の生体由来、合成材料等が知られており、例えば、コラーゲンゃポリグリコール酸のマトリクス中では細胞の 3次元培養が可能であり、生体内で分解 · 吸収される特徴を有している。

しかしながら、これらのマ卜リクスの分解産物は炎症反応を誘起する可能性があり、さらに、マトリクスが組織再建の前に分解したり、組織再生後も長い間分解しない等、分解 ·消失時間の制御が困難であった。本発明は上記課題に鑑みなされたものであリ、組織再生が可能であリ、組織再建時に必要な力学特性を備え、組織再建後の生体内での分解消失特性を有する組織再生用基材を提供することを目的とする。また、良好に組織を再建でき、組織再建後の生体内での分解消失特性を有する移植用材料を提供すること、また、そのような移植用材料の製法を提供することを別の目的とする。発明の開示

上記課題を解決するため、本発明は組織再生用基材であって、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリ口タキサン、又は、このポリ口タキサンにつき隣合うポリ口タキサン 1 分子中に含まれる環状分子同士、生体親和性基同士もしくは環状分子と生体親和性基とを架橋結合で架橋して網目構造としたポリ口タキサンヒドロゲルからなることを特徴とする。

本発明のポリ口タキサン又はポリ口タキサンヒドロゲルからなる組織再生用基材を用いて例えば軟骨細胞を培養すると、細胞は軟骨細胞様の形態を維持しながら増殖する。また、この組織再生用基材を単体で生体内に移植しても、細胞形態や増殖を阻害する事はない。つまり、組織再生が可能である。

また、本発明で用いられるポリ口タキサン又はポリ口タキサンヒドロゲルは、組織再建時に必要な力学特性を備えている。これは、ポリロタキサンおよびポリ口タキサンヒドロゲルが超分子構造つまり線状分子と環状分子のような異分子間の物理的な絡み合い（非共有結合）をしていることにより、高い結晶性を有している為と考えられる。

更に、本発明で用いられるポリ口タキサン又はポリ口タキサンヒドロゲルは、組織再建後の生体内での分解消失特性を備えている。これは、加水分解性結合を有しているため、生体内でのこの加水分解性結合が加水分解して嵩高い生体親和性基（つまリキャップ）が線状分子の両末端から外れ、この線状分子から環状分子が脱離することにより分解消失すると考えられる。

このように本発明の組織再生用基材によれば、組織再生が可能であり、組織再建時に必要な力学特性を備えると共に、組織再建後の生体内での分解消失特性を有しているため、細胞から組織を再構築するのに適している。

本発明の組織再生用基材において、線状分子や環状分子は生体親和性 (生体にほとんど害を与えない性質）を有するものであれば特に限定されないが、線状分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、及びポリメチルビニルエーテルからなる群よリ選ばれる一種又は二種以上であることが好ましい。このように構成する環状分子や線状分子として、生体親和性に優れているものを選ぶことにより、合成されたポリ口タキサンやポリ口タキサンヒドロゲルは生体親和性に優れ, 組織再生用移植材料として適している。また、平均分子量は 2 0 0 ~ 5 0 0 0 0、特に 4 0 0〜 5 0 0 0であることが好ましい。環状分子としては、 α、 ]8又は τーシクロデキス卜リンであることが好ましいが、これと類似の環状構造を持つものであってもよく、そのような環状構造としては環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルァミン、環状ポリアミン等が挙げられる。線状分子と環状分子の組み合わせとしては、 α—シクロデキストリンとポリエチレンダリコールとの組合せが好ましい。

本発明の組織再生用基材において、加水分解性結合としては、生体内で加水分解する結合であればどのような結合であってもよい。このうち、生体内で速やかに非酵素的に加水分解することを考慮すればエステル結合であることが好ましい。

組織再生用基材がポリ口タキサンヒドロゲルの場合、架橋結合はウレタン結合、アミド結合、カルバミド結合、エーテル結合、スルフイド結合又はシッフ塩基型結合が好ましい。また、架橋結合は、環状分子同士を架橋する場合、加水分解性結合よりも水に対して安定であることが好ましい。これは、先に加水分解性結合が分解して線状分子の両末端から嵩高い置換基を有する生体親和性基が外れ、架橋結合された環状分子が一度期に脱離することにより、良好な分解パターンが得られるからである。

本発明の組織再生用基材において、線状分子の両末端の生体親和性基としては、生体に対する親和性が高い基（生体に対して安全性の高い基）であればどのような基であってもよいが、例えばアミノ酸、オリゴぺプチド、オリゴ糖類又は糖誘導体であることが好ましい。アミノ酸としては、例えばァラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチ才ニン、プロリン、フエ二ルァラニン、卜リブ卜ファン、ァスパラギン酸、ダル夕ミンサン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システィン、リジン、アルギニン、ヒスチジン等が挙げられる。また、オリゴぺプチドとしては、前出のアミノ酸の複数がペプチド結合して形成されたもの等が挙げられる。また、オリゴ糖類としては、繰り返し単位が 1 〜 5であり、構成多糖としてデキストラン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、でんぷんからなるもの等が挙げられる。更に、糖誘導体としては、才リゴ糖類、多糖又は単糖をァセチル化やイソプロピル化等の化学修飾した化合物等が挙げられる。このうち、ベンゼン環を有するアミノ酸、例えば L —フエ二ルァラニン、 L—チロシン、 L— トリブトファン等が好ましい。

本発明の組織再生用基材において、生体親和性基が有する嵩高い置換基としては、線状分子から環状分子が抜け落ちるのを防止できればどのような基であってもよいが、例えば 1以上のベンゼン環を有する基又は 1以上の第三ブチルを有する基が好ましい。 1以上のベンゼン環を有する基としては、例えばべンジル才キシカルポニル（Z ) 基、 9一フレ才レニルメチル才キシカルボニル（ F m o c ) 基、ベンジルエステル（O B z ) 基等が挙げられ、また、 1 以上の第三プチルを有する基としては、第三プチルカルポニル（B o c ) 基、アミノ酸第三ブチルエステル（O B u基）等が挙げられるが、このうち、ベンジル才キシカルボニル基が好ましい。

本発明の組織再生用基材としては、上記線状分子がポリエチレンダリコール、上記環状分子が a—シクロデキス卜リン、上記加水分解性結合がエステル結合、上記嵩高い置換基を有する生体親和性基がベンジルォキシカルボ二ルー L一フエ二ルァラニンであることが特に好ましい。なお、 α—シクロデキス卜リンをポリエチレンダリコールに貫通させる場合、 α—シクロデキス卜リンとポリエチレンダリコールの繰り返し単位 (エチレン才キシド単位）の比の化学量論数は 1 ： 2といわれている。本発明の組織再生用基材がポリ口タキサンヒドロゲルの場合には、ポリロタキサンヒドロゲル中のポリ口タキサンの重量割合（ポリロタキサンヒドロゲル骨格に占めるポリ口タキサンの重量割合）を変化させることによりポリ口タキサンヒドロゲルの分解速度をコントロールできる。これは今回新たに得られた知見であるが、この知見を利用して次のようにポリ口タキサンヒドロゲル中のポリ口タキサンの重量割合を定めるのが好ましい。即ち、組織再生用基材の使用状況に適した分解速度を予め求めておき、その分解速度になるようにポリ口タキサンヒドロゲル中のポリ口タキサンの割合を定めるのである。この結果、使用状況に適した組織再生用基材が得られる。

本発明の組織再生用基材がポリ口タキサンヒドロゲルであって、隣合うポリ口タキサン 1 分子中に含まれる環状分子同士（又は生体親和性基同士、又は環状分子と生体親和性基）を、架橋用線状分子を介して架橋結合で架橋した構造の場合には、その架橋用線状分子の平均分子量を変化させることによリボリ口タキサンヒドロゲルの分解速度や分解パターンをコントロールできる。これも今回新たに得られた知見であるが、この知見を利用して次のように架橋用線状分子の平均分子量を定めるのが好ましい。即ち、組織再生用基材の使用状況に適した分解速度や分解パターンを予め求めておき、その分解速度や分解パターンになるように架橋用線状分子の平均分子量を定めるのである。この結果、使用状況に適した組織再生用基材が得られる。

ここで分解パターンとしては、生体内で徐々に分解していくパターンや、生体内である時間絰過するまではほとんど分解せずにその後急激に分解するパターンなどがある。また、架橋用線状分子としては、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレンダリコールとの共重合体などの生体親和性ポリマーが好ましく、その平均分子量は 0 ~ 5 0 0 0 0の範囲で決めることが好ましい。なお、架橋部分の分子量が 0の場合には、架橋用線状分子が介在せずに直接結合していることを意味する。また、架橋用線状分子を介して架橋する際、架橋用線状分子の両端で架撟することが好ましい。

本発明の組織再生用基材は、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリ口タキサンにつき、隣合うポリ口タキサン 1分子中に含まれる環状分子同士を架橋用線状分子を介して架橋結合で架橋して網目構造としたポリ口タキサンヒドロゲルからなリ、下記（ a ) 及びノ又は ( b ) の性質を有するものが好ましい。

( a ) ポリ口タキサンヒドロゲルが完全に加水分解するまでの時間が、ポリ口タキサンヒドロゲル中の含水率に依存せず、ポリ口タキサンヒド口ゲル中のポリ口タキサン含有率が減少するのに伴って、又は、環状分子に対する架橋用線状分子のモル比が増加するのに伴って、又は、架橋用線状分子の平均分子量が減少するのに伴って長くなる。

( b ) ポリ口タキサンヒドロゲルが完全に加水分解するまでの時間を t _∞、経過時間を t、初期の水膨潤状態でのポリ口タキサンヒドロゲル重量を M。、時間 tにおけるポリ口タキサンヒドロゲル重量を M _tとし、横軸に t / t_∞、縦軸に M _t M。をとつてグラフを描いたときの分解バターンが、ポリ口タキサンヒドロゲル中のポリ口タキサン含有率に依存せず、架橋用線状分子の分子量に依存して決まる。

上記（a ) の性質を有する場合には、組織再生用基材の使用状況に適した分解速度を予め求めておき、その分解速度になるようにポリ口タキサンヒドロゲル中のポリ口タキサンの割合（含有率）を定めるか、あるいは、環状分子に対する架橋用線状分子のモル比を定めるか、あるいは、架橋用線状分子の平均分子量を定めることにょリ、使用状況に適した組織再生用基材が得られる。

一方、上記（ b ) の性質を有する場合には、組織再生用基材の使用状況に適した分解パターンを予め求めておき、その分解パターンになるように架橋用線状分子の平均分子量を定めることによリ、使用状況に適した組織再生用基材が得られる。なお、実際に生体内で使用するときにある時間経過するまではほとんど分解せずにその後急激に分解するパターンを得ようとすれば、例えば架橋用線状分子の平均分子量を 4 0 0 0〜 1 0 0 0 0とすることが好ましい。

上記（ a ) 及び/又は（ b ) の性質を有する組織再生用基材としては、例えば、環状分子が α—シクロデキス卜リン、線状分子がポリエチレングリコール、加水分解性結合がエステル結合、架橋用線状分子がポリエチレングリコールビスァミンでぁリ、隣合うポリ口タキサン 1分子中に含まれる α—シクロデキス卜リンの Ο Η基同士をポリエチレングリコールビスァミンの両末端の Ν Η ₂基でウレタン結合により架橋して網目構造としたポリ口タキサンヒドロゲルからなるものが挙げられる。

本発明の組織再生用基材は、細胞を培養又は組み込み可能な形態であれば特にどのような形態であろうと限定されない。例えばフイルム状にしてその上に細胞を播種したり、ゲル状にしてその上に細胞を播種したリ、溶媒に溶かしてその溶液に細胞を播種したリ、溶媒に懸濁させてその懸濁液に細胞を播種したりしてもよい。特に、細胞を保持 ·培養しやすくする点を考慮すれば、ポリ口タキサン又はポリ口タキサンヒドロゲルの多孔体を用いることが好ましい。このときの孔については細胞を保持できる大きさ ·密度であれば特に限定されない。また、細胞と組み合わせず組織再生用基材を単体で生体内に移植する場合にも、組織再生用基材の形態が限定される事はない。好ましくは移植周辺組織からの細胞が増殖するのに好適な環境を与える為、多孔体にする事が望ましい。その際、孔の大きさ、密度は移植周辺組織から細胞が侵入し、血管新生ができるのに適当な大きさ、密度とすればよく、特に限定はされない。また、多孔体の製法としては、周知の方法を適用可能であり、例えば、塩化ナ卜リウ厶存在下でゲル化する方法や、含水ヒドロゲルを真空凍結乾燥する方法等が適用可能である。

本発明の組織再生用基材は、その表面が細胞接着促進物質によって被覆されていてもよい。細胞接着促進物質とは、細胞の接着を促進する性質を有するものであれば特に限定されないが、例えばコラーゲン、ゼラチン等が挙げられる。被覆方法は特に制限されず、常法に従って行うことができるが、簡便には多孔体を調製後、細胞接着促進物質に浸潰し、その後再度凍結乾燥する方法が挙げられる。

組織再生用基材は特にどのような細胞の培養又は組み込みに用いてもよいが、例えば、間葉系細胞、肝細胞、神経細胞の培養に用いることが好ましい。ここで、間葉系細胞には、軟骨細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞とこれら全ての前駆細胞が含まれ、本発明の組織再生用基材は軟骨細胞の培養に用いることが特に好ましい。 '

本発明の組織再生用基材を用いて組織を再生する方法としては、ポリ口タキサンおよびポリ口タキサンゲルを単体で使用する方法、この再生用基材に単に細胞を組み込み使用する方法、またこの再生用基材で細胞を培養して使用する方法が考えられる。

また、細胞を固定化する方法としては、例えば、ポリ口タキサンヒド口ゲルにあっては高濃度の細胞培養液を添加し、ゲルの膨潤と共に細胞をゲル孔内へ取り込ませることにより固定化する方法、回転培養する方法、細胞を播種したあと細胞に影響を与えない程度に減圧することによリ固定化する方法等が挙げられる。

本発明の組織再生用基材に細胞が培養されているか又は細胞が組み込まれた移植用材料を用いれば、組織再生が可能となる。この移植用材料を製造する方法としては、特にどのような製造方法でもよいが、上記組織再生用基材を使用目的に応じて適当な大きさ又は形状に調製した後、この組織再生用基材に細胞を培養するか組み込むことにより移植用材料を得ることが好ましい。例えば、耳の軟骨の再建に用いる場合には、耳の適用部位に適合するよう整形■加工した組織再生用基材に細胞分散液を注入して、一定期間培養して移植用材料としてもよい。この場合、この移植用材料は耳の適用部位に埋め込まれる。逆に、組織再生用基材に細胞を培養または組み込んだ後、この移植用材料を利用時、または出荷時に適応部位に応じた適切な大きさまたは形状に調整してもよい。

ポリ口タキサン又はポリ口タキサンヒドロゲルからなる組織再生用基材に例えば軟骨細胞が培養された移植用材料では、培養細胞は軟骨細胞様の形態を維持しながら増殖し、軟骨基質を豊富に産生している。軟骨組織は、軟骨細胞とその細胞が産生する基質によって主に修復されるため、予めこれらが豊富に含有されていることは、その移植用材料が高い組織再生能力を有することを意味している。このように、培養操作を行つた場合には、組織修復に必要な細胞を増殖させること、あるいは、細胞の産生物質（基質や成長因子など）を移植用材料中に担持できる点が好ましいが、何らかの理由によって細胞が死滅した場合でも、細胞が産生した基質や成長因子は移植用材料中に残存するため組織再生には有効である。さらに、上記組織再生用基材に例えば軟骨細胞を播種しただけ、すなわち、培養せずに単に組み込んだだけでも、細胞の形態が維持されるために移植直後からこれらの細胞が組織再生に機能し、移植用材料として有効である。図面の簡単な説明

図 1 は、生分解性ポリ口タキサンの合成手順を表す説明図であり、図 2は、ポリ口タキサンヒドロゲルの合成手順を表す説明図であり、図 3 は、ポリ口タキサンヒドロゲル P R H G— 5， 6の非酵素的加水分解挙動のグラフでぁリ、図 4は、ポリ口タキサンヒドロゲル P R H G— 5， 6の分解パターンを考察するためのグラフであり、図 5は、ポリ口タキサンヒドロゲル P R H G— 7〜9の非酵素的加水分解挙動のグラフであり、図 6は、ポリ口タキサンヒドロゲル P R H G— 7〜 9の分解パターンを考察するためのグラフであり、図 7は、 P E Gビスァミンの分子量を一定にしてポリ口タキサンの含有率を種々変化させたポリ口タキサンヒドロゲルの分解挙動を表すグラフであり、図 8は、ポリ口タキサン含有率と完全分解時間との関係を表すグラフであり、図 9は、ポリ口タキサン含有率と含水率との関係を表すグラフであり、図 1 0は、 P E G, a— C D比と完全分解時間との関係を表すグラフであり、図 1 1 は、横軸を t / t_∞、縦軸を M _tZM。としたときの分解パターンを表すグラフであり、図 1 2は、ポリ口タキサンヒドロゲル P R H G— 1， 3上でのゥサギ軟骨細胞培養の経時変化を表す図面である。発明を実施するための最良の形態

本発明の好適な実施例について以下に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

( 1 ) 生分解性ポリ口タキサンの合成（図 1 参照）

( 1 - 1 ) 両末端にアミノ基を有する P E Gの合成

分子量 3 3 0 0のポリエチレングリコール（ P E G) ( 3 3 g， 1 0 mm 0 I ) と無水コハク酸（ 2 0 g， 2 0 0 mm o l ) をトルエン（ 2 2 0 m l ) に溶解させ、この溶液を 1 5 (TCで 5時間還流させた。反応終了後、過剰のジェチルエーテルに注ぎ込み、濾別 '減圧乾燥して粗生成物を得た。これをジクロロメタンに溶解させ、不溶物を遠心分離によリ除去し、過剰のジェチルエーテルに注ぎ込んで、濾別 ■減圧乾燥後に両末端にカルボキシル基を有する P E G (化合物 A) を白色粉末として得た。

この化合物 A ( 2 0 g , 5. 7 mm o I ) と N—ヒドロキシスクシンイミド（H O S u ) ( 1 7. 1 g , 1 4 8. 2 mm o l ) を 1， 4ージキサンとジクロロメタンの混合溶液（ 3 5 0 m I ，体積比 1 ： 1 ) に溶解させ、氷冷後ジシクロへキシルカルポジイミド（D C C) ( 2 3. 5 g , 1 1 4 mm 0 I ) を加えた。氷冷したまま 1 時間攪拌し、その後室温で終夜攪拌した。副生成物のジシクロウレタンを濾別し、濾液は濃縮してから過剰のジェチルエーテルに注ぎ込んだ。濾別 ·減圧乾燥後にカルボキシル基が活性化された P E G (化合物 B) を白色粉末として得た。エチレンジァミン（0. 4 m し 6 mm 0 I ) を溶解させたジクロロメタン（ 7 5 m l ) に、化合物 B ( 1 0 g, 2. 7 m m o I ) を溶解させたジクロロメタン（ 7 5 m l ) を滴下し、滴下終了後から室温で 1 時間攪拌した。反応終了後、溶液を過剰のジェチルエーテルに注ぎ込み、濾別，減圧乾燥後に両末端にアミノ基を有する P E G (化合物 C) を白色粉末として得た。

( 1 - 2 ) 擬ポリロタキサンの調製

α—シクロデキス卜リン（Q!— C D) (4 8 g， 4 9. 2 mm o l ) の飽和水溶液（ 3 1 1 m l ) に化合物 C ( 4 g , 1 . 1 2 m m o I ) の水溶液（ 2 0 m l ) を室温で滴下した。 1 時間超音波を照射しながら攪拌し、その後室温で 2 4時間攪拌した。遠心分離により白色の沈殿物を回収し、 5 0 °Cで減圧乾燥を行い、白色粉末の擬ポリロタキサンを得た。なお、ポリ口タキサンとは、多数の環状分子（例えばシクロデキス卜リン）に線状分子（例えば P E G) が貫通し、その線状分子の両末端を嵩高い置換基でキャップしたものをいい、擬ポリロタキサンとは、ポリ口タキサンの両末端を未だ嵩高い置換基でキャップしていないものをいう。

( 1 - 3 ) 末端キャップ剤の調製

- C Dの脱離を防止する嵩高い置換基としてべンジルォキシカルボ二ルー L一フエ二ルァラニン（Z— L一 P h e、 Zはベンジル才キシカルポ二ル基を表す）を導入するために、 Z— L一 P h eの力ルポキシル基の活性化を行った。

すなわち、 Z— L一 P h e ( 1 00 g , 3 3 4 mm o l ) を 1， 4一ジ才キサン（ 8 0 0 m に溶解させ、氷冷しながら H 0 S u ( 3 8. 4 2 g , 3 34 mm o l ) を加えた。 1 時間後に D C C (7 5. 7 g , 3 6 7 mm 0 I ) を溶解させた 1， 4一ジ才キサン溶液（ 2 0 0 m l ) をゆつくリ加え、氷冷したまま 1 時間攪拌し、その後室温で終夜攪拌した。副生成物のジシクロウレタンを濾別し、濾液は濃縮してから過剰のジェチルエーテルに注ぎ込み、濾別 ·減圧乾燥後に粗生成物を得た。室温でできるだけ飽和濃度になるように粗生成物をジクロロメタンに溶解させた後、石油エーテルを適量加え冷蔵し、再結晶を行った。結晶を濾別 ■減圧乾燥して白色針状結晶の Z— L一 P h eのスクシンイミドエステル（ Z— L一 P h e— O S u) を得た。

( 1 - 4 ) 生分解性ポリ口タキサンの調製

Z— L一 P h e— O S u ( 8 0 g, 2 0 0 mm o I ) をジメチルスルフォキシド（DM S O) ( 6 0 m に溶解させ、擬ポリロタキサン（4 5 g、 2 mm 0 I ) を加えた。この不均一溶液を室温で攪拌しながら、均一になるように少しずつ DM S 0を加えて 9 6時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を過剰のジェチルエーテルに注ぎ込み、粗生成物を得た。粗生成物をアセトン、ジメチルホルムアミド（DM F) の順で洗浄して不純物（未反応 Z—し一 P h e— O S u、 a— C D、化合物 Cなど）を除去し、濾別 ·減圧乾燥して生分解性ポリ口タキサンを白色粉末として得た。合成の確認は、 ¹ H— N M Rにより行った。

(2 ) ポリ口タキサンヒドロゲルの調製（図 2参照）

窒素雰囲気下で生分解性ポリ口タキサン（ 1 g， 2. 9 1 1 0 - 5 m o I ， [O H] = 1 6. 2 mm o I ) を DM S O ( 1 0 m l ) に溶解させた後に、 N， N ' 一カルボニルジイミダゾール（C D I ) (8. 1 3 m m o I ) を加え、室温で 3時間攪拌した。反応終了後、過剰のジェチルエーテルに注ぎ込み、濾別 ·減圧乾燥して白色粉末の C D I活性化ポリ口タキサン（C D I - P R) を得た。

下記表 1 に示す配合量に従い、 C D I — P Rの D M S 0溶液と、 P E Gのビスアミン（ P E G— B A、分子量 6 0 0 ) と、塩化ナトリウムとを加え、攪拌 ·脱気後テフロンスぺーサ（直径 1 3 mm、深さ 2 mm) を用いて 3 5°Cで 24時間ゲル化を行った。得られたゲルは、 D M S O で洗浄し、続いて水で重量が変化しなくなるまで洗浄し、ポリロタキサンヒドロゲルを得た（ P R H G— 1 〜4 )。

これらのポリ口タキサンヒドロゲル P R H G— "！〜 4は、隣合うポリ口タキサン 1 分子中に含まれる環状分子（α—シクロデキス卜リン）同士を、架橋結合（ウレタン結合）により P E Gを介して架橋して三次元網目構造としたものである。また、塩化ナ卜リウ厶存在下でゲル化を行つた P R H G— 1 〜 3は多孔体であり（電子顕微鏡で確認済み）、塩化ナ卜リウ厶不在下でゲル化を行った P R H G— 4は非多孔体であった。【表 1 】

※）非多孔体の測定値である《 ( 3 ) ポリ口タキサンヒドロゲルの物性

ポリ口タキサンヒドロゲルの含水率、力学強度の指数となる圧縮弾性率及び膨潤時の架橋密度を測定した（表 1参照）。なお、これらは非多孔体の測定値であるが、圧縮弾性率については多孔体でも同等ないしは 1 オーダー低い程度でぁリ、架橋密度については多孔体でも同等である。含水率は、室温において平衡膨潤状態のポリ口タキサンヒドロゲル重置（W_{w e t})、およびそのゲルを 5 0°Cで減圧乾燥した後の乾燥ポリロタキサンヒドロゲル重量（W_{d r y}) を測定し、下記数 1から算出した。【数 1 】

Wwe t— Wd r y

含水率（％) = X 1 00

Wwe t

圧縮弾性率は、室温で熱応力歪み測定装置を用いて測定し、架橋密度は、圧縮弾性率を用いて下記数 2から算出した。なお、測定には、コルクボーラ一を用いてプローブとほぼ同じ断面積にくリ抜いた平衡膨潤状態のポリ口タキサンヒドロゲルを用いた。

【数 2】

E c=3 RTXv e/V

E c ：圧縮弾性率

v eZV :架橋密度

：気体定数

T：絶対温度

V ：膨潤時のゲルの体積

(4) ポリ口タキサンヒドロゲルの非酵素的加水分解挙動の解析差替え用紙（規則 26) (4 - 1 ) ポリ口タキサンヒドロゲル中のポリ口タキサンの割合に関する考察

上記（ 2 ) において、 C D I — P Rの D M S 0溶液と P E G— B Aの D M S 0溶液と塩化ナ卜リウ厶を加えてゲル化を行う際、ポリロタキサン重置（C D I — P Rの DM S O溶液から換算）と P E G— B A重量との比を 7 0 ： 3 0としたポリ口タキサンヒドロゲル（ P R H G— 5 ) と、 6 0 ： 4 0としたポリ口タキサンヒドロゲル（ P R H G— 6 ) を調製した。

平衡膨潤状態のポリ口タキサンヒドロゲル P R H G— 5， P R H G— 6を 0. 1 Mリン酸緩衝溶液（ P B S) ( p H = 8. 0 )に浸漬し、 3 7 °C で振盪、所定時間毎に水を拭き取りゲルの重量変化を測定した。この重量変化を非酵素的加水分解挙動の評価とした。結果を図 3に示す。

ポリ口タキサンヒドロゲルの分解パターンは、初期において重量が増加していきその後減少してついにはゼロになるというパターンである。ここで、重量が増加している間は、ポリ口タキサンヒドロゲルの架橋点が減少して三次元構造の網目のマスが広がることにより水分を保持しやすくなり含水率が上がったものと考えられるが、ポリ口タキサンヒドロゲルの三次元構造は維持されていると考えられる。一方、ポリロタキサンヒドロゲルの三次元構造が維持できなくなるほど架橋点が減少すると. 溶解して重量が減少していきゼロに至ると考えられる。したがって、重量変化の測定を開始してから重量がゼロに至るまでの時間が分解速度を表す。

図 3によれば、 P R H G— 6よりも P R H G - 5の方が分解速度が速いことから、ポリ口タキサンヒドロゲルの分解速度はポリ口タキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの重量割合が多いほど速くなるといえる。また、ポリ口タキサンヒドロゲルの分解パターンを考察するために、実験開始前の水膨潤状態時のヒドロゲルの重量 M₀、ポリ口タキサンヒドロゲルが完全に分解するまでの時間（完全分解時間という） t_∞を用いて規格化を行い、ポリ口タキサンヒドロゲルを浸水してからの経過時間 tを t_∞で割った値 t Z t_∞、時間 tにおけるゲル重量 M _tを M。で割つた値 M _tZM。を規格化した数値として図 4のグラフを作成した。分解パターンを考察する際の視点の一つは、 t / t_∞の数値がいくつのときにポリ口タキサンヒドロゲルの分解が始まったか（M_tZM。がピークに達したか）という点にある。分解開始時の t t_∞の数値が小さいということは、分解し始めてから完全に分解するまでに要する時間が長いということでぁリ、逆に分解開始時の t / t_∞の数値が大きいということは、分解し始めてから完全に分解するまでに要する時間が短いということである。

図 4によれば、 P R H G— 5でも P R H G— 6でも分解開始時の t / t_∞の数値はほぼ同じ（約 0. 5) であることから、ポリ口タキサンヒドロゲルの分解パターンはポリ口タキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの割合に依存しないといえる。

(4 - 2) ポリ口タキサンヒドロゲル中の架橋部分の分子量に関する考察

上記（ 2) において、 C D I — P Rの DM S 0溶液に P E G— B Aと塩化ナトリウムを加えてゲル化を行う際、 C D I — P Rに含まれる α— C D 1分子当たりに対する P E G— B Aの仕込み比が 1 . 0となるようにし、分子量 6 0 0の P E G— B Aを用いたポリ口タキサンヒドロゲル ( P R H G - 7 ) と、分子量 2 0 0 0の P E G— B Aを用いたポリロタキサンヒドロゲル（ P R H G— 8 )、分子量 4 0 0 0の P E G— B Aを用いたポリ口タキサンヒドロゲル（ P R H G— 9) を調製した。

平衡膨潤状態のポリ口タキサンヒドロゲル P R H G— 7， P R H G - 8， P R H G— 9を 0. 1 Mリン酸緩衝溶液（ P B S ) ( p H = 7. 4 ) に浸潰し、 3 7°Cで振盪、所定時間毎に水を拭き取りゲルの重量変化を測定した。この重量変化を非酵素的加水分解挙動の評価とした。結果を図 5に示す。

この図 5によれば、ポリ口タキサンヒドロゲルの分解速度は、ポリ口タキサンヒドロゲル中の架橋部分の分子量が小さいほど速くなることを示唆している。つまり、この結果は、ポリ口タキサンヒドロゲル中の架撟部分の分子量を変化させれば分解速度をコントロールできることを示唆している。

また、ポリ口タキサンヒドロゲルの分解パターンを考察するために、図 4と同様にして、図 6のグラフを作成した。この図 6によれば、 P R H G— 7の分解開始時の t Z t_∞は 0. 5 0付近でぁリ、 P R H G— 8 の分解開始時の t Z t_∞は 0. 8 5辺りであり、 P R H G— 9の分解開始時の t Z t_∞は 0. 9 0辺りである。このことから、ポリ口タキサンヒドロゲルの分解パターンにおける分解開始時の tノ t_∞は、ポリロタキサン匕ドロゲル中の架橋部分の分子量が大きいほど大きくなるといえる。

(4— 3 ) まとめ

以上の結果から、ポリ口タキサンヒドロゲルの分解速度をコン卜ロールするには、ポリ口タキサンヒドロゲル中のポリ口タキサンの重量割合を変化させるか、ポリ口タキサンヒドロゲル中の架橋部分の分子量を変化させればよいことがわかる。つまり、組織再生用基材としてポリロタキサンヒドロゲルを用いる場合、その組織再生用基材の使用状況に適した分解速度を求め、その分解速度が得られるように、ポリ口タキサンヒドロゲル中のポリ口タキサンの重量割合を決めたり、ポリ口タキサンヒドロゲル中の架橋部分の分子量を決めたりすればよい。また、ポリ口タキサンヒドロゲルの分解パターン（分解開始時の t oo ) をコント α—ルするには、ポリ口タキサンヒドロゲル中の架橋部分の分子量を変化させればよいことがわかる。つまり、組織再生用基材としてポリ口タキサンヒドロゲルを用いる場合、その組織再生用基材の使用状況に適した分解パターンを求め、その分解パターンが得られるようなポリ口タキサンヒドロゲル中の架橋部分の分子量を決めればよい。

( 5 ) ポリ口タキサンヒドロゲルの非酵素的加水分解挙動の解析一その 2

前出の C D I — P R (4. 2 X 1 0— ⁵m o し N—ァシルカーボネー卜基： 1 0. 7 mm o I ) を DM S O ( 5 m l ) に溶かし、次いで溶融させた種々の P E Gビスアミンを添加した。その合成条件を表 2にまとめた。反応混合物をガス抜きし、テフロンスぺ一サに注入し、 3 5 °Cで 24時間維持した。その後、得られた生成物を DM S Oで洗浄し、室温で水に浸し、 2日間かけて完全に水和させた。これによリボリロタキサンヒドロゲルを得た。

※"！）「E」の後に続く数字は PEGビスァミンの平均分子量の 1Z1000を表したものであり、「RXJの後に続く数字はポリ口タキサンの含有量 (wt%)を表したものである。

※ ） PEGZor—CD【ま、ポリ口タキサンヒドロゲル中の PEGビスァミンと a—CDの計算上のモル比を表す。差替え用紙（規則 26) 加水分解挙動は以下のようにして調べた。即ち、上述のようにして得られたポリ口タキサンヒドロゲルの膨潤物を 1 c m X I c mのスラブ (厚さ < 1 mm) にカツ卜し、 0. 0 2 %のアジ化ナ卜リゥ厶を含む 0. 1 Mリン酸バッファ（ p H 7. 4 ) にこれらのスラブを 3 7 °Cにて浸し、振盪機で 1 3 0 r p mで振盪した。ポリ口タキサンヒドロゲルの分解は、残ったポリ口タキサンヒドロゲルの重量を測定することによって評価した。実験は 3回行った。実験結果を図 7〜図 9にグラフで示した。

図 7は P E Gビスァミンの分子量を一定にしてポリ口タキサンの含有率を種々変化させたポリ口タキサンヒドロゲルの分解挙動を表すグラフであり、（a) 〜（ c ) はそれぞれ P E Gビスァミンの分子量が 4 0 0 0 , 2000， 6 00である。また、図 8はポリ口タキサン含有率と完全分解時間との関係を表すグラフである。この図 7及び図 8から明らかなように、完全分解時間は、 P E Gビスァミンの分子量が同じ場合、ポリ口タキサンの含有率が減少するのに伴って長くなる。つまり、ポリ口タキサンヒドロゲルの分解速度は、ポリ口タキサンヒドロゲル中のポリロタキサンの重量割合が多いほど速くなる。

図 9はポリ口タキサン含有率と含水率との関係を表すグラフである。この図 9から明らかなように、ポリ口タキサンヒドロゲル中の含水率は、 P E Gビスァミンの分子量が同じ場合、ポリ口タキサン含有率に関わらず概ね一定である。ここの結果は、含水率は完全分解時間を変化させる要因ではないことを示唆している。

図 1 0は P E GZa— C D比と完全分解時間との関係を表すグラフである。ここで、 P E GZot— C D比は、ポリ口タキサンヒドロゲル中の P E Gビスァミンと α - C Dとのモル比である。この図 1 0から明らかなように、完全分解時間は、 P E Gビスァミンの分子量が同じ場合、 Ρ E GZot— C D比が増加するのに伴って長くなる。つまり、ポリ口タキサンヒドロゲルの分解速度は、 P E GZa— C D比が小さいほど速くなる。表 2に示すように、 P E GZa— C D比はつねに 2以下に調整した。なお、 P E GZ α— C D比が 2を越えると、ポリ口タキサンヒドロゲルは生理学的条件あるいは 0. 1 Μ水酸化ナトリウム水溶液下で分解しないため、ここでは P E G/ £¾— C D比が 2以下のものを取り上げた。図 1 1 は図 4と同様、横軸を t / t_∞、縦軸を M _t> M。としたときの分解パターンを表すグラフである。図 1 1 から明らかなように、この分解パターンはポリ口タキサンヒドロゲル中のポリ口タキサン含有率に依存せず、 P E Gビスァミンの分子量が同じならば同様のプロファイルになる。また、ポリ口タキサンヒドロゲルの分解開始点までのタイムラグは P E Gビスァミンの分子量が増加するにつれて長くなる。この結果は、絶対的な分解時間と関係なく、 P E Gビスァミンの分子量が大きいほど、よリ分解開始点までのタイムラグが長く、分解開始後は早期に分解されるようなパターンになることを示している。

( 6 ) 軟骨細胞の培養

表 1 に示したポリ口タキサンヒドロゲル P R H G— 1 ， P R H G— 3 をォートクレーブに入れ、 1 2 1 °Cで 2 0分間処理して滅菌した。滅菌後のポリロタキサンヒドロゲルを 9 6穴培養用プレー卜に入れ、凍結保存してあったゥサギ軟骨細胞を 1 穴あたり 2 X 1 0⁵細胞/ 1 0 0 I ずつ播種し、 3 7 °C、 5 % C O ₂インキュベータ内で静置し、細胞を各ポリ口タキサンヒドロゲルに固定した（固定時間 2時間又は 2 4時間）。

このように軟骨細胞を固定した各ポリ口タキサンヒドロゲルを 2 4穴培養用プレー卜に移し、 1 0 vZv%ゥシ胎児血清（ F B S) 及び 5 0 g/m I ァスコルビン酸を含むダルベッコ変法イーグル最小必須培地 (DM E M) (以下、単に培地という）を添加し、 7日ごとに培地交換し，計 6週間培養した。培養後、 1 0 %ホルマリンで固定し、アルシャンブルー（A l c i a n B l u e) ( p H 1 . 0 ) で染色し、脱色、脱水、透徹したのち封入した。なお、アルシャンブルー染色は、酸性厶コ多糖の染色法の一つで軟骨組織染色法の一種である。

固定時間が 2時間の場合、培養開始後から円形細胞がコロニーを形成しながら増殖を開始し、培養期間と共に大型化した。具体的には培養 1 4日目、 2 8日目、 4 2日目で観察を行い、大型化していく様子を確認した（図 1 2参照）。これらのコロニーは、コロニーの大型化と共に不透明な基質を産生し、顕微鏡下で濁ったような像として観察された。また、 4週間培養後には細胞コロニー全体に非常に強固なアルシャンブルー陽性像が観察された。つまり、このポリ口タキサンヒドロゲルを用いて軟骨細胞を 3次元形状で培養したときに、軟骨細胞は元の形状を維持しながら増殖すると共に基質（酸性厶コ多糖類）も産生することが確認された。したがって、ポリ口タキサンヒドロゲル（ P R H G— 1， 3 ) からなる組織再生用基材に軟骨細胞が 3次元形状で培養されたものを移植用材料として用いることができる。また、固定時間が 2 4時間の場合においても概ね同じ様子が観察された。

また、細胞の伸展あるいはポリ口タキサンヒドロゲルの分解に伴って培養プレー卜中に軟骨細胞のコロニーがこぼれ出て底面に接着してきた ₍ その後、接着したコロニーから、線維芽細胞様形態を持つ細胞がアウトグロースしてきた。これらは軟骨細胞の円形の形態を維持しておらず、アルシャンブルー染色も陰性を示した。この結果は、ポリ口タキサンヒドロゲル内で維持した軟骨様細胞コロニーを取り出して単層培養にかけたところ軟骨細胞様形質を失ったことから、脱分化を引き起こしたものと推察される。産業上の利用可能性

本発明によれば、整形外科、口腔外科、形成外科などの医療分野に広く利用可能な組織再生用基材、移植用材料を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリ口タキサン, 又は、このポリ口タキサンにつき隣合うポリ口タキサン 1分子中に含まれる環状分子同士、生体親和性基同士もしくは環状分子と生体親和性基とを架橋結合で架橋して網目構造としたポリ口タキサンヒドロゲルからなる組織再生用基材。

2 . 上記線状分子がポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレンダリコールとの共重合体又はポリメチルビニルエーテルであり、上記環状分子が α、）8又は τ— シクロデキス卜リンである請求項〗記載の組織再生用基材。

3 . 上記加水分解性結合がエステル結合である請求項 1 又は 2記載の組織再生用基材。

4 . 上記架橋結合がウレタン結合、アミド結合、カルバミド結合、エーテル結合、スルフィド結合又はシッフ塩基型結合である請求項 3記載の組織再生用基材。

5 . 上記嵩高い置換基が 1以上のベンゼン環を有する基又は 1以上の第三ブチルを有する基である請求項 1 〜 4のいずれかに記載の組織再生用基材。

6 . 上記生体親和性基がアミノ酸、才リゴペプチド、才リゴ糖類又は糖誘導体である請求項 1 〜 5のいずれかに記載の組織再生用基材。

7 . 上記線状分子がポリエチレングリコール、上記環状分子が α—シクロデキス卜リン、上記加水分解性結合がエステル結合、上記嵩高い置換基を有する生体親和性基がベンジル才キシカルボ二ルー L -フエニルァラニンである請求項 1 ~ 6のいずれかに記載の組織再生用基材。

8 . 上記ポリ口タキサン又は上記ポリ口タキサンヒドロゲルが多孔体である請求項 1 〜 7のいずれかに記載の組織再生用基材。

9 . 上記ポリ口タキサンヒドロゲルは、使用状況に適した分解速度になるように、上記ポリ口タキサンヒドロゲル中のポリ口タキサンの重量割合が定められていることを特徴とする請求項〗〜 8のいずれかに記載の組織再生用基材。

1 0 . 上記ポリ口タキサンヒドロゲルは、使用状況に適した分解速度又は分解パターンになるように決められた所定平均分子量の架橋用線状分子を介して、環状分子同士、生体親和性基同士又は環状分子と生体親和性基とを架橋結合で架橋したことを特徴とする請求項 1 〜 9のいずれかに記載の組織再生用基材。

1 1 - 複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンにっき、隣合うポリ口タキサン 1 分子中に含まれる環状分子同士を架撟用線状分子を介して架橋結合で架橋して網目構造としたポリロタキサンヒドロゲルからなり、下記（ a ) の性質を有する組織再生用基材。 ( a ) ポリ口タキサンヒドロゲルが完全に加水分解するまでの時間が、ポリ口タキサンヒドロゲル中の含水率に依存せず、ポリ口タキサンヒド口ゲル中のポリ口タキサン含有率が減少するのに伴って、又は、環状分子に対する架橋用線状分子のモル比が増加するのに伴って、又は、架橋用線状分子の平均分子量が減少するのに伴って、長くなる。

1 2 . 複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンにっき、隣合うポリ口タキサン 1分子中に含まれる環状分子同士を架撟用線状分子を介して架橋結合で架橋して網目構造としたポリロタキサンヒドロゲルからなリ、下記（ b ) の性質を有する組織再生用基材。

( b ) ポリ口タキサンヒドロゲルが完全に加水分解するまでの時間を t _∞、ポリ口タキサンヒドロゲルを浸水してからの経過時間を t、初期の水膨潤状態でのポリ口タキサンヒドロゲル重星を M ₀、時間 t におけるポリ口タキサンヒドロゲル重量を M _tとし、横軸に t / t_∞、縦軸に M _t / M。をとつてグラフを描いたときの分解パターンが、ポリ口タキサンヒドロゲル中のポリ口タキサン含有率に依存せず、架橋用線状分子の分子量に依存して決まる。 1 3 . 環状分子が α —シクロデキストリン、線状分子がポリエチレングリコール、加水分解性結合がエステル結合、架橋用線状分子がポリェチレンダリコールビスァミンであり、隣合うポリ口タキサン 1分子中に含まれる α—シクロデキス卜リンの Ο Η基同士をポリエチレングリコールビスァミンの両末端の Ν Η ₂基でウレタン結合により架橋して網目構造としたポリ口タキサンヒドロゲルからなる請求項 1 1 又は 1 2記載の組織再生用基材。

1 4. 間葉系細胞、肝細胞又は神経細胞の培養に用いられる請求項 1 〜 1 3のいずれかに記載の組織再生用基材。

1 5. 請求項 1 〜 1 4のいずれかに記載の組織再生用基材に細胞が培養されているか又は組み込まれていることを特徴とする移植用材料。

1 6. 請求項 1 〜 1 4のいずれかに記載の組織再生用基材に細胞を培養するか組み込むことによリ移植用材料を得ることを特徴とする移植用材料の製法。