MX2015001251A - Metodo y sistema para la orientacion y/o clasificacion de particulas micro fluidicas. - Google Patents

Metodo y sistema para la orientacion y/o clasificacion de particulas micro fluidicas.

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Abstract

Un sistema para la orientación de partículas en un sistema microfluidico incluye una o más fuentes de presión de radiación dispuestas para exponer las partículas a presión de radiación que causan que las partículas adopten una orientación particular en el fluido. Un sistema para la clasificación de las partículas en un sistema microfluidico incluye una etapa de detección dispuesta para detectar al menos una diferencia o discriminar entre las partículas en el flujo de fluido más allá de la etapa de detección, y una o más fuentes de presión de radiación más allá de las cuales las partículas se mueven secuencialmente y un controlador dispuesto para intercambiar la energía de radiación para causar un cambio en la dirección de movimiento de las partículas seleccionadas en el flujo de fluido para clasificar las partículas. Las partículas pueden ser partículas biológicas tal como espermatozoides. La presión de radiación puede ser presión óptica y puede ser de una o más guías de onda que pueden extenderse a través de un canal del sistema microfluidico.

Description

MÉTODO Y SISTEMA PARA LA ORIENTACIÓN Y/O CLASIFICACIÓN DE PARTÍCULAS MICROFLUÍDICAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un método y sistema para la orientación y/o clasificación de partícula en un sistema icrofluídico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances en la medicina académica y comercial y la bioteenología han impulsado un fuerte enfoque sobre los métodos de clasificación celular biológica. Los dos enfoques principales que han surgido - separación a granel y clasificación de célula única - ambos enriquecen una población de células con un subconjunto dirigido con fisicoquímica específica (por ejemplo, tamaño, volumen, propiedades de dispersión de luz, etc.), características inmunológicas, o funcionales. La clasificación a granel generalmente se centra en una sola característica celular de discriminación. Los ejemplos incluyen filtración de la célula, centrifugación/sedimentación y métodos de cribado basados en la afinidad. Las principales desventajas de la clasificación a granel son menor pureza, pérdida de células durante el proceso de clasificación, dificultad en separar las células relativamente raras, y dificultad para discriminar entre las subpoblaciones similares de células. La Ref NO.: 254168 clasificación a granel, sin embargo, es un método relativamente simple que ofrece alto rendimiento. En contraste, los métodos de célula única, el más importante de los cuales es la clasificación celular activada con fluorescencia (FACS) por citometría de flujo, examina cada célula individualmente para dirigir la subpoblación deseada para el aislamiento y luego guiarlos en diferentes corrientes de salida. La reducción en el rendimiento es compensada por mayores ventajas en la especificidad de la clasificación que es mejorada con el resultado deseado, generalmente mayor recuperación de las células, la capacidad de ordenar las poblaciones celulares discriminadas débilmente solamente o raras, y la disponibilidad de clasificar múltiples objetivos basados en una matriz de múltiples características celulares (es decir, varios tipos de receptor de superficie, cada una etiquetada con una etiqueta fluorescente diferente) . Un importante desafío enfrentado por los métodos citométricos de flujo FACS es el daño incurrido por algunas células en el flujo (esfuerzo cortante) y procesos de clasificación (daño al campo eléctrico). Un ejemplo importante es la fertilidad reducida de muestras ordenadas de esperma que se puede atribuir a estos procesos físicos perjudiciales.
En el sector agrícola, la discriminación celular es particularmente importante en especies de ganadería donde la inseminación artificial se practica comúnmente tal como ganado. El uso de semen sexuado facilita el control del género de la descendencia para beneficio comercial. El actual método comercialmente importante para clasificar el esperma utiliza citometría de flujo FACS, en el cual esperma es discriminado por sus diferencias en el contenido de ADN. El ADN de cada espermatozoide se tiñe con un colorante fluorescente en proporción con el contenido de ADN. Como el cromosoma X es más grande (es decir, tiene más ADN) que el cromosoma Y, los espermatozoides "femeninos" (que portan cromosoma x) absorberán una mayor cantidad de tinta que los espermatozoides "masculinos" (que portan el cromosoma Y) y como una consecuencia cuando está expuesto a la luz UV durante la citometría de flujo será fluorescente con mayor intensidad que los espermatozoides Y. Antes de la detección o discriminación el esperma puede ser orientado hidrodinámicamente y los espermatozoides pueden dividirse en gotas individuales que luego pueden ser cargadas eléctricamente. Después de la detección o la discriminación, el esperma se clasifica por interacciones de campo eléctrico - gota cargad .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En términos generales en un aspecto la invención comprende un método de orientar las partículas en un sistema microfluídico, que incluye la exposición de las partículas a presión de radiación en un sistema microfluídico para provocar que al menos una mayoría de las partículas adopte una orientación particular en el fluido.
En términos generales en otro aspecto la invención comprende un sistema para orientar las partículas en un sistema microfluídico, que incluye una o más fuentes de presión de radiación dispuestas para exponer las partículas en el sistema microfluídico a la presión de la radiación para causar que al menos una mayoría de las partículas adopten una orientación particular en el fluido.
Las partículas pueden ser partículas biológicas o no biológicas. Normalmente las partículas son partículas asimétricas. La asimetría puede ser en cualquier propiedad física que conduce a una interacción asimétrica con la radiación incidente, que incluye pero no se limita a la asimetría en las dimensiones físicas de las partículas. En algunas modalidades las partículas pueden ser esperma, glóbulos rojos, o bacterias, por ejemplo.
La presión de la radiación puede ser presión óptica y puede ser de una o más guías de onda que pueden extenderse a través de un canal del sistema microfluídico, por ejemplo a través de arriba, abajo o a través de las paredes laterales del canal, o pueden empalmar un canal desde arriba, abajo o al lado. La(s) guía(s) de onda puede(n) ser una o más guías de ondas ópticas están conectadas a una fuente de luz, tal como un láser, para transportar la luz y generar la presión de radiación también referida como fuerza óptica, presión del fotón o presión electromagnética. Las una o más guías de onda pueden ser fabricadas como parte del proceso intrínseco de fabricación del sistema microfluídico, o pueden introducirse como unidades de fibra óptica en la construcción del sistema final.
Un sistema microfluídico para orientar las partículas como el anterior también puede comprender una pre etapa para enfocar y/o individualizar las partículas en una ubicación particular dentro del canal. Este sistema puede ser hidrodinámico o basado en la presión de radiación.
En términos generales en otro aspecto la invención comprende un método de clasificación de las partículas en un sistema microfluídico, que incluye: • detectar por lo menos una diferencia o discriminación entre las partículas, y • intercambio basado en una entrada de la detección o discriminación, una o más fuentes de presión de radiación más allá de que las partículas se muevan secuencialmente para causar un cambio en la dirección de movimiento de las partículas seleccionadas en el flujo de fluido para ordenar las partículas.
Las partículas pueden ser dirigidas en dos o más de dos diferentes salidas.
Las una o más fuentes de presión de radiación pueden ser una o más guías de onda, que pueden extenderse a través de un canal del sistema microfluídico, por ejemplo a través de arriba, abajo o a través de las paredes laterales del canal, o pueden empalmar un canal desde arriba, abajo o al lado.
El paso de la detección de al menos una diferencia o discriminación entre las partículas puede comprender una téenica óptica para evaluar una característica de la partícula, la técnica puede ser una técnica de detección basada en fluorescencia.
El método también puede comprender la individualización del flujo de partícula y también puede abarcar enfocar las partículas a una ubicación particular dentro de los canales. Las fuerzas pueden ser hidrodinámicas o basadas en presión de radiación.
El método también puede comprender causar que al menos una mayoría de las partículas primero adopte una orientación particular en el fluido antes de detectar, donde las partículas son partículas asimétricas. El paso de orientación puede comprender exponer las partículas a presión de radiación tal como presión óptica para provocar que al menos una mayoría de las partículas adopte una orientación particular en el fluido.
En términos generales en otro aspecto la invención comprende un sistema para la clasificación de las partículas en un sistema microfluídico, que incluye: • una etapa de detección dispuesta para detectar al menos una diferencia o discriminar entre las partículas en el flujo de fluido más allá de la etapa de detección, y • una o más fuentes de presión de radiación más allá de que las partículas se muevan secuencialmente y un controlador dispuesto para cambiar basado en una entrada de la etapa de detección o de discriminación, la energía de radiación en una o más fuentes de presión de radiación para causar un cambio en la dirección de movimiento de las partículas seleccionadas en el flujo de fluido para ordenar las partículas.
El sistema puede disponerse para cambiar u ordenar las partículas para que cada partícula sea dirigida a uno de dos o uno de más de dos salidas diferentes.
Las una o más fuentes de presión de radiación pueden ser una o más guías de onda que pueden extenderse por lo menos parcialmente a través de un canal del sistema microfluídico, por ejemplo a través de arriba, abajo o a través de las paredes laterales del canal, o pueden empalmar el canal desde arriba, abajo o al lado.
La etapa de detección puede disponerse para detectar o discriminar las partículas por una téenica óptica tal como una técnica de detección basada en fluorescencia.
Las partículas pueden ser partículas biológicas o no biológicas. Normalmente las partículas son partículas asimétricas. La asimetría puede ser en cualquier propiedad física que conduce a una interacción asimétrica con la fuerza óptica, que incluye pero no se limita a la asimetría en las dimensiones físicas. En algunas modalidades las partículas pueden ser esperma, glóbulos rojos, bacterias, o nanopartículas por ejemplo.
Un sistema microfluídico para orientar las partículas como el anterior también puede comprender un flujo de partículas de individualización pre-etapa y también puede comprender una pre-etapa para enfocar las partículas en una ubicación determinada dentro del canal. Este sistema puede ser hidrodinámico u óptico.
El sistema también puede comprender una etapa de orientación dispuesta para causar que al menos una mayoría de las partículas primero adopte una orientación particular en el fluido, particularmente donde las partículas son partículas asimétricas. La etapa de orientación puede comprender una o más guías de onda dispuestas para en uso exponer las partículas a la radiación tal como presión óptica para provocar que al menos una mayoría de las partículas adopte una orientación particular en el fluido.
En términos generales en otro aspecto la invención comprende un sistema microfluídico para esperma sexuado que incluye: • una o más fuentes de presión de radiación de orientación dispuestas para exponer esperma a presión para causar que el esperma individual adopte una orientación común en el fluido • una etapa de detección basada en fluorescencia dispuesta para discriminar el esperma masculino y femenino en el flujo de fluido más allá de la etapa de detección, y • una o más fuentes de presión de radiación de intercambio s más allá de la cual el esperma individual posteriormente se mueva, y • un controlador dispuesto para recibir una entrada de la etapa de detección y para controlar la energía de radiación en una o más fuentes de presión de radiación de intercambio para dirigir separadamente el esperma masculino y/o femenino.
Un sistema microfluídico para la orientación de partículas como anteriormente también puede comprender de una pre-etapa para individualización de flujo de esperma y una pre-etapa para enfocar el esperma en una ubicación particular dentro del canal. Este sistema puede ser hidrodinámico u óptico.
El término "que comprende" como se usa en esta especificación significa "que consiste por lo menos en parte de". Cuando los establecimientos de interpretación en esta especificación que incluyen este término, las características se prologan por este término en cada establecimiento que todas necesitan estar presentes pero otras características también pueden estar presentes. Los términos relacionados tal como "comprenden" y "comprendido" deben ser interpretados de la misma manera.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención se describe adicionalmente con referencia a las figuras acompañantes en donde: La figura 1 ilustra esquemáticamente una modalidad de un sistema microfluídico de la invención para clasificar, la partícula, Las figuras 2a-2b ilustran esquemáticamente modalidades para la orientación de partícula en la cual una sola guía de onda - Figura 2a, o múltiples guías de onda -Figura 2b, empalman el microcanal desde arriba, abajo o desde un lado del canal, Las figuras 3a-3b ilustran esquemáticamente modalidades para la orientación de partícula en la cual una sola guía de onda - Figura 3a, y múltiples guías de onda -Figura 3b, se extienden a través de los microcanales por arriba, abajo o a lo largo de una pared lateral del canal, Las figuras 4a-4b ilustran esquemáticamente modalidades para la clasificación o intercambio de las partículas seleccionadas en un flujo de fluido en un microcanal, en el cual múltiples guías de onda empalman el canal desde arriba, abajo o desde un lado del canal, Las figuras 5a-5b ilustran esquemáticamente modalidades para la clasificación o intercambio de las partículas seleccionadas en un flujo de fluido en un microcanal, en el cual múltiples guías de onda se extienden a través del canal arriba, abajo o a lo largo de la pared lateral del canal, La figura 6a muestra una modalidad de un chip microfluídico de la invención para llevar a cabo la orientación y la separación de esperma y la figura 6b muestra un arreglo de chips de clasificación individual que pueden disponerse para la implementación microfluídica paralela masivamente para clasificar el esperma de acuerdo con el sexo, Las figuras 7a-7b son geometrías computacionales utilizadas en las simulaciones FEM referidas a la posterior descripción de trabajo experimental, la figura 7a - cilindro elíptico en agua colocado a lo largo del eje óptico de guía de onda de 40 mm de término de guía de onda y la figura 7b -cilindro elíptico colocado encima de una guía de onda foto-epoxi de SU8 con una separación pequeña que separa el cilindro de la guía de onda, La figura 8 muestra la torsión en el cilindro elíptico en agua en una variedad de distancias desde el término de una guía de onda, referida a la posterior descripción de trabajo experimental, La figura 9 muestra la torsión en un cilindro elíptico en agua por encima de una guía de onda a 3 distancias de separación, referida a la posterior descripción de trabajo experimental, La figura 10 muestra las fuerzas Fx y Fy en un cilindro elíptico en agua en el término de una guía de onda en la orientación vertical para una variedad de distancias de separación, referida a la posterior descripción de trabajo experimental, La figura 11 muestra las fuerzas ópticas Fx y Fy en un cilindro elíptico en agua por encima de una guía de onda para una variedad de distancias de separación, referida a la posterior descripción de trabajo experimental, Las figuras 12a-12c muestran el desplazamiento de partícula simétrica por un campo óptico conforme la partícula fluye más allá del final de un término de guía de onda en un canal microfluídico referido en la posterior descripción de trabajo experimental, Las figuras 13a-13b muestran un desplazamiento de partícula asimétrica por, y orientada por un campo óptico conforme la partícula fluye más allá del extremo de un término de guía de onda en un canal microfluídico, referido en la posterior descripción de trabajo experimental, y Las figuras 14a-14b muestran la eficiencia de desplazamiento medido en función de la velocidad de flujo de partícula para partículas simétricas - figura 14a, y partículas asimétricas - figura 14b.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Haciendo referencia a la figura 1 el sistema microfluídico normalmente proporcionado en un chip microfluídico para la orientación de la partícula y la clasificación comprende enfoque, orientación, detección de una característica discriminante que puede ser fluorescencia, y etapas de sincronización e intercambio secuencialmente a lo largo de un microcanal a lo largo del cual las partículas se mueven con el flujo de fluido en el canal, de una etapa a la siguiente.
En la modalidad se muestra una etapa de enfoque y/o individualización hidrodinámica 1 que coloca las partículas en una ubicación particular en el canal.
Si las partículas son asimétricas, tal como el esperma por ejemplo, la orientación inicial de las partículas puede ser aleatoria, y una etapa de orientación 2 orienta las partículas sustancialmente todos o por lo menos una mayoría con una orientación común predeterminada en relación con la geometría del canal. En la figura esquemática las partículas se muestran que están orientadas verticalmente. En una modalidad preferida las partículas están orientadas en la etapa de orientación por las fuerzas ópticas tal como de una guía de onda óptica como se describirá adicionalmente. Una o más guías de onda pueden extenderse a través del canal, por ejemplo a través de arriba, abajo o a lo largo de la pared lateral del canal, o pueden empalmar el canal desde arriba, abajo o desde el lado del canal. La guía de onda puede formar parte de la pared del canal, o puede estar físicamente separada de la cámara microfluídica.
En esta modalidad la etapa de detección 3 es una etapa de detección basada en fluorescencia y las partículas son previamente teñidas con un colorante fluorescente, y la etapa de detección de fluorescencia 3 evalúa la intensidad de fluorescencia de cada partícula y pasa la información de fluorescencia a sincronización e intercambio de las etapas 4 y 5, que cambian u ordenan las partículas para que cada partícula sea dirigida a una de dos diferentes salidas 6 y 7. Las etapas de sincronización e intercambio 4 y 5 son controladas por un controlador electrónico 15. Por ejemplo, las partículas pueden ser esperma y esperma masculino puede ser dirigido a la salida 6 y esperma femenino a la salida 7 por ejemplo. Alternativamente las partículas pueden ordenarse para seleccionar un tipo de partícula que se desea de otro tipo de partícula que no se desea para la aplicación particular, tal como seleccionar glóbulos rojos por ejemplo y en dicha modalidad las partículas deseadas pueden ser dirigidas para colección o para procesamiento posterior mientras que las partículas no deseadas pueden ser dirigidas a residuos o una salida a residuos o algún otro procesamiento.
Las partículas entran en el sistema microfluídico desde la fuente 8. En la figura la fuente 8 y salidas 6 y 7 se muestran esquemáticamente como volúmenes de colección tal como cámaras para contener las partículas, pero las partículas pueden entrar en el sistema o la sección de clasificación del sistema microfluídico, desde un canal o canales microfluídicos de una etapa de procesamiento previo y salir a la sección de clasificación a los canales microfluídicos que llevan a las partículas a otro procesamiento posterior por ejemplo.
Las figuras 2a-2b ilustran esquemáticamente modalidades para la orientación de la partícula en la cual una sola guía de onda - Figura 2a, o múltiples guías de onda - Figura 2a, empalman con el microcanal de un lado (arriba, abajo o desde cualquier lado) del canal, que puede ser utilizado en la etapa de orientación 2 del sistema de la figura 1. En la figura 2a, una guía de onda de radiación 9 tal como una fibra óptica conectada a una fuente tal como un láser empalma con el canal de un lado del canal. La guía de onda puede formar parte de la pared del canal o puede separarse físicamente de la cámara microfluídica. Como las partículas asimétricas en orientación aleatoria pasan el término de la guía de onda 9, son sometidas a una fuerza óptica que tiende a hacer que las partículas asimétricas se orienten con una orientación común y predeterminada. En la modalidad de la figura 2b, las partículas pasan tres guías de onda 9a - 9c en una serie, que acumulativamente orientan las partículas. La fuerza óptica de la primera guía de onda 9a puede causar que cada partícula comience a girar hacia una orientación deseada, mientras que la fuerza óptica de guías de onda posteriores 9b-9C continúe causando que la partícula se mueva a la orientación deseada. La figura 2a muestra una sola guía de onda que empalma el lado del canal y la figura 2b tres guías de onda que empalman el lado del canal pero modalidades alternativas pueden comprender dos o más de tres guías de onda, y las guías de onda pueden empalmar el canal desde arriba, abajo o desde cualquier lado.
Las guías de onda pueden ser fabricadas como parte del dispositivo (es decir, in si tu) o insertadas durante el montaje del dispositivo (es decir, componentes ópticos de fibra). Normalmente los guías de onda pueden aplicar fuerza óptica en un intervalo de longitud de onda óptica desde fuentes visibles a casi infrarrojas (500 nm - 2 pm), y fuentes de luz láser serán las fuentes de emisión de CW con potencias de salida de menos de 1 W/guía de onda, para minimizar las fuerzas ópticas aplicadas en cada interacción con la partícula. La emisión de la luz del láser puede ser controlada electrónicamente, para activar y desactivar según lo deseado para generar pulsos en la escala de tiempo de microsegundos a milisegundos.
Las figuras 3a-3b ilustran esquemáticamente modalidades para la orientación de partícula en la cual una sola guía de onda 10a - Figura 3a y múltiples guías de onda 10a - lOd - Figura 3b, se extienden a través del microcanal arriba o abajo del canal. La(s) guía(s) de onda se extienden por arriba, abajo o a lo largo de una pared lateral del microcanal para que las partículas pasen por las guías de onda, y al hacerlo así se someten a radiación que emana de las guías de onda y que aplica la presión del fotón para orientar las partículas descritas anteriormente. La radiación óptica puede ser suministrada a la(s) guía(s) de onda de lentes de acoplamiento 12 como se muestra.
Una ventaja de las modalidades de orientación basada en la guia de onda descrita anteriormente, sobre la orientación de la partícula mediante la presión hidrodinámica como comúnmente se utiliza en el esperma sexuado con citometría de flujo convencional por ejemplo, es que menos fuerza se aplica a las partículas tal como el esperma para orientarlos, así que existe una menor probabilidad de daño a la partícula durante o como un resultado de la orientación de la partícula. Esto puede ser particularmente para las modalidades de las figuras 2b y 3b que orientan las partículas mediante una serie de guías de onda secuencial cada aplicación de presión de radiación inferior que puede ser requerida para orientar las mismas partículas con presión de radiación de una sola guía de onda. Esto puede ser particularmente ventajoso para las partículas biológicas tal como esperma, y las células por ejemplo.
Las figuras 4a-4b muestran una modalidad para ordenar o intercambiar partículas seleccionadas para cambiar la dirección del movimiento en el flujo de fluido en el microcanal, en que las guías de onda múltiples lia - lie empalman el canal de un lado de (o por arriba o por abajo) del canal. Las figuras 5a-5b muestran una modalidad para la clasificación o intercambio de partículas seleccionadas para cambiar la dirección del movimiento en el flujo de fluido en el microcanal, en el cual las múltiples guías de onda se extienden a través del canal arriba, abajo o a lo largo del lado del canal. Después de la etapa de detección de fluorescencia 3 (Figura 1), en la etapa de intercambio 4 (Figura 1) cada partícula pasa una serie de guías de onda lia-lie que entran en el microcanal desde el lado de las figuras 4a y 4b, o 13a-13d que pasan abajo o arriba del microcanal en la modalidad de las figuras 5a-5b. Las guías de onda en las figuras 4a, 4b, 5a-5b pueden formar parte de la pared del canal o puedan separarse físicamente de la cámara microfluídica.
Haciendo referencia a las figuras 4a y 5a, cuando una partícula desea ser cambiada a una salida particular 6 o 7 pasa a través de la etapa de intercambio 5 (véase figura 1), la fuente de energía para cada una de las guías de onda lla-lle o 13a-13d es encendida. Conforme la partícula pasa la primera guía de onda, es desviada por la fuerza óptica, y además se desvía mientras pasa las guías de ondas posteriores. Todas las guías de onda pueden ser energizadas juntas, desde una fuente común de láser a través de lentes de acoplamiento 12 como se muestra en las figuras 5a-5b, por ejemplo, o en un movimiento de partícula del sistema de alta velocidad puede ser cronometrado con el intercambio de cada una de las guías de onda lla-lle o 13a-13d para que cada guía de onda sea energizada, uno tras otro, como la partícula seleccionada pasa cada guía de onda individual. El controlador 6 (véase figura 1) con entrada(s) de etapa de sincronización 4 (véase figura 1) las secuencias de energización del intercambio de guías de onda con el paso de la etapa de intercambio de las partículas seleccionadas. En la modalidad mostrada, existe un flujo laminar a través del canal y, haciendo referencia a las figuras 4a y 5a, las guías de onda cuando se energizan actúan para desviar las partículas seleccionadas por el flujo de un lado hacia la salida 7 a través de los límites de flujo y en el flujo hacia la salida 6. Cuando las guías de onda no están excitadas, no hay ninguna desviación de las partículas que por lo tanto, continúan moviéndose hacia la salida 7, como se muestra en las figuras 4b y 5b. En las modalidades en que se muestra el sistema se disponen para cambiar o clasificar las partículas para que cada partícula sea dirigida a una de dos salidas 6 y 7 pero en modalidades alternativas el sistema puede ser dispuesto para cambiar o clasificar las partículas entre más de dos salidas diferentes tal como tres o cuatro salidas por ejemplo. Por ejemplo las guías de onda cuando se energizan secuencialmente pueden desviar las partículas seleccionadas por el flujo en un lado a través de un primer limite de flujo y en un segundo flujo y luego a través de un segundo límite de flujo y en un tercer flujo hacia una tercera salida. El intercambio o clasificación puede basarse en características ternarias en lugar de binarias de las partículas por ejemplo. También en modalidades alternativas las guías de onda pueden funcionar para causar que las partículas seleccionadas sean desviadas para convertirse en un canal o canales diferentes en vez de volúmenes de colección por ejemplo.
La figura 6a muestra un chip microfluídico que incorpora una modalidad de la invención para llevar a cabo la orientación y la separación de esperma bovino. La muestra de esperma, con ADN ya manchado y enjuagado, entra en el chip en la muestra en, junto con dos flujos de fluidos de recubrimiento Sh. La muestra de esperma y flujos de cubierta se enfrían por una etapa de enfriamiento Peltier (no mostrada) debajo del chip, y se mantienen a baja temperatura durante el proceso de chip encendido. El esperma se enfoca en la región deseada del canal en la región de FF. Luego se orientaron en O usando la presión de radiación del banco de fibra FBI. En este ejemplo, el banco de fibra empalma con el canal del lado y cuatro fibras de modo único se muestran. Estas fibras transmiten la luz de un láser en el chip. Después de la orientación, la intensidad de fluorescencia de ADN del esperma es evaluada usando un UV LED L1 que ilumina la región de detección por debajo del chip. La fluorescencia se acopla fuera del canal usando una fibra de modo único SMF y se envía al detector de tubo fotomultiplicador PMT. La salida del detector de tubo fotomultiplicador PMT se utiliza para controlar el sistema de intercambio Sw. Si un esperma se selecciona para ser dirigido a un nuevo canal de salida, el láser envía la luz a través del segundo banco de fibra FB2 para mover el esperma en el canal a una nueva corriente de flujo. El esperma entonces fluye a través de un segundo gradiente térmico para elevar la temperatura de manera controlada a una temperatura deseada tal como la temperatura ambiente o del cuerpo - tenga en cuenta que la trayectoria serpenteante necesaria para el equilibrio térmico con el gradiente no se muestra para los canales de salida para mayor claridad. Los canales de salida también incluyen salidas de flujo para el fluido de cubierta y una corriente de residuos, así como para el esperma cromosómico X- y Y-. Una fuente de luz blanca L2 por debajo de los canales de salida induce la dispersión de las partículas que entran en los canales de salida individual. Esa dispersión se detecta usando un tercer banco de fibras FB3 para que el intercambio de esperma pueda ser detectado por los diodos PIN Si y enviados al controlador para conteo.
La figura 6b muestra cómo un conjunto de chips de clasificación individual pueden usarse para lograr clasificación a granel de muestras de esperma. Los electrónicos de control, fuentes de láser, sensores, impulsores para la etapa Peltier (T-control) y entrada de fluido a granel y flujo de entrada son externos al chip de clasificación. En este diagrama, se muestran sólo cuatro chips, para mayor claridad solamente.
Nuevamente una ventaja de las modalidades de intercambio de partícula basada en guía de onda descritas anteriormente, sobre el intercambio de partícula mediante presión hidrodinámica por ejemplo, es que menos fuerza se aplica a las partículas, y esto puede ser particularmente ventajoso para las partículas biológicas tal como un esperma y células por ejemplo. Así mientras una etapa de intercambio de partícula basada en guía de onda como se describe anteriormente puede ser precedida por una etapa de orientación de partícula basada en la presión hidrodinámica (si se requiere una etapa de orientación de partícula), y viceversa, una etapa de orientación de partícula basada en guía de onda como se describió anteriormente puede estar seguida de una etapa de intercambio de partícula hidrodinámica, en una modalidad preferida un sistema particularmente para la clasificación de partículas biológicas asimétricas tal como esperma puede comprender una etapa de orientación basada en la guía de onda dispuesta a orientar el esperma por presión de radiación, una etapa de detección tal como una etapa de detección basada en fluorescencia, y una etapa de intercambio basada en la guía de onda que utiliza fuerza óptica para dirigir separadamente el esperma masculino y femenino. El sistema tendrá también un sistema electrónico tal como un sistema de control basado en un microprocesador. La etapa de detección de fluorescencia 3 puede disponerse para irradiar el esperma previamente contactado o teñido con una tinta marcadora fluorescente que se une al ADN de cada espermatozoide, y comprende un detector para detectar la intensidad de la fluorescencia resultante. El esperma femenino absorbe una mayor cantidad de colorante que el esperma masculino, y por lo tanto la fluorescencia con mayor intensidad y permitiendo la discriminación.
Los sistemas que están comprendidos de solamente una sola guía de onda son restringidos en su velocidad de procesamiento por el impulso limitado (fuerza x tiempo) de la fuerza óptica sobre la partícula de interés. El tiempo de interacción es limitado por el tamaño físico de la guía de onda y la velocidad del flujo de las partículas. La fuerza de manipulación está limitada por el potencial de captura óptica de la guía de onda. Las fuerzas mayores conducen a completar la captura óptica, en que las partículas no son libres más grandes para moverse con el fluido circundante. Esto establece el uso típico de la manipulación de partícula de guía de onda única al procesamiento de bajo rendimiento, de alta precisión de partículas. Las modalidades de la orientación de guías de onda múltiples e intercambio, tal como se describe anteriormente ofrecen la ventaja de la aplicación continua de una fuerza óptica bien controlada por un tiempo prolongado sin la ocurrencia de captura óptica. Esto permite arbitrariamente alto rendimiento (velocidad de flujo de partículas) de partículas mediante la adición serial de fuerza óptica que produce guías de onda que incrementan el impulso aplicado a la partícula.
Un sistema microfluídico de la invención para la clasificación de esperma o las partículas puede tener por lo menos un microcanal con una sección de clasificación en que las partículas se procesan como se describió anteriormente, o matrices de dichas secciones de clasificación a aumentar el rendimiento. Los sistemas preferentemente están incorporados en un dispositivo microfluídico pequeño o chip preparado por micromecanizado, las téenicas de procesamiento de polímero u otras tecnologías de microfabricación para formar las estructuras microfluídicas, y comprende bombas de soporte, válvulas e instrumentación. Típicamente el (los) microcanal (es) pueden tener una anchura en el intervalo de 10 a 500 mieras, o de 100 a 400 mieras, y una profundidad en el intervalo de 5 a 250 mieras, por ejemplo. Las dimensiones de los canales de flujo microfluídico soportan el flujo laminar, con mínima turbulencia. En las modalidades descritas e ilustradas en las figuras, la microestructura tiene una forma planar con longitud en el plano y anchura mayor que la profundidad transversa al plano. En modalidades alternativas, la profundidad puede ser mayor que la longitud y/o la anchura del microcanal y reservorio y otras cavidades del microsistema. En modalidades alternativas, los microcanales pueden extenderse en tres direcciones, y pueden incluir segmentos curvados, así como unos ángulos. En las modalidades mostradas en las figuras las microcavidades tienen una sección transversal cuadrada o rectangular pero en modalidades alternativas las microestructuras pueden tener una sección transversal circular u oval, por ejemplo, o una sección transversal de otra forma.
Experimental La invención además se ilustra a modo de ejemplo por la siguiente descripción de simulación y trabajo de ensayos.
EJEMPLO 1 Se realizaron simulaciones usando el método de elemento finito (FEM) para aproximar la acción de fuerzas ópticas en partículas asimétricas. Específicamente, las fuerzas ópticas aplicadas a partículas elípticas situadas cerca de guías de onda tal como las descritas anteriormente se calculan. Las torsiones angulares de orientación se calculan y las fuerzas de captura/propulsivas también se calculan. Las aproximaciones bidimensionales (2D) de partículas elípticas (un cilindro) con un eje mayor: menor de 10 mm: 2 mm se colocaron en el término de la aproximación 2D de una única fibra óptica de modo óptico, una guía de onda de placa - figura 7a. La torsión resultante aplicada a dicha partícula elíptica como una función de su orientación con respecto al eje óptico de guía de onda se muestra en la figura 7b. La potencia de entrada aplicada en la guía de onda es 50mW. Los modos de guía de ondas paralelo polarizados (TM) y perpendicular a (TE) el plano de la simulación se muestra. La misma aproximación de partícula 2D se coloca sobre una aproximación 2D de una guía de onda rígida, como se muestra en la figura 8, y la torsión resultante como una función de orientación paralela al eje óptico de guía de onda se muestra en la figura 9. Ambos resultados muestran que la partícula está orientada (no tiene torsión aplicada) cuando su eje menor es paralelo al eje óptico de las guías de onda. Es decir, cuando está en la orientación vertical (ángulo = 90°). Además las gráficas muestran que la torsión es restaurar (en oposición a la dirección del movimiento) sobre este ángulo de orientación. Esta es la orientación de equilibrio de la partícula debido a las fuerzas ópticas aplicadas. La fuerza óptica resultante aplicada al cilindro elíptico anterior en el agua cuando en el término de una guía de onda se muestra en la figura 10. La fuerza óptica aplicada al mismo cilindro elíptico en agua cuando anteriormente de una guía de onda se muestra en la figura 11. Estas fuerzas ópticas se muestran separadas en dirección paralela a (Fx) y perpendicular a (Fy) los ejes ópticos de guía de onda por una variedad de separaciones de partícula/guía de onda para modos de guía de onda polarizada TM y TE. Las partículas están en la orientación vertical/equilibrio como se describió anteriormente.
EJEMPLO 2 Las imágenes de las figuras 12a-12c que muestran desplazamiento de partícula simétrica por un campo óptico como una partícula P se trasladó al extremo de un término de guía de onda W en un flujo de canal microfluídico rectangular amplio F de 100 mm se recolectaron con una imagen objetivo de microscopio lOx sobre un sensor de la cámara digital CMOS. La partícula es una perla esférica de poliestireno de IOmm de diámetro, y se muestra que fluye de arriba hacia abajo en la figura 12. La figura 12a muestra la partícula en el flujo de fluido antes de la guía de onda. La partícula interactuó con el haz óptico (250 mW de 532 nm acoplado a una fibra de modo único en > 50% de eficiencia) que diverge del término de guía de onda. Esta interacción genera la dispersión fuerte vista en la saturación de la imagen de la figura 12b. La fuerza óptica empujó la partícula por desplazamiento d como se muestra en la figura 12c sin detener el flujo de la partícula a lo largo del canal microf luídico.
EJEMPLO 3 La figura 13 ilustra los efectos de orientación del campo óptico en el término de una guía de onda W adyacente a la pared de un canal microf luídico . Una partícula P con una forma asimétrica específicamente de un espermatozoide bovinos, se lleva en un flujo de fluido de arriba hacia abajo en un flujo de fluido F en un canal microf luídico. La partícula es inerte e incapaz de moverse bajo su propia propulsión. Como se muestra en la figura 13a los espermatozoides inicialmente presentan una orientación de dispersión oscura para el sistema de imagen. Después de pasar a través de e interactuar con el campo óptico en el término de la guía de onda óptica (resumido en la figura 13) los espermatozoides continuaron fluyendo por el canal microfluídico con una nueva orientación y un desplazamiento de su posición inicial. La partícula se mueve lejos de la pared del canal después de la interacción y gira a una nueva orientación, pero continúa fluyendo por el canal. La nueva orientación de los espermatozoides presenta una cabeza blanca, indicando una rotación de 90 grados alrededor del eje largo de la partícula después de interactuar con el campo óptico.
Múltiples eventos de interacción tal como aquellos observados en la figura 12 y figura 13 se analizan cuadro por cuadro y los resultados se presentan en la figura 14. El procesamiento de imágenes se utilizó para medir la posición de la partícula y la orientación antes y después de interactuar con el campo óptico. La figura 14 muestra la eficiencia de desplazamiento medida como una función de la velocidad de flujo de partícula para partículas simétricas es decir una perla de poliestireno de IOmm de diámetro - figura 14a, y las partículas asimétricas es decir espermatozoides bovinos no móviles - figura 14b. Por ejemplo estas partículas que fluyen más allá del término de una sola guía de onda con menos de 200 W de potencia de salida en una longitud de onda de 532nm. El desplazamiento indica la distancia desde la terminación de la fibra al borde del canal microfluídico .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1.- Un sistema para la clasificación de las partículas en un sistema microfluídico, caracterizado porque incluye: • una etapa de detección dispuesta para detectar al menos una diferencia o discriminar entre las partículas en el flujo de fluido más allá de la etapa de detección, y • una o más fuentes de presión de radiación más allá de que las partículas se muevan secuencialmente y un controlador dispuesto para cambiar basado en una entrada de la etapa de detección o de discriminación, la energía de radiación en una o más fuentes de presión de radiación para causar un cambio en la dirección de movimiento de las partículas seleccionadas en el flujo de fluido para clasificar las partículas.
2.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque está dispuesto a intercambiar o clasificar las partículas para que cada partícula sea dirigida en una o dos diferentes entradas.
3.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la(s) fuente(s) de presión de radiación comprende(n) fuente(s) de presión óptica.
4.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la(s) fuente(s) de presión de radiación comprende(n) una o más guías de onda que se extienden a través de un canal del sistema microfluídico.
5.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la etapa de detección comprende una etapa de detección óptica.
6.- Un sistema de orientación de las partículas en un sistema microfluídico, caracterizado porque incluye una o más fuentes de presión de radiación dispuestas para exponer las partículas asimétricas en el sistema microfluídico a la presión de radiación que causa al menos una mayoría de las partículas para adoptar una orientación particular en el fluido.
7.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es implementado en un chip microfluídico.
8.- Un sistema microfluídico para esperma sexuado caracterizado porque incluye: • una o más fuentes de presión de radiación de orientación dispuestas para exponer esperma a presión para causar que el esperma individual adopte una orientación común en el fluido • una etapa de detección basada en fluorescencia dispuesta para discriminar el esperma masculino y femenino en el flujo de fluido más allá de la etapa de detección, y • una o más fuentes de presión de radiación de intercambio s más allá de la cual el esperma individual posteriormente se mueva, y • un controlador dispuesto para recibir una entrada de la etapa de detección y para controlar la energía de radiación en una o más fuentes de presión de radiación de intercambio para dirigir separadamente el esperma masculino y/o femenino.
9.- Un método de clasificación de las partículas en un sistema icrofluídico, caracterizado porque incluye: • detectar por lo menos una diferencia o discriminación entre las partículas, y • intercambio basado en una entrada de la detección o discriminación, una o más fuentes de presión de radiación más allá de que las partículas se muevan secuencialmente para causar un cambio en la dirección de movimiento de las partículas seleccionadas en el flujo de fluido para clasificar las partículas.
10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las partículas son esperma.
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