ES2230877T3 - Microdissection precision laser capture using short pulse length. - Google Patents

Microdissection precision laser capture using short pulse length.

Info

Publication number
ES2230877T3
ES2230877T3 ES99937605T ES99937605T ES2230877T3 ES 2230877 T3 ES2230877 T3 ES 2230877T3 ES 99937605 T ES99937605 T ES 99937605T ES 99937605 T ES99937605 T ES 99937605T ES 2230877 T3 ES2230877 T3 ES 2230877T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sample
transfer film
material
transfer
film
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES99937605T
Other languages
Spanish (es)
Inventor
Robert F. Bonner
Seth R. Goldstein
Thomas Pohida
Paul D. Smith
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
US Department of Health and Human Services (HHS)
Original Assignee
US Department of Health and Human Services (HHS)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US9487198P priority Critical
Priority to US94871P priority
Application filed by US Department of Health and Human Services (HHS) filed Critical US Department of Health and Human Services (HHS)
Application granted granted Critical
Publication of ES2230877T3 publication Critical patent/ES2230877T3/en
Application status is Active legal-status Critical
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/2813Producing thin layers of samples on a substrate, e.g. smearing, spinning-on
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/2813Producing thin layers of samples on a substrate, e.g. smearing, spinning-on
    • G01N2001/2833Collecting samples on a sticky, tacky, adhesive surface
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/2813Producing thin layers of samples on a substrate, e.g. smearing, spinning-on
    • G01N2001/2833Collecting samples on a sticky, tacky, adhesive surface
    • G01N2001/284Collecting samples on a sticky, tacky, adhesive surface using local activation of adhesive, i.e. Laser Capture Microdissection

Abstract

Procedimiento para la extracción directa de material de una muestra, que comprende las etapas siguientes: provisión de una muestra; Process for the direct extraction of material from a sample, comprising the following steps: providing a sample; provisión de una película de transferencia que, sólo tras ser activada en zonas seleccionadas, presenta la propiedad de proporcionar a las zonas seleccionadas la capacidad de adherirse a la muestra; providing a transfer film which only after being enabled in selected areas, has the property of providing selected areas the ability to adhere to the sample; yuxtaposición de la muestra a la película de transferencia; juxtaposing the sample to the transfer film; identificación de por lo menos una parte del material para extraerla de la muestra; identification of at least part of the material to remove it from the sample; enfoque del haz de radiación pulsada, de un diámetro de haz preseleccionado y una longitud de pulso preseleccionada, sobre la película de transferencia para activar un volumen de la película de transferencia adyacente a la muestra y adherirlo a por lo menos una parte del material que se va a extraer de la muestra; approach pulsed radiation beam, of a diameter of preselected beam and a length of preselected pulse on the transfer film to activate a volume of the film adjacent to the sample transfer and adhere to at least a portion of the material will extract the sample; observación de la interfase óptica entre la muestra y la película de transferencia durante la etapa de enfoque para comprobar que dicha parte por lo menos del material de la muestra se adhiera a la película de transferencia, y el alcance espacial de la unión en el plano de la imagen, y separación de la película de transferencia de la muestra mientras se mantiene la adhesión entre la película de transferencia y dicha parte por lo menos de material de la muestra, para desprender de ese modo dicha parte por lo menos de material de la muestra de la parte restante de la muestra; observing the optical interface between the sample and the transfer film during the stage of approach to verify that said at least part of the material of the sample adheres to the transfer film and the spatial extent of binding in the plane image, and separating the transfer film from the sample while the adhesion between the transfer film and said portion is maintained at least the sample material to loosen thereby that at least part of the sample material the remaining portion of the sample; en el que la película de transferencia se separa un pequeño intervalo espacial de la muestra y en el que el haz de radiación pulsada, de un diámetro de haz preseleccionado y una longitud de pulso preseleccionada, se enfoca sobre la película de transferencia para activar un volumen de la película de transferencia adyacente a la muestra, lo cual determina que dicho volumen se expanda y abarque el pequeño intervalo espacial para adherirse a dicha parte por lo menos del material que se va a extraer de la muestra. wherein the transfer film is separated a small spatial sample interval and wherein the pulsed radiation beam, of a diameter of preselected beam and a length of preselected pulse is focused onto the transfer film to activate a volume film adjacent the sample transfer, which determines that the volume expands and covers the small spatial interval for adhering to said at least part of the material to be extracted from the sample.

Description

Microdisección de precisión por captura con láser utilizando longitud de pulso corta. Microdissection precision laser capture using short pulse length.

Campo de la invención Field of the Invention

La presente invención se refiere a la microdisección por captura con láser, técnica en la que se visualiza un espécimen mediante un microscopio y en la que a continuación se recubre el espécimen con una capa de material de transferencia que, una vez activado mediante un láser, se adhiere a los elementos de destino concretos de la muestra desprendiéndolos de ésta para su ulterior procesamiento. The present invention relates to capture microdissection laser technique in which a specimen is viewed through a microscope and in which then the specimen is coated with a layer of transfer material which when activated by a laser, it adheres to the elements of the specific target sample detaching it for further processing. Más particularmente, la presente exposición se centra en la extracción de muestras de igual tamaño o más pequeñas que el haz del láser de activación. More particularly, the present disclosure focuses on the sampling of equal size or smaller than the laser beam activation. El objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento y un aparato para la microdisección fiable de objetivos situados dentro de un tejido u otras muestras de espécimen, de un tamaño inferior a 10 micras de diámetro, aproximadamente. The object of the present invention to provide a method and apparatus for reliable microdissection of targets within a tissue or other specimen samples, of a size less than 10 microns in diameter, approximately.

Antecedentes de la invención BACKGROUND OF THE INVENTION

En el documento WO 97/13838, titulado "Isolation of Cellular Material Under Microscopic Visualization" y publicado el 17 de abril de 1997, en la página 20, línea 24, se afirma lo siguiente: In WO 97/13838, entitled "Isolation of Cellular Material Under Microscopic Visualization" and published on April 17, 1997, on page 20, line 24, which states:

El tamaño del tejido transferido, dependiendo de las necesidades del técnico, puede variarse cambiando el diámetro del haz del láser y la duración del pulso. The size of the tissue transferred, depending on the needs of the technician, can be varied by changing the diameter of the laser beam and pulse duration. Pueden realizarse con facilidad transferencias altamente reproducibles en el rango de 60 a 700 \mum de diámetro para la obtención de lesiones pequeñas (de 100 \mum a 1 mm) sin invasión de las células no-neoplásicas adyacentes. They can be easily performed highly reproducible transfers in the range of 60 to 700 \ mum diameter for obtaining small lesions (100 \ mum 1 mm) without invasion of adjacent non-neoplastic cells. En la mayoría de estudios de investigación básicos y clínicos, es necesario obtener entre varias centenas y varios millares de células para proporcionar suficiente material genético y llevar a cabo una amplificación fiable y un análisis estadísticamente significativo. In most studies of basic and clinical research, it is necessary to obtain between several hundred and several thousand cells to provide enough genetic material and carry out a reliable amplification and statistically significant analysis. Sin embargo, puesto que los haces de láser pueden enfocarse en un área inferior a un diámetro celular, se considera que las transferencias de células individuales específicas o incluso de partes de éstas son posibles según el procedimiento de la invención . However, since the laser beams can focus on a smaller area to a cell diameter, it is considered that the transfer of specific individual cells or even parts thereof are possible according to the process of the invention.

En la presente solicitud, se expone la solución para la transferencia "considerada posible" mencionada más arriba. In the present application, the transfer solution is exposed "considered possible" mentioned above.

Aunque en las primeras patentes de microdisección se describe un sustrato rígido inerte al que se aplica el polímero termoplástico que puede utilizarse como placa de presión, en la implementación original de la LCM (microdisección por captura con láser) se emplea una película independiente que se aplica a la superficie del tejido, empujando suavemente la película contra la muestra. Although an inert rigid substrate to which the thermoplastic polymer can be used as pressure plate, the original implementation of LCM (capture microdissection laser) is applied as described in the first patents microdissection a separate film that is applied is used to the tissue surface by gently pressing the film against the sample. A continuación, la película colocada sobre la sección del tejido deseada se calienta mediante un haz de 100 micras de diámetro y se funde mediante impulsos de láser de CO_{2}. Then, the film placed over the desired tissue section is heated by a beam 100 microns in diameter and melted by laser pulses {2} CO. La longitud de pulso láser elegida (entre 100 ms y 630 ms) permite que la película irradiada aumente hasta una temperatura de estado estacionario durante un tiempo suficientemente prolongado, para que el polímero fluya dentro del tejido y forme una unión fuerte llenando los espacios vacíos de la muestra desecada. The length chosen laser pulse (between 100 ms and 630 ms) allow the irradiated film to increase to a steady state temperature for a sufficiently long time for the polymer to flow into the tissue and form a strong bond filling the empty spaces the dried sample. Los pulsos de 630 ms utilizados habitualmente con este sistema se eligen con esta duración a propósito, para asegurar que el polímero fundido (que permanece fundido hasta el final del impulso) disponga de suficiente tiempo, tras alcanzar la temperatura de estado estacionario, para fluir de forma fiable dentro del tejido durante el impulso láser. Pulses of 630 ms commonly used with this system are selected this time on purpose to ensure that the molten polymer (which remains molten until the end of the pulse) has enough time, after reaching a temperature steady-state, to flow reliably within the tissue during the laser pulse. En un ensayo posterior, se ha demostrado la posibilidad de efectuar transferencias equivalentes con este sistema y pulsos de 100 ms, aunque debido a la separación irregular entre la superficie del polímero y el tejido, la transferencia con pulsos de 100 ms es menos reproducible que con los impulsos más largos. In a subsequent trial, it demonstrated the possibility of equivalent transfers this system and pulses of 100 ms, although because of irregular spacing between the polymer surface and the tissue, transfer with pulses of 100 ms is less reproducible than with the longer pulses. Cuando se utiliza este sistema LCM, el objetivo consiste en calentar la superficie inferior del polímero un poco por encima del punto de fusión. When this system is used LCM, the purpose is to heat the lower surface of the polymer a little above the melting point. Los niveles de energía suministrados por el láser de CO_{2} se mantienen dentro de un factor de dos de la energía umbral necesaria (rango de 25 a 50 mW suministrado a un punto de 100 \mum de una película de polímero EVA de 100 \mum de grosor). Energy levels supplied by the laser CO {2} are maintained within a factor of two of the threshold power required (range 25 to 50 mW delivered to a point 100 \ mum a polymer film EVA 100 \ mum thick). Por lo tanto, el tejido capturado mediante el polímero fundido se expone habitualmente a temperaturas máximas de \sim90 a 100ºC durante \sim500 ms. Therefore, the captured tissue by the molten polymer is typically exposed to peak temperatures of \ sim90 at 100 for \ sim500 ms. Cuando se utiliza este procedimiento, no se observan daños al DNA, al RNA ni a las proteínas de la muestra capturada en el posterior análisis molecular. When this procedure is used, no damage to DNA, RNA or the protein of the sample captured in the subsequent molecular analysis observed.

En la LCM, se evitan los pulsos cortos para asegurar una fuerza de unión adecuada. In the LCM, short pulses are avoided to ensure adequate bond strength. Las informaciones proporcionadas por una serie de fabricantes de adhesivos termoplásticos basados en EVA (por ejemplo, cola caliente) sugieren que la utilización de adhesivos de EVA requiere mantener las junturas fundidas bajo presión durante más de un segundo. The information provided by a number of manufacturers of EVA-based thermoplastic adhesives (e.g., hot glue) suggested that using EVA adhesives required maintaining molten joints under pressure for more than one second. En los diseños de LCM por láser de CO_{2} originales, la utilización de una placa de presión (transparente y no absorbente de luz láser y luz visible) no resulta práctica, debido a la escasez y al coste de los materiales que transmiten longitudes de onda de láser de CO_{2} (9 a 11 \mum). In designs LCM laser CO {2} originals, using a pressure plate (transparent and non absorbing of the laser and visible light) is not practical, due to the scarcity and cost of materials that transmit lengths laser wavelengths of CO {2} (9 to 11 \ mum). Posteriormente, la introducción de colorantes altamente absorbentes de infrarrojos cercanos (\sim0,8 \mum) solubles en los polímeros termoplásticos ha permitido que la película de transferencia se funda focalmente mediante los diodos láser de pulsos infrarrojos (\sim0,8 \mum), que se enfocan con facilidad a través de sustratos transparentes sobre diámetros pequeños de un tamaño inferior a 10 \mum de la película termoplástica absorbente. Then, the introduction of soluble thermoplastic polymers highly near infrared absorbing dyes (\ sim0,8 \ mum) has allowed the transfer film rests focally by infrared laser diodes pulses (\ sim0,8 \ mum), They are focusing easily through transparent substrates on small diameters smaller than 10 \ mum of the absorbing thermoplastic film.

La solicitud internacional WO98/35216, que fue publicada el 13 de agosto de 1998 y reivindica una fecha de prioridad de 7 de febrero de 1997, forma parte del estado de la técnica únicamente en relación con el Artículo 54(3) CPE. The international application WO98 / 35216, which was published on 13 August 1998 and claiming a priority date of 7 February 1997, forms part of the state of the art solely in connection with Article 54 (3) EPC. Este documento da a conocer un procedimiento de LCM, en el que la película de transferencia está separada de la muestra por un pequeño intervalo de espacio, pero no describe la etapa de observación de la interfase óptica entre la muestra y la película de transferencia durante el procedimiento de irradiación. This document discloses a method of LCM in which the transfer film is separated from the sample by a small interval of space, but does not describe the step of observing the optical interface between the sample and the transfer film during the irradiation method.

Sumario de la invención SUMMARY OF THE INVENTION

La presente invención se refiere a un procedimiento para la extracción directa de material de una muestra según la reivindicación 1. The present invention relates to a process for the direct extraction of material from a sample according to claim 1.

La microdisección por captura con láser tiene lugar cuando la película de polímero de transferencia se coloca sobre un sustrato que cubre el material celular visualizado y seleccionado que se va a extraer de una muestra. The laser capture microdissection occurs when the polymer film is placed on a transfer substrate that covers the selected cell material displayed and to be extracted from a sample. La película de polímero de transferencia se activa focalmente (se funde) con un pulso suficientemente corto como para permitir que el volumen fundido quede confinado al polímero directamente irradiado. The polymer film is focally activated transfer (melts) with a sufficiently short pulse to allow the melted volume is confined to the polymer directly irradiated. La presente invención utiliza pulsos breves para reducir la difusión térmica hacia el polímero no irradiado circundante, impidiendo de ese modo que éste se caliente hasta fundirse y proporcionando al mismo tiempo suficiente calor por absorción directa para el pequeño volumen focal directamente irradiado por el haz de láser enfocado. The present invention uses brief pulses to reduce the thermal diffusion into the polymer unirradiated surrounding, thereby preventing it to warm to melt and while providing sufficient heat by direct absorption for the small focal volume directly irradiated by the laser beam in focus. Este procedimiento puede utilizarse tanto en la LCM descrita anteriormente como en la LCM sin contacto, ya sea empleando radiación del lado del condensador (el haz pasa a través del polímero antes de pasar por el tejido) o epirradiación (el láser pasa a través del tejido antes de pasar por el polímero). This procedure can be used in the LCM described above as the LCM contactless either using radiation condenser side (the beam passes through polymer before passing through the tissue) or epi-irradiation (laser passes through tissue before passing through the polymer). El procedimiento puede utilizarse en configuraciones en las que el láser pasa a través del tejido antes de pasar por el polímero, con y sin un sustrato inerte adicional. The process may be used in configurations in which the laser passes through tissue before passing through the polymer, with and without an additional inert substrate. En la configuración preferida, se emplea el confinamiento inerte o elástico del polímero termoplástico circundante no fundido (y el sustrato unido superpuesto) para forzar la expansión del polímero fundido hacia el interior del tejido subyacente deseado. In the preferred embodiment, the inert or elastic confinement of the surrounding thermoplastic polymer unfused (and the overlying attached substrate) is used to force the expansion of the melt into the underlying tissue desired polymer. Mediante el protocolo de pulso corto, el material enfocado y extraído puede tener un diámetro igual o inferior al del haz excitador, aunque se esté cerca de los límites de difracción óptica. By short pulse protocol, the targeted and extracted material can have a diameter equal to or less than the excitation beam, though it is near the limits of optical diffraction.

Para mejorar todavía más la precisión y la localización, pueden aplicarse una serie de pulsos cortos "subumbrales" a los mismos puntos oa puntos inmediatamente adyacentes para entrar en contacto sólo con objetivos concretos dentro del haz del láser (por ejemplo, un objetivo inferior al diámetro del haz del láser situado en el centro del pulso láser). To improve accuracy and location even more, may apply a series of short pulses "subthreshold" to the same points or points immediately adjacent to contact only specific targets within the laser beam (for example, a lower target diameter laser beam located in the center of the laser pulse). En este caso, se saca provecho del hecho de que cuando un volumen de polímero se funde de arriba abajo en la película termoplástica absorbente por la acción de un pulso láser, éste experimenta una expansión volumétrica proporcional en la dirección del tejido. In this case, advantage of the fact that when a volume of polymer is melted from top to bottom in the absorbent thermoplastic film by the action of a laser pulse, it experiences a proportional volumetric expansion in the direction of tissue is removed. Este volumen de expansión del polímero puede hacerse coincidir con el volumen del objetivo deseado, incluyendo el volumen de separación inicial entre el polímero y el objetivo, ya sea mediante cálculo aproximado de los parámetros de pulso medio necesarios para llevar a cabo la captura con un solo pulso, o bien mediante un pulso láser que es aproximadamente la mitad del necesario para la captura con un solo impulso y aplicando una serie de pulsos hasta que se consigue la unión con el objetivo. This volume of polymer expansion can be matched to the volume of the desired target including the initial volume of separation between the polymer and the target either by estimate parameters mean pulse necessary to perform capturing with one pulse, or by a laser pulse that is about half the need for capture with a single pulse and applying a series of pulses until the connection is achieved with the objective.

El objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento que permita una zona de transferencia LCM reproducible inferior a 20 micras, con la máxima precisión y eficacia y la mínima duración de transitorios térmicos en la muestra de destino, ocasionados por el contacto con el polímero termoplástico fundido durante el pulso láser y, posteriormente, hasta que se enfría. The aim of the present invention to provide a method allowing an area of ​​LCM transfer less than 20 microns reproducible, with maximum accuracy and effectiveness and minimum duration of thermal transients in the target sample, caused by contact with the thermoplastic polymer melted during the laser pulse and subsequently until it cools. Se ha comprobado que un procedimiento fiable para obtener tamaños de punto de transferencia más pequeños (inferiores a 10 micras de diámetro) incluye la reducción de la anchura del pulso láser a menos de 1 ms y el ajuste de la potencia máxima del láser. It has been found that a reliable method for sizes smaller transfer point (less than 10 microns in diameter) includes reducing the width of the laser pulse less than 1 ms and adjusting the maximum laser power. Estas anchuras de pulso y potencias reducen al mínimo los daños a las macromoléculas de la muestra de tejido. These pulse widths and powers minimize damage to the macromolecules of the tissue sample.

Se ha comprobado, en el momento de presentar la presente solicitud, que el contacto y la adherencia del material activable con la muestra crea un fenómeno perceptible. It has been found, at the time of filing this application, that the contact and adhesion of the activatable material to the sample creates a noticeable phenomenon. En realidad, el usuario puede percibir la adherencia deseada con la muestra mientras ajusta la longitud del pulso y la potencia para dilatar, contraer e incluso conformar las áreas de adhesión. Actually, the user can perceive the desired adherence to the sample while adjusting pulse length and power to expand, contract, and even shape the areas of adhesion.

Breve descripción de los dibujos BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

La Figura 1A es un esquema de microdisección por captura con láser, en el que la luz del láser de activación pasa a través del lado del condensador de un microscopio para la microdisección del tejido seleccionado. Figure 1A is a schematic of laser capture microdissection in which the activating laser light passes through the condenser side of a microscope for the microdissection of selected tissue.

La Figura 1B es un detalle del emplazamiento de la LCM que ilustra el haz de excitación del láser y la capacidad de excitación de un área inferior al haz para aplicar con mayor precisión la LCM de contacto al tejido seleccionado. 1B is a detail of the site of the LCM illustrating the laser excitation beam and the excitation capacity of a lower area to the beam to more accurately apply LCM contact the selected tissue.

La Figura 2A es un esquema de LCM sin contacto, en la que se utiliza epirradiación (el láser pasa a través del tejido antes de pasar por el polímero) para que la película activada se extienda hasta el tejido seleccionado a través de un espacio. 2A is a schematic LCM contactless wherein epi-irradiation is used (the laser passes through tissue before passing through the polymer) for the activated film extends to the selected tissue across a gap.

La Figura 2B es un detalle del emplazamiento de la LCM que ilustra el haz de excitación del láser y la capacidad de excitación de un área inferior al haz para aplicar con mayor precisión la LCM sin contacto al tejido seleccionado. Figure 2B is a detail of the site of the LCM illustrating the laser excitation beam and the excitation capacity of a lower area to the beam to apply to more accurately contact the selected LCM without tissue.

La Figura 3 es una vista de una capa de EVA (etileno-acetato de vinilo), en la que se muestra un haz pasando a través de la capa. Figure 3 is a view of a layer of EVA (ethylene-vinylacetate), in which a beam is shown passing through the layer.

Las Figuras 4A a 4E son perfiles radiales sucesivos del EVA de la Figura 3, que ilustran cómo la expansión de los perfiles radiales sobrepasa la dimensión de los haces con el aumento de la duración de la radiación, y cómo incrementa el intervalo del contorno con el incremento de la potencia del haz del láser, sobrentendiéndose que se muestran los contornos de 25ºC de un haz de láser de 20 mW (un haz de 40 mW generaría un contorno de 50ºC de idéntica forma). 4A to 4E are radial profiles successive EVA of Figure 3 illustrating how the expansion of the radial profiles beyond the dimension of the beams with increasing duration of radiation, and how increases the contour interval with increasing the power of the laser beam, it being understood that the contours 25 of a laser beam of 20 mW (40 mW beam would generate a contour 50 identically) is.

Descripción detallada de las realizaciones concretas Detailed description of the specific embodiments

En relación con la Figura 1A, se ilustra una LCM de contacto convencional. In relation to Figure 1A, there is illustrated a conventional contact LCM. En la Figura 1A, el observador representado por el ojo E visualiza el espécimen S del portaobjetos P a través del microscopio M (representado de forma esquemática). In Figure 1A, the observer represented by the eye E visualizes specimen S on slide P through microscope M (schematically shown). La iluminación del espécimen S se proporciona a través de la lámpara incandescente del microscopio L y del espejo dicroico D. La iluminación pasa a través de un soporte transparente B (que puede ser una capa no absorbente inerte de material rígido o de material fuerte aunque flexible, tal como una película de poliéster, formando el primer tipo de material un elemento de transferencia rígido y el segundo, en combinación con la capa T, una cinta más flexible de 2 o más capas) y una capa de transferencia transparente T. The illumination of the specimen S is provided through the incandescent lamp microscope L and dichroic mirror D. Illumination passes through a transparent support B (which may be a non-absorbent inert material layer or rigid strong yet flexible material as a polyester film, forming the first type of material a rigid transfer and the second, in combination with the T layer, a more flexible tape of 2 or more layers) and a layer of transparent transfer T.

La capa de transferencia T suele ser un polímero termoplástico de bajo punto de fusión con un gran incremento de volumen asociado a la transición de fase sólida a fase líquida (p.ej., etileno-acetato de vinilo) que puede teñirse (p.ej., a las longitudes de onda de los infrarrojos cercanos invisibles al ojo humano) para acoplarse a la radiación 16 del láser Z de una frecuencia concreta. The transfer layer T is typically a thermoplastic polymer low melting point with a large volume increase associated with the transition from liquid phase to solid phase (eg, ethylene-vinyl acetate) dyeable (eg ., at wavelengths of near-infrared invisible to human eyes) for engaging the radiation 16 of the laser Z of a specific frequency. Cuando se determina a qué parte del espécimen S debe aplicarse la LCM, el láser Z se activa y entonces la capa de transferencia T se activa para adherirse al espécimen S del tejido seleccionado. When it is determined which part of the specimen S should apply the LCM, laser Z is activated and then the transfer layer T activated to adhere to specimen S of the selected tissue. La luz 16 del láser Z pasa a través de la lente 14, incide en el espejo dicroico D ya continuación pasa a través de la placa de soporte transparente B para incidir en la capa de transferencia T. Light 16 laser Z passes through lens 14, impinges on the dichroic mirror D and then passes through the transparent support plate B to influence the transfer layer T.

En la Figura 1B, se ilustra un detalle de la LCM de contacto ilustrada. In Figure 1B, a detail of the illustrated contact LCM is illustrated. El haz de láser 16 representado pasa a través el soporte transparente B y penetra en la capa de transferencia T (que absorbe el haz pero no la luz visible). The laser beam 16 passes through the depicted transparent support B and into the transfer layer T (which absorbs the beam but not visible light). La capa de transferencia T representada está en contacto con el espécimen S. En relación con las Figuras 4A a 4E, se sobrentenderá que es posible excitar un área de la capa de transferencia T más pequeña que el área total expuesta de ésta. The transfer layer T is shown in contact with the specimen S. In relation to Figures 4A to 4E, it will be understood that it is possible to excite an area of ​​the transfer layer T smaller than the total exposed area thereof. Por consiguiente, la columna de adherencia C representada se prolonga hasta el interior del espécimen S para extraer el grupo de células seleccionadas G que puede constar sólo de una célula. Accordingly, column C bond represented extends to the interior of the specimen S to extract selected cell group G which can contain only one cell.

Como se sobrentenderá, el soporte transparente B de esta LCM tiene una función. As will be understood, the transparent support of this LCM B has a function. En particular, y mediante el apoyo que proporciona a la capa de transferencia T, la placa de soporte transparente B forma un sustrato subyacente suficientemente fuerte como para resistir la expansión del polímero termoplástico fundido. In particular, and by supporting providing the transfer layer T, transparent backing plate B forms a strong enough to resist expansion of the molten thermoplastic polymer underlying substrate. Este sustrato subyacente combinado con el confinamiento inercial o elástico del material inactivado circundante de la capa de transferencia T obliga al polímero fundido a fluir en la dirección de la muestra de tejido. This underlying substrate combined with the inertial or elastic confinement of the surrounding inactivated material of transfer layer T forces the molten flow in the direction of the tissue sample polymer. Los requisitos preferidos para el sustrato subyacente son: 1) que sea transparente tanto a la luz visible necesaria para la visualización microscópica como a la luz láser infrarroja utilizada para activar el polímero termoplástico, 2) que tenga un punto de fusión suficientemente alto para que el calor del polímero termoplástico absorbente de láser adyacente fundido no provoque su fusión y 3) que sea suficientemente rígido para que no se deforme apreciablemente a las presiones ocasionadas por la expansión del polímero termoplástico adyacente activado por el láser (es decir, se comporte como un cuerpo rígido frente a dichas fuerzas transitorias). Preferred for the underlying substrate requirements are 1) that is transparent to both visible light required for microscopic visualization and the infrared laser light used to activate the thermoplastic polymer, 2) has a melting point high enough that the heat absorbing thermoplastic polymer laser adjacent melt does not cause melting and 3) is sufficiently rigid so that it does not appreciably deform the pressures caused by the expansion of the thermoplastic polymer adjacent activated by the laser (ie, it behaves as a body rigid against such transient forces).

Hasta aquí, la descripción general del tipo de LCM de contacto. So far, the general description of the type of contact LCM. El tipo de LCM sin contacto puede ilustrarse mediante las Figuras 2A y 2B. The LCM non-contact type may be illustrated by Figures 2A and 2B.

La Figura 2A es en esencia igual a la Figura 1A, con la excepción de que la radiación utilizada es la denominada epirradiación. 2A is essentially the same as Figure 1A, with the exception that the radiation used is called epi-irradiation. En consecuencia, como se observará, el láser Z se sitúa por debajo del portaobjetos P. Accordingly, as will be seen, the laser Z is below slide P. of

En relación con la Figura 2B, se observará que el haz del láser 16 asciende, a través del portaobjetos P, hasta la muestra S y el intervalo espacial 20. A continuación, el haz del láser 16 se introduce en la capa de activación T para activarla. In connection with Figure 2B it will be seen that the laser beam 16 ascends through slide P, to the sample S and spatial interval 20. Thereafter, the laser beam 16 is introduced into the activating layer T to activate it. Como se describirá, la columna de adherencia C atraviesa este intervalo espacial 20 y de nuevo se fija al material seleccionado G. También esta vez, la fijación al material seleccionado G consiste en una columna que presenta un diámetro inferior al diámetro real del haz. As will be described, the adhesion column C through this spatial interval 20 and again is fixed to selected material G. Also this time, setting the selected material G consists of a column having a diameter less than the actual beam diameter. Por lo tanto, mediante las técnicas descritas más adelante, es posible "enfocar" el material activado en relación con el haz del láser 16 para que ocupe en realidad un área (o un diámetro de destino de transferencia) inferior a la del haz del láser (diámetro), aun cuando se reduzca el diámetro del haz por debajo de 10 \mum. Therefore, using the techniques described below, it is possible to "focus" activated material relative to the laser beam 16 to fill actually an area (or a diameter of the transfer destination) below the laser beam (diameter), even when the beam diameter is reduced below 10 \ mum.

En relación con la Figura 3, se representa un modelo térmico de los contornos de temperatura del polímero (EVA) que compone la capa de transferencia T. Se observará que la capa de transferencia T superpuesta es la placa de soporte transparente B y que la capa de transferencia subyacente T es el portaobjetos de vidrio P con el espécimen S. El diámetro del haz es de 30 \mum. Regarding Figure 3, a thermal model of temperature contours polymer (EVA) which comprises the transfer layer T. It will be noted that the transfer layer superposed T is the transparent plate support B represents and the layer underlying transfer T is glass slide P with specimen S. beam diameter is 30 \ mum.

Con referencia al área oscurecida representada en la que se indica que el polímero está fundido, puede efectuarse una deducción importante. With reference to the shaded area shown in which indicates that the polymer is molten, it can be effected a significant deduction. El lector comprenderá que antes que la película fundida y el espécimen entren en contacto en la parte seleccionada, existe una interfase de aire entre el espécimen y la película. The reader will understand that before the molten film and the specimen into contact in the selected portion, an air interface exists between the specimen and film. La interfase aire-muestra normalmente es una superficie muy irregular con una gran diferencia de índices de refracción, lo cual provoca una gran dispersión de la luz incidente en la muestra. The air-sample is normally a highly irregular surface with a large refractive index difference, causing a scattering of incident light in the sample.

Cuando se produce el contacto y la adhesión del polímero termoplástico fundido con la muestra, la diferencia de índices de refracción se reduce mucho (los índices de refracción del polímero y la muestra son mucho más parecidos entre sí que los índices de cualquiera de éstos y el aire), y en consecuencia se observa un cambio claramente visible en la imagen de transmisión de la muestra en el punto de contacto. When contact and adhesion of molten thermoplastic polymer to the sample occurs, the difference in refractive index is greatly reduced (the refractive indices of the polymer and the sample are more similar to each other that the indices of any of these and air) and consequently a clearly visible change is observed in the transmission image of the sample at the point of contact. En concreto, la dispersión disminuye y la parte contactada y adherida del espécimen se ve más "brillante". Specifically, the dispersion decreases and the contacted and adhered portion of the specimen is "brighter". Por lo tanto, cuando se produce la unión con la película de transferencia fundida, aparece una interfase claramente visible para el observador. Therefore, when binding occurs with the molten film transfer, a clearly visible interface appears to the observer.

Debe destacarse que este cambio de aspecto se produce incluso cuando la película ya está "en contacto" con el espécimen. It should be noted that this change of appearance occurs even when the film is already "in contact" with the specimen. En el caso habitual, la superficie del espécimen es muy irregular. In the usual case, the specimen surface is very irregular. El contacto de la película con el espécimen en los puntos "altos" de una superficie irregular todavía genera una dispersión de luz muy perceptible. The contact of the film with the specimen at the "high" points of an irregular surface still produces a very perceptible light scattering. Cuando se efectúa el calentamiento y la adhesión, la huella de la unión es relativamente fácil de observar. When heating and adhesion occurs, the trace of the junction is relatively easy to observe. Por lo tanto, en el procedimiento dado a conocer, el técnico tiene la ventaja de poder observar la unión en el momento en que ésta se produce. Therefore, in the disclosed method, the technician has the benefit of observing the binding at the time it occurs.

Mediante esta técnica, el tamaño del punto puede ajustarse visualmente utilizando la presente exposición. Using this technique, spot size can be visually adjusted using the disclosure herein. Por ejemplo, cuando se necesita una disección precisa, el observador puede verificar visualmente que en ningún momento el punto llega a ser más grande que el área seleccionada. For example, when a precise dissection is needed, the observer can visually verify that at no time point becomes larger than the selected area. Por otra parte, cuando el material deseado de la muestra está aislado en esencia (ya sea por una separación espacial o por un material "inocuo" que lo rodea) el área de contacto puede ampliarse. Moreover, when the material desired sample is essentially isolated (either by spatial separation or by "harmless" material surrounding) the contact area can be extended. En cualquier caso, el contacto descrito aquí proporciona una interfase visual valiosa que orienta al observador durante el procedimiento de recogida. In any event, the contact here described provides a valuable visual interface which guides the observer during the collection procedure.

Las áreas oscurecidas características que guían a la persona que recoge las muestras durante la microdisección también se ilustran en la Figura 4. The characteristics darkened areas which guide the person collecting the samples for microdissection are also illustrated in Figure 4.

En la puesta en práctica habitual de la LCM mediante películas poliméricas absorbentes de IR cercanos con una DO de \sim0,3 y un grosor de \sim50 micras, la duración de pulso necesaria para aproximarse al estado estacionario en el centro del punto irradiado con láser es de \sim100 ms para haces de \sim100 \mum, \sim40 ms para haces de 60 \mum, \sim10 ms para haces de 30 \mum, \sim1 ms para haces de 10 \mum y alrededor de 500 us para haces de 5 \mum. At start practice of LCM using IR absorbing polymer films with an OD of nearby \ sim0,3 and a thickness of \ sim50 microns, the pulse duration required to approach steady state in the center of the irradiated spot laser is \ SIM100 ms beams \ SIM100 \ mum, \ sim40 ms beams 60 \ mum, \ ~ 10 ms for beams 30 \ mum, \ sim1 ms beams 10 \ m and about 500 us for beams 5 \ mum.

Utilizando un sistema LCM especial capaz de suministrar pulsos de diodo láser casi de alta potencia de sólo 200 \mus, se han demostrado cuantitativamente ciertas características nuevas de funcionamiento con pulsos cortos, en comparación con los pulsos de estado estacionario utilizados anteriormente con la LCM, que son el objeto de la presente invención. Using a special LCM system capable of delivering pulses of laser diode near high power of only 200 \ mus, have quantitatively demonstrated some novel features of operating with short pulses compared to the pulses steady state previously used with LCM, that they are the object of the present invention.

Para un haz de 10 \mum, se obtienen pulsos de longitud inferior a 1,0 ms en una respuesta EVA (expansión y unión) que depende del producto de la potencia y la duración del pulso (o energía total suministrada). For a beam 10 \ mum, pulses shorter than 1.0 ms are obtained in an EVA response (expansion and bonding) that depends on the product of power and pulse duration (or total energy delivered). En este régimen de pulsos cortos, la eficacia de calentamiento del polímero y la creación de una unión es óptima. In this short pulse regime, efficiency of heating the polymer and the creation of a bond is optimal. Con pulsos más largos, debe suministrarse una mayor cantidad total de calor (o energía láser absorbida que es el producto de la duración del pulso y la potencia absorbida), lo cual determina que los tamaños de transferencia sean mayores y que las moléculas del tejido estén expuestas a integrales más altas de temperatura por tiempo (es decir, expuestas mayor tiempo a elevadas temperaturas). With longer pulses, it must be supplied more total heat (or absorbed laser energy which is the product of pulse duration and absorbed power), which determines transfer sizes are larger and the molecules of tissue are exposed to higher temperature integrals of time (ie, longer exposed to elevated temperatures). En general, para una duración de pulso superior a este régimen de "tiempo corto", las transferencias seguras serán de mayor tamaño y los transitorios térmicos macromoleculares serán más prolongados. In general, for a duration exceeding this regime "short time" pulse secure transfers will be larger and the macromolecular thermal transients will be longer. Del mismo modo, para haces de 5 \mum, los pulsos láser de menos de 0,5 ms proporcionarán transferencias equivalentes a una energía total equivalente (la potencia y la duración del pulso necesarios para transferencias "eficaces" varían de forma mutuamente recíproca). Similarly, for beams 5 \ mum, laser pulses of less than 0.5 ms provide equivalent to a total equivalent transfers energy (the power and pulse duration required for "efficient" transfers vary in a mutually reciprocal).

La duración del transitorio térmico experimentado por las macromoléculas del tejido de destino puede reducirse utilizando pulsos más cortos, obteniéndose las mismas temperaturas máximas. The duration of the thermal transient experienced by macromolecules target tissue can be reduced by using shorter pulses, obtaining the same maximum temperatures. El tamaño del tejido transferido viene determinado por el diámetro de la zona de la película que se calienta hasta fundirse y fusionarse con la muestra de tejido. The size of the transferred tissue is determined by the diameter of the area of ​​the film is heated to melt and fuse with the tissue sample. Para pulsos largos (es decir, en las condiciones de estado estacionario descritas por Goldstein et al . en Applied Optics 37:7378, 1998), el tamaño de transferencia viene determinado por la potencia del haz de láser y por las características térmicas (capacidad y difusión térmica) de la película de transferencia LCM. For long pulses (i.e., in steady state conditions described by Goldstein et al in Applied Optics . 37: 7378, 1998), the transfer size is determined by the power of the laser beam and by the thermal characteristics (capacity and thermal) diffusion LCM transfer film. La tabla proporcionada a continuación resume los parámetros para la LCM de estado estacionario convencional, equiparándose el tamaño de la transferencia con el diámetro del haz (utilizando un polímero de 40 \mum de grosor y una sección tisular de 5 \mum de grosor): The table provided below summarizes the parameters for conventional steady state LCM, matching the size of the transfer beam diameter (using a polymer of 40 \ mum thickness and a tissue section of 5 \ mum thickness):

TABLA 1 TABLE 1 Parámetros LCM convencionales utilizados para transferencias de 30 a 100 \mum Conventional LCM parameters used for 30 to 100 transfers \ mum

Diámetro del haz Beam diameter Tamaño de transferencia Transfer Size Potencia de láser Laser power Duración de pulso láser Duration laser pulse
30 \mum 30 \ mum 30 \mum 30 \ mum 15 mW 15 mW 25 ms* 25 ms *
60 \mum 60 \ mum 60 \mum 60 \ mum 30 mW 30 mW 50 ms* 50 ms *
100 \mum 100 \ mum 100 \mum 100 \ mum 40 mW 40 mW 100 ms* 100 ms *
* superior o igual a * Greater than or equal to

A potencias más elevadas, el tamaño de la transferencia y las correspondientes temperaturas máximas del polímero aumentan. At higher powers, the transfer size and the corresponding peak polymer temperatures increase. No obstante, si se incrementan las anchuras de pulso por encima de los valores indicados en la Tabla 1, ni el diámetro del punto transferido ni las temperaturas máximas varían de forma significativa con la anchura del pulso. However, if the pulse widths are increased above the values ​​indicated in Table 1, or the diameter of the transferred spot nor the peak temperatures vary significantly with the pulse width. Cuando es necesario fijar la película de transferencia LCM a un sustrato inerte en lugar de utilizar una película independiente, el sustrato: When it is necessary to fix the LCM transfer film to an inert substrate rather than using an independent film, the substrate:

1) actúa como una placa de presión que proporciona una fuerza de aplicación definida, 1) acts as a pressure plate which provides a force application defined,

2) delimita de forma reproducible la superficie inferior o de unión con el tejido del polímero activable en relación con una superficie no activada y proporciona precisión de posicionamiento de un cuerpo rígido, 2) delimits reproducibly lower surface or binding with the tissue of the activatable polymer relative to a non-activated and provides precision positioning of a rigid body surface,

3) impide la expansión del polímero a través de la superficie del sustrato rígido oa lo largo de ésta, y en combinación con la película polimérica termoplástica inactivada (y por lo tanto sólida) circundante obliga al polímero fundido a expandirse en la dirección del tejido subyacente ya introducirse en éste, lo cual da por resultado un área de contacto superficial reproducible entre el polímero y el tejido y una unión fuerte. 3) prevents polymer expansion across the surface of the rigid substrate or along it, and in combination with the polymeric film inactivated thermoplastic (and therefore strong) surrounding forces the molten polymer to expand in the direction of the underlying tissue and introduced therein, which results in a reproducible surface area contact between polymer and tissue and a strong bond.

Dicho de otro modo, siempre que se irradie la película mediante el láser con suficiente energía absorbida para fundirla focalmente, la película fundida trata de expandirse (debido al coeficiente de expansión térmica y al incremento de volumen asociado al cambio de sólido a líquido), pero queda confinada por la rigidez del soporte de la película y las partes no calentadas de la película. Stated otherwise, if the film is irradiated by the laser with sufficient absorbed power to melt it focally, the molten film is expanded (due to the thermal expansion coefficient and the volume increase associated with the change from solid to liquid), but it is confined by the stiffness of film carrier and the unheated portions of the film. Una vez que la superficie "inferior" del polímero activado se ha fundido, la expansión empuja la película fundida hacia abajo introduciéndola en el tejido. Once the "bottom" surface of the activated polymer has melted, the expansion pushes down the molten film inserting tissue. Por lo tanto, no es necesario que la película esté en contacto directo con el objetivo. Therefore, it is not necessary that the film is in direct contact with the target. La superficie inferior de la parte fundida de la película es empujada durante el pulso láser, se fusiona o une con el objetivo microscópico y el objetivo situado dentro del volumen delimitado por la zona de expansión del polímero es capturado o queda fijado a la película y el sustrato. The bottom surface of the cast portion of the film is pushed during the laser pulse, it merges or joins with the microscope lens and the target located within the volume delimited by the zone of polymer expansion is captured or is attached to the film and substratum. La combinación de 1) pulsos de haz cortos y pequeños, 2) la gran expansión al producirse la fusión de los polímeros seleccionados y 3) el confinamiento de la expansión y redirección hacia el objetivo permite la captura fiable de objetivos inferiores a 10 \mum. The combination of 1) pulses of short, small beam, 2) the large expansion to merging the selected and 3 polymer) confinement of the expansion and redirection towards the target allow reliable capture of targets below 10 \ mum occur. Para pulsos más largos (como en el caso de CO_{2} original), el polímero puede expandirse hacia arriba y hacia abajo y fluir por acción de la gravedad o la tensión superficial una vez que el polímero fundido ha entrado en contacto con el tejido (o superficie húmeda del objetivo). For longer (as in the case of CO {2} original) pulses, the polymer can expand up and down and flow by gravity or surface tension once the melted polymer has contacted tissue (or wet lens surface). No obstante, para que los pulsos más cortos formen uniones eficaces, se requiere una presión local alta para forzar el flujo rápido del polímero dentro del objetivo (tanto si éstos están inicialmente en contacto como si no). However, for the shorter pulses form effective joints, a high local pressure is required to force the rapid flow of polymer into the target (whether they are initially in contact or not). La expansión del polímero fundido crea esta presión. The expansion of the melted polymer creates this pressure. Si el volumen fundido es confinado por el material rígido por todos los lados, salvo en la dirección del objetivo, dichas uniones pueden efectuarse en menos de un ms y son muy fuertes. If the melted volume is confined by the rigid material on all sides, except in the direction of the target, such unions can be performed in less than one ms and are very strong. El soporte (capa de sustrato) es particularmente crucial cuando se utiliza la irradiación del "lado del condensador", en la que la parte superior de la película se funde antes que la parte inferior. The support (substrate layer) is particularly critical when irradiating the "condenser side", in which the top of the film melts before the bottom is used. Sin sustrato inerte de "confinamiento", la expansión inicial se producirá en la dirección opuesta al objetivo y la presión que impulsa el flujo en la dirección del tejido, una vez que se ha producido la fusión de arriba abajo, estará considerablemente reducida. No inert substrate "confinement", the initial expansion will occur in the opposite direction to the target and the pressure driving the flow in the direction of the fabric, once fusion has occurred up and down, will be considerably reduced. Por lo tanto, las uniones sin confinamiento de la expansión del polímero por la parte superior serán menos fuertes o se formarán de forma menos fiable en tiempos cortos. Therefore, the joints Unconfined polymer expansion at the top will be less strong or less reliably formed in short times.

Siempre que estas uniones sean más fuertes que la unión original entre el objetivo y el portaobjetos de vidrio, el objetivo será transferido a la superficie de la película y separado de los elementos adyacentes del portaobjetos una vez que el sustrato se ha separado del portaobjetos (si existen elementos adyacentes no deseados situados junto a los elementos deseados o unidos a éstos, para lograr la separación será necesario que la fuerza de unión de los elementos no deseados con el portaobjetos de vidrio supere a la fuerza de unión de los elementos no deseados con los elementos deseados). Whenever these bonds are stronger that the original bond between the target and the glass slide, the target will be transferred to the film surface and separated from adjacent elements on the slide once the substrate is separated from the slide (if are adjacent unwanted elements located next to the desired, or attached to elements, to achieve separation will be necessary that the bonding strength of unwanted items with the glass slide exceeds the bonding strength of unwanted items with desired elements). Habitualmente, se forman una serie de uniones láser para acumular un grupo de objetivos equivalentes de la zona deseada en el portaobjetos antes de la separación del sustrato, su capa polimérica termoplástica y los objetivos capturados del portaobjetos y el resto de elementos microscópicos de éste. Typically, a series of laser bonds are formed to accumulate a group of equivalent targets the target zone on the slide prior to the separation of substrate, its thermoplastic polymer layer, and captured targets from the slide and the remaining microscopic elements thereof.

Realización preferida pREFERRED eMBODIMENT

Se utiliza cualquiera de las muestras o películas LCM existentes con cualquier geometría de visualización o irradiación (p.ej., irradiación de lado de condensador o epirradiación). either sample or existing LCM films used with any viewing or irradiation geometry (eg, irradiation or epi-irradiation side condenser). La combinación de 1) pulsos de haz cortos y pequeños, 2) la gran expansión fraccionaria al producirse la fusión de los polímeros seleccionados (p.ej., \sim10%) y 3) el confinamiento de la expansión y redirección hacia el objetivo permite la captura fiable de objetivos inferiores a 10 \mum. The combination of 1) short pulses and small beam, 2) the large expansion fractional fusion to the selected polymers (eg, \ ~ 10%) and 3) occur confinement of the expansion and redirection towards the target allow reliable capture of lower targets 10 \ mum. Para pulsos más largos (como en el caso de CO_{2} original), el polímero puede expandirse hacia arriba y hacia abajo y fluir por acción de la gravedad o la tensión superficial una vez que el polímero fundido ha entrado en contacto con el tejido (objetivo poroso). For longer (as in the case of CO {2} original) pulses, the polymer can expand up and down and flow by gravity or surface tension once the melted polymer has contacted tissue (porous target). Se requieren pulsos láser más cortos a potencias algo más altas que las de la LCM convencional para confinar el volumen fundido del polímero fijado a pequeños diámetros de haz (< 20 micras). shorter laser pulses at somewhat higher than those of conventional LCM to confine the molten polymer attached to small beam diameters (<20 microns) volume required powers. Para estos pulsos más cortos, se requiere una presión local alta para forzar el flujo rápido del polímero dentro del objetivo (tanto si éstos están inicialmente en contacto como si no). For these shorter pulses, a high local pressure is required to force the rapid flow of polymer into the target (whether they are initially in contact or not). La gran expansión del polímero fundido crea esta presión. The great expansion of the melted polymer creates this pressure. Si el volumen fundido es confinado por material rígido por todos los lados, salvo en la dirección del objetivo, dichas uniones pueden formarse en menos de un ms y son muy fuertes. If the melt volume is confined by rigid material on all sides except in the direction of the target, such bonds can be formed in less than a msec and are quite strong. El soporte (capa de sustrato) es particularmente crucial cuando se utiliza la irradiación del "lado del condensador". The support (substrate layer) is particularly critical when irradiating the "condenser side" is used. En este caso, la parte superior de la película se fundirá antes que la parte inferior, y la expansión inicial sin un sustrato inerte de "confinamiento" se producirá en la dirección opuesta al objetivo. In this case, the top of film will melt before the bottom, and the initial expansion without an inert substrate "confinement" will occur in the opposite direction to the objective. Esta trayectoria fluida hacia el aire en la parte superior reducirá considerablemente la presión que impulsa el flujo en la dirección del tejido una vez que ha tenido lugar la fusión de arriba abajo. This fluid path to air on the top will substantially reduce the pressure driving the flow in the direction of the tissue once fusion has occurred up and down. Por lo tanto, las uniones no serán tan fuertes ni se formarán de forma tan fiable en tiempos cortos. Therefore, unions will not be as strong or be formed so reliably in a short time.

A diferencia de la LCM de pulso largo convencional, a anchuras de pulso por debajo de 1 ms, la película no se acerca al equilibrio térmico a distancias de más de 2 micras del borde del haz del láser durante el pulso láser. Unlike the conventional long pulse LCM, at pulse widths below 1 msec the film does not approach thermal equilibrium at distances more than 2 microns from the edge of the laser beam during the laser pulse. En consecuencia, la pérdida de calor se reduce al mínimo. Consequently, heat loss is minimized. Por lo tanto, cuando la capa activable recibe y absorbe la energía adecuada, sólo la película de la zona expuesta al láser se calienta hasta el punto de fusión durante el pulso láser, expandiéndose para entrar en contacto y fusionarse con el tejido. Therefore, when the activatable layer receives and absorbs adequate energy, only the film from exposure to the laser it is heated to the melting point during the laser pulse, expanding to contact and fuse into the tissue. Para un pulso corto (inferior a 1 ms), no se dispone de tiempo suficiente para que la temperatura de la película aumente hasta el punto de fusión fuera de la zona expuesta al pulso láser, debido a la corta duración del pulso. For a short pulse (less than 1 ms), there is sufficient so that the film temperature increase to the melting point outside the region exposed to the laser pulse, due to the short pulse duration time. Esta zona permanece por debajo del punto de fusión y no se fusiona con el tejido. This area remains below the melting point and does not fuse with the tissue. Por lo tanto, para pulsos cortos, el tamaño de la zona de transferencia no es incrementado por difusión térmica y el tamaño de transferencia del tejido viene determinado principalmente por el diámetro del punto láser. Thus, for short pulses, the size of the transfer zone is not increased by thermal diffusion and the tissue transfer size is determined primarily by the laser spot diameter. Para pulsos cortos, se observa que el tamaño del punto de transferencia incrementa cuando se incrementa la anchura del pulso láser, en contraste con el régimen LCM de pulsos largos convencional, lo cual indica que se está trabajando en un régimen de difusión térmica diferente. For short pulses, it is noted that the transfer spot size increases as the width of the laser pulse increases, in contrast to the conventional LCM regime long pulses, indicating that it is working on a different thermal diffusion regime. La tabla proporcionada a continuación resume los parámetros para la nueva LCM de pulso corto con un tamaño de transferencia igual al diámetro del haz (utilizando un polímero de 40 \mum de grosor y una sección tisular de 5 \mum de grosor). The table provided below summarizes the parameters for new short pulse LCM with a size equal to beam diameter transfer (using a polymer of 40 \ mum thickness and a tissue section of 5 \ mum thick).

TABLA 2 TABLE 2 Parámetros de LCM de pulso corto necesarios para transferencias de tamaños más pequeños (5 y 10 \mum de diámetro de objetivos de 5 \mum de grosor Parameters short pulse LCM transfers required for smaller sizes (5 and 10 \ mum diameter targets 5 \ mum thick

1 one

Es importante observar que la unión obtenida de los polímeros de EVA (tales como Dupont Elvax 200W, 410, 205W y 4310) con el tejido es fiable y tiene la fuerza suficiente para permitir transferencias reproducibles en transitorios térmicos de sólo 0,3 ms. Importantly, the binding obtained polymers EVA (Elvax 200W such as Dupont, 410, 205W and 4310) to tissue is reliable and has sufficient strength to permit reproducible transfers in thermal transients as 0.3 ms. Por lo tanto, no sólo es posible confinar el polímero fundido a una zona de pocas micras de diámetro con pulsos cortos, sino además formar uniones fiables con el tejido en dichos transitorios de fusión breves. Therefore, not only is it possible to confine the molten zone few microns in diameter with short pulses, but also forming polymer reliable bonds with the tissue in such short transient fusion.

En la tabla 2 anterior, las mediciones experimentales demuestran transferencias equivalentes para la misma energía de pulso cuando la duración del pulso láser se mantiene por debajo de un tiempo crítico asociado al tiempo necesario para una difusión térmica significativa desde el volumen irradiado. In Table 2 above, experimental measurements demonstrate equivalent for the same pulse energy transfers when the laser pulse duration is kept below a critical time associated with the time required for significant thermal diffusion from the irradiated volume. Como se ha indicado, por debajo de cierta longitud de pulso (<< 1 ms para un punto de 10 \mum de diámetro y 0,5 ms para un punto de 5 \mum de diámetro), la energía láser necesaria para crear un tamaño pequeño de transferencia dado es esencialmente constante (p.ej., 9 microjulios para una transferencia de 5 micras utilizando una película EVA activable de 40 \mum de grosor con una DO de 0,4 a la longitud de onda del láser). As indicated, below a certain pulse length (<< 1 msec for a point 10 \ mum diameter and 0.5 ms for a point 5 \ mum diameter), the laser energy required to create a size given small transfer is essentially constant (e.g., 9 micro-joules for a 5 micron transfer using a film activatable EVA 40 \ mum thick with an OD of 0.4 at the wavelength of the laser). En general, en las realizaciones preferidas de LCM se utilizan polímeros termoplásticos (p.ej., de EVA con bajo porcentaje de acetato de vinilo) con una temperatura de fusión baja, de tal forma que las temperaturas máximas necesarias para formar una unión termoplástica se reducen al mínimo. In general, in preferred embodiments of LCM thermoplastic polymers (eg EVA with a low percentage of vinyl acetate) are used with a low melting temperature, so that the necessary high temperatures to form a thermoplastic bond is minimized.

Como puede observarse en la Tabla 2, en el régimen de pulsos cortos utilizado, la energía láser necesaria para crear un tamaño pequeño de transferencia dado es esencialmente constante (p.ej., 9 microjulios para una transferencia de 5 micras utilizando una película de EVA activable de 40 \mum de grosor con una DO de 0,4 a la longitud de onda del láser). As shown in Table 2, in the short pulse regime utilized the laser energy required to create a small transfer size is essentially constant given (eg, 9 microjoules 5 micron transfer using an EVA film activatable 40 \ mum thick with an OD of 0.4 at the wavelength of the laser). Aunque es posible utilizar cualquiera de estos pulsos para capturar un elemento microscópico de tamaño equivalente, existen ciertas diferencias físicas intrínsecas que aconsejan utilizar estrategias de optimización concretas. Although you can use any of these pulses to capture a microscopic element of equivalent size, there are certain inherent physical differences advise using specific optimization strategies. En general, los pulsos más cortos de potencia más alta (p.ej., de 5 \mum, 45 mW y 0,2 ms con 9 microjulios) crean en el polímero termoplástico temperaturas máximas superiores a las de los pulsos más largos equivalentes (p.ej., de 5 \mum, 18 mW y 0,5 ms también con 9 microjulios). In general, higher power pulses shorter (eg, 5 \ mum, 45 mW and 0.2 ms microjoules 9) created in the thermoplastic polymer maximum temperatures higher than the longer pulses equivalent ( eg 5 \ mum, 18 mW and 0.5 ms also with 9 micro-joules). Cuando las temperaturas se incrementan dentro del polímero fundido, se crea una viscosidad transitoria inferior y puede producirse una inyección más eficaz de polímero dentro de los espacios vacíos más finos del volumen de destino. When temperatures rise into the molten polymer, a transient lower viscosity and create a more effective injection of polymer can be produced within the finest voids target volume. No obstante, los pulsos más cortos de más potencia también están asociados a transitorios térmicos máximos más altos en los objetivos capturados, durante el breve período entre el instante en que el polímero fundido entra por primera vez en contacto con el objetivo y el momento en que el polímero se enfría y solidifica (tras finalizar el pulso y el rápido enfriamiento por flujo de calor a través del vidrio subyacente). However, shorter pulses more power are also associated with thermal transients higher peak in the objectives captured during the brief period between the instant the molten polymer first enters in contact with the target and the time the polymer cools and solidifies (after the end of the pulse and rapid cooling by heat flow through the underlying glass). Por otra parte, los pulsos ligeramente más largos de potencia inferior proporcionan el mismo volumen máximo de polímero fundido y volumen de expansión con la misma energía absorbida, mediante temperaturas máximas inferiores y tiempos más largos que pueden reducir al mínimo el ataque térmico máximo a la muestra, mientras proporcionan tiempos más largos para crear una unión mecánica más fuerte con el objetivo. Moreover, the slightly longer pulses of lower power provides the same maximal volume of molten polymer and volume expansion with the same absorbed energy, by longer lower peak temperatures and times which may minimize peak thermal attack on the sample while providing longer times to create a strong mechanical bond with the target. En general, en las realizaciones preferidas de LCM se utilizan polímeros termoplásticos (p.ej., de EVA con bajo porcentaje de acetato de vinilo) de baja temperatura de fusión, de tal forma que la temperatura máxima necesaria para formar una unión termoplástica se reduce al mínimo. In general, in preferred embodiments of LCM thermoplastic polymers (eg EVA with a low percentage of vinyl acetate) low melting temperature, are used so that the maximum temperature required to form a thermoplastic bond is reduced minimum. Cuando se trabaja con materiales sensibles térmicamente, tales como proteínas en las cuales se desea conservar la función enzimática, los parámetros láser "equivalentes" preferidos de la Tabla 2 son los pulsos eficaces de mayor longitud citados. When working with thermally sensitive materials such as proteins in which it is desired to preserve enzyme function, the "equivalent" of Table 2 Preferred laser parameters are the longest efficient pulses listed.

Los requisitos para obtener una unión satisfactoria del objetivo son: 1) la fusión del polímero activable a lo largo del eje del haz de láser desde la superficie superior a la inferior y 2) la expansión del polímero termoplástico en este eje hasta la superficie de destino y dentro de los espacios vacíos de destino. The requirements for satisfactory bonding of the target are 1) melting the activatable polymer along the axis of the laser beam from top to bottom and two surface) expansion of the thermoplastic polymer on this axis to the target surface and in empty spaces destination. En la LCM anterior, se utilizan pulsos más largos capaces de proporcionar distribuciones de temperatura en estado estacionario dentro del polímero fundido, y un grosor del polímero aproximadamente igual al diámetro del haz del láser (Tabla 1: de 30 a 100 \mum). In the above LCM capable longer pulses provide temperature distributions in steady state within the molten polymer, and a polymer thickness approximately equal to the diameter of the laser beam (: 30 to 100 \ mum Table 1) are used. Cuando se utilizan pulsos cortos para reducir al mínimo la difusión térmica lateral y permitir transferencias de objetivos más pequeños, el flujo de calor de la parte superior a la parte inferior de la película también se reduce durante el pulso láser. When short pulses are used to minimize lateral thermal diffusion and allow transfers of smaller targets, the heat flow from the top to the bottom part of the film is also reduced during the laser pulse. El gradiente térmico inducido por el láser desde la parte superior hasta la parte inferior del volumen irradiado incrementa tanto con el grosor del polímero activable como con su densidad óptica (absorbancia) a la longitud de onda de activación del láser. The thermal gradient induced by the laser from the top to the bottom of the irradiated volume increases with both thickness of the activatable as optical density (absorbance) at the wavelength of laser activation polymer. Por lo tanto, en particular para la LCM de pulso corto, la película de polímero activable debe ser cuidadosamente diseñada por lo que respecta al grosor y la densidad óptica. Therefore, particularly for short pulse LCM the activatable polymer film must be carefully designed with respect to thickness and optical density. Como se ha descrito anteriormente (Bonner et al ., Science 278:1431, 1997 y patentes...), la absorbancia de los polímeros termoplásticos, tales como el etileno-acetato de vinilo, a longitudes de onda láser de IR cercano puede controlarse con precisión mediante la concentración de moléculas añadidas con gran absorbancia de IR cercano, tales como colorantes de naftalocianina que son muy solubles en el polímero. As previously described (Bonner et al, Science . 278: 1431, 1997 and patents ...), the absorbance of thermoplastics, such as ethylene vinyl acetate, to laser wavelengths near IR polymers can be controlled accurately by concentrating added molecules with high absorbance near-IR, such as naphthalocyanine dyes which are highly soluble in the polymer. La absorbancia de la película termoplástica a las longitudes de onda láser utilizadas deberá mantenerse a una DO < 0,43 variando la concentración de colorante con el grosor de la película que se va a utilizar. The absorbance of the thermoplastic film to laser wavelengths used should be kept at OD <0.43 by varying the dye concentration with film thickness to be used. Otras películas más finas se asocian, al fundirse de arriba abajo en puntos pequeños, con volúmenes respectivamente pequeños de polímero fundido y, por consiguiente, volúmenes de expansión polimérica más pequeña. Other thinner films are associated, by melting up and down small dots, with respectively smaller volumes of melted polymer and therefore smaller polymer volume expansion. De esta forma, las películas poliméricas más delgadas presentarán de forma intrínseca una mayor precisión de captura, en particular, para espécimenes de destino más delgados. Thus, the thinner polymer films present intrinsically greater precision of capture, particularly for thinner target specimens. Por otra parte, cuando aumenta el espacio de separación inicial entre la superficie polimérica no activada y la superficie de destino o el grosor del objetivo, la distancia de expansión necesaria para crear una unión y una transferencia asociada eficaz también aumenta. Moreover, when increasing the space of initial separation between the non-activated polymer surface and the target surface or the target thickness, the required expansion distance to create an effective bond and associated transfer also one increases. En tales casos, deberá incrementarse el grosor del polímero y deberá reducirse la concentración del colorante. In such cases, it must increase the thickness of the polymer and be reduced dye concentration.

En otra realización preferida, se utiliza el procedimiento LCM de pulso corto a potencias ligeramente inferiores (de un factor de dos de la potencia necesaria para transferir un objeto del espécimen exactamente igual al tamaño del haz con un solo pulso), pero con una serie de pulsos (con una repetición de << 2 a 3 pulsos por segundo). In another preferred embodiment, the LCM procedure short at slightly lower powers (a factor of two than necessary to transfer an object of the specimen exactly equal to the beam size with a single pulse power), pulse is used but with a series of pulses (with a repetition of << 2-3 pulses per second). Esta serie de pulsos incrementa el avance de la expansión del polímero hasta que entra en contacto y se une a una célula u objeto microscópico de destino situado en el portaobjetos, momento en el cual el tren de pulsos se interrumpe. This series of pulses increases advancing polymer expansion until contact and joins a microscopic cell or target object in the glove, at which point the pulse train is interrupted. En este procedimiento, el primer pulso corto determina que el polímero se funda focalmente y se separe de la superficie mediante la combinación de la expansión térmica y el confinamiento inerte y elástico de los materiales sólidos circundantes. In this procedure, the first short pulse determines the polymer to melt and spread focally from the surface by the combination of thermal expansion and elastic and inert solid materials surrounding confinement. Puesto que el pulso individual es corto y el enfriamiento/solidificación de la extensión pequeña es muy rápido (<<1 ms), tras un breve enfriamiento, se forma un pequeño pedestal sólido que sobresale de la superficie polimérica. Since the individual pulse is short and the cooling / solidification of the small extension is very rapid (<< 1 msec), after brief cooling a solid small pedestal protruding from the polymeric surface is formed. Cada pulso adicional expandirá el polímero en dirección al objetivo en incrementos cada vez menores. Each additional pulse will expand toward the lens polymer in decreasing increments. De esta forma, para llevar a cabo las transferencias más pequeñas posibles de forma fiable, basta con suministrar sólo el número de pulsos necesarios para expandir el polímero hasta que entra en contacto con el tejido. Thus, to perform the smallest possible transfers reliably enough to provide only the number of pulses required to expand the polymer until it comes into contact with the tissue. Los pulsos adicionales suministrados después del contacto permiten la expansión del polímero dentro del tejido hasta alcanzar el tamaño del haz del láser. Additional pulses after contact allow supplied expansion of the polymer into the tissue up to the size of the laser beam.

Puesto que bajo observación microscópica durante la LCM se observa abrillantamiento óptico en la zona de destino debido a la correspondencia de índices entre la superficie del tejido y el polímero de contacto, es fácil de determinar el primer pulso que entra en contacto con el tejido. Since under microscopic observation during LCM observed optical brightening in the target area because the correspondence index between the tissue surface and the polymer contact, it is easy to determine the first pulse that makes contact with the tissue. De esta forma, la transferencia puede realizarse de forma segura a una escala que es inferior a la del tamaño del haz (p.ej., es posible enfocar y transferir objetos de \sim 1 micra con un haz de 5 micras). Thus, the transfer can be safely performed on a scale that is less than the beam size (e.g., focus and can transfer objects \ ~ 1 micron to 5 micron beam).

En un tercer procedimiento preferido de LCM de pulso corto, se utilizan diversos pulsos supraumbrales adicionales tras el primer contacto con la muestra de destino para permitir la captura de una sola célula completa de forma irregular (objeto de destino de la muestra) mediante un haz que es ligeramente inferior a la célula individual. In a third preferred method of short pulse LCM, various additional suprathreshold pulses are used after the initial contact with the target sample to allow capture of a single whole cell irregularly (target object sample) by a beam it is slightly lower than the individual cell. Puesto que el polímero fluye dentro del tejido poroso desecado, con pulsos cortos cercanos al umbral el polímero fluye preferentemente a lo largo de las estructuras macromoleculares contiguas de una célula dada y tiende a rellenar la célula por completo, antes de expandirse a través de los bordes intercelulares. Since the polymer flows within the porous tissue desiccated, with short pulses near threshold the polymer preferentially flows along contiguous macromolecular structures of a given cell and tends to fill the cell completely before expanding across the edges intercellular. De esta forma, los pulsos cortos cercanos al umbral son capaces de enfocarse en células individuales o estructuras densamente conectadas, tales como el núcleo celular, aun cuando éstas tengan una forma irregular y no concuerden con la forma del haz del láser. Thus, near-threshold pulses are capable of short focus on individual cells or densely connected, such as the cell nucleus, structures even though they have an irregular shape and not matching the shape of the laser beam.

La precisión de la LCM de pulso corto o el tamaño mínimo del elemento capturado descritos aquí se refieren a espécimenes densos, tales como una sección tisular en la que los objetivos deseados son inmediatamente contiguos a los no deseados. The accuracy of the short pulse LCM or the minimal size of the item described relate captured dense here, such as a tissue section in which desired targets are immediately contiguous with unwanted specimens. Debe sobrentenderse que es posible alcanzar una precisión todavía mayor cuando se capturan partículas más pequeñas con una separación mayor que la de sus diámetros (p.ej., un frotis citológico diluido o un aplastamiento cromosómico). It should be understood that it is possible to achieve even greater precision when smaller particles are captured with greater separation than their diameters (eg, a dilute cytological smear or a chromosomal crushing). En este caso, pueden capturarse elementos de destino puros más pequeños mediante expansión polimérica que abarca los elementos y el espacio vacío circundante del portaobjetos del microscopio, sin unión con el elemento no deseado más cercano. In this case, they can be captured pure elements smaller polymer expansion destination by covering elements and empty space surrounding the microscope slide without connection to the element nearest unwanted. Por lo tanto, es posible enfocar y capturar microscópicamente elementos de sólo 1 \mum, con gran pureza (p.ej., mediante los pulsos láser de 5 um de la Tabla 2). Therefore, it is possible to focus and capture elements microscopically only one \ mum, high purity (e.g., by laser pulses 5um Table 2). Aunque puede considerarse que la resolución final de la captura LCM está limitada por la longitud de onda de la luz utilizada para la visualización y el enfoque microscópico y por la del láser de activación, en ciertas circunstancias, mediante esta técnica es posible enfocar y capturar (es decir, purificar a partir de una mezcla compleja) partículas submicrónicas. Although it may be considered that the ultimate resolution of LCM capture is limited by the wavelength of light used for display and microscopic approach and the activating laser, in certain circumstances, using this technique it is possible to focus and capture ( ie, purified from a complex mixture) submicron particles. Por ejemplo, marcadores de fluorescencia específicos pueden identificar partículas micrónicas específicas sin resolver su estructura. For example, specific fluorescence markers might identify specific micronic particles unresolved structure. Si estas partículas se esparcen hasta una densidad suficientemente baja sobre el portaobjetos del microscopio (separación media aproximada de 5 um), la LCM de pulso corto podrá enfocarlas y capturarlas. If these particles are spread to a low enough density on the microscope slide (mean separation approximately 5 um), the short pulse LCM can approach them and capture. Además, las imágenes del resto del portaobjetos del espécimen y de la superficie de transferencia obtenidas tras la transferencia pueden verificar y cuantificar el procedimiento de captura. Furthermore, images of remaining specimen slide and of the transfer surface obtained after the transfer can verify and quantify the capture process.

La anterior técnica LCM ha sido descrita con respecto a las aplicaciones biológicas. LCM prior art has been described with respect to biological applications. Debe sobrentenderse que estas técnicas son aplicables a cualquier muestra que pueda ser observada al microscopio, tal como un grupo heterogéneo de elementos en el que el procedimiento provoca la separación de un componente o grupo de componentes microscópicamente reconocibles. It should be understood that these techniques are applicable to any sample that can be observed microscopically, such as a heterogeneous group of elements in which the method causes the separation of a component or group of components recognizable microscopically. Por lo tanto, se da a conocer un procedimiento de separación basado en la utilización de un microscopio en el que se emplea una película de transferencia activada de manera selectiva y aplicada a un tejido, espécimenes citológicos, orgánulos celulares, cromosomas o virus. Therefore, it provides a separation method based on the use of a microscope in which a transfer film selectively activated and applied to tissue, cytology specimens, cellular organelles, chromosomes or viruses are used. Además, también es posible separar objetos inertes identificables mediante un microscopio en subgrupos que se van a aislar mediante procedimientos LCM. Furthermore, it is also possible to separate identifiable under a microscope inert objects into subgroups to be isolated by procedures LCM.

La solicitud de patente US nº de serie 08/883.821 titulada "Convex Geometry Adhesive Film System for Laser Capture Microdissection", ahora patente US nº 6 100 051, fue publicada el 8 de agosto de 2000 y no forma parte del estado de la técnica. Patent application US Serial No. 08 / 883,821 entitled "Convex Geometry Adhesive Film System for Laser Capture Microdissection", now US Patent No. 6100051, was published on 8 August 2000 and does not form part of the prior art. En esta exposición, se describe la utilización de una superficie convexa que presenta un adhesivo activable de forma selectiva, para la agrupación de lado a lado y la concentración de espécimenes unidos mediante microdisección por captura con láser. In this disclosure, the use of a convex surface having a selectively activatable adhesive for the side by side grouping and concentration of specimens bonded by laser capture microdissection described. Como observará el lector, en la presente exposición se ha descrito la unión de elementos sumamente pequeños o escasos mediante microdisección por captura con láser. As the reader will, in the present disclosure it has been described binding extremely small or rare elements by laser capture microdissection. De este modo, la combinación de estas dos exposiciones permitirá el aislamiento y la unión de elementos concretos muy pequeños en un grupo de un espécimen microscópico. Thus, the combination of these two exposures allow isolation and joining of very small specific elements in a group of a microscopic specimen. A continuación, podrá llevarse a cabo la transferencia de los grupos formados a cualquier lugar preciso para su ulterior análisis. Then you can take out the transfer of the groups formed any precise place for further analysis.

Claims (8)

1. Procedimiento para la extracción directa de material de una muestra, que comprende las etapas siguientes: 1. Process for the direct extraction of material from a sample comprising the following steps:
provisión de una muestra; providing a sample;
provisión de una película de transferencia que, sólo tras ser activada en zonas seleccionadas, presenta la propiedad de proporcionar a las zonas seleccionadas la capacidad de adherirse a la muestra; providing a transfer film which only after being enabled in selected areas, has the property of providing selected areas the ability to adhere to the sample;
yuxtaposición de la muestra a la película de transferencia; juxtaposing the sample to the transfer film;
identificación de por lo menos una parte del material para extraerla de la muestra; identification of at least part of the material to remove it from the sample;
enfoque del haz de radiación pulsada, de un diámetro de haz preseleccionado y una longitud de pulso preseleccionada, sobre la película de transferencia para activar un volumen de la película de transferencia adyacente a la muestra y adherirlo a por lo menos una parte del material que se va a extraer de la muestra; approach pulsed radiation beam, of a diameter of preselected beam and a length of preselected pulse on the transfer film to activate a volume of the film adjacent to the sample transfer and adhere to at least a portion of the material will extract the sample;
observación de la interfase óptica entre la muestra y la película de transferencia durante la etapa de enfoque para comprobar que dicha parte por lo menos del material de la muestra se adhiera a la película de transferencia, y el alcance espacial de la unión en el plano de la imagen, y observing the optical interface between the sample and the transfer film during the stage of approach to verify that said at least part of the material of the sample adheres to the transfer film and the spatial extent of binding in the plane image, and
separación de la película de transferencia de la muestra mientras se mantiene la adhesión entre la película de transferencia y dicha parte por lo menos de material de la muestra, para desprender de ese modo dicha parte por lo menos de material de la muestra de la parte restante de la muestra; separating the transfer film from the sample while the adhesion between the transfer film and said portion is maintained at least the sample material to loosen thereby that at least part of the sample material from the remaining part of the sample;
en el que la película de transferencia se separa un pequeño intervalo espacial de la muestra y en el que el haz de radiación pulsada, de un diámetro de haz preseleccionado y una longitud de pulso preseleccionada, se enfoca sobre la película de transferencia para activar un volumen de la película de transferencia adyacente a la muestra, lo cual determina que dicho volumen se expanda y abarque el pequeño intervalo espacial para adherirse a dicha parte por lo menos del material que se va a extraer de la muestra. wherein the transfer film is separated a small spatial sample interval and wherein the pulsed radiation beam, of a diameter of preselected beam and a length of preselected pulse is focused onto the transfer film to activate a volume film adjacent the sample transfer, which determines that the volume expands and covers the small spatial interval for adhering to said at least part of the material to be extracted from the sample.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la película de transferencia es un polímero termoplástico con una gran expansión volumétrica asociada con la fusión, destinado a crear una expansión y una fuerza impulsora suficiente como para empujar el polímero contra el elemento de destino e introducirlo en el mismo y obtener de ese modo una unión fuerte de forma rápida. 2. Method according to claim 1, wherein the transfer film is a thermoplastic polymer with a large volume expansion associated with melting, intended to create expansion and a driving force enough to push the polymer against the target element and enter therein and thereby obtain a strong bond quickly.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además la etapa de: 3. Method according to claim 1 or claim 2, further comprising the step of:
provisión de un sustrato de apoyo inerte sobre la cara superior del polímero termoplástico que impide que la gran expansión volumétrica asociada con la fusión se desvíe del objetivo deseado, y determina que la presión interna creada por el polímero que se expande impulse el polímero fundido contra el elemento de destino y se introduzca en el mismo para proporcionar una unión fuerte con el objetivo. providing a substrate of inert support on the upper face of the thermoplastic polymer which prevents the large volume expansion associated with melting deviates from the desired target, and determines that the internal pressure created by the polymer expands propel the molten polymer against element destination and enter therein to provide a strong bond with the objective.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la etapa de: 4. Process according to any of claims 1 to 3, further comprising the step of:
incremento de la longitud de pulso preseleccionada para incrementar el área activada de la película de transferencia o reducción de la longitud de pulso preseleccionada para reducir el área activada de la película de transferencia y, opcionalmente, suministro de pulsos adicionales después del primer pulso, lo cual crea una unión para incrementar positivamente el diámetro de la zona unida a un objetivo deseado. increased pulse length preselected to increase the activated area of ​​the transfer film or reducing the pulse length preselected to reduce the activated film transfer area and optionally providing additional pulses after the first pulse, which creates a bond to positively increase the diameter of the bound to a desired target area.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además las etapas siguientes: 5. Process according to any of claims 1 to 4, further comprising the following steps:
ajuste de la duración de los pulsos para activar un volumen de la película de transferencia con el diámetro de haz preseleccionado y adherirlo a dicha parte por lo menos de material de la muestra, y adjusting the pulse duration to activate a volume of the transfer film with the preselected beam diameter and adhere to that part at least of the sample material, and
observación de la interfase óptica entre la muestra y la película de transferencia durante la etapa de enfoque para comprobar que dicha parte por lo menos del material de la muestra se adhiera a la película de transferencia, y el alcance espacial de la unión en el plano de la imagen. observing the optical interface between the sample and the transfer film during the stage of approach to verify that said at least part of the material of the sample adheres to the transfer film and the spatial extent of binding in the plane the picture.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, que comprende además la etapa de: 6. Method according to claim 5, further comprising the step of:
ajuste de la duración del pulso para activar un área de la película de transferencia menor o igual al diámetro de haz preseleccionado y adherirla a dicha parte por lo menos de material de la muestra. adjusting the pulse duration to activate an area of ​​the film of less than or equal to the diameter of preselected beam transfer and adhere to that part at least of the sample material.
7. Procedimiento según la reivindicación 5, que comprende además las etapas siguientes: 7. Method according to claim 5, further comprising the following steps:
disminución de la energía del pulso, por ejemplo, reduciendo la longitud del pulso o la potencia del pulso, de tal forma que un solo pulso subumbral sea insuficiente para activar la película de transferencia en cualquier punto de la muestra, y decreased energy pulse, for example by reducing the pulse length or pulse power, so that a single subthreshold pulse is insufficient to activate the transfer film at any point of the sample, and
aplicación de una serie de dichos impulsos subumbrales a la película de transferencia que está yuxtapuesta a dicha parte por lo menos de material que se va a extraer, sin entrar en contacto con la misma, hasta que la película de transferencia se une a dicha parte por lo menos de material que se va a extraer. applying a series of such subthreshold pulses to the transfer film which is juxtaposed to said part at least of material to be removed, without contact therewith, until the transfer film is attached to said part by at least material to be extracted.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además las etapas siguientes: 8. Process according to claim 1, further comprising the following steps:
observación del contacto entre la película de transferencia y dicha parte por lo menos de material de la muestra; observing the contact between the transfer film and said portion at least of material of the sample;
enfoque de otro haz de radiación pulsada sobre el contacto de la muestra para provocar sólo la adhesión entre la película de transferencia y la muestra, y another approach pulsed radiation beam on the sample contact to cause only the adhesion between the transfer film and the sample, and
separación de la película de transferencia de la muestra mientras se mantiene la adhesión entre la película de transferencia y dicha parte por lo menos de material de la muestra, de tal modo que dicha parte por lo menos de material de la muestra se desprenda de la parte restante de la muestra, incluyendo además opcionalmente dicho procedimiento la etapa de enfoque de otro haz de radiación pulsada sobre el contacto de la muestra para expandir el área de adhesión entre la película de transferencia y la muestra. separating the transfer film from the sample while the adhesion between the transfer film and said portion is maintained at least the sample material, so that said portion at least of sample material falling off the part remaining sample, said method optionally further comprising the step of approach of another pulsed radiation beam on the sample contact to expand the area of ​​adhesion between the transfer film and the sample.
ES99937605T 1998-07-30 1999-07-28 Microdissection precision laser capture using short pulse length. Active ES2230877T3 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9487198P true 1998-07-30 1998-07-30
US94871P 1998-07-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2230877T3 true ES2230877T3 (en) 2005-05-01

Family

ID=22247676

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES99937605T Active ES2230877T3 (en) 1998-07-30 1999-07-28 Microdissection precision laser capture using short pulse length.

Country Status (9)

Country Link
US (2) US6420132B1 (en)
EP (1) EP1101094B1 (en)
JP (1) JP4387594B2 (en)
AT (1) AT278183T (en)
AU (1) AU5240499A (en)
CA (1) CA2337900C (en)
DE (1) DE69920718T2 (en)
ES (1) ES2230877T3 (en)
WO (1) WO2000006992A1 (en)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2230877T3 (en) * 1998-07-30 2005-05-01 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Microdissection precision laser capture using short pulse length.
US6743601B1 (en) * 1998-12-10 2004-06-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Non-contact laser capture microdissection
US6584145B1 (en) * 1999-06-02 2003-06-24 Level One Communications, Inc. Sample rate converter
US10156501B2 (en) 2001-11-05 2018-12-18 Life Technologies Corporation Automated microdissection instrument for determining a location of a laser beam projection on a worksurface area
AU2922701A (en) * 1999-11-04 2001-05-14 Arcturus Engineering, Inc. Automated laser capture microdissection
US6887703B2 (en) 2000-02-16 2005-05-03 Arturus Bioscience, Inc. Transfer film for laser microcapture
DE10018255C2 (en) * 2000-04-13 2003-08-28 Leica Microsystems Laser cutting method, and laser cutting device for laser cutting with microscopic samples
WO2001081892A2 (en) 2000-04-26 2001-11-01 Arcturus Engineering, Inc. Laser capture microdissection (lcm) extraction device and device carrier and method for post-lcm fluid processing
WO2002037159A2 (en) * 2000-11-03 2002-05-10 Arcturus Engineering, Inc. Road map image for automated microdissection
DE10300091A1 (en) * 2003-01-04 2004-07-29 Lubatschowski, Holger, Dr. microtome
US7695752B2 (en) 2003-01-24 2010-04-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target activated microtransfer
AU2003256803B2 (en) 2003-01-24 2009-09-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target activated microtransfer
AU2004235298A1 (en) * 2003-04-25 2004-11-11 Janssen Pharmaceutica N.V. Preservation of RNA in a biological sample
WO2008021202A2 (en) * 2006-08-11 2008-02-21 The Regents Of The University Of California Capillary-based cell and tissue acquisition system (ctas)
DE102007030320B4 (en) * 2007-06-29 2015-04-02 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Laser microdissection and laser microdissection
WO2009039192A2 (en) 2007-09-17 2009-03-26 The Regents Of The University Of Californina Internalizing human monoclonal antibodies targeting prostate cancer cells in situ
TWI358278B (en) * 2008-12-22 2012-02-21 Chien Ming Chen Laser capture microdissection system and electric
WO2015199976A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Target activated microdissection
JPWO2016163385A1 (en) * 2015-04-06 2018-02-22 国立大学法人名古屋大学 Devices used laser microdissection apparatus, the analyzer comprising a laser microdissection device, sampling method, 及 laser microdissection device

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4629687A (en) 1982-07-29 1986-12-16 Board Of Trustees Of Michigan State University Positive selection sorting of cells
US4624915A (en) 1982-07-29 1986-11-25 Board Of Trustees Of Michigan State University Positive selection sorting of cells
US5281517A (en) 1985-11-04 1994-01-25 Cell Analysis Systems, Inc. Methods for immunoploidy analysis
US5202230A (en) 1990-09-07 1993-04-13 Kamentsky Louis A Methods of detecting cut cells in a tissue section
US5665582A (en) 1990-10-29 1997-09-09 Dekalb Genetics Corp. Isolation of biological materials
US5817462A (en) 1995-02-21 1998-10-06 Applied Spectral Imaging Method for simultaneous detection of multiple fluorophores for in situ hybridization and multicolor chromosome painting and banding
US5843657A (en) * 1994-03-01 1998-12-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Isolation of cellular material under microscopic visualization
US5843644A (en) 1994-03-01 1998-12-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Isolation of cellular material under microscopic visualization using an adhesive/extraction reagent tipped probe
US6251516B1 (en) * 1994-03-01 2001-06-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Isolation of cellular material under microscopic visualization
US6251467B1 (en) * 1994-03-01 2001-06-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Isolation of cellular material under microscopic visualization
US5723290A (en) 1994-11-03 1998-03-03 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for profiling mRNA expression in neurites
US5759781A (en) 1995-12-22 1998-06-02 Yale University Multiparametric fluorescence in situ hybridization
US5859699A (en) 1997-02-07 1999-01-12 Arcturus Engineering, Inc. Laser capture microdissection analysis vessel
US6469779B2 (en) * 1997-02-07 2002-10-22 Arcturus Engineering, Inc. Laser capture microdissection method and apparatus
US6100051A (en) * 1997-06-27 2000-08-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method utilizing convex geometry for laser capture microdissection
US5985085A (en) * 1997-10-01 1999-11-16 Arcturus Engineering, Inc. Method of manufacturing consumable for laser capture microdissection
US6720191B1 (en) * 1998-02-03 2004-04-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Mechanical handling systems for laser capture microdissection
ES2230877T3 (en) * 1998-07-30 2005-05-01 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Microdissection precision laser capture using short pulse length.
US6743601B1 (en) * 1998-12-10 2004-06-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Non-contact laser capture microdissection

Also Published As

Publication number Publication date
US6897038B2 (en) 2005-05-24
DE69920718D1 (en) 2004-11-04
AT278183T (en) 2004-10-15
CA2337900C (en) 2004-05-11
US20030008322A1 (en) 2003-01-09
US6420132B1 (en) 2002-07-16
JP4387594B2 (en) 2009-12-16
AU5240499A (en) 2000-02-21
WO2000006992A1 (en) 2000-02-10
EP1101094B1 (en) 2004-09-29
EP1101094A1 (en) 2001-05-23
DE69920718T2 (en) 2005-10-20
CA2337900A1 (en) 2000-02-10
JP2002521687A (en) 2002-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Denk et al. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick
US7927865B2 (en) Microfluidic devices for use in the assaying of biological fluids
JP5512579B2 (en) Optical device
Misawa et al. Three‐dimensional optical trapping and laser ablation of a single polymer latex particle in water
CA2384964C (en) Method for linking two plastic work pieces without using foreign matter
JP5389782B2 (en) Cell sorting system and method
EP0500717B2 (en) Two-photon laser scanning microscopy
Rieder et al. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores.
Puppels et al. Laser irradiation and Raman spectroscopy of single living cells and chromosomes: sample degradation occurs with 514.5 nm but not with 660 nm laser light
ES2646622T3 (en) System and method of sorting materials using laser holographic address
US8640555B2 (en) Performance
König INTRACELLULAR NANOSURGERY WITH NEAR INFRARED FEMTOSECOND LASER PULSES K. KÖNIG “, I. RIEMANN, P. FISCHER and K.-J. HALBHUBER
ES2197994T3 (en) Destelleante sheet retroreflective cube-corner.
Grover et al. Automated single-cell sorting system based on optical trapping
US7279136B2 (en) Metering technique for lateral flow assay devices
US5079169A (en) Method for optically manipulating polymer filaments
US20100323392A1 (en) Metering Technique for Lateral Flow Assay Devices
US6879394B2 (en) Multi-photon imaging installation
CN101418280B (en) Sperm populations with high purity x- and y- chromosome chromosomes
US8835802B2 (en) Cleaving wafers from silicon crystals
Greulich Micromanipulation by light in biology and medicine: the laser microbeam and optical tweezers
König Multiphoton microscopy in life sciences
US7588940B2 (en) Apparatus and method for fabricating, sorting, and integrating materials with holographic optical traps
US20070069119A1 (en) Optical trapping with a semiconductor
Salehi-Reyhani et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection