ES2842552T3 - Sistema para orientación y separación microfluídica de partículas - Google Patents

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Abstract

Un sistema para separar partículas en un sistema microfluídico que incluye en secuencia: una etapa de orientación (2) que comprende una o más guías de onda (10a - 10d) dispuestas para exponer partículas a presión de radiación óptica de al menos una primera fuente de presión de radiación óptica, para provocar que al menos una mayoría de las partículas en un flujo de fluido adopte una orientación particular; una etapa de detección (3) dispuesta para detectar al menos una diferencia o distinguir entre partículas en el flujo de fluido más allá de la etapa de detección (3), y una etapa de conmutación (5) que comprende una pluralidad de segundas fuentes de presión de radiación óptica que comprenden más de una guía de onda (11a - 11e) que se extienden a través de o colindan con un canal del sistema microfluídico y que más allá de las cuales las partículas se mueven secuencialmente de manera que cada partícula pasa una serie de fuentes de presión de radiación óptica, y el sistema que comprende, además: un controlador (15) dispuesto para conmutar en función de una entrada desde la etapa de detección, energía de radiación de las segundas fuentes de presión de radiación óptica para provocar un cambio en la dirección del movimiento de las partículas seleccionadas en el flujo de fluido para separar las partículas de manera que cada partícula se dirija hacia una de al menos dos salidas diferentes (6, 7).

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema para orientación y separación microfluídica de partículas
Campo de la invención
La invención se relaciona con un método y sistema para la orientación y/o separación de partículas en un sistema microfluídico.
Antecedentes
Los desarrollos en medicina y biotecnología comercial y académica han impulsado un fuerte enfoque en métodos para la separación celular biológica. Las dos principales estrategias que emergieron, la separación a granel y la separación celular simple, enriquecen ambas una población de células con un subconjunto diana con características fisicoquímicas (es decir, tamaño, volumen, propiedades de dispersión de luz, etc.), inmunológicas o características funcionales. La separación a granel generalmente se centra en un único rasgo celular distintivo. Los ejemplos incluyen métodos de filtración, centrifugación / sedimentación y tamizaje basado en afinidad celular. Las principales desventajas de la separación a granel son la baja pureza, la pérdida de células durante el proceso de separación, la dificultad para separar células relativamente raras y la dificultad para distinguir entre subpoblaciones de células similares. Sin embargo, la separación a granel es un método relativamente simple que ofrece alto rendimiento. En cambio, los métodos de célula simple, el más importante de los cuales es la separación celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) mediante citometría de flujo, examinan cada célula individualmente para dirigirse a la subpoblación deseada para el aislamiento y después las guían hacia diferentes corrientes de salida. La reducción en el rendimiento se compensa por ventajas importantes en la especificidad de la separación que se puede ajustar para el resultado deseado, generalmente una mayor recuperación de células, la capacidad de separar poblaciones celulares raras o solo débilmente diferenciadas y la disponibilidad de una separación con múltiples dianas basada en una matriz de múltiples rasgos celulares (es decir, varios tipos de receptor de superficie, cada uno identificado con una etiqueta fluorescente diferente). Un desafío importante que enfrentan los métodos citométricos de flujo FACS es el daño que sufren algunas células en los procesos de flujo (estrés por cizallamiento) y separación (daño por campo eléctrico). Un ejemplo importante es la fertilidad reducida de muestras de esperma separadas que se puede atribuir a estos procesos físicos perjudiciales.
En el sector agrícola, la diferenciación celular es particularmente importante en especies de ganado donde se practica comúnmente la inseminación artificial tal como en bovinos. El uso de semen sexuado facilita el control del sexo de la cría con un beneficio comercial. El método comercialmente importante actual para la separación de esperma usa citometría de flujo FACS, en la cual el esperma se distingue por sus diferencias en el contenido de ADN. El ADN de cada espermatozoide se tiñe con un tinte fluorescente en proporción con el contenido de ADN. Dado que el cromosoma X es mayor (es decir, tiene más ADN) que el cromosoma Y, el espermatozoide "femenino" (que lleva el cromosoma X) absorberá una cantidad mayor de tinte que el espermatozoide "masculino" (que lleva el cromosoma Y) y, en consecuencia, cuando se exponga a la luz UV durante la citometría de flujo tendrá fluorescencia con una mayor intensidad que el espermatozoide Y. Antes de la detección o diferenciación, el esperma se puede orientar hidrodinámicamente y el esperma se puede separar en gotículas individuales que después se pueden cargar eléctricamente. Después de la detección o diferenciación, el esperma se separa mediante interacciones de gotículas cargadas con campo eléctrico.
La patente europea núm. EP 1563908 proporcionar una técnica de separación de partículas finas que usa presión óptica. Describe dirigir un haz de láser hacia un trayecto de flujo de partículas finas, de tal manera que el haz de láser atraviese la dirección de flujo de las partículas finas para desviar así la dirección del movimiento de las partículas finas que se van a recuperar, en la dirección de convergencia del haz de láser. En la internacional núm. WO02/087792, se proporcionan aparato y métodos para hacer interactuar luz con partículas que incluyen, pero no se limitan a, materia biológica tal como células. La patente estadounidense núm. US2009/158823 se refiere a un método y aparato para manipular acústicamente una o más partículas.
Compendio de la invención
En términos amplios, la invención comprende un sistema para separar partículas en un sistema microfluídico como se define mediante la reivindicación 1. Se definen rasgos opcionales en las reivindicaciones dependientes.
El sistema se puede disponer para conmutar o separar las partículas, de manera que cada partícula se dirija a una de dos o una de más de dos salidas diferentes.
La una o más fuentes de presión de radiación comprenden más de una guía de onda que se puede extender al menos parcialmente a través de un canal del sistema microfluídico, por ejemplo, a través de por encima, por debajo o a través de las paredes laterales del canal, o puede colindar con el canal desde arriba, abajo o el lateral.
La etapa de detección se puede disponer para detectar o diferenciar partículas mediante una técnica óptica tal como una técnica de detección basada en fluorescencia.
Las partículas pueden ser partículas biológicas o no biológicas. Típicamente, las partículas pueden ser partículas asimétricas. La asimetría puede estar en cualquier propiedad física que conduce a una interacción asimétrica con la fuerza óptica que incluye, pero no se limita a, asimetría en dimensiones físicas. En algunas realizaciones, las partículas pueden ser esperma, eritrocitos, bacterias o nanopartículas, por ejemplo.
Un sistema microfluídico para orientar partículas como se indicó anteriormente también puede comprender una preetapa para identificar el flujo de partículas y también puede comprender una preetapa para centrar las partículas en una ubicación particular dentro del canal. Este sistema puede ser hidrodinámico u óptico.
El sistema también comprende una etapa de orientación dispuesta para provocar que al menos una mayoría de las partículas adopte primero una orientación particular en el fluido, particularmente, cuando las partículas son partículas asimétricas. La etapa de orientación puede comprender una o más guías de onda dispuestas para, durante el uso, exponer partículas a presión de radiación óptica para provocar que al menos una mayoría de las partículas adopte una orientación particular en el fluido.
El término "que comprende/n", como se usa en la presente memoria descriptiva, significa "consiste al menos en parte de". Al interpretar declaraciones en la presente memoria descriptiva que incluyen dicho término, los rasgos introducidos por dicho término en cada declaración deben estar todos presentes, pero otros rasgos también pueden estar presentes. Los términos relacionados tales como "comprende" y "comprendía" deben interpretarse del mismo modo.
Breve descripción de los dibujos
La invención se describe adicionalmente en referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La Figura 1 ilustra esquemáticamente una realización de un sistema microfluídico de la invención para la separación de partículas.
Las Figuras 2a y 2b ilustran esquemáticamente realizaciones para la orientación de partículas en las que una guía de onda simple - Figura 2a, o múltiples guías de onda - Figura 2b, colindan con el microcanal desde arriba, abajo o desde un lateral del canal.
La Figura 3a y 3b ilustran esquemáticamente realizaciones para la orientación de partículas en las que una guía de onda simple - Figura 3a y múltiples guías de onda - Figura 3b, se extienden a través del microcanal arriba, abajo o a lo largo de una pared lateral del canal.
La Figura 4a y 4b ilustran esquemáticamente realizaciones para separar o conmutar partículas seleccionadas en un flujo de fluido en un microcanal, en el que múltiples guías de onda colindan con el canal desde arriba, abajo o desde un lateral del canal.
Las Figuras 5a y 5b ilustran esquemáticamente realizaciones para separar o conmutar partículas seleccionadas en un flujo de fluido en un microcanal, en el que múltiples guías de onda se extienden a través del canal arriba, abajo o lo largo de una pared lateral del canal.
La Figura 6a muestra una realización de un chip microfluídico de la invención para llevar a cabo la orientación y separación de esperma y la Figura 6b muestra una matriz de chips de separación individuales que se pueden disponer para la implementación microfluídica paralela masiva para separar esperma según el sexo.
La Figura 7a y 7b son geometrías informáticas usadas en simulaciones FEM a las que se hace referencia en la posterior descripción de trabajo experimental, la Figura 7a - cilindro elíptico en agua colocado a lo largo del eje óptico de la guía de onda a 40 pm desde la punta de la guía de onda y la Figura 7b - cilindro elíptico colocado sobre una guía de onda de foto-epoxi SU8 con un pequeño espacio que separa el cilindro de la guía de onda.
La Figura 8 muestra el torque sobre un cilindro elíptico en agua a una variedad de distancias desde la punta de una guía de onda, a las que se hace referencia en la descripción posterior del trabajo experimental.
La Figura 9 muestra el torque sobre un cilindro elíptico en agua por encima de una guía de onda a 3 distancias de separación, a las que se hace referencia en la descripción posterior del trabajo experimental.
La Figura 10 muestra las fuerzas Fx y Fy sobre un cilindro elíptico en agua en la punta de una guía de onda en la orientación vertical desde una variedad de distancias de separación, a las que se hace referencia en la descripción posterior del trabajo experimental.
La Figura 11 muestra las fuerzas ópticas Fx y Fy sobre un cilindro elíptico en agua por encima de una guía de onda para una variedad de distancias de separación, a las que se hace referencia en la descripción posterior del trabajo experimental.
Las Figuras 12a - c muestran el desplazamiento de una partícula simétrica mediante un campo óptico a medida que la partícula fluye más allá del extremo de una punta de guía de onda en un canal microfluídico, al que se hace referencia en una descripción posterior del trabajo experimental.
Las Figuras 13a y b muestran el desplazamiento de una partícula asimétrica mediante y orientada por un campo óptico a medida que la partícula fluye más allá del extremo de una punta de guía de onda en un canal microfluídico, al que se hace referencia en una descripción posterior del trabajo experimental y
La Figura 14 muestra la eficacia del desplazamiento medida como una función de la velocidad del flujo de partículas para partículas simétricas - Figura 14a, y partículas asimétricas - Figura 14b.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
En referencia a la Figura 1, el sistema microfluídico típicamente proporcionado en un chip microfluídico para la orientación y separación de partículas comprende las etapas de enfoque, orientación, detección de un rasgo distintivo que puede ser fluorescencia, y sincronización y conmutación secuencialmente a lo largo de un microcanal junto con el movimiento de las partículas con el flujo de fluido en el canal, desde una etapa a la siguiente.
En la realización que se muestra, una etapa de enfoque hidrodinámico y/o etapa 1 coloca las partículas en una ubicación particular en el canal.
Si las partículas son asimétricas, tal como el esperma, por ejemplo, la orientación inicial de las partículas puede ser aleatoria y una etapa de orientación 2 orienta las partículas sustancialmente todas o al menos la mayoría con una orientación común predeterminada con respecto a la geometría del canal. En la figura esquemática, las partículas se muestran orientadas verticalmente. Las partículas se orientan en la etapa de orientación mediante fuerzas ópticas a partir de una guía de onda óptima como se describirá adicionalmente. Una o más guías de onda se pueden extender a través del canal, por ejemplo, a través de por encima, por debajo o a lo largo de la pared lateral del canal, o pueden colindar con el canal desde arriba, abajo o el lateral del canal. La guía de onda puede formar parte de la pared del canal o puede estar físicamente separada de la cámara microfluídica.
En esta realización, la etapa de detección 3 es una etapa de detección basada en fluorescencia y las partículas se tiñen anteriormente con un tinte fluorescente, y la etapa de detección de fluorescencia 3 evalúa la intensidad de la fluorescencia de cada partícula y pasa información de fluorescencia a las etapas de sincronización y conmutación 4 y 5, que conmutan o separan las partículas de manera que cada partícula se dirija hacia una de dos salidas diferentes 6 y 7. Las etapas de sincronización y conmutación 4 y 5 se controlan mediante un controlador electrónico 15. Por ejemplo, las partículas pueden ser esperma y el esperma masculino se puede dirigir a la salida 6 y el esperma femenino a la salida 7, por ejemplo. Alternativamente, las partículas se pueden separar para seleccionar un tipo de partícula que se desea de otro tipo de partícula que no se desea para la aplicación particular, tal como para seleccionar eritrocitos, por ejemplo, y en tal realización, las partículas deseadas se pueden dirigir hacia recolección o hacia procesamiento adicional, mientras las partículas indeseadas se pueden dirigir hacia los desechos o una salida hacia desechos o algún otro procesamiento.
Las partículas ingresan al sistema microfluídico desde la fuente 8. En la figura, la fuente 8 y las salidas 6 y 7 se muestran esquemáticamente como volúmenes de recolección tales como cámaras que contienen las partículas, pero las partículas pueden ingresar al sistema o la sección de separación del sistema microfluídico, desde un canal o canales microfluídicos desde una etapa de procesamiento anterior y salir de la sección de separación hacia canales microfluídicos que llevan las partículas a otro procesamiento posterior, por ejemplo.
Las Figuras 2a y 2b ilustran esquemáticamente realizaciones para la orientación de partículas en las que una guía de onda simple - Figura 2a, o múltiples guías de onda - Figura 2a, colindan con el microcanal desde un lateral (arriba, abajo o desde cualquier lateral) del canal, que se puede usar en la etapa de orientación 2 del sistema de la Figura 1. En la Figura 2a, una guía de onda de radiación 9 tal como una fibra óptica conectada a una fuente tal como un láser colinda con el canal desde un lateral del canal. La guía de onda puede formar parte de la pared del canal o puede estar físicamente separada de la cámara microfluídica. A medida que las partículas asimétricas en orientación aleatoria pasan la punta de la guía de onda 9, se someten a una fuerza óptica que tiende a provocar que las partículas asimétricas se orienten con una orientación común y predeterminada. En la realización de la Figura 2b, las partículas pasan tres guías de onda 9a - 9c en una serie, que orientan de manera acumulada las partículas. La fuerza óptica de la primera guía de onda 9a puede provocar que cada partícula comience a rotar hacia una orientación deseada, mientras la fuerza óptica de guías de onda 9b y 9c posteriores continúa provocando que la partícula se mueva hacia la orientación deseada. La Figura 2a muestra una guía de onda simple que colinda con el lateral del canal y la Figura 2b tres guías de onda que colindan con el lateral del canal, pero realizaciones alternativas pueden comprender dos o más de tres guías de onda, y las guías de onda pueden colindar con el canal desde arriba, abajo o desde cualquier lateral.
Las guías de onda pueden fabricarse como parte del dispositivo (es decir, in situ) o insertarse durante el ensamblaje del dispositivo (es decir, componentes de fibra óptica). Típicamente, las guías de onda pueden aplicar fuerza óptica en un intervalo de longitud de onda óptica desde la visible a infrarrojo cercano (500 nm - 2 gm), y fuentes de luz láser serán fuentes de emisión de CW con potencias de salida menores que 1 W / guía de onda, para minimizar las fuerzas ópticas aplicadas en cada interacción con la partícula. La emisión de la luz láser puede controlarse electrónicamente, para encenderse o apagarse según lo deseado para generar impulsos en la escala de tiempo de microsegundos a milisegundos.
Las Figuras 3a y 3b ilustran esquemáticamente realizaciones para la orientación de partículas en las que una guía de onda simple 10a - Figura 3a y múltiples guías de onda 10a - 10d - Figura 3b, se extienden a través del microcanal arriba o abajo del canal. La(s) guía(s) de onda se extiende(n) por encima, por debajo o a lo largo de la pared lateral del microcanal, de manera que las partículas pasen por las guías de onda y, al hacerlo, se sometan a la radiación que emana desde las guías de onda y que aplica presión de fotones para orientar las partículas descritas anteriormente. La radiación óptica se puede suministrar a la(s) guía(s) de onda desde una lente de acoplamiento 12 como se muestra.
Una ventaja de las realizaciones de orientación basadas en guía de onda descritas anteriormente con respecto a la orientación de partículas a través de presión hidrodinámica como se usa comúnmente en el sexado de esperma con citometría de flujo convencional, por ejemplo, es que se aplica menos fuerza a las partículas tales como al esperma para orientarlas, de manera que hay una menor probabilidad de daño de la partícula durante o como resultado de la orientación de la partícula. Esto puede ser particularmente así para las realizaciones de las figuras 2b y 3b, que orientan las partículas a través de una serie de guías de onda secuenciales, cada una aplica una presión de radiación más baja que la que sería necesaria para orientar las mismas partículas con presión de radiación desde una guía de onda simple. Esto puede ser particularmente ventajoso para partículas biológicas tales como el esperma, y células, por ejemplo.
Las Figuras 4a y 4b muestran una realización para separar o conmutar partículas seleccionadas para cambiar la dirección del movimiento en el flujo de fluido en el microcanal, en el que múltiples guías de onda 11a - 11e colindan con el canal desde un lateral (o arriba o abajo) del canal. Las Figuras 5a y 5b muestran una realización para separar o conmutar partículas seleccionadas para cambiar la dirección del movimiento en el flujo de fluido en el microcanal, en el que múltiples guías de onda se extienden a través del canal arriba, abajo o a lo largo del lateral del canal. Después de la etapa de detección de la fluorescencia 3 (Figura 1), en la etapa de conmutación 4 (Figura 1) cada partícula pasa una serie de guías de onda 11a-11e que ingresan al microcanal desde el lateral en las Figuras 4a y 4b, o 13a-13d que pasa por abajo o arriba del microcanal en la realización de las Figuras 5a y 5b. Las guías de onda en las Figuras 4a, 4b, 5a y 5b pueden formar parte de la pared del canal o puede estar físicamente separadas de la cámara microfluídica.
En referencia a las Figuras 4a y 5a, cuando una partícula que sea desea conmutar a una salida particular 6 o 7 pasa a través de la etapa de conmutación 5 (ver la Figura 1), la fuente de energía a cada una de las guías de onda 11a-11e o 13a-13d se enciende. A medida que la partícula pasa la primera guía de onda, se desvía mediante la fuerza óptica y se desvía adicionalmente a medida que pasa las guías de onda posteriores. Todas las guías de onda se pueden energizar juntas, a partir de una fuente de láser común a través de una lente de acoplamiento 12 como se muestra en las Figuras 5a y 5b, por ejemplo, o en un sistema de mayor velocidad el movimiento de la partícula se puede sincronizar con la conmutación de cada una de las ondas de guía 11a-11e o 13a-13d, de manera que cada onda de guía se energice, una después de la otra, a medida que la partícula seleccionada pasa cada guía de onda individual. El controlador 6 (ver la Figura 1) con entrada(s) de la etapa de sincronización 4 (ver figura 1) secuencia la energización de las guías de onda en conmutación con el pasaje por la etapa de conmutación de las partículas seleccionadas. En la realización que se muestra, hay un flujo laminar a través del canal y, en referencia a las Figuras 4a y 5a, las guías de onda cuando se energizan actúan para desviar partículas seleccionadas del flujo en un lateral hacia la salida 7 a través del límite de flujo y por el flujo hacia la salida 6. Cuando las guías de onda no se excitan, no hay desviación de las partículas que, por lo tanto, continúan en movimiento hacia la salida 7, como se muestra en las Figuras 4b y 5b. En las modalidades que se muestran, el sistema se dispone para conmutar o separar las partículas, de manera que cada partícula se dirija a una de dos salidas 6 y 7, pero en realizaciones alternativas, el sistema se puede disponer para conmutar o separar las partículas entre más de dos salidas diferentes, tal como tres o cuatro salidas, por ejemplo. Por ejemplo, las guías de onda cuando se energizan secuencialmente pueden desviar partículas seleccionadas del flujo en un lateral a través de un primer límite de flujo y por un segundo flujo y después a través de un segundo límite de flujo y por un tercer flujo hacia una tercera salida. La conmutación o separación se puede basar en características ternarias de las partículas en lugar de binarias, por ejemplo. También, en realizaciones alternativas, las guías de onda pueden funcionar para provocar que partículas seleccionadas se desvíen para girar hacia una canal o canales diferentes en lugar de los volúmenes de recolección, por ejemplo.
La Figura 6a muestra un chip microfluídico que incorpora una realización de la invención para llevar a cabo la orientación y separación de esperma bovino. La muestra de esperma, con ADN ya teñido y enjuagado, ingresa al chip en la Entrada de muestra, junto con dos flujos de fluido envolvente Sh. La muestra de esperma y los flujos envolventes se enfrían mediante una etapa de enfriamiento Peltier (no se muestra) debajo del chip, y se mantienen a baja temperatura a través del procesamiento en el chip. El esperma se enfoca en la región deseada del canal en la región FF. A continuación, se orienta en O al usar la presión de radiación de un banco de fibra FB1. En este ejemplo, el banco de fibra colinda con el canal desde el lateral y se muestran cuatro fibras en modo simple. Estas fibras transmiten luz desde un láser hacia el chip. Después de la orientación, se evalúa la intensidad de fluorescencia del ADN del esperma al usar un UV LED L1 que ilumina la región de detección desde debajo del chip. La fluorescencia se acopla fuera del canal al usar una fibra de modo simple SMF y se envía al detector de tubo fotomultiplicador PMT. La salida del detector de tubo fotomultiplicador PMT se usa para controlar el sistema de conmutación Sw. Si se selecciona un esperma para dirigirse a un nuevo canal de salida, el láser envía luz a través del segundo banco de fibra FB2 para mover el esperma en el canal hacia una nueva corriente de flujo. El esperma después fluye a través de un segundo gradiente térmico para elevar la temperatura de manera controlada hasta una temperatura deseada. Tal como temperatura ambiente o corporal, obsérvese que el trayecto de serpentina necesario para el equilibrio térmico con el gradiente no se muestra para los canales de salida, a efectos de mayor claridad. Los canales de salida también incluyen salidas de flujo para el fluido envolvente y una corriente de desechos, así como para el esperma con cromosoma X e Y. Una fuente de luz blanca L2 debajo de los canales de salida induce la dispersión de partículas que ingresan a los canales de salida individuales. Dicha dispersión se detecta al usar un tercer banco de fibras FB3, de manera que la conmutación del esperma puede detectarse mediante diodos de Si PIN y enviarse al controlador para el recuento.
La Figura 6b muestra cómo una matriz de chips de separación individuales se puede usar para lograr la separación a granel de muestras de esperma. La electrónica de control, fuentes de láser, sensores, accionador para la etapa Peltier (control T) y entrada de fluido a granel y flujo de salida son externos con respecto al chip de separación. En este diagrama, solo se muestran cuatro chips, apenas a efectos de mayor claridad.
Se reitera, una ventaja de las realizaciones de conmutación de partícula basadas en guía de onda descritas anteriormente, con respecto a la conmutación de partícula a través de presión hidrodinámica, por ejemplo, es que se aplica menos fuerza a las partículas y esto puede ser particularmente ventajoso para partículas biológicas tales como el esperma, y células, por ejemplo. Por lo tanto, aunque una etapa de conmutación de partícula basada en guía de onda, según se describió anteriormente, puede estar precedida por una etapa de orientación de partícula basada en presión hidrodinámica (si se necesita una etapa de orientación de partícula), y viceversa, después de una etapa de orientación de partícula basada en guía de onda, según se describió anteriormente, puede seguir una etapa de conmutación de partícula hidrodinámica, en una realización preferida, un sistema particularmente para separar partículas biológicas asimétricas tales como esperma puede comprender una etapa de orientación basada en guía de onda dispuesta para orientar el esperma mediante presión de radiación, una etapa de detección, tal como una etapa de detección basada en fluorescencia y una etapa de conmutación basada en guía de onda que usa fuerza óptica para dirigir por separado el esperma masculino y femenino. El sistema también tendrá un controlador electrónico, tal como un sistema de control basado en microprocesador. La etapa de detección de fluorescencia 3 se puede disponer para irradiar el esperma que anteriormente se puso en contacto o se tiñó con un tinte marcador fluorescente que se une al ADN de cada espermatozoide, y comprende un detector para detectar la intensidad de la fluorescencia resultante. El femenino absorbe una mayor cantidad de tinte que el esperma masculino y, por lo tanto, tiene una fluorescencia de mayor intensidad y posibilita la distinción.
Los sistemas que comprenden solo una guía de onda simple están restringidos en su velocidad de procesamiento al impulso limitado (fuerza x tiempo) de la fuerza óptica en la partícula de interés. El tiempo de interacción está limitado por el tamaño físico de la guía de onda y la velocidad de flujo de las partículas. La fuerza de manipulación está limitada por el potencial de retención óptica de la guía de onda. Fuerzas más altas conducen a una retención óptica completa, en la que las partículas ya no están libres para moverse con el fluido circundante. Esto fija el uso típico de la manipulación de partículas con guía de onda simple a un procesamiento de partículas con alta precisión y bajo rendimiento. Las modalidades de orientación y conmutación con múltiples guías de onda, tales como se describieron anteriormente, ofrecen la ventaja de la aplicación continua de una fuerza óptica bien controlada a lo largo de un tiempo prolongado sin que se produzca retención óptica. Esto posibilita un alto rendimiento arbitrariamente (velocidad de flujo de partículas) de partículas mediante la adición en serie de guías de onda que producen fuerza óptica que aumentan el impulso aplicado a la partícula.
Un sistema microfluídico de la invención para separar esperma o las partículas puede tener al menos un microcanal con una sección de separación en la que las partículas se procesan según se describió anteriormente, o matrices de dichas secciones de separación para aumentar el rendimiento. Los sistemas preferiblemente se incorporan en un dispositivo o chip microfluídico pequeño preparado mediante micromaquinado, técnicas de procesamiento de polímeros u otras tecnologías de microfabricación para formar estructuras microfluídicas, y comprende bombas de respaldo, válvulas e instrumentación. Típicamente, el(los) microcanal(es) puede(n) tener un ancho en el intervalo 10 a 500 micrones, o 100 a 400 micrones, y una profundidad en el intervalo 5 a 250 micrones, por ejemplo. Las dimensiones de los canales de flujo microfluídico respaldan el flujo laminar, con turbulencia mínima. En las realizaciones descritas e ilustradas en las figuras, la microestructura tiene una forma plana con la longitud en el plano y el ancho mayor que la profundidad transversal con respecto al plano. En realizaciones alternativas, la profundidad puede ser mayor que la longitud y/o el ancho del microcanal y el reservorio y otras cavidades del microsistema. En realizaciones alternativas, los microcanales se pueden extender en tres direcciones y pueden incluir segmentos curvados, así como ángulos. En las realizaciones que se muestran en las figuras, las microcavidades tienen una sección transversal rectangular o cuadrada, pero en realizaciones alternativas, las microestructuras pueden tener una sección transversal circular u ovalada, por ejemplo, o una sección transversal de otra forma.
Sección experimental
La invención se ilustra adicionalmente a modo de ejemplo mediante la siguiente descripción de trabajo de simulación y ensayos.
Ejemplo 1
Se llevaron a cabo simulaciones al usar el método de elemento finito (FEM, por sus siglas en inglés) para aproximarse a la acción de fuerzas ópticas sobre partículas asimétricas. Específicamente, se calcularon las fuerzas ópticas aplicadas a partículas elípticas situadas cerca de guías de onda, tales como aquellas descritas anteriormente. Se calcularon los torques angulares de orientación y también se calcularon las fuerzas de retención/propulsión. Se colocaron aproximaciones bidimensionales (2D) de partículas elípticas (un cilindro) con un eje mayor:menor 10gm:2 gm en la punta de la aproximación 2D de una fibra óptica de modo simple, una guía de onda de losa - Figura 7a. El torque resultante aplicado a una partícula elíptica de ese tipo como una función de su orientación con respecto al eje óptico de la guía de onda se muestra en la Figura 7b. La potencia de entrada aplicada en la guía de onda es 50 mW. Se muestran los modos de guía de onda paralelo (TM) y perpendicular (TE) polarizado con respecto al plano de simulación. La misma aproximación de partícula 2D se colocó sobre una aproximación 2D de una guía de onda de arista, como se muestra en la Figura 8, y el torque resultante como una función de orientación paralela al eje óptico de guía de onda se muestra en la Figura 9. Ambos resultados muestran que la partícula está orientada (no tiene torque aplicado) cuando su eje menor es paralelo al eje óptico de las guías de onda. Es decir, cuando está en la orientación vertical (ángulo = 90°). Además, los gráficos muestran que el torque se restablece (en oposición a la dirección de movimiento) alrededor de dicho ángulo de orientación. Esta es la orientación de equilibrio de la partícula debido a las fuerzas ópticas aplicadas. La fuerza óptica resultante aplicada al cilindro elíptico mencionado anteriormente en agua en la punta de una guía de onda se muestra en la Figura 10. La fuerza óptica aplicada al mismo cilindro elíptico en agua cuando está arriba de una guía de onda se muestra en la Figura 11. Estas fuerzas ópticas se muestran separadas en direcciones paralelas a (Fx) y perpendiculares a (Fy) los ejes ópticos de guía de onda para una variedad de separaciones de partícula/guía de onda para los modos de guía de onda TM y TE polarizado. Las partículas están en la orientación vertical/de equilibrio orientación según se describió anteriormente.
Ejemplo 2
Las imágenes de las Figuras 12a - c que muestran el desplazamiento de partícula simétrica mediante un campo óptico a medida que una partícula P se mueve más allá del extremo de una punta de guía de onda W en un flujo de un canal microfluídico rectangular de 100 gm de ancho F se recogieron con un objetivo de microscopio 10x expuesto en un sensor de cámara digital CMOS. La partícula fue una perla esférica de poliestireno de 10 gm de diámetro y se muestra fluyendo desde la parte superior a la parte inferior en la Figura 12. La Figura 12a muestra la partícula en el flujo de fluido antes de la guía de onda. La partícula interactuó con el haz óptico (250 mW de 532 nm acoplado en una fibra de modo simple a >50 % de eficacia) divergiendo de la punta de la guía de onda. Esta interacción generó una fuerte dispersión que se observó saturando la imagen de la Figura 12b. La fuerza óptica impulsó la partícula mediante el desplazamiento d como se muestra en la Figura 12c, sin detener el flujo de la partícula a lo largo del canal microfluídico.
Ejemplo 3
La Figura 13 ilustra los efectos orientadores del campo óptico en la punta de una guía de onda W adyacente a la pared de un canal microfluídico. Una partícula P con una forma asimétrica, específicamente un espermatozoide bovino, se transportó en un flujo de fluido desde una parte superior hasta la parte inferior en un flujo de fluido F en un canal microfluídico. La partícula fue inerte e incapaz de moverse por su propia propulsión. Como se muestra en la Figura 13a, el espermatozoide inicialmente presentó una orientación de dispersión oscura al sistema de obtención de imágenes. Después de pasar a través de y de interactuar con el campo óptico en la punta de la guía de onda óptica (indicada en la Figura 13), el espermatozoide continúa fluyendo por el canal microfluídico con una nueva orientación y un desplazamiento con respecto a su posición inicial. La partícula se alejó de la pared del canal después de la interacción y rotó hacia una nueva orientación, pero continuó fluyendo por el canal. La nueva orientación del espermatozoide presentó un cabezal blanco, que indica una rotación de 90 grados alrededor del eje largo de la partícula después de interactuar con el campo óptico.
Se analizaron marco por marco múltiples eventos de interacción tales como aquellos observados en la Figura 12 y Figura 13 y los resultados se presentan en la Figura 14. Se usó procesamiento de imágenes para medir la posición y orientación de la partícula antes y después de interactuar con el campo óptico. La Figura 14 muestra la eficacia del desplazamiento medida como una función de la velocidad del flujo de partículas para partículas simétricas, a saber, una perla de poliestireno de 10 gm de diámetro - Figura 14a, y partículas asimétricas, a saber, espermatozoides bovinos inmóviles - Figura 14b. Por ejemplo, estas partículas fluyen más allá de la punta de una guía de onda simple con menos de 200mW de potencia de salida a una longitud de onda de 532nm. La desviación indica la distancia desde la terminación de la fibra hasta el borde del canal microfluídico.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema para separar partículas en un sistema microfluídico que incluye en secuencia:
una etapa de orientación (2) que comprende una o más guías de onda (10a - 10d) dispuestas para exponer partículas a presión de radiación óptica de al menos una primera fuente de presión de radiación óptica, para provocar que al menos una mayoría de las partículas en un flujo de fluido adopte una orientación particular;
una etapa de detección (3) dispuesta para detectar al menos una diferencia o distinguir entre partículas en el flujo de fluido más allá de la etapa de detección (3), y
una etapa de conmutación (5) que comprende una pluralidad de segundas fuentes de presión de radiación óptica que comprenden más de una guía de onda (11a - 11e) que se extienden a través de o colindan con un canal del sistema microfluídico y que más allá de las cuales las partículas se mueven secuencialmente de manera que cada partícula pasa una serie de fuentes de presión de radiación óptica, y el sistema que comprende, además:
un controlador (15) dispuesto para conmutar en función de una entrada desde la etapa de detección, energía de radiación de las segundas fuentes de presión de radiación óptica para provocar un cambio en la dirección del movimiento de las partículas seleccionadas en el flujo de fluido para separar las partículas de manera que cada partícula se dirija hacia una de al menos dos salidas diferentes (6, 7).
2. Un sistema según la reivindicación 1 en donde las fuentes de presión de radiación óptica comprenden un láser o láseres.
3. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en donde el controlador se dispone para secuenciar la energización de las múltiples fuentes de presión de radiación óptica con el pasaje por la etapa de conmutación de una partícula o partículas seleccionadas.
4. Un sistema según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde las segundas fuentes de presión de radiación óptica se disponen cuando se energizan para desviar una partícula desde un flujo en un lado, a través de un límite o límites de flujo, y hacia un flujo en dirección a una salida seleccionada.
5. Un sistema según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde la etapa de detección comprende una etapa de detección óptica.
6. Un sistema según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la etapa de detección se dispone para detectar o diferenciar partículas mediante una técnica de detección basada en fluorescencia.
7. Un sistema según cualquier reivindicación anterior implementado en un chip microfluídico.
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