WO2001079806A1 - Verfahren und vorrichtung zum laserschneiden mikroskopischer proben - Google Patents

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WO2001079806A1
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laser
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laser beam
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Michael Ganser
Albrecht Weiss
Rüdiger STENZEL
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Leica Microsystems Wetzlar Gmbh
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    • G01N2001/2886—Laser cutting, e.g. tissue catapult
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    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
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    • Y10T83/141—With means to monitor and control operation [e.g., self-regulating means]

Definitions

  • the invention relates to a method for laser cutting microscopic samples.
  • the invention further relates to a device for laser cutting microscopic samples, the device comprising a microscope with at least one objective for viewing a sample to be cut, the objective defining an optical axis and an objective aperture, a laser which generates a laser beam, and at least one optical system that couples the laser beam into the lens.
  • the German patent application DE-196 16 216.5 describes such a method, the so-called laser pressure catapulting method (LPC method).
  • LPC method laser pressure catapulting method
  • a sample part is cut out of a sample stored on a transparent slide using a laser.
  • the cut-out sample part is removed from the total sample by an induced laser process.
  • a collecting device the inner surface of which is coated with an adhesive, is guided over the cut-out sample part by means of a support arm.
  • this sample part is exposed to a flat laser bombardment of suitable power, by means of which the cut-out sample part is catapulted upwards out of the total sample. That way Detached sample is collected from the adhesive surface of the collecting device and can then be used for further examinations.
  • the laser pulse used to catapult the specimens can damage the tissue.
  • sample particles detached from the cutting line can be deposited on the sample area to be examined due to the cutting process. This problem occurs especially when using inverted microscopes.
  • the cutting quality of the laser can be adjusted by changing the laser intensity and the focus position.
  • the aperture of the laser light beam used in these known systems is determined by the lens aperture, which in turn must be as large as possible for maximum image quality.
  • the constant cut quality is difficult to achieve in the devices or methods of the prior art.
  • the quality of the cuts depends on the one hand on the focus position of the specimen and its thickness and on the other hand on the laser intensity. This must be varied by the user in order to optimize the cutting quality.
  • the invention is based on the object of designing a device for laser cutting microscopic samples in such a way that an approximately constant cutting quality is ensured for a broad spectrum of samples.
  • the solution to this problem is characterized in that an aperture is provided which generates a dimmed laser beam, a laser aperture generated by the objective being smaller than the aperture of the objective.
  • Another object of the invention is to describe a method for laser cutting microscopic specimens, which enables an approximately constant cutting quality for a wide range of samples.
  • a process which comprises the following steps: a) inserting a slide with a sample to be cut into a microscope which comprises at least one objective; b) determining a region of the sample to be cut out with the objective; c) defining a cutting line around the area; d) generating a dimmed laser beam by means of an aperture, so that its diameter is reduced such that a laser aperture generated by the objective is smaller than the objective aperture of the objective itself; and e) cutting the sample along the defined cutting line.
  • An advantage of the invention is that by reducing the laser aperture, the laser light cone becomes slimmer, which leads to an increase in the depth of field. As a result of the greater depth of field of the laser light, the requirement for focusing accuracy is reduced and thus leads to a uniform and narrow cutting channel.
  • Another advantage of the configuration of the device according to the invention is that the size of the objective aperture is maintained during the cutting process. This enables the specimen to be observed at all times with the full objective aperture. This ensures the best possible definition of the sample plane and maximum image quality for assessing the sample.
  • Objective apertures up to about 0.8 are necessary for detailed imaging and a targeted selection of areas of the sample. Of course, this requires a shallow depth of field, so that the specimen can be fixed at different levels. However, a shallow depth of field is undesirable for cutting with a laser beam.
  • the invention now combines the relatively large objective aperture with a dimmed laser beam in such a way that the laser aperture generated by the objective is smaller than the aperture of the objective itself. The objective can be used for simultaneous observation and cutting of the sample while the aperture remains the same.
  • the optical system contains a dichroic splitter which reflects the laser light and into the lens couples in, and at the same time lets the light from the observation beam path through to the eyepieces or the camera.
  • the laser cut can be controlled simultaneously via an imaging system, camera. If it is determined during the evaluation of the images that either the preparation was not completely severed during laser bombardment or that the cutting geometry is inadequate, individual system parameters such as the laser intensity and / or the focus position of the laser beam and / or or the size of the aperture in the laser beam can be set using a computer. This simultaneous control reduces the total cutting time with improved quality.
  • FIG. 3 shows a graphic representation of the cutting width as a function of the aperture of the laser beam.
  • the microscope 1 shown is a microscope in which the illumination system 3 is on the microscope stand 5 below the work table
  • a lens 6 of the microscope 1 is arranged above the work table 2 and the sample 12.
  • the objective 6 defines an optical axis 14, in which the lighting system 3 is also arranged.
  • laser cutting can of course also be carried out with inverted microscopes, in which the illumination system
  • Illumination system 3 emitted light is directed via a condenser lens 7 from below onto the object carrier 10 and sample 12 arranged on the work table 2.
  • the light penetrating the sample 12 reaches the objective 6 of the microscope 1.
  • the light is transmitted via lenses and mirrors (not shown) to at least one eyepiece 8
  • Microscope 1 is fed through which an operator can view the sample arranged on the work table 2.
  • An optical system 16 is provided in the stand 5 of the microscope 1 in the optical axis of the objective 6.
  • the optical system 16 can be a dichroic splitter, for example.
  • the optical system 16 consists of several optical components. This is the case when the laser 4 has to be steered around several corners.
  • an aperture 18 is provided in the laser beam 4a, with which the diameter of the laser beam can be limited in a corresponding manner.
  • the aperture 18 can be designed, for example, as a fixed aperture. In this case, a plurality of fixed diaphragms are arranged in a corresponding manner, for example on a turret disk, in order to move the required diaphragm 18 into the beam path.
  • the method can be carried out manually by the user or by motor.
  • the diaphragm 18 is designed as a vario diaphragm, for example as an iris diaphragm, the diameter of which is controlled by a motor 20.
  • the motor 20 receives the necessary control signals from a computer 22 for setting the required diaphragm diameter.
  • the microscope 1 is also provided with a camera 24, which takes an image of the sample 12 to be cut. This image can be displayed on a monitor 26 which is connected to the computer 22.
  • the system of computer 22, camera 24 and monitor 26 can be used so that the cutting process can be observed and monitored by laser 4.
  • the area of the sample 12 to be cut out can be bypassed on the monitor 26 by means of a mouse pointer.
  • the cutting process is then carried out by the laser 4 along the cutting line marked in this way.
  • FIG. 2 shows the beam path in the area of the sample 12 to be cut.
  • the diameter of the laser beam 4a coming from the laser 4 is limited by the diaphragm 18.
  • a dimmed laser beam 4b with a smaller diameter emerges.
  • the laser beam 4b strikes the optical system 16, which is designed as a dichromatic splitter, and is thereby directed through the objective 6 onto the sample 12 to be cut.
  • the lens 6 is symbolically represented in FIG. 2 by a lens.
  • the sample 12 applied to a slide 10 is illuminated via the condenser lens 7.
  • the objective 6 generates an imaging beam path 6a, which has a greater width than the laser beam 4b after the aperture 18.
  • FIG. 3 illustrates the advantage of a dimmed laser beam 4b which is narrower than the imaging beam path 6a or as a non-dimmed laser beam which fills the entire lens opening 32, through which the largest possible beam cross section is defined.
  • the sample 12 has a thickness 30 which can be greater than the depth of field of the objective 6 used. The user can focus on different planes in the sample 12 in order to find points relevant for the further examination.
  • the lens 6 If the sample 12 is cut with a non-dimmed laser beam, the cross section of which corresponds to the lens opening 32 of the lens 6, the lens 6 generates a maximum laser aperture which is equal to that Lens aperture 34 is. Due to the maximum laser aperture generated, a maximum cutting channel 34b with a width 34a is generated in the sample 12.
  • a reduced laser aperture 36 is generated by the objective 6, which creates a reduced cut channel 36b with a width 36a in the sample 12.
  • the aperture 18 By arranging the aperture 18 to limit the laser beam cross section in front of the optical system 16 outside the observation beam path, it is ensured that the depth of field of the objective 6 for viewing the sample 12 remains unchanged during the cutting process, regardless of the set laser aperture. As a result, the image quality is retained even during the cutting process.
  • the aperture 18 delimiting the laser beam 4a is adapted to the thickness 30 of the sample 12 to be cut.
  • a first possibility is that the aperture 18 required for an optimal cut is determined from a table (not shown) and the aperture is set manually by the user.
  • the aperture 18 required for an optimal cut can be determined by the computer 22 from a stored table (not shown). The setting of the diaphragm 18 is then carried out automatically by the computer 22. For this purpose, the computer 22 sends appropriate signals to the motor 20, which causes the diaphragm 18 to be adjusted.
  • a further possibility for an optimal cut is that the computer 22 is connected to the microscope 1 with an image evaluation system (not shown) in such a way that individual system parameters, such as the laser intensity, the focus position of the laser beam and the size of the aperture 18, automatically Optimum can be set.
  • the setting can also be changed automatically during the cutting process in order to take account of possible fluctuations in the thickness of the sample 12.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Laserschneiden mikroskopischer Proben. Die Vorrichtung zum Laserschneiden mikroskopischer Proben umfasst ein Mikroskop (1) mit mindestens einem Objektiv (6) zur Betrachtung einer zu schneidenden Probe (12). Das Objektiv (6) definiert eine optische Achse (14) und eine Objektivapertur (34). Ferner ist ein Laser (4) mit dem Mikroskop (1) verbunden. Der Laser (4) erzeugt einen Laserstrahl (4a), der über mindestens ein optisches System (16) in das Objektiv (6) eingekoppelt wird. Eine Blende (18) ist vorgesehen, die einen abgeblendeten Laserstrahl (4b) erzeugt, wobei eine durch das Objektiv (6) erzeugte Laserapertur (36) kleiner ist als die Objektivapertur (34) des Objektivs (6) selbst.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum Laserschneiden mikroskopischer
Proben
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Laserschneiden mikroskopischer Proben.
Des weiteren betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Laserschneiden mikroskopischer Proben, wobei die Vorrichtung ein Mikroskop mit mindestens einem Objektiv zur Betrachtung einer zu schneidenden Probe, wobei das Objektiv eine optische Achse und eine Objektivapertur definiert, einen Laser, der einen Laserstrahl erzeugt, und mindestens ein optisches System, das den Laserstrahl in das Objektiv einkoppelt, umfasst.
Krankheiten, wie beispielsweise Krebs, werden seit langer Zeit dadurch identifiziert, dass Biopsien von Gewebeproben vorgenommen werden, um unnatürliche Zellen zu identifizieren. Die zu untersuchenden Zellen werden manuell oder mechanisch mittels Mikrodissektion oder durch andere aufwendige Verfahren isoliert.
Die deutsche Offenlegungsschrift DE-196 16 216.5 beschreibt ein solches Verfahren, das sogenannte Laser Pressure Catapulting-Verfahren (LPC- Verfahren). Dabei wird aus einer auf einem transparenten Objektträger gelagerten Probe mittels eines Lasers ein Probenteil herausgeschnitten. Das Entfernen des ausgeschnittenen Probenteils aus der Gesamtprobe erfolgt bei diesem Verfahren durch einen induzierten Laserprozess. Zu diesem Zweck wird eine Auffangvorrichtung, deren innere Oberfläche mit einem Klebstoff beschichtet ist, mittels eines Tragarms über das ausgeschnittene Probenteil geführt. Anschließend wird dieses Probenteil einem flächigen Laserbeschuss geeigneter Leistung ausgesetzt, durch den das ausgeschnittene Probenteil aus der Gesamtprobe nach oben herauskatapultiert wird. Das solchermaßen herausgelöste Probenteil wird von der mit Klebstoff beschichteten inneren Oberfläche der Auffangvorrichtung aufgefangen und kann dann weiterführenden Untersuchungen zugeführt werden. Der Laserpuls, der zum Katapultieren der Probenstücke verwendet wird, kann zu einer Schädigung des Gewebes führen. Ferner können sich aufgrund des Schneideprozesses aus der Schnittlinie herausgelöste Probenteilchen auf den zu untersuchenden Probenbereich niederschlagen. Dieses Problem tritt vor allem bei der Verwendung von umgekehrten Mikroskopen auf.
Bei den aus der Praxis bekannten Systemen lässt sich die Schnittqualität des Lasers durch die Veränderung der Laserintensität und die Fokuslage einstellen. Die verwendete Apertur des Laserlichtbündels wird bei diesen bekannten Systemen durch die Objektivapertur bestimmt, welche wiederum für eine maximale Bildqualität möglichst groß sein muss. Wie bereits oben erwähnt, ist die gleichbleibende Schnittqualität bei den Vorrichtungen bzw. Verfahren des Standes der Technik schwer zu erreichen. Die Qualität der Schnitte ist zum einen von der Fokuslage des Präparates und dessen Dicke abhängig und zum anderen von der Laserintensität. Diese muss von den Benutzern variiert werden, um die Schnittqualität zu optimieren.
Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die A u f g a b e zugrunde, eine Vorrichtung zum Laserschneiden mikroskopischer Proben so auszugestalten, dass eine annähernd gleichbleibende Schnittqualität für ein breites Probenspektrum gewährleistet ist.
Die L ö s u n g dieser Aufgabenstellung ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass eine Blende vorgesehen ist, die einen abgeblendeten Laserstrahl erzeugt, wobei eine durch das Objektiv erzeugte Laserapertur kleiner ist als die Apertur des Objektivs.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren zum Laserschneiden mikroskopischer Präparate zu beschreiben, das eine annähernd gleichbleibende Schnittqualität für ein breites Probenspektrum ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, das folgende Schritte umfasst: a) Einbringen eines Objektträgers mit einer zu schneidenden Probe in ein Mikroskop, das mindestens ein Objektiv umfasst; b) Ermitteln eines auszuschneidenden Bereichs der Probe mit dem Objektiv; c) Festlegen einer Schnittlinie um den Bereich; d) Erzeugen eines abgeblendeten Laserstrahls mittels einer Blende, so dass dessen Durchmessers derart verringert ist, dass eine durch das Objektiv erzeugte Laserapertur kleiner ist als die Objektivapertur des Objektivs selbst; und e) Schneiden der Probe entlang der festgelegten Schnittlinie.
Ein Vorteil der Erfindung ist, dass durch die Verringerung der Laserapertur der Laserlichtkegel schlanker wird, was zu einer Vergrößerung der Schärfentiefe führt. Infolge der größeren Schärfentiefe des Laserlichts verringert sich die Anforderung an die Fokussiergenauigkeit und führt somit zu einem gleichförmigen und schmalen Schnittkanal.
Vorteilhaft bei der erfindungsgemäßen Ausgestaltung der Vorrichtung ist weiterhin, dass beim Schneidvorgang die Größe der Objektivapertur beibehalten wird. Dadurch ist jederzeit eine Beobachtung der Probe mit der vollen Objektivapertur möglich. So ist eine bestmögliche Festlegung der Probenebene und eine maximale Bildqualität zur Beurteilung der Probe gewährleistet. Für die detailreiche Abbildung und eine gezielte Auswahl von Bereichen der Probe sind Objektivaperturen bis etwa 0.8 notwendig. Dies bedingt natürlich eine geringe Schärfentiefe, so dass gezielt auf unterschiedliche Ebenen der Probe fixiert werden kann. Für das Schneiden mit einem Laserstrahl ist eine geringe Schärfentiefe jedoch unerwünscht. Die Erfindung vereint nun die relativ große Objektivapertur derart mit einem abgeblendeten Laserstrahl, dass die durch das Objektiv erzeugte Laserapertur geringer ist als die Apertur des Objektivs selbst. Das Objektiv kann bei gleichbleibender Öffnung zum gleichzeitigen Beobachten und Schneiden der Probe verwendet werden.
Gemäß einer praktischen Ausführungsform enthält das optische System einen dichromatischen Teiler, der das Laserlicht reflektiert und in das Objektiv einkoppelt, und der gleichzeitig das Licht des Beobachtungsstrahlengangs zu den Okularen oder der Kamera durchlässt.
Um den Laserschnitt insbesondere bezüglich der Schnittqualität kontrollieren zu können, wird weiterhin mit der Erfindung vorgeschlagen, dass der Laserschnitt zeitgleich über ein bildgebendes System, Kamera, kontrollierbar ist. Wird bei der Auswertung der Bilder festgestellt, dass entweder das Präparat beim Laserbeschuss nicht vollständig durchtrennt wurde oder aber die Schnittgeometrie unzureichend ist, können als Reaktion dieser zeitgleichen Kontrolle des Laserschnitts einzelne System parameter, wie beispielsweise die Laserintensität und/oder die Fokuslage des Laserstrahls und/oder die Größe der Blende im Laserstrahl, über einen Rechner eingestellt werden. Durch diese zeitgleiche Kontrolle wird die Gesamtschnittzeit bei verbesserter Qualität verkürzt.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der zugehörigen Zeichnung, in der ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Laserschneiden von mikroskopischen Proben beispielhaft schematisch dargestellt ist. In der Zeichnung zeigt:
Fig. 1: eine schematische Seitenansicht einer Vorrichtung zum Laserschneiden von mikroskopischen Proben,
Fig. 2; den Strahlengang im Bereich der zu schneidenden Probe, und
Fig. 3: eine graphische Darstellung der Schnittbreite in Abhängigkeit von der Apertur des Laserstrahls.
Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung zum Laserschneiden von mikroskopischen Proben aus einem Mikroskop 1 ,das mit einem Arbeitstisch 2 zur Aufnahme eines Objektträgers 10 versehen ist. Eine zu untersuchende bzw. zu schneidende Probe 12 ist auf dem Objektträger 10 aufgebracht. Ferner ist ein Beleuchtungssystem 3 sowie einem Laser 4 vorgesehen, der einen Laserstrahl 4a erzeugt, der zum Schneiden der Probe 12 Verwendung findet. . Bei dem dargestellten Mikroskop 1 handelt es sich um ein Mikroskop, bei dem das Beleuchtungssystem 3 am Mikroskopstativ 5 unterhalb des Arbeitstisches
2 und der Probe 12 angeordnet ist. Ein Objektiv 6 des Mikroskops 1 ist oberhalb des Arbeitstisches 2 und der Probe 12 angeordnet. Das Objektiv 6 definiert eine optische Achse 14, in der ebenfalls das Beleuchtungssystem 3 angeordnet ist. Das Laserschneiden kann jedoch selbstverständlich auch mit inversen Mikroskopen ausgeführt werden, bei denen das Beleuchtungssystem
3 dann oberhalb des Arbeitstisches 2 und das mindestens eine Objektiv 6 unterhalb des Arbeitstisches 2 angeordnet ist.
In den in Fig. 1 offenbarten Ausführungsbeispiel wird das von dem
Beleuchtungssystem 3 ausgestrahlte Licht wird über eine Kondensorlinse 7 von unten auf die auf dem Arbeitstisch 2 angeordneten Objektträger 10 und Probe 12 gerichtet. Das die Probe 12 durchdringende Licht gelangt zum Objektiv 6 des Mikroskops 1. Innerhalb des Mikroskops 1 wird das Licht über nicht dargestellte Linsen und Spiegel mindestens einen Okular 8 des
Mikroskops 1 zugeleitet, durch welches ein Bediener die auf dem Arbeitstisch 2 angeordnete Probe betrachten kann.
Im Stativ 5 des Mikroskops 1 ist ein optisches System 16 in der optischen Achse des Objektivs 6 vorgesehen. Das optische System 16 kann z.B. ein dichromatischer Teiler sein. Ferner ist es denkbar, dass das optische System 16 aus mehreren optischen Bauteilen besteht. Dies ist dann der Fall, wenn der Laser 4 um mehrere Ecken gelenkt werden muss. Ferner ist im Laserstrahl 4a eine Blende 18 vorgesehen, mit welcher der Durchmesser des Laserstrahls in entsprechender Weise beschränkt werden kann. Die Blende 18 kann z.B. als eine Festblende ausgebildet sein. In diesem Fall sind mehrere Festblenden in entsprechender Weise, beispielsweise auf einer Revolverscheibe, angeordnet, um die erforderliche Blende 18 in den Strahlengang zu verfahren. Das Verfahren kann manuell durch den Benutzer oder motorisch durchgeführt werden. In der in Fig. 1 dargestellten Ausführungsform ist die Blende 18 als eine Varioblende, beispielsweise als eine Irisblende, ausgebildet, deren Durchmesser über einen Motor 20 gesteuert wird. Der Motor 20 erhält von einem Rechner 22 die nötigen Steuersignale zum Einstellen des erforderlichen Blendendurchmessers. Das Mikroskop 1 ist ferner mit einer Kamera 24 versehen, die ein Bild von der zu schneidenden Probe 12 aufnimmt. Dieses Bild ist auf einem Monitor 26 darstellbar, der mit dem Rechner 22 verbunden ist. Das System aus Rechner 22, Kamera 24 und Monitor 26 kann dazu verwendet werden, dass der Schneidevorgang durch den Laser 4 beobachtbar und überwachbar ist.
Ferner kann auf dem Monitor 26 der auszuschneidende Bereich der Probe 12 mittels eines Mauszeigers umfahren werden. Entlang der so gekennzeichneten Schnittlinie wird dann der Schneidevorgang durch den Laser 4 ausgeführt.
Fig. 2 zeigt den Strahlengang im Bereich der zu schneidenden Probe 12. Der vom Laser 4 kommende Laserstrahl 4a wird durch die Blende 18 in seinem Durchmesser beschränkt. Nach der Blende 18 tritt ein abgeblendeter Laserstrahl 4b mit einem kleineren Durchmesser aus. Der Laserstrahl 4b trifft auf das optische System 16, das als dichromatischer Teiler ausgebildet ist, und wird dadurch durch das Objektiv 6 auf die zu schneidende Probe 12 gerichtet. Das Objektiv 6 ist in Fig. 2 symbolisch durch eine Linse dargestellt. Die auf einen Objektträger 10 aufgebrachte Probe 12 wird über die Kondensorlinse 7 beleuchtet. Das Objektiv 6 erzeugt einen Abbildungsstrahlengang 6a, der eine größere Breite aufweist als der Laserstrahl 4b nach der Blende 18.
Fig. 3 verdeutlicht den Vorteil eines abgeblendeten Laserstrahls 4b, der schmaler ist als der Abbildungsstrahlengang 6a bzw. als ein nichtabgeblendeter Laserstrahl, der die gesamte Objektivöffnung 32 ausfüllt, durch die der größtmögliche Strahlquerschnitt festgelegt ist. Die Probe 12 besitzt eine Dicke 30, die größer sein kann als die Schärfentiefe des verwendeten Objektivs 6. Der Benutzer kann auf unterschiedliche Ebenen in der Probe 12 fokussieren, um für die weitere Untersuchung relevante Stellen zu finden.
Wird die Probe 12 mit einem nichtabgeblendeten Laserstrahl geschnitten, dessen Querschnitt der Objektivöffnung 32 des Objektivs 6 entspricht, wird durch das Objektiv 6 eine maximale Laserapertur erzeugt, die gleich der Objektivapertur 34 ist. Durch die erzeugte maximale Laserapertur wird in der Probe 12 ein maximaler Schnittkanal 34b mit einer Breite 34a erzeugt.
Wird jedoch die Probe 12 erfindungsgemäß mit dem abgeblendeten Laserstrahl 4b geschnitten, so wird durch das Objektiv 6 eine reduzierte Laserapertur 36 erzeugt, die in der Probe 12 einen reduzierten Schnittkanal 36b mit einer Breite 36a erzeugt. Je geringer der Durchmesser des zum Schneiden verwendeten Laserstrahls ist, desto genauer kann der Schneidevorgang ausgeführt werden.
Indem die Blende 18 zur Begrenzung des Laserstrahlquerschnitts vor dem optischen System 16 außerhalb des Beobachtungsstrahlengangs angeordnet ist, ist gewährleistet, dass die Schärfentiefe des Objektivs 6 zur Betrachtung der Probe 12 während des Schneidevorganges unabhängig von der eingestellten Laserapertur unverändert bleibt. Dadurch bleibt die Bildqualität auch beim Schneidevorgang erhalten.
Um die Schnittqualität weiter zu optimieren ist es erforderlich, dass die den Laserstrahl 4a begrenzende Blende 18 an die Dicke 30 der zu schneidenden Probe 12 angepasst wird. Eine erste Möglichkeit ist, dass die für einen optimalen Schnitt erforderliche Blende 18 aus einer Tabelle (nicht dargestellt) ermittelt und die Blende durch den Benutzer manuell eingestellt wird.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel kann die für einen optimalen Schnitt erforderliche Blende 18 durch den Rechner 22 aus einer abgespeicherten Tabelle (nicht dargestellt) ermittelt werden. Die Einstellung der Blende 18 erfolgt dann automatisch durch den Rechner 22. Hierzu werden vom Rechner 22 entsprechende Signale an den Motor 20 gesendet, der die Verstellung der Blende 18 veranlasst.
Eine weitere Möglichkeit für einen optimalen Schnitt ist, dass der Rechner 22 mit einem Bildauswertesystem (nicht dargestellt) derart an das Mikroskop 1 angebunden ist, dass einzelne Systemparameter, wie beispielsweise die Laserintensität, die Fokuslage des Laserstrahls und die Größe der Blende 18 automatisch auf ein Optimum eingestellt werden. Die Einstellung kann automatisch auch während des Schneidevorgangs verändert werden, um eventuelle Dickenschwankungen der Probe 12 zu berücksichtigen.
Die Erfindung wurde in Anbetracht eines Ausführungsbeispiels beschrieben. Es können jedoch von einem Fachmann Änderungen und Abwandlungen vorgenommen werden, ohne den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
Bezugszeichenliste
Mikroskop
Arbeitstisch
Beleuchtungssystem
Laser a Laserstrahl b abgeblendeter Laserstrahl
Mikroskopstativ
Objektiv a Abbildungsstrahlengang
Kondensorlinse
Okular 0 Objektträger 2 Probe 4 optische Achse 6 optisches System 8 Blende 0 Motor 2 Rechner 4 Kamera 6 Monitor 0 Dicke der Probe 2 Objektivöffnung 4 Objektivapertur 4a Breite des maximalen Schnittkanals 4b maximaler Schnittkanal 6 Laserapertur 6a Breite des reduzierten Schnittkanals 6b reduzierter Schnittkanal

Claims

Patentansprüche
1) Verfahren zum Laserschneiden mikroskopischer Proben gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
a) Einbringen eines Objektträgers (10) mit einer zu schneidenden Probe (12) in ein Mikroskop (1), das mindestens ein Objektiv (6) umfasst;
b) Ermitteln eines auszuschneidenden Bereichs der Probe (12) mit dem Objektiv (6);
c) Festlegen einer Schnittlinie um den Bereich;
d) Erzeugen eines abgeblendeten Laserstrahls (4b) mittels einer Blende (18), so dass dessen Durchmessers derart verringert ist, dass eine durch das Objektiv (6) erzeugte Laserapertur (36) kleiner ist als die Objektivapertur (34) des Objektivs (6) selbst; und
e) Schneiden der Probe (12) entlang der festgelegten Schnittlinie.
2) Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Festlegen der Schnittlinie an einem auf einem Monitor (26) dargestellten Bild der Probe (12) durchgeführt wird, indem der auszuschneidende Bereich der Probe (12) mittels eines Mauszeigers umfahren wird.
3) Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Kamera (24) vorgesehen ist, über die der Schneidevorgang des
Lasers (4) kontrolliert und überwacht wird.
4) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die für einen optimalen Schnitt erforderliche Blende (18) aus einer Tabelle ermittelt wird, und dass die Blende (18) durch den Benutzer manuell eingestellt wird.
5) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Rechner (22) mit einem Bildauswertesystem derart mit dem Mikroskop (1) verbunden ist, dass einzelne Systemparameter, wie beispielsweise die Laserintensität, die Fokuslage des Laserstrahls und die Größe der Blende (18) automatisch auf ein Optimum eingestellt werden.
6) Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die für einen optimalen Schnitt erforderliche Blende (18) durch den Rechner (22) aus einer abgespeicherten Tabelle ermittelt wird, und dass die Einstellung der Blende automatisch durch den Rechner (22) über einen Motor (20) erfolgt.
7) Eine Vorrichtung zum Laserschneiden mikroskopischer Proben umfasst:
a) ein Mikroskop (1) mit mindestens einem Objektiv (6) zur Betrachtung einer zu schneidenden Probe (12), wobei das Objektiv (6) eine optische Achse (14) und eine Objektivapertur (34) definiert, b) einen Laser (4), der einen Laserstrahl (4a) erzeugt, und c) mindestens ein optisches System (16), das den Laserstrahl (4a) in das
Objektiv (6) einkoppelt, dadurch gekennzeichnet, dass eine Blende (18) vorgesehen ist, die einen abgeblendeten
Laserstrahl (4b) erzeugt, wobei eine durch das Objektiv (6) erzeugte Laserapertur (36) kleiner ist als die Objektivapertur (34) des Objektivs
(6).
8) Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe des Durchmessers des Laserstrahls (4a) über eine variable Blende (18) veränderbar ist. 9) Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Beleuchtungssystem (3) vorgesehen ist, das die Probe (12) beleuchtet.
10) Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungssystem (3) die Probe (12) durchleuchtet.
11) Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das optische System (16) aus mindestens einem dichromatischen Teiler besteht.
12) Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kamera (24) vorgesehen ist, über die der Schneidevorgang des
Lasers (4) kontrollierbar und überwachbar ist.
13) Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, das die für einen optimalen Schnitt erforderliche Blende (18) aus einer Tabelle ermittelbar ist, und dass die Blende (18) durch den Benutzer manuell einstellbar ist.
14) Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein Rechner (22) mit einem Bildauswertesystem derart mit dem Mikroskop (1) verbunden ist, dass einzelne Systemparameter, wie beispielsweise die Laserintensität, die Fokuslage des Laserstrahls und die Größe der Blende (18), einstellbar sind.
15) Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die für einen optimalen Schnitt erforderliche Blende (18) durch den Rechner (22) aus einer abgespeicherten Tabelle ermittelbar ist und dass die Einstellung der Blende (18) automatisch durch den Rechner (22) erfolgt.
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