ES2230877T3 - Microdiseccion de precision por captura con laser utilizando longitud de pulso corta. - Google Patents
Microdiseccion de precision por captura con laser utilizando longitud de pulso corta.Info
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Abstract
Procedimiento para la extracción directa de material de una muestra, que comprende las etapas siguientes: provisión de una muestra; provisión de una película de transferencia que, sólo tras ser activada en zonas seleccionadas, presenta la propiedad de proporcionar a las zonas seleccionadas la capacidad de adherirse a la muestra; yuxtaposición de la muestra a la película de transferencia; identificación de por lo menos una parte del material para extraerla de la muestra; enfoque del haz de radiación pulsada, de un diámetro de haz preseleccionado y una longitud de pulso preseleccionada, sobre la película de transferencia para activar un volumen de la película de transferencia adyacente a la muestra y adherirlo a por lo menos una parte del material que se va a extraer de la muestra; observación de la interfase óptica entre la muestra y la película de transferencia durante la etapa de enfoque para comprobar que dicha parte por lo menos del material de la muestra se adhiera a la película de transferencia, y el alcance espacial de la unión en el plano de la imagen, y separación de la película de transferencia de la muestra mientras se mantiene la adhesión entre la película de transferencia y dicha parte por lo menos de material de la muestra, para desprender de ese modo dicha parte por lo menos de material de la muestra de la parte restante de la muestra; en el que la película de transferencia se separa un pequeño intervalo espacial de la muestra y en el que el haz de radiación pulsada, de un diámetro de haz preseleccionado y una longitud de pulso preseleccionada, se enfoca sobre la película de transferencia para activar un volumen de la película de transferencia adyacente a la muestra, lo cual determina que dicho volumen se expanda y abarque el pequeño intervalo espacial para adherirse a dicha parte por lo menos del material que se va a extraer de la muestra.
Description
Microdisección de precisión por captura con láser
utilizando longitud de pulso corta.
La presente invención se refiere a la
microdisección por captura con láser, técnica en la que se visualiza
un espécimen mediante un microscopio y en la que a continuación se
recubre el espécimen con una capa de material de transferencia que,
una vez activado mediante un láser, se adhiere a los elementos de
destino concretos de la muestra desprendiéndolos de ésta para su
ulterior procesamiento. Más particularmente, la presente exposición
se centra en la extracción de muestras de igual tamaño o más
pequeñas que el haz del láser de activación. El objetivo de la
presente invención es proporcionar un procedimiento y un aparato
para la microdisección fiable de objetivos situados dentro de un
tejido u otras muestras de espécimen, de un tamaño inferior a 10
micras de diámetro, aproximadamente.
En el documento WO 97/13838, titulado
"Isolation of Cellular Material Under Microscopic
Visualization" y publicado el 17 de abril de 1997, en la página
20, línea 24, se afirma lo siguiente:
El tamaño del tejido transferido, dependiendo
de las necesidades del técnico, puede variarse cambiando el diámetro
del haz del láser y la duración del pulso. Pueden realizarse con
facilidad transferencias altamente reproducibles en el rango de 60 a
700 \mum de diámetro para la obtención de lesiones pequeñas (de
100 \mum a 1 mm) sin invasión de las células
no-neoplásicas adyacentes. En la mayoría de estudios
de investigación básicos y clínicos, es necesario obtener entre
varias centenas y varios millares de células para proporcionar
suficiente material genético y llevar a cabo una amplificación
fiable y un análisis estadísticamente significativo. Sin embargo,
puesto que los haces de láser pueden enfocarse en un área inferior a
un diámetro celular, se considera que las transferencias de células
individuales específicas o incluso de partes de éstas son posibles
según el procedimiento de la invención.
En la presente solicitud, se expone la solución
para la transferencia "considerada posible" mencionada más
arriba.
Aunque en las primeras patentes de microdisección
se describe un sustrato rígido inerte al que se aplica el polímero
termoplástico que puede utilizarse como placa de presión, en la
implementación original de la LCM (microdisección por captura con
láser) se emplea una película independiente que se aplica a la
superficie del tejido, empujando suavemente la película contra la
muestra. A continuación, la película colocada sobre la sección del
tejido deseada se calienta mediante un haz de 100 micras de diámetro
y se funde mediante impulsos de láser de CO_{2}. La longitud de
pulso láser elegida (entre 100 ms y 630 ms) permite que la película
irradiada aumente hasta una temperatura de estado estacionario
durante un tiempo suficientemente prolongado, para que el polímero
fluya dentro del tejido y forme una unión fuerte llenando los
espacios vacíos de la muestra desecada. Los pulsos de 630 ms
utilizados habitualmente con este sistema se eligen con esta
duración a propósito, para asegurar que el polímero fundido (que
permanece fundido hasta el final del impulso) disponga de suficiente
tiempo, tras alcanzar la temperatura de estado estacionario, para
fluir de forma fiable dentro del tejido durante el impulso láser. En
un ensayo posterior, se ha demostrado la posibilidad de efectuar
transferencias equivalentes con este sistema y pulsos de 100 ms,
aunque debido a la separación irregular entre la superficie del
polímero y el tejido, la transferencia con pulsos de 100 ms es menos
reproducible que con los impulsos más largos. Cuando se utiliza este
sistema LCM, el objetivo consiste en calentar la superficie inferior
del polímero un poco por encima del punto de fusión. Los niveles de
energía suministrados por el láser de CO_{2} se mantienen dentro
de un factor de dos de la energía umbral necesaria (rango de 25 a 50
mW suministrado a un punto de 100 \mum de una película de polímero
EVA de 100 \mum de grosor). Por lo tanto, el tejido capturado
mediante el polímero fundido se expone habitualmente a temperaturas
máximas de \sim90 a 100ºC durante \sim500 ms. Cuando se utiliza
este procedimiento, no se observan daños al DNA, al RNA ni a las
proteínas de la muestra capturada en el posterior análisis
molecular.
En la LCM, se evitan los pulsos cortos para
asegurar una fuerza de unión adecuada. Las informaciones
proporcionadas por una serie de fabricantes de adhesivos
termoplásticos basados en EVA (por ejemplo, cola caliente) sugieren
que la utilización de adhesivos de EVA requiere mantener las
junturas fundidas bajo presión durante más de un segundo. En los
diseños de LCM por láser de CO_{2} originales, la utilización de
una placa de presión (transparente y no absorbente de luz láser y
luz visible) no resulta práctica, debido a la escasez y al coste de
los materiales que transmiten longitudes de onda de láser de
CO_{2} (9 a 11 \mum). Posteriormente, la introducción de
colorantes altamente absorbentes de infrarrojos cercanos (\sim0,8
\mum) solubles en los polímeros termoplásticos ha permitido que la
película de transferencia se funda focalmente mediante los diodos
láser de pulsos infrarrojos (\sim0,8 \mum), que se enfocan con
facilidad a través de sustratos transparentes sobre diámetros
pequeños de un tamaño inferior a 10 \mum de la película
termoplástica absorbente.
La solicitud internacional WO98/35216, que fue
publicada el 13 de agosto de 1998 y reivindica una fecha de
prioridad de 7 de febrero de 1997, forma parte del estado de la
técnica únicamente en relación con el Artículo 54(3) CPE.
Este documento da a conocer un procedimiento de LCM, en el que la
película de transferencia está separada de la muestra por un pequeño
intervalo de espacio, pero no describe la etapa de observación de la
interfase óptica entre la muestra y la película de transferencia
durante el procedimiento de irradiación.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la extracción directa de material de una muestra
según la reivindicación 1.
La microdisección por captura con láser tiene
lugar cuando la película de polímero de transferencia se coloca
sobre un sustrato que cubre el material celular visualizado y
seleccionado que se va a extraer de una muestra. La película de
polímero de transferencia se activa focalmente (se funde) con un
pulso suficientemente corto como para permitir que el volumen
fundido quede confinado al polímero directamente irradiado. La
presente invención utiliza pulsos breves para reducir la difusión
térmica hacia el polímero no irradiado circundante, impidiendo de
ese modo que éste se caliente hasta fundirse y proporcionando al
mismo tiempo suficiente calor por absorción directa para el pequeño
volumen focal directamente irradiado por el haz de láser enfocado.
Este procedimiento puede utilizarse tanto en la LCM descrita
anteriormente como en la LCM sin contacto, ya sea empleando
radiación del lado del condensador (el haz pasa a través del
polímero antes de pasar por el tejido) o epirradiación (el láser
pasa a través del tejido antes de pasar por el polímero). El
procedimiento puede utilizarse en configuraciones en las que el
láser pasa a través del tejido antes de pasar por el polímero, con y
sin un sustrato inerte adicional. En la configuración
preferida, se emplea el confinamiento inerte o elástico del polímero
termoplástico circundante no fundido (y el sustrato unido
superpuesto) para forzar la expansión del polímero fundido hacia el
interior del tejido subyacente deseado. Mediante el protocolo de
pulso corto, el material enfocado y extraído puede tener un diámetro
igual o inferior al del haz excitador, aunque se esté cerca de los
límites de difracción óptica.
Para mejorar todavía más la precisión y la
localización, pueden aplicarse una serie de pulsos cortos
"subumbrales" a los mismos puntos o a puntos inmediatamente
adyacentes para entrar en contacto sólo con objetivos concretos
dentro del haz del láser (por ejemplo, un objetivo inferior al
diámetro del haz del láser situado en el centro del pulso láser). En
este caso, se saca provecho del hecho de que cuando un volumen de
polímero se funde de arriba abajo en la película termoplástica
absorbente por la acción de un pulso láser, éste experimenta una
expansión volumétrica proporcional en la dirección del tejido. Este
volumen de expansión del polímero puede hacerse coincidir con el
volumen del objetivo deseado, incluyendo el volumen de separación
inicial entre el polímero y el objetivo, ya sea mediante cálculo
aproximado de los parámetros de pulso medio necesarios para llevar a
cabo la captura con un solo pulso, o bien mediante un pulso láser
que es aproximadamente la mitad del necesario para la captura con un
solo impulso y aplicando una serie de pulsos hasta que se consigue
la unión con el objetivo.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento que permita una zona de transferencia
LCM reproducible inferior a 20 micras, con la máxima precisión y
eficacia y la mínima duración de transitorios térmicos en la muestra
de destino, ocasionados por el contacto con el polímero
termoplástico fundido durante el pulso láser y, posteriormente,
hasta que se enfría. Se ha comprobado que un procedimiento fiable
para obtener tamaños de punto de transferencia más pequeños
(inferiores a 10 micras de diámetro) incluye la reducción de la
anchura del pulso láser a menos de 1 ms y el ajuste de la potencia
máxima del láser. Estas anchuras de pulso y potencias reducen al
mínimo los daños a las macromoléculas de la muestra de tejido.
Se ha comprobado, en el momento de presentar la
presente solicitud, que el contacto y la adherencia del material
activable con la muestra crea un fenómeno perceptible. En realidad,
el usuario puede percibir la adherencia deseada con la muestra
mientras ajusta la longitud del pulso y la potencia para dilatar,
contraer e incluso conformar las áreas de adhesión.
La Figura 1A es un esquema de microdisección por
captura con láser, en el que la luz del láser de activación pasa a
través del lado del condensador de un microscopio para la
microdisección del tejido seleccionado.
La Figura 1B es un detalle del emplazamiento de
la LCM que ilustra el haz de excitación del láser y la capacidad de
excitación de un área inferior al haz para aplicar con mayor
precisión la LCM de contacto al tejido seleccionado.
La Figura 2A es un esquema de LCM sin contacto,
en la que se utiliza epirradiación (el láser pasa a través del
tejido antes de pasar por el polímero) para que la película activada
se extienda hasta el tejido seleccionado a través de un espacio.
La Figura 2B es un detalle del emplazamiento de
la LCM que ilustra el haz de excitación del láser y la capacidad de
excitación de un área inferior al haz para aplicar con mayor
precisión la LCM sin contacto al tejido seleccionado.
La Figura 3 es una vista de una capa de EVA
(etileno-acetato de vinilo), en la que se muestra un
haz pasando a través de la capa.
Las Figuras 4A a 4E son perfiles radiales
sucesivos del EVA de la Figura 3, que ilustran cómo la expansión de
los perfiles radiales sobrepasa la dimensión de los haces con el
aumento de la duración de la radiación, y cómo incrementa el
intervalo del contorno con el incremento de la potencia del haz del
láser, sobrentendiéndose que se muestran los contornos de 25ºC de un
haz de láser de 20 mW (un haz de 40 mW generaría un contorno de 50ºC
de idéntica forma).
En relación con la Figura 1A, se ilustra una LCM
de contacto convencional. En la Figura 1A, el observador
representado por el ojo E visualiza el espécimen S del portaobjetos
P a través del microscopio M (representado de forma esquemática). La
iluminación del espécimen S se proporciona a través de la lámpara
incandescente del microscopio L y del espejo dicroico D. La
iluminación pasa a través de un soporte transparente B (que puede
ser una capa no absorbente inerte de material rígido o de material
fuerte aunque flexible, tal como una película de poliéster, formando
el primer tipo de material un elemento de transferencia rígido y el
segundo, en combinación con la capa T, una cinta más flexible de 2 o
más capas) y una capa de transferencia transparente T.
La capa de transferencia T suele ser un polímero
termoplástico de bajo punto de fusión con un gran incremento de
volumen asociado a la transición de fase sólida a fase líquida
(p.ej., etileno-acetato de vinilo) que puede teñirse
(p.ej., a las longitudes de onda de los infrarrojos cercanos
invisibles al ojo humano) para acoplarse a la radiación 16 del láser
Z de una frecuencia concreta. Cuando se determina a qué parte del
espécimen S debe aplicarse la LCM, el láser Z se activa y entonces
la capa de transferencia T se activa para adherirse al espécimen S
del tejido seleccionado. La luz 16 del láser Z pasa a través de la
lente 14, incide en el espejo dicroico D y a continuación pasa a
través de la placa de soporte transparente B para incidir en la capa
de transferencia T.
En la Figura 1B, se ilustra un detalle de la LCM
de contacto ilustrada. El haz de láser 16 representado pasa a través
el soporte transparente B y penetra en la capa de transferencia T
(que absorbe el haz pero no la luz visible). La capa de
transferencia T representada está en contacto con el espécimen S. En
relación con las Figuras 4A a 4E, se sobrentenderá que es posible
excitar un área de la capa de transferencia T más pequeña que el
área total expuesta de ésta. Por consiguiente, la columna de
adherencia C representada se prolonga hasta el interior del
espécimen S para extraer el grupo de células seleccionadas G que
puede constar sólo de una célula.
Como se sobrentenderá, el soporte transparente B
de esta LCM tiene una función. En particular, y mediante el apoyo
que proporciona a la capa de transferencia T, la placa de soporte
transparente B forma un sustrato subyacente suficientemente fuerte
como para resistir la expansión del polímero termoplástico fundido.
Este sustrato subyacente combinado con el confinamiento inercial o
elástico del material inactivado circundante de la capa de
transferencia T obliga al polímero fundido a fluir en la dirección
de la muestra de tejido. Los requisitos preferidos para el sustrato
subyacente son: 1) que sea transparente tanto a la luz visible
necesaria para la visualización microscópica como a la luz láser
infrarroja utilizada para activar el polímero termoplástico, 2) que
tenga un punto de fusión suficientemente alto para que el calor del
polímero termoplástico absorbente de láser adyacente fundido no
provoque su fusión y 3) que sea suficientemente rígido para que no
se deforme apreciablemente a las presiones ocasionadas por la
expansión del polímero termoplástico adyacente activado por el láser
(es decir, se comporte como un cuerpo rígido frente a dichas fuerzas
transitorias).
Hasta aquí, la descripción general del tipo de
LCM de contacto. El tipo de LCM sin contacto puede ilustrarse
mediante las Figuras 2A y 2B.
La Figura 2A es en esencia igual a la Figura 1A,
con la excepción de que la radiación utilizada es la denominada
epirradiación. En consecuencia, como se observará, el láser Z se
sitúa por debajo del portaobjetos P.
En relación con la Figura 2B, se observará que el
haz del láser 16 asciende, a través del portaobjetos P, hasta la
muestra S y el intervalo espacial 20. A continuación, el haz del
láser 16 se introduce en la capa de activación T para activarla.
Como se describirá, la columna de adherencia C atraviesa este
intervalo espacial 20 y de nuevo se fija al material seleccionado G.
También esta vez, la fijación al material seleccionado G consiste en
una columna que presenta un diámetro inferior al diámetro real del
haz. Por lo tanto, mediante las técnicas descritas más adelante, es
posible "enfocar" el material activado en relación con el haz
del láser 16 para que ocupe en realidad un área (o un diámetro de
destino de transferencia) inferior a la del haz del láser
(diámetro), aun cuando se reduzca el diámetro del haz por debajo de
10 \mum.
En relación con la Figura 3, se representa un
modelo térmico de los contornos de temperatura del polímero (EVA)
que compone la capa de transferencia T. Se observará que la capa de
transferencia T superpuesta es la placa de soporte transparente B y
que la capa de transferencia subyacente T es el portaobjetos de
vidrio P con el espécimen S. El diámetro del haz es de 30
\mum.
Con referencia al área oscurecida representada en
la que se indica que el polímero está fundido, puede efectuarse una
deducción importante. El lector comprenderá que antes que la
película fundida y el espécimen entren en contacto en la parte
seleccionada, existe una interfase de aire entre el espécimen y la
película. La interfase aire-muestra normalmente es
una superficie muy irregular con una gran diferencia de índices de
refracción, lo cual provoca una gran dispersión de la luz incidente
en la muestra.
Cuando se produce el contacto y la adhesión del
polímero termoplástico fundido con la muestra, la diferencia de
índices de refracción se reduce mucho (los índices de refracción del
polímero y la muestra son mucho más parecidos entre sí que los
índices de cualquiera de éstos y el aire), y en consecuencia se
observa un cambio claramente visible en la imagen de transmisión de
la muestra en el punto de contacto. En concreto, la dispersión
disminuye y la parte contactada y adherida del espécimen se ve más
"brillante". Por lo tanto, cuando se produce la unión con la
película de transferencia fundida, aparece una interfase claramente
visible para el observador.
Debe destacarse que este cambio de aspecto se
produce incluso cuando la película ya está "en contacto" con el
espécimen. En el caso habitual, la superficie del espécimen es muy
irregular. El contacto de la película con el espécimen en los puntos
"altos" de una superficie irregular todavía genera una
dispersión de luz muy perceptible. Cuando se efectúa el
calentamiento y la adhesión, la huella de la unión es relativamente
fácil de observar. Por lo tanto, en el procedimiento dado a conocer,
el técnico tiene la ventaja de poder observar la unión en el momento
en que ésta se produce.
Mediante esta técnica, el tamaño del punto puede
ajustarse visualmente utilizando la presente exposición. Por
ejemplo, cuando se necesita una disección precisa, el observador
puede verificar visualmente que en ningún momento el punto llega a
ser más grande que el área seleccionada. Por otra parte, cuando el
material deseado de la muestra está aislado en esencia (ya sea por
una separación espacial o por un material "inocuo" que lo
rodea) el área de contacto puede ampliarse. En cualquier caso, el
contacto descrito aquí proporciona una interfase visual valiosa que
orienta al observador durante el procedimiento de recogida.
Las áreas oscurecidas características que guían a
la persona que recoge las muestras durante la microdisección también
se ilustran en la Figura 4.
En la puesta en práctica habitual de la LCM
mediante películas poliméricas absorbentes de IR cercanos con una DO
de \sim0,3 y un grosor de \sim50 micras, la duración de pulso
necesaria para aproximarse al estado estacionario en el centro del
punto irradiado con láser es de \sim100 ms para haces de \sim100
\mum, \sim40 ms para haces de 60 \mum, \sim10 ms para haces
de 30 \mum, \sim1 ms para haces de 10 \mum y alrededor de 500
us para haces de 5 \mum.
Utilizando un sistema LCM especial capaz de
suministrar pulsos de diodo láser casi de alta potencia de sólo 200
\mus, se han demostrado cuantitativamente ciertas características
nuevas de funcionamiento con pulsos cortos, en comparación con los
pulsos de estado estacionario utilizados anteriormente con la LCM,
que son el objeto de la presente invención.
Para un haz de 10 \mum, se obtienen pulsos de
longitud inferior a 1,0 ms en una respuesta EVA (expansión y unión)
que depende del producto de la potencia y la duración del pulso (o
energía total suministrada). En este régimen de pulsos cortos, la
eficacia de calentamiento del polímero y la creación de una unión es
óptima. Con pulsos más largos, debe suministrarse una mayor cantidad
total de calor (o energía láser absorbida que es el producto de la
duración del pulso y la potencia absorbida), lo cual determina que
los tamaños de transferencia sean mayores y que las moléculas del
tejido estén expuestas a integrales más altas de temperatura por
tiempo (es decir, expuestas mayor tiempo a elevadas temperaturas).
En general, para una duración de pulso superior a este régimen de
"tiempo corto", las transferencias seguras serán de mayor
tamaño y los transitorios térmicos macromoleculares serán más
prolongados. Del mismo modo, para haces de 5 \mum, los pulsos
láser de menos de 0,5 ms proporcionarán transferencias equivalentes
a una energía total equivalente (la potencia y la duración del pulso
necesarios para transferencias "eficaces" varían de forma
mutuamente recíproca).
La duración del transitorio térmico experimentado
por las macromoléculas del tejido de destino puede reducirse
utilizando pulsos más cortos, obteniéndose las mismas temperaturas
máximas. El tamaño del tejido transferido viene determinado por el
diámetro de la zona de la película que se calienta hasta fundirse y
fusionarse con la muestra de tejido. Para pulsos largos (es decir,
en las condiciones de estado estacionario descritas por Goldstein
et al. en Applied Optics 37:7378, 1998), el tamaño de
transferencia viene determinado por la potencia del haz de láser y
por las características térmicas (capacidad y difusión térmica) de
la película de transferencia LCM. La tabla proporcionada a
continuación resume los parámetros para la LCM de estado
estacionario convencional, equiparándose el tamaño de la
transferencia con el diámetro del haz (utilizando un polímero de 40
\mum de grosor y una sección tisular de 5 \mum de grosor):
| Diámetro del haz | Tamaño de transferencia | Potencia de láser | Duración de pulso láser |
| 30 \mum | 30 \mum | 15 mW | 25 ms* |
| 60 \mum | 60 \mum | 30 mW | 50 ms* |
| 100 \mum | 100 \mum | 40 mW | 100 ms* |
| * superior o igual a |
A potencias más elevadas, el tamaño de la
transferencia y las correspondientes temperaturas máximas del
polímero aumentan. No obstante, si se incrementan las anchuras de
pulso por encima de los valores indicados en la Tabla 1, ni el
diámetro del punto transferido ni las temperaturas máximas varían de
forma significativa con la anchura del pulso. Cuando es necesario
fijar la película de transferencia LCM a un sustrato inerte en lugar
de utilizar una película independiente, el sustrato:
1) actúa como una placa de presión que
proporciona una fuerza de aplicación definida,
2) delimita de forma reproducible la superficie
inferior o de unión con el tejido del polímero activable en relación
con una superficie no activada y proporciona precisión de
posicionamiento de un cuerpo rígido,
3) impide la expansión del polímero a través de
la superficie del sustrato rígido o a lo largo de ésta, y en
combinación con la película polimérica termoplástica inactivada (y
por lo tanto sólida) circundante obliga al polímero fundido a
expandirse en la dirección del tejido subyacente y a introducirse en
éste, lo cual da por resultado un área de contacto superficial
reproducible entre el polímero y el tejido y una unión fuerte.
Dicho de otro modo, siempre que se irradie la
película mediante el láser con suficiente energía absorbida para
fundirla focalmente, la película fundida trata de expandirse (debido
al coeficiente de expansión térmica y al incremento de volumen
asociado al cambio de sólido a líquido), pero queda confinada por la
rigidez del soporte de la película y las partes no calentadas de la
película. Una vez que la superficie "inferior" del polímero
activado se ha fundido, la expansión empuja la película fundida
hacia abajo introduciéndola en el tejido. Por lo tanto, no es
necesario que la película esté en contacto directo con el objetivo.
La superficie inferior de la parte fundida de la película es
empujada durante el pulso láser, se fusiona o une con el objetivo
microscópico y el objetivo situado dentro del volumen delimitado por
la zona de expansión del polímero es capturado o queda fijado a la
película y el sustrato. La combinación de 1) pulsos de haz cortos y
pequeños, 2) la gran expansión al producirse la fusión de los
polímeros seleccionados y 3) el confinamiento de la expansión y
redirección hacia el objetivo permite la captura fiable de objetivos
inferiores a 10 \mum. Para pulsos más largos (como en el caso de
CO_{2} original), el polímero puede expandirse hacia arriba y
hacia abajo y fluir por acción de la gravedad o la tensión
superficial una vez que el polímero fundido ha entrado en contacto
con el tejido (o superficie húmeda del objetivo). No obstante, para
que los pulsos más cortos formen uniones eficaces, se requiere una
presión local alta para forzar el flujo rápido del polímero dentro
del objetivo (tanto si éstos están inicialmente en contacto como si
no). La expansión del polímero fundido crea esta presión. Si el
volumen fundido es confinado por el material rígido por todos los
lados, salvo en la dirección del objetivo, dichas uniones pueden
efectuarse en menos de un ms y son muy fuertes. El soporte (capa de
sustrato) es particularmente crucial cuando se utiliza la
irradiación del "lado del condensador", en la que la parte
superior de la película se funde antes que la parte inferior. Sin
sustrato inerte de "confinamiento", la expansión inicial se
producirá en la dirección opuesta al objetivo y la presión que
impulsa el flujo en la dirección del tejido, una vez que se ha
producido la fusión de arriba abajo, estará considerablemente
reducida. Por lo tanto, las uniones sin confinamiento de la
expansión del polímero por la parte superior serán menos fuertes o
se formarán de forma menos fiable en tiempos cortos.
Siempre que estas uniones sean más fuertes que la
unión original entre el objetivo y el portaobjetos de vidrio, el
objetivo será transferido a la superficie de la película y separado
de los elementos adyacentes del portaobjetos una vez que el sustrato
se ha separado del portaobjetos (si existen elementos adyacentes no
deseados situados junto a los elementos deseados o unidos a éstos,
para lograr la separación será necesario que la fuerza de unión de
los elementos no deseados con el portaobjetos de vidrio supere a la
fuerza de unión de los elementos no deseados con los elementos
deseados). Habitualmente, se forman una serie de uniones láser para
acumular un grupo de objetivos equivalentes de la zona deseada en el
portaobjetos antes de la separación del sustrato, su capa polimérica
termoplástica y los objetivos capturados del portaobjetos y el resto
de elementos microscópicos de éste.
Se utiliza cualquiera de las muestras o películas
LCM existentes con cualquier geometría de visualización o
irradiación (p.ej., irradiación de lado de condensador o
epirradiación). La combinación de 1) pulsos de haz cortos y
pequeños, 2) la gran expansión fraccionaria al producirse la fusión
de los polímeros seleccionados (p.ej., \sim10%) y 3) el
confinamiento de la expansión y redirección hacia el objetivo
permite la captura fiable de objetivos inferiores a 10 \mum. Para
pulsos más largos (como en el caso de CO_{2} original), el
polímero puede expandirse hacia arriba y hacia abajo y fluir por
acción de la gravedad o la tensión superficial una vez que el
polímero fundido ha entrado en contacto con el tejido (objetivo
poroso). Se requieren pulsos láser más cortos a potencias algo más
altas que las de la LCM convencional para confinar el volumen
fundido del polímero fijado a pequeños diámetros de haz (< 20
micras). Para estos pulsos más cortos, se requiere una presión local
alta para forzar el flujo rápido del polímero dentro del objetivo
(tanto si éstos están inicialmente en contacto como si no). La gran
expansión del polímero fundido crea esta presión. Si el volumen
fundido es confinado por material rígido por todos los lados, salvo
en la dirección del objetivo, dichas uniones pueden formarse en
menos de un ms y son muy fuertes. El soporte (capa de sustrato) es
particularmente crucial cuando se utiliza la irradiación del "lado
del condensador". En este caso, la parte superior de la película
se fundirá antes que la parte inferior, y la expansión inicial sin
un sustrato inerte de "confinamiento" se producirá en la
dirección opuesta al objetivo. Esta trayectoria fluida hacia el aire
en la parte superior reducirá considerablemente la presión que
impulsa el flujo en la dirección del tejido una vez que ha tenido
lugar la fusión de arriba abajo. Por lo tanto, las uniones no serán
tan fuertes ni se formarán de forma tan fiable en tiempos
cortos.
A diferencia de la LCM de pulso largo
convencional, a anchuras de pulso por debajo de 1 ms, la película no
se acerca al equilibrio térmico a distancias de más de 2 micras del
borde del haz del láser durante el pulso láser. En consecuencia, la
pérdida de calor se reduce al mínimo. Por lo tanto, cuando la capa
activable recibe y absorbe la energía adecuada, sólo la película de
la zona expuesta al láser se calienta hasta el punto de fusión
durante el pulso láser, expandiéndose para entrar en contacto y
fusionarse con el tejido. Para un pulso corto (inferior a 1 ms), no
se dispone de tiempo suficiente para que la temperatura de la
película aumente hasta el punto de fusión fuera de la zona expuesta
al pulso láser, debido a la corta duración del pulso. Esta zona
permanece por debajo del punto de fusión y no se fusiona con el
tejido. Por lo tanto, para pulsos cortos, el tamaño de la zona de
transferencia no es incrementado por difusión térmica y el tamaño de
transferencia del tejido viene determinado principalmente por el
diámetro del punto láser. Para pulsos cortos, se observa que el
tamaño del punto de transferencia incrementa cuando se incrementa la
anchura del pulso láser, en contraste con el régimen LCM de pulsos
largos convencional, lo cual indica que se está trabajando en un
régimen de difusión térmica diferente. La tabla proporcionada a
continuación resume los parámetros para la nueva LCM de pulso corto
con un tamaño de transferencia igual al diámetro del haz (utilizando
un polímero de 40 \mum de grosor y una sección tisular de 5 \mum
de grosor).
Es importante observar que la unión obtenida de
los polímeros de EVA (tales como Dupont Elvax 200W, 410, 205W y
4310) con el tejido es fiable y tiene la fuerza suficiente para
permitir transferencias reproducibles en transitorios térmicos de
sólo 0,3 ms. Por lo tanto, no sólo es posible confinar el polímero
fundido a una zona de pocas micras de diámetro con pulsos cortos,
sino además formar uniones fiables con el tejido en dichos
transitorios de fusión breves.
En la tabla 2 anterior, las mediciones
experimentales demuestran transferencias equivalentes para la misma
energía de pulso cuando la duración del pulso láser se mantiene por
debajo de un tiempo crítico asociado al tiempo necesario para una
difusión térmica significativa desde el volumen irradiado. Como se
ha indicado, por debajo de cierta longitud de pulso (<< 1 ms
para un punto de 10 \mum de diámetro y 0,5 ms para un punto de 5
\mum de diámetro), la energía láser necesaria para crear un tamaño
pequeño de transferencia dado es esencialmente constante (p.ej., 9
microjulios para una transferencia de 5 micras utilizando una
película EVA activable de 40 \mum de grosor con una DO de 0,4 a la
longitud de onda del láser). En general, en las realizaciones
preferidas de LCM se utilizan polímeros termoplásticos (p.ej., de
EVA con bajo porcentaje de acetato de vinilo) con una temperatura de
fusión baja, de tal forma que las temperaturas máximas necesarias
para formar una unión termoplástica se reducen al mínimo.
Como puede observarse en la Tabla 2, en el
régimen de pulsos cortos utilizado, la energía láser necesaria para
crear un tamaño pequeño de transferencia dado es esencialmente
constante (p.ej., 9 microjulios para una transferencia de 5 micras
utilizando una película de EVA activable de 40 \mum de grosor con
una DO de 0,4 a la longitud de onda del láser). Aunque es posible
utilizar cualquiera de estos pulsos para capturar un elemento
microscópico de tamaño equivalente, existen ciertas diferencias
físicas intrínsecas que aconsejan utilizar estrategias de
optimización concretas. En general, los pulsos más cortos de
potencia más alta (p.ej., de 5 \mum, 45 mW y 0,2 ms con 9
microjulios) crean en el polímero termoplástico temperaturas máximas
superiores a las de los pulsos más largos equivalentes (p.ej., de 5
\mum, 18 mW y 0,5 ms también con 9 microjulios). Cuando las
temperaturas se incrementan dentro del polímero fundido, se crea una
viscosidad transitoria inferior y puede producirse una inyección más
eficaz de polímero dentro de los espacios vacíos más finos del
volumen de destino. No obstante, los pulsos más cortos de más
potencia también están asociados a transitorios térmicos máximos más
altos en los objetivos capturados, durante el breve período entre el
instante en que el polímero fundido entra por primera vez en
contacto con el objetivo y el momento en que el polímero se enfría y
solidifica (tras finalizar el pulso y el rápido enfriamiento por
flujo de calor a través del vidrio subyacente). Por otra parte, los
pulsos ligeramente más largos de potencia inferior proporcionan el
mismo volumen máximo de polímero fundido y volumen de expansión con
la misma energía absorbida, mediante temperaturas máximas inferiores
y tiempos más largos que pueden reducir al mínimo el ataque térmico
máximo a la muestra, mientras proporcionan tiempos más largos para
crear una unión mecánica más fuerte con el objetivo. En general, en
las realizaciones preferidas de LCM se utilizan polímeros
termoplásticos (p.ej., de EVA con bajo porcentaje de acetato de
vinilo) de baja temperatura de fusión, de tal forma que la
temperatura máxima necesaria para formar una unión termoplástica se
reduce al mínimo. Cuando se trabaja con materiales sensibles
térmicamente, tales como proteínas en las cuales se desea conservar
la función enzimática, los parámetros láser "equivalentes"
preferidos de la Tabla 2 son los pulsos eficaces de mayor longitud
citados.
Los requisitos para obtener una unión
satisfactoria del objetivo son: 1) la fusión del polímero activable
a lo largo del eje del haz de láser desde la superficie superior a
la inferior y 2) la expansión del polímero termoplástico en este eje
hasta la superficie de destino y dentro de los espacios vacíos de
destino. En la LCM anterior, se utilizan pulsos más largos capaces
de proporcionar distribuciones de temperatura en estado estacionario
dentro del polímero fundido, y un grosor del polímero
aproximadamente igual al diámetro del haz del láser (Tabla 1: de 30
a 100 \mum). Cuando se utilizan pulsos cortos para reducir al
mínimo la difusión térmica lateral y permitir transferencias de
objetivos más pequeños, el flujo de calor de la parte superior a la
parte inferior de la película también se reduce durante el pulso
láser. El gradiente térmico inducido por el láser desde la parte
superior hasta la parte inferior del volumen irradiado incrementa
tanto con el grosor del polímero activable como con su densidad
óptica (absorbancia) a la longitud de onda de activación del láser.
Por lo tanto, en particular para la LCM de pulso corto, la película
de polímero activable debe ser cuidadosamente diseñada por lo que
respecta al grosor y la densidad óptica. Como se ha descrito
anteriormente (Bonner et al., Science 278:1431, 1997 y
patentes...), la absorbancia de los polímeros termoplásticos, tales
como el etileno-acetato de vinilo, a longitudes de
onda láser de IR cercano puede controlarse con precisión mediante la
concentración de moléculas añadidas con gran absorbancia de IR
cercano, tales como colorantes de naftalocianina que son muy
solubles en el polímero. La absorbancia de la película termoplástica
a las longitudes de onda láser utilizadas deberá mantenerse a una DO
< 0,43 variando la concentración de colorante con el grosor de la
película que se va a utilizar. Otras películas más finas se asocian,
al fundirse de arriba abajo en puntos pequeños, con volúmenes
respectivamente pequeños de polímero fundido y, por consiguiente,
volúmenes de expansión polimérica más pequeña. De esta forma, las
películas poliméricas más delgadas presentarán de forma intrínseca
una mayor precisión de captura, en particular, para espécimenes de
destino más delgados. Por otra parte, cuando aumenta el espacio de
separación inicial entre la superficie polimérica no activada y la
superficie de destino o el grosor del objetivo, la distancia de
expansión necesaria para crear una unión y una transferencia
asociada eficaz también aumenta. En tales casos, deberá
incrementarse el grosor del polímero y deberá reducirse la
concentración del colorante.
En otra realización preferida, se utiliza el
procedimiento LCM de pulso corto a potencias ligeramente inferiores
(de un factor de dos de la potencia necesaria para transferir un
objeto del espécimen exactamente igual al tamaño del haz con un solo
pulso), pero con una serie de pulsos (con una repetición de <<
2 a 3 pulsos por segundo). Esta serie de pulsos incrementa el avance
de la expansión del polímero hasta que entra en contacto y se une a
una célula u objeto microscópico de destino situado en el
portaobjetos, momento en el cual el tren de pulsos se interrumpe. En
este procedimiento, el primer pulso corto determina que el polímero
se funda focalmente y se separe de la superficie mediante la
combinación de la expansión térmica y el confinamiento inerte y
elástico de los materiales sólidos circundantes. Puesto que el pulso
individual es corto y el enfriamiento/solidificación de la extensión
pequeña es muy rápido (<<1 ms), tras un breve enfriamiento, se
forma un pequeño pedestal sólido que sobresale de la superficie
polimérica. Cada pulso adicional expandirá el polímero en dirección
al objetivo en incrementos cada vez menores. De esta forma, para
llevar a cabo las transferencias más pequeñas posibles de forma
fiable, basta con suministrar sólo el número de pulsos necesarios
para expandir el polímero hasta que entra en contacto con el tejido.
Los pulsos adicionales suministrados después del contacto permiten
la expansión del polímero dentro del tejido hasta alcanzar el tamaño
del haz del láser.
Puesto que bajo observación microscópica durante
la LCM se observa abrillantamiento óptico en la zona de destino
debido a la correspondencia de índices entre la superficie del
tejido y el polímero de contacto, es fácil de determinar el primer
pulso que entra en contacto con el tejido. De esta forma, la
transferencia puede realizarse de forma segura a una escala que es
inferior a la del tamaño del haz (p.ej., es posible enfocar y
transferir objetos de \sim 1 micra con un haz de 5 micras).
En un tercer procedimiento preferido de LCM de
pulso corto, se utilizan diversos pulsos supraumbrales adicionales
tras el primer contacto con la muestra de destino para permitir la
captura de una sola célula completa de forma irregular (objeto de
destino de la muestra) mediante un haz que es ligeramente inferior a
la célula individual. Puesto que el polímero fluye dentro del tejido
poroso desecado, con pulsos cortos cercanos al umbral el polímero
fluye preferentemente a lo largo de las estructuras macromoleculares
contiguas de una célula dada y tiende a rellenar la célula por
completo, antes de expandirse a través de los bordes intercelulares.
De esta forma, los pulsos cortos cercanos al umbral son capaces de
enfocarse en células individuales o estructuras densamente
conectadas, tales como el núcleo celular, aun cuando éstas tengan
una forma irregular y no concuerden con la forma del haz del
láser.
La precisión de la LCM de pulso corto o el tamaño
mínimo del elemento capturado descritos aquí se refieren a
espécimenes densos, tales como una sección tisular en la que los
objetivos deseados son inmediatamente contiguos a los no deseados.
Debe sobrentenderse que es posible alcanzar una precisión todavía
mayor cuando se capturan partículas más pequeñas con una separación
mayor que la de sus diámetros (p.ej., un frotis citológico diluido o
un aplastamiento cromosómico). En este caso, pueden capturarse
elementos de destino puros más pequeños mediante expansión
polimérica que abarca los elementos y el espacio vacío circundante
del portaobjetos del microscopio, sin unión con el elemento no
deseado más cercano. Por lo tanto, es posible enfocar y capturar
microscópicamente elementos de sólo 1 \mum, con gran pureza
(p.ej., mediante los pulsos láser de 5 um de la Tabla 2). Aunque
puede considerarse que la resolución final de la captura LCM está
limitada por la longitud de onda de la luz utilizada para la
visualización y el enfoque microscópico y por la del láser de
activación, en ciertas circunstancias, mediante esta técnica es
posible enfocar y capturar (es decir, purificar a partir de una
mezcla compleja) partículas submicrónicas. Por ejemplo, marcadores
de fluorescencia específicos pueden identificar partículas
micrónicas específicas sin resolver su estructura. Si estas
partículas se esparcen hasta una densidad suficientemente baja sobre
el portaobjetos del microscopio (separación media aproximada de 5
um), la LCM de pulso corto podrá enfocarlas y capturarlas. Además,
las imágenes del resto del portaobjetos del espécimen y de la
superficie de transferencia obtenidas tras la transferencia pueden
verificar y cuantificar el procedimiento de captura.
La anterior técnica LCM ha sido descrita con
respecto a las aplicaciones biológicas. Debe sobrentenderse que
estas técnicas son aplicables a cualquier muestra que pueda ser
observada al microscopio, tal como un grupo heterogéneo de elementos
en el que el procedimiento provoca la separación de un componente o
grupo de componentes microscópicamente reconocibles. Por lo tanto,
se da a conocer un procedimiento de separación basado en la
utilización de un microscopio en el que se emplea una película de
transferencia activada de manera selectiva y aplicada a un tejido,
espécimenes citológicos, orgánulos celulares, cromosomas o virus.
Además, también es posible separar objetos inertes identificables
mediante un microscopio en subgrupos que se van a aislar mediante
procedimientos LCM.
La solicitud de patente US nº de serie 08/883.821
titulada "Convex Geometry Adhesive Film System for Laser Capture
Microdissection", ahora patente US nº 6 100 051, fue publicada el
8 de agosto de 2000 y no forma parte del estado de la técnica. En
esta exposición, se describe la utilización de una superficie
convexa que presenta un adhesivo activable de forma selectiva, para
la agrupación de lado a lado y la concentración de espécimenes
unidos mediante microdisección por captura con láser. Como observará
el lector, en la presente exposición se ha descrito la unión de
elementos sumamente pequeños o escasos mediante microdisección por
captura con láser. De este modo, la combinación de estas dos
exposiciones permitirá el aislamiento y la unión de elementos
concretos muy pequeños en un grupo de un espécimen microscópico. A
continuación, podrá llevarse a cabo la transferencia de los grupos
formados a cualquier lugar preciso para su ulterior análisis.
Claims (8)
1. Procedimiento para la extracción directa de
material de una muestra, que comprende las etapas siguientes:
provisión de una muestra;
provisión de una película de transferencia que,
sólo tras ser activada en zonas seleccionadas, presenta la propiedad
de proporcionar a las zonas seleccionadas la capacidad de adherirse
a la muestra;
yuxtaposición de la muestra a la película de
transferencia;
identificación de por lo menos una parte del
material para extraerla de la muestra;
enfoque del haz de radiación pulsada, de un
diámetro de haz preseleccionado y una longitud de pulso
preseleccionada, sobre la película de transferencia para activar un
volumen de la película de transferencia adyacente a la muestra y
adherirlo a por lo menos una parte del material que se va a extraer
de la muestra;
observación de la interfase óptica entre la
muestra y la película de transferencia durante la etapa de enfoque
para comprobar que dicha parte por lo menos del material de la
muestra se adhiera a la película de transferencia, y el alcance
espacial de la unión en el plano de la imagen, y
separación de la película de transferencia de la
muestra mientras se mantiene la adhesión entre la película de
transferencia y dicha parte por lo menos de material de la muestra,
para desprender de ese modo dicha parte por lo menos de material de
la muestra de la parte restante de la muestra;
en el que la película de transferencia se separa
un pequeño intervalo espacial de la muestra y en el que el haz de
radiación pulsada, de un diámetro de haz preseleccionado y una
longitud de pulso preseleccionada, se enfoca sobre la película de
transferencia para activar un volumen de la película de
transferencia adyacente a la muestra, lo cual determina que dicho
volumen se expanda y abarque el pequeño intervalo espacial para
adherirse a dicha parte por lo menos del material que se va a
extraer de la muestra.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la película de transferencia es un polímero termoplástico con
una gran expansión volumétrica asociada con la fusión, destinado a
crear una expansión y una fuerza impulsora suficiente como para
empujar el polímero contra el elemento de destino e introducirlo en
el mismo y obtener de ese modo una unión fuerte de forma rápida.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que comprende además la etapa de:
provisión de un sustrato de apoyo inerte sobre la
cara superior del polímero termoplástico que impide que la gran
expansión volumétrica asociada con la fusión se desvíe del objetivo
deseado, y determina que la presión interna creada por el polímero
que se expande impulse el polímero fundido contra el elemento de
destino y se introduzca en el mismo para proporcionar una unión
fuerte con el objetivo.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la etapa de:
incremento de la longitud de pulso
preseleccionada para incrementar el área activada de la película de
transferencia o reducción de la longitud de pulso preseleccionada
para reducir el área activada de la película de transferencia y,
opcionalmente, suministro de pulsos adicionales después del primer
pulso, lo cual crea una unión para incrementar positivamente el
diámetro de la zona unida a un objetivo deseado.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que comprende además las etapas
siguientes:
ajuste de la duración de los pulsos para activar
un volumen de la película de transferencia con el diámetro de haz
preseleccionado y adherirlo a dicha parte por lo menos de material
de la muestra, y
observación de la interfase óptica entre la
muestra y la película de transferencia durante la etapa de enfoque
para comprobar que dicha parte por lo menos del material de la
muestra se adhiera a la película de transferencia, y el alcance
espacial de la unión en el plano de la imagen.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, que
comprende además la etapa de:
ajuste de la duración del pulso para activar un
área de la película de transferencia menor o igual al diámetro de
haz preseleccionado y adherirla a dicha parte por lo menos de
material de la muestra.
7. Procedimiento según la reivindicación 5, que
comprende además las etapas siguientes:
disminución de la energía del pulso, por ejemplo,
reduciendo la longitud del pulso o la potencia del pulso, de tal
forma que un solo pulso subumbral sea insuficiente para activar la
película de transferencia en cualquier punto de la muestra, y
aplicación de una serie de dichos impulsos
subumbrales a la película de transferencia que está yuxtapuesta a
dicha parte por lo menos de material que se va a extraer, sin entrar
en contacto con la misma, hasta que la película de transferencia se
une a dicha parte por lo menos de material que se va a extraer.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además las etapas siguientes:
observación del contacto entre la película de
transferencia y dicha parte por lo menos de material de la
muestra;
enfoque de otro haz de radiación pulsada sobre el
contacto de la muestra para provocar sólo la adhesión entre la
película de transferencia y la muestra, y
separación de la película de transferencia de la
muestra mientras se mantiene la adhesión entre la película de
transferencia y dicha parte por lo menos de material de la muestra,
de tal modo que dicha parte por lo menos de material de la muestra
se desprenda de la parte restante de la muestra, incluyendo además
opcionalmente dicho procedimiento la etapa de enfoque de otro haz de
radiación pulsada sobre el contacto de la muestra para expandir el
área de adhesión entre la película de transferencia y la
muestra.
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