IT201600104645A1 - Dispositivo microfluidico e metodo per l'isolamento di particelle - Google Patents

Description

“DISPOSITIVO MICROFLUIDICO E METODO PER L'ISOLAMENTO DI PARTICELLE”

SETTORE TECNICO

La presente invenzione è relativa ad un dispositivo microfluidico e ad un metodo per l’isolamento di particelle da un campione, in particolare un campione biologico.

CONTESTO DELL’INVENZIONE

Sono noti sistemi per l’isolamento di particelle di almeno un tipo determinato da un campione, in particolare un campione biologico in forma liquida. Tali sistemi ricevono, in uso, un campione comprendente particelle del tipo determinato e tipicamente particelle di uno o più tipi diversi e sono atti a selezionare e separare le particelle del tipo determinato e le particelle del tipo o dei tipi diversi. Generalmente tali sistemi permettono non solo l’isolamento delle particelle del tipo determinato da un campione comprendente anche altri tipi di particelle, ma anche il riconoscimento delle varie particelle prima dell’isolamento stesso.

Tali sistemi trovano ad esempio applicazione nell’analisi di campioni biologici comprendenti cellule tumorali, cellule fetali, cellule staminali, o altri tipi di cellule.

Un tale sistema è descritto in EP-A-2408562 e comprende un apparato d’analisi ed un dispositivo microfluidico (in particolare, una cartuccia) per l’isolamento delle particelle del tipo determinato.

Il dispositivo microfluidico per l’isolamento di particelle, il quale è del tipo usa e getta, è, in uso, alloggiato in modo rimovibile nell’apparato.

Il dispositivo microfluidico è dotato di un primo ingresso, attraverso il quale, in uso, un campione comprendente le particelle viene introdotto nel dispositivo microfluidico, di una unità di separazione, la quale comprende una camera principale ed una camera di recupero fluidicamente connesse fra loro, e di un condotto d’ingresso connesso al primo ingresso ed alla camera principale.

In uso, nella camera di recupero, che comprende una zona di attesa ed una zona di recupero, vengono portate le particelle del tipo determinato in modo selettivo rispetto a particelle di tipo diverso.

Il dispositivo comprende, inoltre, una uscita connessa mediante un condotto di uscita alla camera di recupero, più specificamente alla zona di recupero. In uso, le particelle del tipo determinato vengono evacuate dalla camera di recupero, più specificamente dalla zona di recupero e dal dispositivo microfluidico stesso attraverso il primo condotto e l’uscita.

Il dispositivo microfluidico comprende anche un secondo ingresso, il quale è connesso mediante un condotto di alimentazione alla camera di recupero ed attraverso il quale, in uso, viene introdotto un liquido di lavaggio nella camera di recupero stessa.

Il dispositivo microfluidico comprende, inoltre, un serbatoio di raccolta connesso alla camera principale ed alla zona di attesa. È anche prevista una membrana idrofobica disposta in corrispondenza di una porzione terminale del serbatoio di raccolta, la quale membrana permette la fuoriuscita dell’aria presente nel dispositivo microfluidico e, nel caso sia integra, previene l’uscita del campione o di parti del campione e/o del campione.

Inoltre, l’apparato comprende una prima pompa, la quale è atta a dirigere il campione attraverso il condotto d’ingresso nell’unità di separazione, ed una seconda pompa, la quale è atta a dirigere il liquido di lavaggio nella camera di recupero.

Il sistema comprende, inoltre, un dispositivo di riconoscimento avente un microscopio a fluorescenza, che permette il riconoscimento dei tipi di particelle e la determinazione delle relative posizioni ed un dispositivo attuatore, il quale permette di spostare le particelle in funzione del tipo di particelle riconosciute dal dispositivo di riconoscimento in modo tale da portare le particelle del tipo definito nella camera di recupero e mantenere le particelle di tipo diverso nella camera principale. Più specificamente, il dispositivo attuatore è atto a spostare le particelle mediante dielettroforesi.

Un sistema microfluidico di questo tipo è descritto in EP-A-2408562 e non permette (o permette limitatamente) l’introduzione di più porzioni successive del campione nell’unità di separazione. In particolare, nel caso in cui un campione sia in quantità elevate, non è possibile isolare tutte le particelle del tipo determinato utilizzando un unico dispositivo microfluidico, ma è necessario utilizzarne più di uno. Ciò prolunga i tempi di lavoro ed i costi.

Un ulteriore inconveniente risiede nel fatto che un malfunzionamento della membrana idrofobica (ad esempio una rottura) può provocare una fuoriuscita del campione dal dispositivo microfluidico che può eventualmente danneggiare l’apparato e/o il sistema.

Inoltre, si noti che, utilizzando i sistemi microfluidici noti, non è possibile recuperare il campione una volta che questo è stato inserito nel dispositivo microfluidico.

Scopo della presente invenzione è quello di fornire un dispositivo microfluidico ed un metodo per l’isolamento di particelle, i quali permettano di superare, almeno parzialmente, gli inconvenienti dell’arte nota e siano, nel contempo, di facile ed economica realizzazione.

SOMMARIO

Secondo la presente invenzione vengono forniti un dispositivo microfluidico ed un metodo per l’isolamento di particelle, secondo quanto licitato nelle rivendicazioni indipendenti che seguono e, preferibilmente, in una qualsiasi delle rivendicazioni dipendenti direttamente o indirettamente dalle rivendicazioni indipendenti.

A meno che non sia esplicitamente differentemente specificato, nel presente testo i seguenti termini presentano il significato indicato qui sotto.

Per diametro equivalente di una sezione si intende il diametro di un cerchio presentante la medesima area della sezione.

Per sistema microfluidico si intende un sistema comprendente almeno un condotto microfluidico e/o almeno una camera microfluidica. In particolare, il sistema microfluidico comprende almeno una pompa (più in particolare, una pluralità di pompe), almeno un gruppo valvolare (più in particolare, una pluralità di gruppi valvolari) ed eventualmente almeno una guarnizione (più in particolare, una pluralità di guarnizioni).

Nel contesto della presente domanda di brevetto un serbatoio può comprendere un condotto microfluidico, una camera microfluidica od una qualsiasi loro combinazione.

In particolare, per condotto microfluidico si intende un condotto presentante una sezione con diametro equivalente inferiore a 0,5 mm.

In particolare, la camera microfluidica presenta un’altezza inferiore a 0,5 mm. Più in particolare, la camera microfluidica presenta una larghezza ed una lunghezza maggiori dell’altezza (più precisamente almeno cinque volte l’altezza).

Nel presente testo, per particella si intende un corpuscolo presentante la dimensione maggiore inferiore a 500 µm (vantaggiosamente inferiore a 150 µm). Esempi non limitativi di particelle sono: cellule, detriti cellulari (in particolare, frammenti cellulari), aggregati cellulari (quali per es. piccoli cluster di cellule derivanti da cellule staminali come neurosfere o mammosfere) batteri, liposfere, microsfere (in polistirene e/o magnetiche), nanosfere (per es. nanosfere fino a 100 nm) complessi formati da microsfere legate a cellule. Vantaggiosamente, le particelle sono cellule.

Secondo alcune forme di attuazione, le particelle (vantaggiosamente cellule e/o detriti cellulari) presentano la dimensione maggiore inferiore a 60 µm.

Le dimensioni delle particelle possono essere misurate in modo standard con dei microscopi con scala graduata o microscopi normali utilizzati con vetrini (sui quali vengono depositate le particelle) a scala graduata.

Nel presente testo, per dimensioni di una particella si intende la lunghezza, la larghezza e lo spessore della particella.

Il termine “sostanzialmente selettivo” viene utilizzato per identificare uno spostamento (o altri termini analoghi indicanti un movimento e/o una separazione e/o una dislocazione) di particelle, in cui le particelle che vengono spostate e/o separate e/o dislocate sono particelle in gran maggioranza di uno o più tipi determinati. Vantaggiosamente, uno spostamento (o altri termini analoghi indicanti un movimento e/o una separazione e/o una dislocazione) sostanzialmente selettivo prevede di spostare particelle con almeno il 90% (vantaggiosamente il 95%) di particelle del o dei tipi determinati (percentuale data dal numero di particelle del/i tipo/i determinato/i rispetto al numero di particelle complessive).

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

La presente invenzione verrà ora descritta con riferimento ai disegni annessi, che ne illustrano un esempio di attuazione non limitativo, in cui:

- la figura 1 illustra in modo schematico un sistema realizzato in accordo con la presente invenzione;

- la figura 2 è una vista dall’alto di un dispositivo del sistema della figura 1;

- la figura 3 è una vista dall’alto di un esploso del dispositivo della figura 2;

- la figura 4 è una vista dal basso di un esploso del dispositivo della figura 2; e

- la figura 5 è una vista ingrandita di un particolare della figura 4.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA

Nella figura 1, con 1 è indicato schematicamente e nel suo complesso un sistema 1 microfluidico per l’isolamento di particelle di almeno un tipo determinato di un campione C1. Il sistema 1 comprende un dispositivo 2 microfluidico per l’isolamento delle particelle del tipo determinato ed un apparato 3 (solo parzialmente illustrato) atto ad alloggiare il dispositivo 2, in particolare in modo rimuovibile, e a cooperare con il dispositivo 2 per l’isolamento delle particelle del tipo determinato.

Secondo alcune forme d’attuazione non limitative, il sistema 1 è atto ad isolare un tipo di particelle determinato. Il sistema 1 può anche essere utilizzato per l’isolamento di diversi tipi di particelle.

Si noti che il campione, tipicamente, comprende le particelle del tipo determinato ed almeno un altro tipo di particelle. Più precisamente, il campione è un campione biologico ed, in particolare, è una sospensione di particelle biologiche (ad esempio cellule).

Il sistema 1 è atto ad isolare le particelle del tipo determinato in modo sostanzialmente selettivo rispetto alle particelle dell’altro tipo o degli altri tipi. Più in particolare, il sistema 1 è atto ad isolare le particelle del tipo determinato dall’altro tipo di particelle in modo tale da ottenere un campione finale C2 adatto ad essere ulteriormente analizzato, in particolare mediante analisi biologiche.

Vantaggiosamente, il dispositivo 2 è una cartuccia di tipo usa e getta.

Con particolare riferimento alle figure 1 e 2, e secondo un aspetto della presente invenzione, il dispositivo 2 comprende:

- un primo ingresso 4 atto a ricevere il campione C1 comprendente le particelle del tipo determinato per l’inserimento del campione C1 nel dispositivo 2 stesso;

- un’unità 5 di separazione, la quale comprende una camera 6 principale ed una camera 7 di recupero ed è atta a ricevere il campione C1 ed a trasferire almeno parte delle particelle del tipo determinato dalla camera 6 principale alla camera 7 di recupero in modo sostanzialmente selettivo rispetto ad ulteriori particelle del campione C1; ed

- una prima uscita 8 connessa fluidicamente, in particolare direttamente alla camera 7 e configurata per permettere la raccolta delle particelle del tipo determinato, in particolare in un campione C2 finale all’esterno del dispositivo 2.

Più in dettaglio, la camera 7 dell’unità 5 comprende una zona 7a di attesa ed una zona 7b di recupero connesse fluidicamente tra loro ed alla camera 6. La zona 7b è connessa, in particolare direttamente (vale a dire senza l’interposizione di ulteriori elementi) fluidicamente all’uscita 8. In particolare, la zona 7b è disposta tra l’uscita 8 e la zona 7a.

In ulteriore dettaglio, il dispositivo 2 comprende un condotto 9 di uscita interposto tra la camera 7, in particolare la zona 7b, e l’uscita 8.

Vantaggiosamente, il dispositivo 2 comprende anche una seconda uscita 10, la quale è atta a permettere l’uscita del campione C1 o di una sostanza, in particolare almeno una porzione C3 del campione C1, dalla camera 6 principale e dal dispositivo 2 stesso, in particolare in un modo controllato. In particolare, l’uscita 10 è definita da un ugello 11 d’uscita (si veda in particolare la figura 5).

Secondo alcune forme d’attuazione non limitative, il dispositivo 2 comprende, inoltre, un serbatoio 12 per il campione fluidicamente connesso all’ingresso 4 ed all’unità 5, in particolare alla camera 6. In particolare, il serbatoio 12 è disposto tra la camera 6 e l’ingresso 4.

Più precisamente, il serbatoio 12 è atto a ricevere il campione C1 dall’ingresso 4 ed a dirigere il campione C1 verso l’unità 5, in particolare verso la camera 6.

Secondo alcune forme d’attuazione non limitative (come quella illustrata), il serbatoio 12 comprende un condotto 13 d’ingresso connesso fluidicamente all’ingresso 4 ed all’unità 5, in particolare alla camera 6. Più specificamente, il serbatoio 12 è formato dal condotto 13. Preferibilmente, il condotto 13 comprende un foro 14 di alimentazione in corrispondenza all’ingresso 4. Vantaggiosamente ma non necessariamente, il condotto 13 presenta una configurazione curva (vale a dire dotata di una o più curve). Inoltre, il condotto 13 comprende una porzione 13a iniziale direttamente connessa all’ingresso 4, una porzione 13b terminale direttamente connessa all’unità 5, in particolare alla camera 6 ed una porzione 13c intermedia disposta tra le porzioni 13a e 13b. Le porzioni 13a, 13b e 13c presentano sezioni di grandezza sostanzialmente diversa fra loro.

Vantaggiosamente ma non necessariamente, il dispositivo 2 comprende anche un serbatoio 15 di raccolta atto a connettere fluidicamente la camera 6 con l’uscita 10. In particolare, il serbatoio 15 è disposto tra la camera 6 e l’uscita 10.

Più in dettaglio, il serbatoio 15 è fluidicamente, in particolare direttamente e fluidicamente, connesso alla camera 6 ed è atto a ricevere almeno parte del campione C1, in particolare almeno la porzione C3, dalla camera 6 ed a dirigere il campione verso la (alla) uscita 10.

Più precisamente, il serbatoio 15 comprende, in particolare è, un condotto 16 di raccolta connesso alla camera 6. Inoltre, l’ugello 11 è disposto in corrispondenza di una porzione 16a finale del condotto 16 di raccolta. Il condotto 16 è connesso alla camera 6 in corrispondenza ad una porzione 16b iniziale del condotto 16. Le porzioni 16a e 16b sono disposte ad estremi opposti del condotto 16. In alcune forme d’attuazione, il condotto 16 presenta una configurazione curva (vale a dire dotata di una o più curve).

Secondo alternative forme d’attuazione, il serbatoio 15 è assente. In altre parole, il dispositivo 2 è privo di un serbatoio disposto tra la camera 6 principale e l’uscita 10. In questo modo, viene facilitata (riducendo la quantità di tampone necessaria allo scopo) l’uscita di sostanza dalla camera 6 principale. In particolare, in questi casi, tra la camera principale 6 e l’uscita 10 è disposto solo un condotto 16 di piccole dimensioni (relativamente corto). Vantaggiosamente ma non necessariamente, il dispositivo 2 comprende anche un condotto 18 atto a connettere fluidicamente la camera 7, in particolare la zona 7a, con l’uscita 10. In particolare, il condotto 18 è connesso fluidicamente alla camera 7, in particolare alla zona 7a, ed al condotto 16.

In particolare, il dispositivo 2 comprende, inoltre, un serbatoio 20 di liquido di lavaggio fluidicamente connesso alla camera 7 ed atto a ricevere un liquido di lavaggio, in particolare un tampone. Il dispositivo 2 comprende anche un secondo ingresso 21 atto a ricevere il liquido di lavaggio ed a dirigere il liquido di lavaggio al serbatoio 20. In particolare, serbatoio 20 è disposto tra l’ingresso 21 e la camera 7.

Più in dettaglio, il serbatoio 20 di liquido è connesso ad una zona 7c centrale della camera 7 interposta tra la zona 7a di attesa e la zona 7b di recupero. Il serbatoio 20 comprende, in particolare è, un condotto 22 di alimentazione. Il condotto 22 presenta un secondo foro 23 di alimentazione disposto in corrispondenza dell’ingresso 21.

In particolare, il serbatoio 12 presenta un volume almeno doppio (in alcuni casi, almeno triplo) del volume della camera 6 (o della somma dei volumi delle camere 6 e 7).

Vantaggiosamente ma non necessariamente, il serbatoio 20 presenta un volume almeno doppio (in alcuni casi, almeno triplo) del volume della camera 6 (o della somma dei volumi delle camere 6 e 7).

Inoltre, preferibilmente, il condotto 22 presenta una configurazione curva (vale a dire dotata di una o più curve).

In ulteriore dettaglio, il condotto 22 comprende una porzione 22a principale ed una porzione 22b ausiliaria; in particolare, la porzione 22b definisce una porzione finale del condotto 22 direttamente collegata alla camera 7. In particolare, la porzione 22a ha un diametro maggiore della porzione 22b. Più precisamente, la porzione 22a presenta una sezione che è sostanzialmente maggiore delle rispettive sezioni dei condotti 9 e 13.

Secondo alcune forme d’attuazione (come quella illustrata nelle figure 3 e 4), il dispositivo 2 comprende:

- un elemento 27 superiore, in particolare di COC (cicloolefin-copolimero) o di un materiale similare;

- un elemento 28 di supporto, in particolare di COC (cicloolefin-copolimero) o di un materiale similare oppure è un circuito stampato; ed

- un elemento 29 intermedio, in particolare di polimetilmetacrilato (PMMA) o di un materiale similare, interposto tra gli elementi 27 e 28.

L’elemento 29 presenta su una propria superficie (visibile nella figura 3) superiore almeno parte dei serbatoi 12, 15, e 20, ed in particolare parte dei condotti 13, 16, 18, 22. L’elemento 29 presenta su una propria superficie inferiore (visibile nelle figure 4 e 5) almeno parte delle uscite 8 e 10, almeno parte degli ingressi 4 e 21, in particolare parte dei fori 14 e 23.

Il dispositivo 2 comprende, inoltre, almeno parte di un gruppo 30 di separazione, il quale comprende l’unità 5. Questa parte del gruppo 30 è alloggiato in una sede 31 di un alloggiamento dell’elemento 29. Secondo alcune forme d’attuazione, l’apparato 3 comprende una ulteriore parte del gruppo 30 di separazione, in particolare un dispositivo attuatore.

Il dispositivo 2 comprende anche una pluralità di elementi 32 di tenuta nel caso specifico due, in particolare ciascuno di forma anulare. Più in particolare, uno degli elementi 32 circonda il foro 14 e l’altro circonda il foro 23.

Inoltre, il dispositivo 2 comprende anche una pluralità di elementi 33 di chiusura ciascuno atto a collaborare con un rispettivo condotto 9, 13, 16, 18 o 21 e facente parte di un gruppo valvolare (non illustrato in ulteriore dettaglio). Ciascun elemento 33 è selettivamente controllabile tra una posizione di chiusura nella quale il rispettivo l’elemento 33 chiude fluidicamente il rispettivo condotto 9, 13, 16, 18 o 21 ed una posizione di apertura nella quale il rispettivo elemento 33 apre fluidicamente il rispettivo condotto 9, 13, 16, 18 e 21.

Più in dettaglio, uno degli elementi 33 collabora con il condotto 9 in modo da chiudere od aprire selettivamente la connessione fluidica tra l’uscita 8 e l’unità 5, in particolare la camera 7. Un altro elemento 33 collabora con il condotto 13 in modo da chiudere od aprire selettivamente la connessione fluidica tra l’ingresso 4 e l’unità 5, in particolare la camera 6. Un altro elemento 33 collabora con il condotto 16 in modo da chiudere od aprire selettivamente la connessione fluidica tra la camera 6 ed l’uscita 10. Un altro elemento 33 collabora con il condotto 18 in modo da chiudere od aprire selettivamente la connessione fluidica tra la camera 7, in particolare la zona 7a e l’uscita 10. Un ulteriore elemento 33 collabora con il condotto 21 in modo da chiudere od aprire selettivamente la connessione fluidica tra la camera 7 ed l’ingresso 21.

Vantaggiosamente ma non necessariamente, con particolare riferimento alla figura 1, il sistema 1 (in particolare, l’apparato 3) comprende un dispositivo 36 di rilevazione atto a rilevare l’uscita (in particolare, la quantità) di una sostanza, in particolare il campione C1 o almeno la porzione C3 del campione C1, dall’uscita 10.

Più precisamente, il dispositivo 36 di rilevazione comprende:

- un sensore 37 atto a rilevare singole gocce della sostanza, in particolare il campione C1 o almeno la porzione C3 del campione C1, che, in uso, esce dall’uscita 10, in particolare che esce in un modo controllato dall’uscita 10; ed

- un gruppo di calcolo (non illustrato e di per sé noto) atto a determinare la quantità della sostanza (in particolare del campione C1 o almeno della porzione C3 del campione C1) che esce dall’uscita 10 in funzione del numero di singole gocce rilevato dal sensore 37.

È da notare che le singole gocce sono di un volume predefinito (in particolare conosciuto) che sostanzialmente dipende dall’ugello 11 (e dal liquido). Ciascuna goccia presenta sostanzialmente lo stesso volume delle altre.

Preferibilmente, l’apparato 3 comprende anche un alloggiamento (non illustrato e di per sé noto) per alloggiare il dispositivo 2 in un modo removibile.

In particolare, l’apparato 3 comprende, inoltre, mezzi di pressione 38 (più precisamente, una pompa e/o un serbatoio di gas sotto pressione) atti a dirigere il campione dal serbatoio 12 all’unità 5 di separazione.

In aggiunta o in alternativa, secondo alcune forme d’attuazione non limitative, il sistema 1 comprende un sensore 37 atto a rilevare il passaggio di un liquido (in particolare, del campione) dall’uscita 10, ed un sistema di controllo (non illustrato e di per sé noto – eventualmente comprendente il sopra citato gruppo di calcolo) collegato al sensore 37 ed atto a comandare i mezzi di pressione 38 in funzione di quanto rilevato dal sensore 37. In particolare, il sistema di controllo è atto a fermare il funzionamento dei mezzi di pressione 38 quando, in uso, il sensore 37 rileva il passaggio di liquido.

In aggiunta o in alternativa, l’apparato 3 comprende anche dei mezzi di pressione 39 (più precisamente, una pompa e/o un serbatoio di gas sotto pressione) atti a dirigere il liquido di lavaggio dal serbatoio 20 all’unità 5, in particolare direttamente nella camera 7.

Secondo alcune forme d’attuazione, il sistema 1 (più precisamente, l’apparato 3) comprende un dispositivo di riconoscimento (non illustrato e di per sé noto) atto a determinare la posizione ed il tipo delle particelle presenti nell’unità 5 di separazione.

Vantaggiosamente ma non necessariamente, il dispositivo di riconoscimento è definito da un apparato con un microscopio ottico atto ad ottenere un’immagine in fluorescenza e/o in campo chiaro (bright field) per rilevare il tipo ed il posizionamento delle singole particelle presenti nell’unità 5. In particolare, l’apparato con microscopio è configurato per stimolare marcatori di fluorescenza selettivi con i quali sono marcate le particelle e per rilevare la posizione delle particelle marcate nell’unita 5 sulla base del segnale di fluorescenza ricevuto.

Vantaggiosamente ma non necessariamente, il sistema 1 (più precisamente, il gruppo 30 di separazione) comprende il dispositivo attuatore atto ad azionare la dislocazione delle particelle del tipo determinato dalla camera 6 alla camera 7. Il gruppo 30 di separazione (in particolare, il dispositivo attuatore) è atto a azionare il movimento selettivo di ciascuna particella mediante magnetoforesi, dielettroforesi, onde acustiche (acustoforesi) e/o manipolazione ottica (optical tweezers). Secondo specifiche forme d’attuazione, il gruppo 30 di separazione (in particolare, il dispositivo attuatore) comprende una unità (o sistema) di dielettroforesi come ad esempio descritto in almeno una delle domande di brevetto WO-A-0069565, WO-A-2007010367, WO-A-2007049120, il cui contenuto viene qui integralmente richiamato per completezza di descrizione (incorporato per riferimento). In particolare, l’unità 5 comprende una parte dell’unità (o sistema) di dielettroforesi. Più in particolare, l’unità 5 (il gruppo 30) funziona in accordo con quanto descritto nelle domande di brevetto con numero di pubblicazione WO2010/106434 e WO2012/085884).

In uso, prima dell’inserimento del dispositivo 2 nell’apparato 3 il dispositivo 2 stesso viene caricato con il campione C1 e, preferibilmente, anche con il liquido di lavaggio. In particolare, il campione C1 viene inserito attraverso l’ingresso 4 nel serbatoio 12. Più in particolare, il campione C1 viene inserito nel condotto 13 mediante il foro 14.

Inoltre, prima dell’inserimento del dispositivo 2 nell’apparato 3 viene introdotto nel dispositivo 2 il liquido di lavaggio (in particolare un soluzione tampone) attraverso l’ingresso 21. Più precisamente, il liquido di lavaggio viene introdotto nel serbatoio 20. Più in particolare, il liquido di lavaggio viene introdotto nel condotto 22 mediante foro 23.

Dopo il caricamento del campione C1 e, preferibilmente del liquido di lavaggio nel dispositivo 2, il dispositivo 2 viene inserito nell’apparato 3, in particolare il dispositivo 2 viene inserito nell’alloggiamento dell’apparato 3.

A questo punto, durante una fase di introduzione, almeno una frazione del campione C1 viene inserita nell’unità 5. In particolare, una frazione del campione C1 viene portata dal serbatoio 12 (in particolare, dal condotto 13) all’unità 5, in particolare alla camera 6. Più specificamente, l’inserimento della frazione del campione C1 viene effettuato mediante l’azionamento dei mezzi di pressione 38.

A questo punto, durante almeno una fase di selezione, le particelle del tipo determinato vengono portate nella camera 7 in modo sostanzialmente selettivo rispetto ad ulteriori particelle del campione, in particolare mediante un sistema scelto nel gruppo consistente di: dielettroforesi, optical tweezers, magnetoforesi, acustoforesi ed una loro combinazione.

Vantaggiosamente ma non necessariamente, durante la fase di selezione, la distribuzione delle particelle nell’unità 5 viene quindi determinata, in particolare mediante il dispositivo di riconoscimento. Più specificamente, viene determinata la posizione ed il tipo di ciascuna particella. Ancora più specificamente, le particelle del tipo determinato vengono identificate otticamente sulla base di segnali fluorescenti (viene catturata un’immagine o vengono catturate più immagini di fluorescenza).

Più specificamente, ciò avviene mediante l’attivazione del dispositivo attuatore sostanzialmente nel modo descritto nelle domande di brevetto WO-A-0069565, WO-A-2007010367 e WO-A-2007049120.

Più specificamente, le particelle del tipo determinato vengono posizionate nella zona 7a della camera 7. Tipicamente, particelle di altri tipi vengono mantenute nella camera 6. Successivamente, in particolare prima di una fase di scarico delle particelle del tipo predeterminato, le particelle del tipo predeterminato vengono portate nella zona 7b.

Secondo alcune forme d’attuazione non limitative, viene effettuata almeno una fase di ripetizione durante la quale la fase di introduzione e la fase di selezione vengono ripetute. In particolare, viene introdotta una ulteriore frazione del campione C1 dal serbatoio 12, in particolare dal condotto 13 nell’unità 5. Poi le particelle del tipo determinato vengono nuovamente posizionate nella camera 7, in particolare nella zona 7a.

In alcuni casi, durante la fase di ripetizione, anche la fase di scarico viene ripetuta. In questo modo è possibile processare un numero di particelle superiore a quello che può essere gestito dal sistema 1; più precisamente, in questo modo è possibile processare un numero di particelle superiore a quelle che può essere contenuto nella zona 7a di attesa.

Vantaggiosamente ma non necessariamente, si effettuano più fasi di ripetizione in modo tale da processare tutto il campione C1 per ottenere un campione finale comprendente sostanzialmente tutte le particelle del tipo predeterminato originalmente presente nel campione C1.

Inoltre, vantaggiosamente, durante le fasi di ripetizione, frazioni del campione possono uscire dall’uscita 10 che vengono raccolte fuori dal dispositivo 2.

Vantaggiosamente, ma non necessariamente, durante la fase o le fasi di ripetizione, mentre l’ulteriore frazione del campione C1 viene inserita nell’unità 5, almeno una porzione C3 del campione esce dalla camera 6 e dal dispositivo 2 attraverso l’uscita 10. In particolare, la porzione C3 del campione C1 è almeno parte della frazione del campione C1 inserita nell’unità 5 nel passo precedente.

La/e fase/i di ripetizione è/sono particolarmente utili quando si ha a disposizione un campione C1 contenente una quantità di particelle particolarmente elevata (e che quindi necessita di essere molto diluito). Più precisamente, quando le cellule d’interesse sono una percentuale molto ridotta rispetto alle particelle totali.

È anche prevista almeno una fase di scarico, durante la quale le particelle del tipo determinato vengono condotte dalla camera 7 fuori dal dispositivo 2 attraverso l’uscita 8. In particolare, le particelle del tipo determinato vengono raccolte nel campione finale C2 (che passa attraverso l’uscita 8). Le particelle contenute in tale campione finale C2 vengono successivamente sottoposte ad ulteriori analisi.

Più specificamente, la fase di scarico viene effettuata mediante l’introduzione del liquido di lavaggio nella camera 7. In particolare, il liquido di lavaggio viene trasferito dal serbatoio 20 (in particolare, dal condotto 22) nella camera 7. Più in particolare, i mezzi di pressione 39 vengono azionati per dirigere il liquido di lavaggio dal condotto 22 nella camera 7.

In alcuni casi, che prevedono più fasi di ripetizione, la fase di scarico viene effettuata solo al termine delle (di tutte le) fasi di ripetizione.

In altri casi, che prevedono più fasi di ripetizione, una rispettiva fase di scarico viene effettuata al termine di ciascuna fase di ripetizione (o al termine di una parte delle fasi di ripetizione).

Vantaggiosamente ma non necessariamente, prima di ciascuna fase di ripetizione viene effettuata una fase di uscita, in particolare per rimuovere la frazione rimanente del campione C1 nella camera 6 dalla camera 6 stessa (e per recuperare la frazione rimanente del campione fuori dal dispositivo 2). In particolare, durante la fase di uscita, viene introdotto il liquido di lavaggio nella camera 6. Più in particolare, durante la fase di uscita, i mezzi di pressione 39 vengono azionati per dirigere il liquido di lavaggio dal serbatoio 20 attraverso la (parte della) camera 7 alla camera 6.

Vantaggiosamente ma non necessariamente, la fase di uscita è successiva alla fase di selezione ed anteriore alla fase di scarico.

Secondo alcune forme d’attuazione, durante la fase di uscita, per portare almeno parte del campione C1 attraverso l’uscita 10 un primo fluido viene spinto nell’unità 5 di separazione entrando in corrispondenza della (in particolare, attraverso la) camera 6 principale ed un secondo fluido viene spinto nell’unità 5 di separazione entrando in corrispondenza della (in particolare, attraverso la) camera 7 di recupero.

In alcuni casi, il sistema 1 comprende un serbatoio 12, il quale è collegato fluidicamente con l’unità 5 di separazione in corrispondenza (in particolare, attraverso) della camera 6 principale ed è in particolare atto a contenere il campione; e dei mezzi di pressione 38, atti a dirigere un primo fluido dal serbatoio 12 nella camera 6 principale. Il sistema 1 comprende, inoltre, un secondo serbatoio 20, il quale è fluidicamente collegato con l’unità 5 di separazione in corrispondenza della (in particolare, attraverso la) camera 7 recupero ed è in particolare atto a contenere un liquido di lavaggio; e dei mezzi di pressione 39, atti a dirigere un secondo fluido dal secondo serbatoio 20 nella camera 6 principale. In questi casi, durante la fase di uscita, vengono azionati i mezzi di pressione 38 e 39.

Si noti che nella forma d’attuazione illustrata nelle figure (in particolare, si veda la figura 2) il serbatoio 12 è di dimensioni relativamente piccole. Per effettuare una o più fasi di ripetizione, il serbatoio 12 presenta una forma differente e (soprattutto) un capacità di contenimento (volume) sensibilmente superiore rispetto al serbatoio 12 illustrato.

In particolare, il serbatoio 12 presenta un volume almeno doppio (in alcuni casi, almeno triplo) del volume della camera 6 (o della somma dei volumi delle camere 6 e 7).

Secondo alcune forme d’attuazione non limitative, durante la fase di selezione, le particelle del tipo determinato vengono identificate otticamente sulla base di segnali fluorescenti (provenienti dalle particelle).

Si noti che, in accordo con la presente invenzione, si ottengono rilevanti vantaggi rispetto allo stato dell’arte. In particolare, sottolineiamo che la presenza della seconda uscita 10, in particolare dell’ugello 11, permette il recupero del campione C1 o almeno della porzione C3 del campione C1. Questo è particolarmente vantaggioso considerando che il campione C1 è difficilmente recuperabile e che è di alto valore. In particolare, in alcuni casi applicativi il campione C1 serve per diagnosticare gravi malattie. La perdita di campioni potrebbe, pertanto, portare a conseguenze molto negative per i pazienti.

Inoltre, anche nel caso di un malfunzionamento del dispositivo 2 che non permette l’isolamento delle particelle determinate, il dispositivo 2 è in grado di recuperare tutto (o quasi) il campione C1. Successivamente, è dunque possibile introdurre il campione in un nuovo dispositivo 2 per poi isolare le particelle del tipo determinato mediante il nuovo dispositivo 2.

Un ulteriore vantaggio risiede nel fatto che, grazie alla presenza della seconda uscita 10 e, quindi, alla possibilità di ripetere le fasi di introduzione e selezione più volte, risulta possibile ottenere un campione finale comprendente sostanzialmente tutte le particelle del tipo determinato anche in campioni contenenti un elevato numero di particelle, in particolare laddove il campione presenti una bassa percentuale di particelle di interesse rispetto alle particelle totali (ad esempio inferiore di 1/1000) e/o ci sia una necessità di ottenere un elevato numero di particelle di interesse.

Inoltre, è stata eliminata la membrana idrofobica e con questo anche il possibile problema di una non desiderata ed incontrollata fuoriuscita di una frazione del campione C1 o di un’altra sostanza dal dispositivo 2 a causa di una rottura della membrana idrofobica stessa.

A meno che non sia esplicitamente indicato il contrario, il contenuto dei riferimenti (articoli, libri, domande di brevetto ecc.) citati in questo testo è qui integralmente richiamato. In particolare i menzionati riferimenti sono qui incorporati per riferimento.

Claims (1)

1. R I V E N D I C A Z I O N I 1.- Dispositivo (2) microfluidico per l’isolamento di particelle di almeno un tipo determinato da un campione (C1); il dispositivo (2) microfluidico comprende: un primo ingresso (4), il quale è atto a ricevere un campione (C1) comprendente le particelle del tipo determinato e a permettere l’inserimento del campione nel dispositivo (2) microfluidico stesso; un’unità (5) di separazione, la quale comprende una camera (6) principale ed una camera (7) di recupero ed è atta a ricevere il campione (C1) ed a trasferire almeno parte delle particelle del tipo determinato dalla camera (6) principale alla camera (7) di recupero in modo sostanzialmente selettivo rispetto ad ulteriori particelle del campione (C1); ed una prima uscita (8) configurata per permettere la raccolta delle particelle del tipo determinato all’esterno del dispositivo; il dispositivo (2) microfluidico è caratterizzato dal fatto di comprendere una seconda uscita (10), la quale è atta a permettere l’uscita di almeno una porzione (C3) del campione dalla camera (6) principale e dal dispositivo (2) microfluidico. 2.- Dispositivo microfluidico secondo la rivendicazione 1, e comprendente un serbatoio (15) di raccolta, il quale è disposto tra la camera (6) principale e la seconda uscita (10) ed è atto a connettere fluidicamente la camera (6) principale con la seconda uscita (10). 3.- Dispositivo (2) microfluidico secondo la rivendicazione 2, in cui il serbatoio (15) di raccolta comprende (in particolare, è) un condotto (16) di raccolta; la seconda uscita (10) comprende un ugello (11) disposto in corrispondenza di una porzione (16a) finale del condotto (16) di raccolta. 4.- Dispositivo microfluidico secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui la camera (7) di recupero comprende una zona (7a) di attesa ed una zona (7b) di recupero connesse fluidicamente alla camera (6) principale e tra loro; la zona (7b) di recupero essendo connessa fluidicamente alla prima uscita (8); in particolare, la zona (7b) di recupero è disposta tra la prima uscita (8) e la zona (7a) di attesa. 5.- Dispositivo microfluidico secondo una delle rivendicazioni precedenti, e comprendente un serbatoio (20) di liquido fluidicamente connesso alla camera (7) di recupero ed, in particolare, comprendente un secondo ingresso (21) atto a ricevere un liquido di lavaggio; in particolare, la camera (7) di recupero è disposta tra il serbatoio (20) di liquido e la camera (6) principale. 6.- Dispositivo microfluidico secondo la rivendicazione 5, in cui il serbatoio (20) di liquido è connesso ad una zona (7c) centrale interposta tra la zona (7a) di attesa e la zona (7b) di recupero ed, in particolare, comprende un condotto (22) di alimentazione fluidicamente direttamente connesso al secondo ingresso (21). 7.- Dispositivo microfluidico secondo la rivendicazione 5 o 6, in cui il serbatoio (20) di liquido presenta un volume almeno doppio (in particolare, almeno triplo) del volume della camera (6) principale. 8.- Metodo per l’isolamento di particelle di almeno un tipo determinato da un campione (C1) utilizzando un dispositivo (2) microfluidico secondo una delle rivendicazioni da 1 a 7, il metodo comprende: - almeno una fase di introduzione, durante la quale una prima frazione del campione (C1) viene inserita nell’unità (5) di separazione; - almeno una fase di selezione, durante la quale almeno parte delle particelle del tipo determinato vengono portate nella camera (7) di recupero in modo sostanzialmente selettivo rispetto ad ulteriori particelle del campione; - almeno una fase di ripetizione, durante la quale la fase di introduzione e la fase di selezione vengono ripetute; - almeno una fase di scarico, durante la quale le particelle del tipo determinato vengono condotte dalla camera (7) di recupero fuori dal dispositivo (2) microfluidico attraverso la prima uscita (8). 9.- Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui, durante la fase di ripetizione, la fase di scarico viene ripetuta. 10.- Metodo secondo la rivendicazione 8, comprendente più fasi di ripetizione; la fase di scarico venendo effettuata solo al termine di tutte le fasi di ripetizione. 11.- Metodo secondo una delle rivendicazioni da 8 a 10, in cui durante la fase di selezione, almeno parte delle particelle del tipo determinato vengono spostate mediante un sistema scelto nel gruppo consistente di: dielettroforesi, optical tweezers, magnetoforesi, acustoforesi ed una loro combinazione. 12.- Metodo secondo una delle rivendicazioni da 8 a 11, in cui, durante la fase di selezione, le particelle del tipo determinato vengono identificate otticamente sulla base di segnali fluorescenti. 13.- Metodo secondo una delle rivendicazioni da 8 a 12, in cui durante la fase di ripetizione una porzione (C3) del campione esce dalla camera (6) principale e dalla seconda uscita (10). 14.- Metodo una delle rivendicazioni da 8 a 13, in cui durante la fase di ripetizione, mentre una ulteriore frazione del campione (C1) viene inserita nell’unità (5) di separazione, almeno una porzione (C3) del campione esce dalla camera (6) principale e dal dispositivo (2) microfluidico attraverso l’uscita (10); in particolare, la detta porzione (C3) del campione è almeno parte della prima frazione del campione (C1). 15.- Metodo secondo una delle rivendicazioni da 8 a 14, e comprendente una fase di lavaggio durante la quale viene introdotto nella camera (6) principale un liquido di lavaggio; in particolare la fase di lavaggio è successiva alla fase di selezione ed anteriore alla fase di scarico. 16.- Metodo secondo una delle rivendicazioni da 8 a 15, in cui la camera (7) di recupero comprende una zona (7a) di attesa ed una zona (7b) di recupero; durante la fase di selezione, le particelle del tipo determinato vengono disposte nella zona (7a) di attesa; le particelle del tipo determinato vengono inoltre dirette dalla zona (7a) di attesa alla zona (7b) di recupero prima della fase di scarico. 17.- Metodo secondo la rivendicazione 16, in cui, durante la fase di ripetizione, le particelle sono disposte nella zona (7a) di attesa; e al termine della fase di ripetizione e prima della fase di scarico, le particelle vengono portate dalla zona (7a) di attesa alla zona (7b) di recupero. 18.- Metodo secondo una delle rivendicazioni da 8 a 17, in cui, durante la fase di scarico, un liquido di lavaggio viene introdotto nella camera (7) di recupero.