DE102007030320B4 - Laser microdissection and laser microdissection - Google Patents

Laser microdissection and laser microdissection

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DE102007030320B4
DE102007030320B4 DE200710030320 DE102007030320A DE102007030320B4 DE 102007030320 B4 DE102007030320 B4 DE 102007030320B4 DE 200710030320 DE200710030320 DE 200710030320 DE 102007030320 A DE102007030320 A DE 102007030320A DE 102007030320 B4 DE102007030320 B4 DE 102007030320B4
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    • G01N2001/2886Laser cutting, e.g. tissue catapult

Abstract

Laser-Mikrodissektionsverfahren, Laser microdissection,
wobei sich ein biologische Objekt auf einem Träger (104) befindet, der biologisches Material aufweist, von welchem das biologische Objekt separiert werden soll, und wherein a biological object is located on a support (104) comprising biological material from which the biological object to be separated, and
wobei mit einer Laserquelle (103) ein Laserstrahl erzeugt wird, wherein a laser beam is generated with a laser source (103)
dadurch gekennzeichnet, dass characterized, in that
das von dem biologischen Material zu separierende biologische Objekt automatisch von mehreren Laserpulsen nacheinander bestrahlt wird, wobei die Laserpulse auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers (104) eingestrahlt werden, um das biologische Objekt mittels eines von den Laserpulsen ausgelösten laserinduzierten Transportprozesses von dem Träger zu einer Auffangvorrichtung (110) zu transportieren. the biological of the biological material to be separated object is automatically irradiated with several laser pulses one after the other, wherein the laser pulses are radiated on a substantially same area of ​​the carrier (104) to the biological object by means of a triggered by the laser pulses, laser induced transport process from the carrier to a collecting device (110) to transport.

Description

  • [0001]
    Die vorliegende Erfindung betrifft ein Laser-Mikrodissektionsverfahren und ein Laser-Mikrodissektionssystem. The present invention relates to a laser microdissection and a laser microdissection system. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Laser-Mikrodissektionsverfahren zum Separieren eines biologischen Objekts von einem biologischen Material, sowie ein Laser-Mikrodissektionssystem zum Durchführen des Laser-Mikrodissektionsverfahrens. In particular, the present invention relates to a laser microdissection method for separating a biological specimen of a biological material, and a laser microdissection system for performing the laser Mikrodissektionsverfahrens.
  • [0002]
    Mit einem Laser-Mikrodissektionssystem ist es möglich, ein biologisches Objekt von einer umgebenden biologischen Materie zu separieren, und zu einer Auffangvorrichtung zu transportieren. With a laser microdissection system, it is possible to separate a biological object from a surrounding biological matter, and to transport them to a collecting device. Der selektive Transport und das Auffangen des biologischen Objekts in einem Rezipienten ermöglichen eine Aufbewahrung, Weiterverarbeitung oder Analyse ausgewählter biologischer Objekte. The selective transport and collection of the biological object in a recipient permit storage, further processing or analysis of selected biological objects. So ist es beispielsweise möglich, Zellen mit einer besonderen Morphologie für eine Analyse gezielt zu isolieren. So it is for example possible to isolate cells with a specific morphology for an analysis targeted.
  • [0003]
    Als ein herkömmliches Verfahren zum Separieren von biologischen Objekten ist die Manipulation der biologischen Objekte mit einer Mikropipette bekannt. As a conventional method for separating biological objects the manipulation of biological objects with a micropipette is known. Jedoch ist dafür eine aufwändige Halterungsvorrichtung nötig, um die Mikropipette präzise zu platzieren. However, for an elaborate mounting device is necessary to place the micropipette accurate. Auch erfolgt die Manipulation eines biologischen Objekts mit einer Mikropipette weder steril noch berührungslos. The manipulation of a biological object with a micropipette is contact neither sterile nor. Weiterhin ist es mit einer solchen Technik überaus schwierig, Zellen beispielsweise aus einem histologischen Gewebepräparat zu lösen. Furthermore, it is extremely difficult with such a technique to solve, for example, cells from a histological tissue preparation.
  • [0004]
    In der In the WO 97/29355 A1 WO 97/29355 A1 der Anmelderin wird ein Verfahren und eine Vorrichtung zur berührungslosen Mikroinjektion sowie zum Sortieren und zur Gewinnung von planar aufgebrachten biologischen Objekten mit Laserstrahlen beschrieben. of the Applicant, a method and apparatus for non-contact micro-injection, and for sorting and for obtaining planar applied biological objects with laser beams. Mit diesem Verfahren können aus einer sehr großen Anzahl von Objekten einzelne Objekte räumlich abgetrennt und aussortiert werden, insbesondere biologische Objekte. With this method, individual objects may be spatially separated and screened from a very large number of objects, especially biological objects. Die biologischen Objekte befinden sich auf einer Trägerfolie. The biological properties are located on a carrier film. Bei dem Verfahren wird ein Bereich der Trägerfolie mit einem Laserstrahl ausgeschnitten, auf dem sich das selektierte biologische Objekt befindet, und dieser Bereich wird durch Einstrahlen eines Laserpulses zu einem Rezipienten transportiert. In the method an area of ​​the carrier film is cut with a laser beam, on which the selected biological object is located and this area is transported by irradiating a laser pulse to a recipient. Dieser durch Bestrahlung mit einem Laserpuls ausgelöste Transportprozess wird im Allgemeinen als Katapultieren bezeichnet. This triggered by irradiation with a laser pulse transport process is generally referred to as catapulting. Für den Transport wird im Allgemeinen derselbe Laserstrahl wie für das Ausschneiden verwendet, jedoch wird er leicht defokussiert und die Laserenergie erhöht. For transport in general, the same laser beam is used as for the cut, but it is slightly defocused and increases the laser energy. Obwohl sich das Verfahren und die Vorrichtung sehr gut zum Ausschneiden von selektierten Bereichen von biologischem Material eignet, besteht jedoch der beträchtliche Nachteil, dass das Transportieren des ausgeschnittenen biologischen Materials zum Rezipienten in einer erheblichen Anzahl von Fällen nicht erfolgreich stattfindet. Although the method and apparatus is very well suited for cutting out selected portions of biological material, however, there is the considerable disadvantage that the transporting of the cut-biological material to the recipient in a significant number of cases does not take place successfully. Der Transportvorgang muss vom Benutzer kontrolliert und bei Misserfolg gegebenenfalls wiederholt werden. The transport process must be controlled by the user and repeated if unsuccessful, if necessary.
  • [0005]
    Die The WO 03/036266 A1 WO 03/036266 A1 der Anmelderin beschreibt ein Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels Laserbestrahlung und ein Steuersystem zur Durchführung des Verfahrens. of the Applicant describes a method for processing a mass by means of laser irradiation and a control system for implementing the method. Bei dem Verfahren wird ebenfalls ein Bereich einer vorzugsweise biologischen Masse ausgeschnitten und/oder transportiert, wobei sowohl das Ausschneiden als auch das Transportieren rechnergestützt erfolgen. In the method, a region is also cut out of a preferably biological mass and / or transported, whereby both the cutting and transporting carried out with computer assistance. Es werden drei Verfahren zum Transport eines selektierten Bereichs angegeben. There are given three methods for transporting a selected area. Bei einem Verfahren wird der selektierte Bereich durch den Laserstrahl komplett ausgeschnitten, und das ausgeschnittene Material wird durch Bestrahlung mit einem gezielt platzierten Laserpuls zum Rezipienten transportiert. In one method, the selected area is completely cut by the laser beam, and the cut material is conveyed by irradiation with a laser pulse strategically placed to the recipient. Bei einem weiteren Verfahren wird das selektierte Objekt bis auf eine ca. 1–2 μm dünne Verbindung (Steg) ausgeschnitten. In another method, the selected object to a 1-2 micron thin connection (bridge) is cut out. Das Einstrahlen des Laserpulses für den Transport erfolgt dann in dem Bereich der dünnen Verbindung am Rande des Objektes. The irradiation of the laser pulse for the transport then takes place in the region of the thin connecting at the edge of the object. Bei einem dritten Verfahren wird das Objekt direkt katapultiert, dh ohne den selektierten Bereich zuvor auszuschneiden. In a third method, the object is catapulted directly, ie without the selected area to cut out previously. Durch Einstrahlen eines Laserpulses auf den ausgewählten Bereich wird die darauf befindliche biologische Materie direkt transportiert. the biological matter thereon is transported directly by irradiating a laser pulse on the selected area. Ist der transportierte Bereich kleiner als der selektierte Bereich, kann durch Verfahren des Substrathalters der selektierte Bereich abgerastert werden, wobei bei jeder Position ein Laserpuls eingestrahlt wird. If the transported area smaller than the selected range, the selected range can be scanned by moving the substrate holder, wherein at each position of a laser pulse is irradiated. Ein nicht erfolgreicher Transport muss von einem Benutzer festgestellt werden. An unsuccessful transport must be established by a user. In diesem Fall wird die Laserleistung erhöht und ein erneuter Laserbeschuss ausgeführt. In this case, the laser power is increased and a new laser bombardment executed. Dieses Vorgehen ist unvorteilhaft, zum einen, da ein solches Vorgehen sehr zeitaufwändig ist, zum anderen, da das zu transportierende Material durch den mehrfachen Laserbeschuss stark durch die Laserstrahlung belastet werden kann. This procedure is disadvantageous, on the one hand, since such a procedure is very time consuming, and secondly because the transported material can be adversely affected by the multiple laser bombardment heavily by the laser radiation. Insbesondere die erneute Bestrahlung eines nicht vollständig ausgeschnittenen Bereichs mit erhöhter Laserleistung führt zu einer unnötig hohen Belastung der Transportimpuls-Stelle, beispielsweise des Stegs zwischen dem ausgeschnittenen Material und dem restlichen Material. In particular, the re-irradiation of a not fully cut-out portion with increased laser power leads to an unnecessarily high loading of the feed pulse location, for example the web between the cut material and the remaining material. Diese Belastung ist vorwiegend thermischer Natur und kann sich beispielsweise durch Anschmelzen einer dem biologischen Objekt unterliegenden Substratfolie bemerkbar machen. This load is primarily thermal in nature and can be felt, for example, by melting an underlying the biological object substrate film. Die thermische Belastung der Transportimpulsstelle des biologischen Objektes kann dazu führen, dass dieser Bereich beispielsweise für eine DNA-Extraktion nicht mehr verwendet werden kann, da DNA in diesem Bereich denaturiert ist. The thermal load of the feed pulse site of the biological object may result in that this area can not be used, for example for DNA extraction, because DNA is denatured in this area.
  • [0006]
    Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Laser-Mikrodissektionsverfahren bereitzustellen, mit dem ein erfolgreicher Transport eines von einem biologischen Material zu separierenden biologischen Objekts gewährleistet wird, ohne dass dabei die thermische Belastung der Transportimpulsstelle des biologischen Objekts wesentlich erhöht wird, und ohne dass ein manuelles Eingreifen eines Benutzers nötig ist. The present invention therefore has for its object to provide an improved laser microdissection method by which a successful transport of a is provided by a biological material to be separated biological object, without damaging the thermal load of the feed pulse site of the biological object is increased substantially, and without that manual user intervention is required. Es ist weiterhin eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Laser-Mikrodissektionssystem bereitzustellen, mit dem das Laser-Mikrodissektionsverfahren durchgeführt werden kann. It is a further object of the present invention to provide an improved laser microdissection system with which the laser microdissection method can be carried out.
  • [0007]
    Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Laser-Mikrodissektionsverfahren nach Anspruch 1 bzw. ein Laser-Mikrodissektionssystem nach Anspruch 14 gelöst. This object is inventively achieved by a laser microdissection method according to claim 1 and a laser microdissection system according to claim fourteenth Die Unteransprüche definieren jeweils bevorzugte und vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. The subclaims each define preferred and advantageous embodiments of the present invention.
  • [0008]
    Erfindungsgemäß befindet sich ein biologisches Objekt auf einem Träger, der biologisches Material aufweist, von welchem das biologische Objekt separiert werden soll. According to the invention there is a biological object on a support comprising biological material from which the biological object to be separated. Weiterhin wird mit einer Laserquelle ein Laserstrahl erzeugt. Further, a laser beam is generated with a laser source. Das von dem biologischen Material zu separierende biologische Objekt wird automatisch von mehreren Laserpulsen nacheinander bestrahlt, wobei die Laserpulse auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers eingestrahlt werden, um das biologische Objekt mittels eines von den Laserpulsen ausgelösten laserinduzierten Transportprozesses von dem Träger zu einer Auffangvorrichtung transportieren. The biological of the biological material to be separated object is automatically irradiated with several laser pulses one after the other, wherein the laser pulses are radiated on a substantially equal portion of the carrier to transport the biological object by means of a triggered by the laser pulses, laser induced transport process from the carrier to a collecting device , Durch das automatische Einstrahlen mehrerer Laserpulse nacheinander auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers kann mit dem erfindungsgemäßen Laser-Mikrodissektionsverfahren eine wesentlich höhere Erfolgsquote des Transports des biologischen Objekts erzielt werden als bei herkömmlichen Verfahren, die nur einen Laserpuls für den Transport verwenden. By automatically irradiating a plurality of laser pulses one after the other on a substantially same region of the wearer a much higher success rate of transport of the biological object can be achieved than in conventional methods that use only one laser pulse for transport with the inventive laser microdissection. Aufgrund der erhöhten Erfolgsquote des laserinduzierten Transportes ist es in der Regel nicht nötig, manuell eine weitere Bestrahlung des biologischen Objekts vorzunehmen. Due to the increased success rate of laser-induced transport it is not usually necessary to manually perform another exposure of the biological object. Dadurch wird zum einen der Zeitaufwand für einen Anwender des Laser-Mikrodissektionsverfahrens verringert, zum anderen wird dadurch eine unnötig hohe Belastung der Transportimpulsstelle des zu separierenden biologischen Objekts vermieden. Thereby, the time required for a user of the laser is reduced to a Mikrodissektionsverfahrens, characterized an unnecessarily high loading of the transport position of the pulse to be separated biological object is avoided to the other. Bei herkömmlichen Verfahren erfolgt das erneute manuelle Einstrahlen eines Pulses im Allgemeinen mit einer höheren Energie, wohingegen bei dem erfindungsgemäßen Laser-Mikrodissektionsverfahren vorzugsweise Pulse mit einer gleichen Energie eingestrahlt werden, wodurch folglich die thermische Belastung des bestrahlten Bereichs geringer ist. In conventional methods, the manual re-radiating a pulse generally at a higher energy occurs, whereas preferably pulses with a same energy are irradiated in the inventive laser microdissection, whereby consequently the thermal load of the irradiated area is reduced.
  • [0009]
    Vorzugsweise werden die nacheinander eingestrahlten Laserpulse für den Transport des biologischen Objekts auf ein und dieselbe Stelle des Trägers eingestrahlt. Preferably, the sequentially irradiated laser pulses are radiated for the transport of the biological object at one and the same point of the carrier. Während des Einstrahlens der Laserpulse wird also weder ein Halter verfahren, der den Träger hält, noch die Position des Laserstrahls verändert. During the irradiating of the laser pulses neither procedure is a holder that holds the carrier, changed the position of the laser beam. Das Einstrahlen der Laserpulse auf ein und dieselbe Stelle des Trägers ermöglicht das Transportieren des biologischen Objekts mit einer hohen Erfolgsquote. The irradiation of the laser pulses on one and the same point of the support allows transporting the biological object with a high success rate.
  • [0010]
    Die Laserpulse werden vorzugsweise durch Ansteuern der Laserquelle erzeugt. The laser pulses are preferably generated by driving the laser source. Die Laserquelle wird dabei so angesteuert, dass sie eine vorbestimmte Zahl von Laserpulsen mit einer vorbestimmten Energie emittiert. The laser source is then controlled so that it emits a predetermined number of laser pulses having a predetermined energy. Die Energie der Laserpulse kann auch durch Ansteuern eines elektrisch verstellbaren Filters eingestellt werden. The energy of the laser pulses can also be adjusted by controlling an electrically adjustable filter. Beispielsweise kann ein neutraler Dichtefilter oder ein polarisationsabhängiger Filter im Strahlengang platziert werden. For example, a neutral density filter or a polarization-dependent filter in the beam path can be placed. Durch diese Maßnahmen wird ein präzises Einstellen der Energie der Laserpulse ermöglicht. Through these measures, a precise adjustment of the energy of the laser pulses is possible. Vorzugsweise erfolgt das Ansteuern der Laserquelle und/oder des Filters derart, dass 2–10 Pulse mit einer Frequenz von 80–120 Hz und vorzugsweise 95–105 Hz eingestrahlt werden. Preferably, the driving of the laser source and / or of the filter is such that 2-10 pulses at a frequency of 80-120 Hz, preferably 95-105 Hz are radiated. Die Pulsenergie kann 1–20 μJ betragen. The pulse energy can be 1-20 .mu.J. Die Pulsenergie bezieht sich dabei auf die auf den Träger eingestrahlte Pulsenergie, die im Allgemeinen aufgrund optischer Elemente zum Ablenken und Fokussieren des Laserstrahls geringer ist als die von der Laserquelle emittierte Pulsenergie. The pulse energy refers to the irradiated onto the carrier pulse energy, due to the optical elements for deflecting and focusing the laser beam is generally less than the pulse energy emitted from the laser source. Die Wahl der Pulsparameter wie beispielsweise der Anzahl der Pulse und die Pulsenergie wird im Allgemeinen von der Art und Beschaffenheit des Präparats abhängen, das das biologische Material und das zu separierende biologische Objekt umfasst, sowie von den Mikroskopeinstellungen des Laser-Mikrodissektionssystems, wie beispielsweise dem für das Fokussieren des Laserstrahls verwendete Objektiv. The choice of the pulse parameters such as the number of pulses and the pulse energy will generally depend upon the type and nature of the preparation, which comprises the biological material and to be separated biological object, as well as by the microscope settings of the laser microdissection system, such as the for focusing the laser beam lens used. Vorzugsweise werden vor dem Transport des biologischen Objekts Probetransporte durchgeführt, um eine Energie der Laserpulse zu bestimmen, die notwendig ist, um das biologische Objekt zu transportieren. Preferably, the sample transport operations are performed to determine a power of the laser pulses necessary to transport the biological object before transportation of the biological object. Beispielsweise werden mehrere Bereiche des biologischen Materials mit jeweils unterschiedlichen Laserpulsenergien bestrahlt, wobei für einen nachfolgenden Transport des biologischen Objekts die geringste Laserpulsenergie verwendet wird, mit der ein Transport eines der Bereiche stattgefunden hat. For example, a plurality of regions of the biological material with the lowest laser pulse energy is used for a subsequent transportation of the biological object, with a transport one of the regions has taken place to be irradiated, each with different laser pulse energies. Somit wird die thermische Belastung des biologischen Objekts gering gehalten. Thus, the thermal loading of the biological object is kept low. Es kann auch eine um 10–20% höhere als die vorab genannte Laserpulsenergie verwendet werden, um die Erfolgsquote weiter zu verbessern. It can also be used a 10-20% higher than the laser pulse energy previously mentioned, in order to improve the success rate on.
  • [0011]
    Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Energie aufeinander folgender Laserpulse, die für den Transport des biologischen Objekts automatisch nacheinander eingestrahlt werden, verändert. According to a further aspect of the invention, the energy of consecutive laser pulses are radiated automatically for the transport of biological object successively changed. Beispielsweise ist es vorstellbar, dass ein biologisches Objekt, für dessen Transport eine Mindestenergie notwendig ist, mit einer Pulsfolge bestrahlt wird, bei der die Energie aufeinander folgender Laserpulse erhöht wird. For example, it is conceivable that a biological object, a minimum energy is required for its transport, is irradiated with a pulse sequence in which the energy of consecutive laser pulses is increased. Dadurch wird das Teilchen mit dem Puls transportiert, der eine Energie aufweist, die nur unwesentlich höher als die für den Transport benötigte Mindestenergie ist. Thereby the particle is transported with the pulse having an energy that is only slightly higher than the minimum energy required for transport. Nachfolgend eingestrahlte Pulse mit höheren Energien treffen also nicht mehr auf das biologische Objekt, da dieses bereits von dem Träger wegtransportiert wurde. Subsequently irradiated pulses with higher energies therefore no longer meet the biological object, as this has already been transported away from the support. Dies hat den Vorteil, dass das biologische Objekt nicht mit Laserpulsen bestrahlt wird, deren Energie höher ist als die für den Transport des biologischen Objektes benötigte Mindestenergie. This has the advantage that the biological object is not irradiated with laser pulses, whose energy is higher than the minimum energy required for the transport of the biological object to advantage. Gleichermaßen kann eine zu hohe thermische Belastung bei biologischen Objekten vermieden werden, die mit den ersten Pulsen bereits teilweise aus dem biologischen Material herausgelöst werden und anschließend nur noch Laserpulse geringerer Energie benötigen, um von dem Träger wegtransportiert zu werden. Likewise, a too high thermal load on biological objects can be avoided, which are dissolved with the first pulses already partially from the biological material, and then only require laser pulses of lower energy to be transported away from the support. Für solch ein biologisches Objekt kann beispielsweise eine Pulssequenz verwendet werden, bei der die Energie aufeinander folgender Laserpulse erniedrigt wird. For such a biological object, a pulse sequence can be used, for example, in which the energy of consecutive laser pulses is lowered.
  • [0012]
    Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das biologische Objekt vor dem Einstrahlen der Laserpulse für den Transport des biologischen Objekts mittels eines Laserstrahls vollständig aus dem biologischen Material ausgeschnitten, so dass das biologische Objekt im Wesentlichen freipräpariert ist. According to a preferred embodiment of the invention the biological object is completely cut out before the irradiation of the laser pulses for the transport of the biological object by means of a laser beam from the biological material such that the biological object is dissected substantially. Als Träger kann beispielsweise ein mit einer UV-absorbierenden Polymerfolie beschichteter Glasobjektträger verwendet werden, wobei das sich auf dem Träger befindliche biologische Objekt mittels eines von einem gepulsten UV-Laser emittierten Laserstrahls aus dem biologischen Material entlang einer vorgegebenen geschlossenen Schnittkurve ausgeschnitten wird. As a carrier, for example, a coated with a UV absorbing polymer film glass slides can be used, wherein the located on the carrier biological object excised from the biological material along a predetermined closed curve of intersection by means of a radiation emitted by a pulsed UV-laser beam. Die Laserpulse für den Transport können nun beispielsweise in die Mitte des ausgeschnittenen biologischen Objektes platziert werden. The laser pulses for transport can now be placed for example in the middle of the cut biological object. Der Vorteil des Ausschneidens liegt darin, dass das biologische Objekt sauber von dem umgebenden biologischen Material abgetrennt werden kann, sowie dass geringere Pulsenergien für den Transport des biologischen Objekts verwendet werden können. The advantage of cutting is that the biological object can be cleanly separated from the surrounding biological material, and that smaller pulse energies can be used for the transport of the biological object.
  • [0013]
    Nach einer weiteren Ausführungsform wird das biologische Objekt mittels eines Laserstrahls bis auf einen Steg aus dem biologischen Material ausgeschnitten. According to a further embodiment, the biological object is cut by a laser beam except for a web from the biological material. Die Laserpulse für einen nachfolgenden Transport des biologischen Objekts werden vorzugsweise auf den Steg eingestrahlt. The laser pulses for a subsequent transportation of the biological object are preferably irradiated to the web. Indem beim Ausschneiden eine dünne Verbindung in Form des Stegs zwischen der umgebenden biologischen Masse und dem biologischen Objekt stehengelassen wird, kann ein ungewolltes Herausfallen oder Verschieben des ausgeschnittenen biologischen Objektes vor dem eigentlichen Transportvorgang vermieden werden. By applying a thin compound is allowed to stand in the form of the web between the surrounding biological mass and the biological object when cutting, it falling out or moving of the cut biological object before the actual transporting operation can be avoided.
  • [0014]
    Zweckmäßig ist es, dass das biologische Objekt mit Laserpulsen von derselben Laserquelle ausgeschnitten und transportiert wird. It is expedient that the biological object is cut with laser pulses from the same laser source and transported is. Vorteilhaft wird nach dem Ausschneiden die Energie der Laserpulse derart eingestellt, dass die Energie der Laserpulse für den Transport geringer oder im Wesentlichen dieselbe ist wie die Energie der Laserpulse für das Ausschneiden. the energy of the laser pulses is advantageously adjusted such that the energy of the laser pulses is the same low for the transport or substantially as the energy of the laser pulses for the cut after the cutting. Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren, bei welchen die Energie des Laserpulses für den Transport im Vergleich zu der Laserpulsenergie für das Ausschneiden erhöht ist, ergibt sich hier der Vorteil, dass eine geringere oder im Wesentlichen gleiche Laserpulsenergie für den Transport verwendet werden kann, wodurch wiederum die thermische Belastung des biologischen Objekts reduziert wird. In contrast to conventional processes in which the energy of the laser pulse is increased for transportation in comparison to the laser pulse energy for cutting, the result is the advantage that a smaller or substantially the same laser pulse energy can be used for the transport, which in turn thermal loading of the biological object is reduced. Der Transport des biologischen Objekts mit einer geringeren Laserpulsenergie wird durch das Einstrahlen mehrerer Laserpulse auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich ermöglicht. The transport of the biological object at a lower laser pulse energy is made possible by irradiating a plurality of laser pulses on a substantially same area.
  • [0015]
    Es ist vorteilhaft, wenn die Laserpulse für den Transport in einer Ebene fokussiert werden, die 1–5 μm in axialer Richtung ober- oder unterhalb einer Objektebene liegt, in welcher sich das biologische Objekt befindet. It is advantageous if the laser pulses are focused for the transport in a plane which is above 1-5 microns in the axial direction or is below an object plane, in which the biological object is located. Dadurch wird es möglich, das biologische Objekt im Gegensatz zum Ausschneiden, bei dem der Fokus des Laserstrahls in der Ebene des biologischen Objekts liegt und das biologische Objekt durchlöchert wird, mittels der eingestrahlten Laserpulse zu transportieren. This makes it possible to transport the biological object, in contrast to cutting out, at which the focus of the laser beam lies in the plane of the biological object, and the biological object is perforated, by means of the irradiated laser pulses.
  • [0016]
    Nach einer weiteren Ausführungsform wird das biologische Objekt mit mehreren Laserpulsen bestrahlt, die auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers eingestrahlt werden, um das biologische Objekt direkt aus dem biologischen Material herauszulösen und zu der Auffangvorrichtung zu transportieren. According to a further embodiment, the biological object is irradiated with several laser pulses are radiated on a substantially same area of ​​the substrate to extract the biological object directly from the biological material, and to transport it to the collection device. Bei dieser Ausführungsform erfolgt also kein Ausschneidevorgang vor dem Transport des biologischen Objekts. In this embodiment, so no cut operation is carried out before transporting the biological object. Vielmehr wird das biologische Objekt durch Einstrahlen der Laserpulse sowohl aus dem biologischen Material herausgelöst als auch zu der Auffangvorrichtung transportiert. Rather, the biological object is removed by irradiating the laser pulses both from the biological material as well as transported to the collecting device. Der Vorteil des Verfahrens liegt in der Geschwindigkeit, mit der das biologische Objekt von dem biologischen Material separiert werden kann. The advantage of the method lies in the speed with which the biological object from the biological material can be separated. Biologische Objekte, die größer sind als der Bereich, der durch das Einstrahlen der Laserpulse transportiert wird, können durch rasterförmiges Abfahren in Teilen transportiert werden. Biological objects that are larger than the area that is transported by the irradiation of the laser pulses can be transported by grid-like retraction in parts.
  • [0017]
    Vorzugsweise erfolgt das Einstrahlen der Laserpulse rechnergestützt, wobei mehrere zuvor selektierte biologische Objekte mit jeweils mehreren Laserpulsen im selben Bereich bestrahlt werden, um diese biologischen Objekte zu einer Auffangvorrichtung zu transportieren. Preferably, the irradiation of the laser pulses is performed with computer assistance, wherein a plurality of previously selected biological objects are irradiated with a respective plurality of laser pulses in the same area in order to transport these biological properties to a collecting device. Somit können mehrere biologische Objekte zügig von einem biologischen Material separiert werden, ohne dass eine Benutzereingabe nach jedem Transportvorgang erforderlich ist. Thus, a plurality of biological objects can be rapidly separated from a biological material, without user input after each transport operation is required. Von besonderem Vorteil ist dabei, dass die Erfolgsquote für den Transport der selektierten biologischen Objekte aufgrund des Einstrahlens mehrerer Laserpulse für den Transport jeweils eines biologischen Objekts erhöht ist, wodurch dem Benutzer eine Zeitersparnis entsteht, da er weniger fehlgeschlagene Transportvorgänge manuell wiederholen muss. Of particular advantage here is that the success rate for the transport of selected biological objects is increased because of irradiating a plurality of laser pulses to transport each of a biological object, thereby creating a time saving the user because he must repeat less failed transport processes manually.
  • [0018]
    Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Laser-Mikrodissektionssystem bereitgestellt, mit einer Laserquelle und mit einem Halter zum Aufnehmen eines Trägers mit einem biologischen Material, das ein von dem biologischen Material zu separierendes biologisches Objekt umfasst, und die weiterhin eine Steuereinheit umfasst, welche derart ausgestaltet ist, dass sie das Einstrahlen von Laserpulsen derart steuert, dass das von dem biologischen Material zu separierende biologische Objekt automatisch von mehreren Laserpulsen nacheinander bestrahlt wird, wobei die Laserpulse auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers eingestrahlt werden, um das biologische Objekt mittels eines von den Laserpulsen ausgelösten laserinduzierten Transportprozesses von dem Träger zu einer Auffangvorrichtung zu transportieren. According to the invention, a laser microdissection system is further provided, further comprising a laser source and a holder for receiving a support with a biological material, comprising a from the biological material to separierendes biological object, and a control unit which is designed such that it controls the irradiation of laser pulses such that the biological of the biological material to be separated object is automatically irradiated with several laser pulses one after the other, wherein the laser pulses are radiated on a substantially same region of the wearer caused the biological object by means of one of the laser pulses to transport laser induced transport process from the carrier to a collecting device. Das erfindungsgemäße Laser-Mikrodissektionssystem ermöglicht den erfolgreichen Transport des biologischen Objekts, ohne dass der Transportvorgang manuell von einem Benutzer wiederholt werden muss. The laser microdissection system according to the invention allows the successful transport of the biological object, without the transport process must be manually repeated by a user. Weiterhin wird eine starke Belastung der Transportimpulsstelle vermieden, da kein weiterer Laserpuls mit stark erhöhter Energie eingestrahlt werden muss. Furthermore, a strong stress on the feed pulse point is avoided, since no other laser pulse must be irradiated with greatly increased energy. Vorzugsweise ist das Laser-Mikrodissektionssystem zum Durchführen eines der vorab genannten Verfahren ausgestaltet. Preferably, the laser microdissection system is configured for performing one of the methods previously mentioned.
  • [0019]
    Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein computerlesbares Speichermedium bereitgestellt, in dem ein Steuerprogramm zum rechnergestützten Steuern eines Laser-Mikrodissektionssystems gespeichert ist, wobei das Steuerprogramm zum Durchführen eines der vorab genannten Verfahren ausgestaltet ist. According to a further aspect of the invention a computer readable storage medium is provided, in which a control program is stored for computer-aided controlling a laser microdissection, wherein the control program is configured for performing one of the methods previously mentioned.
  • [0020]
    Die Erfindung wird nachfolgend näher unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels erläutert. The invention will be explained in more detail below with reference to the accompanying drawings based on a preferred embodiment.
  • [0021]
    1 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Laser-Mikrodissektionssystems, das eine Steuereinheit aufweist, die das Einstrahlen von Laserpulsen steuert. shows a schematic representation of a laser microdissection system, comprising a control unit that controls the irradiation of laser pulses.
  • [0022]
    2 2 zeigt ein Flussdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laser-Mikrodissektionsverfahrens. shows a flow diagram of an embodiment of the laser according to the invention Mikrodissektionsverfahrens.
  • [0023]
    3 3 zeigt zwei Abbildungen von biologischem Material, aus dem Bereiche ausgeschnitten wurden, wobei auf die ausgeschnittenen Bereiche ein Laserpuls (a) bzw. mehrere Laserpulse (b) eingestrahlt wurden. shows two pictures of biological material, were cut out from the areas where the cutout portions, a laser pulse (a) or a plurality of laser pulses (b) were irradiated.
  • [0024]
    Die in In the 1 1 gezeigte Ausführungsform eines Laser-Mikrodissektionssystems Embodiment of a laser microdissection system shown 100 100 umfasst ein Mikroskopsystem comprises a microscope system 101 101 , eine Steuereinheit , A controller 102 102 , eine Laserquelle A laser source 103 103 , sowie einen Träger And a carrier 104 104 , der biologisches Material sowie ein von dem biologischen Material zu separierendes biologisches Objekt aufweist. Having a biological material as well as to the biological material separierendes of biological object. Weiterhin ist das Laser-Mikrodissektionssystem Further, the laser microdissection 100 100 mit einer Eingabeeinheit having an input unit 105 105 und einer Anzeigeeinheit and a display unit 106 106 ausgestattet. fitted. Ein vergrößertes Abbild des sich auf dem Träger An enlarged image of himself on the carrier 104 104 befindenden biologischen Materials wird einem Benutzer des Laser-Mikrodissektionssystems that are available biological material is a user of the laser microdissection 100 100 mittels der Anzeigeeinheit by means of the display unit 106 106 zur Verfügung gestellt. made available. Mittels der Eingabeeinheit By means of the input unit 105 105 kann der Benutzer ein biologisches Objekt selektieren, das von dem biologischen Material separiert werden soll. the user can select a biological object which is to be separated from the biological material. Beispielsweise kann die Eingabeeinheit For example, the input unit 105 105 eine Maus umfassen, mit der der Benutzer den Umriss des zu separierenden biologischen Objektes auswählt. comprise a mouse with which the user selects the outline of the to be separated biological object. Weiterhin kann der Benutzer über die Eingabeeinheit Furthermore, the user can via the input unit 105 105 Parameter festlegen, mit denen der Transport des biologischen Objekts erfolgen soll. set parameters by which the transport of the biological object to be made. Beispielsweise kann hier selektiert werden, ob ein Ausschneidevorgang oder ein direkter Transport des biologischen Objektes durchgeführt werden soll, oder es kann die Anzahl und die Energie der für den Transport verwendeten Laserpulse eingestellt werden. For example, here are selected, whether a cut operation or a direct transport of the biological object to be performed, or it may be the number and the energy of the laser pulses used for the transport can be adjusted. Die Steuereinheit The control unit 102 102 steuert dann die Laserquelle then controls the laser source 103 103 derart an, dass diese die vorgegebene Anzahl an Laserpulsen emittiert. such that this emits the predetermined number of laser pulses. Der gepulste Laserstrahl, der von der Laserquelle The pulsed laser beam emitted from the laser source 103 103 emittiert wird, ist in is emitted, is in 1 1 als eine durchbrochene Linie gezeigt. shown as a broken line. Zum Einstellen der Energie der Laserpulse wird vorzugsweise ein Filter To adjust the energy of the laser pulses is preferably a filter 107 107 verwendet. used. Als Filter kann beispielsweise ein elektrisch verstellbarer neutraler Dichtefilter, wie eine logarithmisch bedampfte und mit einem Schrittmotor gekoppelte Glasplatte verwendet werden, wobei die Steuereinheit As a filter, for example, an electrically adjustable neutral density filter such as a log-evaporated and coupled with a stepping motor glass plate may be used, wherein the control unit 102 102 die Filterstärke und somit die Verringerung der Energie der Laserpulse steuert. the filter strength and thereby reduce the energy of the laser pulses controls. Es können jedoch auch andere Filter verwendet werden, wie beispielsweise auf Polarisation basierende Filter. However, it can be used other filters also how based for example on polarizing filter. Wichtig ist nur, dass eine präzise Einstellung der Energie der Laserpulse ermöglicht wird. It is only important that a precise adjustment of the energy of the laser pulses is possible. Der Laserstrahl tritt durch die Linse The laser beam passes through the lens 113 113 , wird von einem Objektiv , Is of a lens 108 108 fokussiert und trifft auf den Träger focused and is incident on the carrier 104 104 . , Im Strahlengang des Laserstrahls sind weitere optische Elemente vorgesehen, wie beispielsweise Spiegel oder Linsen, die hier aus Übersichtlichkeitsgründen nicht gezeigt sind. In the beam path of the laser, further optical elements are provided, such as mirrors or lenses, which are not shown here for reasons of clarity. Der Träger the carrier 104 104 wird von einem Halter is a holder of 109 109 gehalten, dessen Position mit der Steuereinheit maintained its position to the control unit 102 102 gesteuert werden kann. can be controlled. Zum Verfahren des Halters For moving the holder 109 109 können Schrittmotoren oder Piezoelemente eingesetzt werden, wodurch eine präzise Positionierung des Trägers Stepping motors or piezoelectric elements can be used, whereby a precise positioning of the support 104 104 ermöglicht wird. is made possible. Mittels des Halters By means of the holder 109 109 lässt sich so ein biologisches Objekt präzise relativ zu dem Laserstrahl positionieren. can thus be a biological object precisely positioned relative to the laser beam.
  • [0025]
    Das Mikroskopsystem The microscope system 101 101 kann als invertiertes oder aufrechtes Mikroskop ausgestaltet sein. can be configured as an inverted or upright microscope. Es weist die üblichen aber hier nicht näher beschriebenen Komponenten eines Mikroskops auf, wie beispielsweise eine Lichtquelle, einen Kondensor, eine Videokamera zum Aufnehmen eines durch das Objektiv It has the usual but not described in detail here components of a microscope, such as a light source, a condenser, a video camera for receiving a through the lens 108 108 vergrößerten Abbildes eines Präparats, eine Vorrichtung für Fluoreszenzmikroskopie oder ähnliche Komponenten. enlarged image of a preparation, a device for fluorescence microscopy or similar components. Das Mikroskopsystem The microscope system 101 101 weist des weiteren eine Auffangvorrichtung further comprises a collecting device 110 110 auf, die mit einer Positioniervorrichtung , which with a positioning device 111 111 positioniert werden kann. can be positioned. Die Positioniervorrichtung the positioning device 111 111 kann dabei sowohl für eine manuelle Kontrolle ausgebildet sein, als auch für ein automatisches von der Steuereinheit can be designed for manual control of both, and for an automatic by the control unit 102 102 kontrolliertes Positionieren. controlled position. Die Auffangvorrichtung The catcher 110 110 kann einen oder mehrere Auffangbehälter may include one or more collecting containers 112 112 umfassen, beispielsweise in Form einer Mikrotiter-Platte, von Kappen von Eppendorfbehältern oder von Eppendorfbehältern selbst, oder von anderen Behältern, die zum Auffangen eines biologischen Objekts dienen können. include, for example, in the form of a microtiter plate, caps of containers or Eppendorf Eppendorf containers themselves, or other containers that can be used for collecting a biological object.
  • [0026]
    Die Steuereinheit The control unit 102 102 kann beispielsweise als ein Computer ausgestaltet sein, wobei ein auf dem Computer ausgeführtes Computerprogrammprodukt die Komponenten des Laser-Mikrodissektionssystems may for example be configured as a computer, a program executed on the computer A computer program product, the components of the laser microdissection 100 100 steuert. controls.
  • [0027]
    Anhand des Flussdiagrams in Based on the Flussdiagrams in 2 2 soll eine Ausführungsform des Laser-Mikrodissektionsverfahrens genauer erläutert werden. will be explained in more detail an embodiment of the laser Mikrodissektionsverfahrens. In einem ersten Schritt In a first step 201 201 wählt ein Benutzer ein biologisches Objekt aus, das von einem biologischen Material separiert werden soll. a user selects from a biological object which is to be separated from a biological material. Dem Benutzer wird beispielsweise das biologische Material mit der Anzeigeeinheit The user, for example, the biological material to the display unit 106 106 in Form eines Bildschirms angezeigt, woraufhin der Benutzer mit einem Cursor, der von der Eingabeeinheit displayed in the form of a screen, prompting the user with a cursor from the input unit 105 105 in Form einer Maus oder ähnlichem gesteuert werden kann, ein zu separierendes biologisches Objekt auswählt. a separierendes to biological object can be controlled in the form of a mouse or the like, selects. Es können aber auch mehrere biologische Objekte ausgewählt werden, wobei diese durch Verfahren des Trägers but it can also be selected a plurality of biological objects, which by movement of the carrier 104 104 mit dem Halter with the holder 109 109 angefahren werden können. can be approached. In einem nächsten Schritt In a next step 202 202 wählt der Benutzer Transportparameter aus. the user selects transport parameters. Beispielsweise kann der Benutzer auswählen, ob vor dem Transportprozess ein Schneidevorgang erfolgen soll, oder wie viele Laserpulse für den Transport mit welcher Pulsenergie eingestrahlt werden sollen. For example, the user can choose whether to take place before the transport process, a cutting process, or how many laser pulses to be irradiated for the transport by which pulse energy. Die Schritte The steps 201 201 und and 202 202 können auch in umgekehrter Reihenfolge erfolgen. can also be done in reverse order. Wurde ein Ausschneidevorgang gewählt, so wird in einem Schritt A cut operation was selected, in a step 203 203 der Ausschneidevorgang durchgeführt. the cut operation performed. Zum Ausschneiden des selektierten biologischen Objekts wird von der Laserquelle For cutting out the selected biological object is from the laser source 103 103 ein gepulster Laserstrahl emittiert, und mit dem Objektiv a pulsed laser beam is emitted, and with the lens 108 108 in der Ebene des biologischen Materials fokussiert. focused in the plane of the biological material. Die axiale Position des Laserfokus relativ zum biologischen Material kann dabei entweder durch axiales Verschieben des Objekts The axial position of the laser focus relative to the biological material can take place either by axial displacement of the object 108 108 oder des Trägers or carrier 104 104 erfolgen, oder durch axiales Verschieben der Linse take place, or by axial displacement of the lens 113 113 , wobei die Positionierung des Laserfokus vorzugsweise rechnergestützt mittels der Steuereinheit Wherein the positioning of the laser focus, preferably computer-supported by means of the control unit 102 102 erfolgt. he follows. Der Laserfokus wird für den Ausschneidevorgang in die Ebene des biologischen Material oder einer dem biologischen Materials unterliegenden Membran gelegt. The laser focus is set for the cut operation in the level of biological material or a material underlying the biological membrane. Der Halter the holder 109 109 positioniert den Träger positioning the carrier 104 104 derart, dass der Laserstrahl auf die Linie trifft, entlang welcher das biologische Objekt ausgeschnitten werden soll. such that the laser beam strikes the line along which the biological object to be cut. Der Träger the carrier 104 104 wird mit dem Halter is with the holder 109 109 anschließend derart verfahren, dass der Laserfokus entlang der Schnittlinie das biologische Objekt ausschneidet. then moved such that the laser focus along the section line cuts the biological object. Alternativ ist es auch möglich, die Position des Trägers Alternatively, it is also possible for the position of the carrier 104 104 festzuhalten, und den Fokus des Laserstrahls entlang der Schnittlinie zum Ausschneiden des biologischen Objektes zu bewegen, beispielsweise durch das Ansteuern optischer Elemente im Strahlengang des Laserstrahls. hold, and to move the focus of the laser beam along the cutting line for cutting of the biological object, for example by driving optical elements in the beam path of the laser beam. Als Laserquelle The laser source 103 103 wird vorzugsweise im Frequenz-verdreifachter Nd:YAG-Laser mit einer Wellenlänge von 355 nm oder alternativ ein gepulster UV-Stickstofflaser verwendet. is preferably in the frequency-tripled Nd: YAG laser with a wavelength of 355 nm, or alternatively, a pulsed nitrogen laser UV. Es können jedoch auch andere Laser als Laserquelle verwendet werden, es ist nur wichtig, dass die emittierte Laserstrahlung geeignet ist, um biologisches Material mittels eines laserinduzierten Transportprozesses zu transportieren, und gegebenenfalls biologisches Material zu schneiden. However, other lasers are used as the laser source, it is only important that the emitted laser radiation is suited to transport biological material by a laser induced transport process, and optionally for cutting biological material.
  • [0028]
    Nach dem Ausschneiden des biologischen Objektes wird das biologische Objekt in einem nächsten Schritt After cutting of the biological object the biological object in a next step 204 204 derart positioniert, dass die Laserpulse für den Transport des biologischen Objekts auf einen vorbestimmten Bereich des biologischen Objekts eingestrahlt werden. positioned such that the laser pulses are radiated for the transport of biological object to a predetermined range of the biological object. Wurde das biologische Objekt vollständig aus dem umgebenden biologischen Material ausgeschnitten, wird das biologische Objekt beispielsweise mittig über dem Fokus des Laserstrahls platziert. Was completely the biological object excised from the surrounding biological material, the biological object is placed, for example, centered above the focus of the laser beam. Wurde das biologische Objekt bis auf einen Steg aus dem biologischen Material ausgeschnitten, so wird vorzugsweise der Bereich, in dem sich der Steg befindet, über dem Laserfokus platziert. Was the biological object to a web cut from the biological material, then preferably, the area in which the web is placed over the laser focus. Wurde kein Ausschneidevorgang vor dem Transport durchgeführt, so wird der zu transportierende Bereich mittig über dem Laserfokus platziert. If no cut operation performed before transport, the area to be transported is placed centrally over the laser focus. Das Positionieren des biologischen Objekts kann durch Verfahren des Halters The positioning of the biological object can be obtained by methods of the holder 109 109 erfolgen, vorzugsweise rechnergestützt durch die Steuereinheit take place, preferably supported by the computer control unit 102 102 . , Alternativ kann der Laserfokus beispielsweise durch ansteuerbare optische Elemente wie die Linse Alternatively, the laser focus can be actuated for example by optical elements such as the lens 113 113 im Strahlengang des Laserstrahls positioniert werden. be positioned in the beam path of the laser beam. Weiterhin hängt die Stelle, an welcher die Laserpulse für den Transport des biologischen Objekts eingestrahlt werden sollen, auch von der Beschaffenheit des biologischen Objekts ab. Furthermore, the location at which the laser pulses to be irradiated for the transport of biological object depends also on the nature of the biological object. Handelt es sich bei dem biologischen Objekt beispielsweise um lebende Zellen, oder um Zellen, von denen Chromosomen bzw. DNA extrahiert werden soll, so ist eine Einstrahlung am Rand der Zelle sinnvoll, um eine Beschädigung der DNA oder der Chromosomen zu vermeiden. If it is the biological object, for example, to living cells, or cells from which chromosomes or DNA is to be extracted, a radiation at the edge of the cell is useful in order to avoid damage to the DNA or chromosomes.
  • [0029]
    Zweckmäßig wird vor dem Transport des biologischen Objektes die axiale Position des Laserfokus eingestellt, dh die Position des Laserfokus in z-Richtung senkrecht zur Ebene des Trägers. Suitably, the axial position of the laser focus is adjusted before the transport of the biological object, ie the position of the laser focus in the z direction perpendicular to the plane of the carrier. Für einen Ausschneidevorgang befindet sich der Fokus im Allgemeinen in der Ebene des biologischen Materials bzw. in der Ebene einer unter dem biologischen Material angeordneten Membran. For a cut operation the focus is generally on the level of the biological material and in the plane of a biological material located below the membrane. Für den direkten Transport eines biologischen Objektes oder den Transport eines vollständig ausgeschnittenen biologischen Objektes ist es vorteilhaft, den Laserfokus 1–5 μm aus der Ebene heraus und vorzugsweise 1–2 μm nach unten, dh in Richtung der Laserquelle, zu verschieben. For the direct transport of a biological object, or the transport of a complete cut-biological object, it is advantageous to laser focus 1-5 microns out of plane and preferably 1-2 microns down to move ie, toward the laser source. Wurde das biologische Objekt bis auf einen Steg ausgeschnitten, ist ein Defokussieren des Laserstrahls, dh ein Verschieben des Laserfokus in axialer Richtung, nicht immer notwendig. Was the biological object to a web cut out is a defocusing of the laser beam, ie, a displacement of the laser focus in the axial direction, not always necessary. Die axiale Position des Laserfokus kann beispielsweise durch axiales Verschieben von Linse The axial position of the laser focus, for example, by axial displacement of lens 113 113 im Strahlengang des Laserstrahls erreicht werden, oder durch axiales Verschieben des Objektivs be achieved in the beam path of the laser beam, or by axial displacement of the lens 108 108 oder des Trägers or carrier 104 104 . ,
  • [0030]
    In einem nächsten Schritt In a next step 205 205 werden Laserpulse eingestrahlt, um das zu separierende biologische Objekt zu der Auffangvorrichtung Laser pulses are irradiated to the biological object to be separated to the collecting device 110 110 zu transportieren. to transport. Eine vorgegebene Zahl von Laserpulsen wird durch Ansteuern der Laserquelle A predetermined number of laser pulses is by driving the laser source 103 103 erzeugt. generated. Die Laserpulse passieren den Filter The laser pulses pass through the filter 107 107 , der von der Steuereinheit That from the control unit 102 102 derart eingestellt wird, dass die Laserpulse eine vorgegebene Energie aufweisen. is adjusted such that the laser pulses have a predetermined energy. Im Allgemeinen wird die Energie der Laserpulse weiter durch die Optik des Mikroskopsystems In general, the energy of the laser pulses on through the optics of the microscope system is 101 101 verringert. reduced. Insbesondere findet eine Abschwächung der Laserpulse beim Durchlaufen des Objektivs In particular, is a weakening of the laser pulses as it passes through the lens 108 108 statt. instead of. Vorzugweise wird ein Objektiv Preferably, a lens 108 108 verwendet, das eine möglichst hohe Transmission bei der Wellenlänge des von der Laserquelle used, the highest possible transmission at the wavelength of the laser source of 103 103 emittierten Laserstrahls aufweist. has emitted laser beam. Entscheidend ist, welche Energie die Laserpulse in der Ebene des biologischen Objekts aufweisen. The decisive factor is that energy having the laser pulses in the plane of the biological object. Je nach verwendetem Mikroskopsystem und verwendeter Laserquelle sind unterschiedliche Stellungen des Filters Depending on the microscope system used and the laser source are different positions of the filter 107 107 notwendig, um eine geeignete Energie der Laserpulse in der Ebene des biologischen Objekts für den Transport des biologischen Objekts zu erreichen. necessary in order to achieve a suitable energy of the laser pulses in the plane of the biological object to transport the biological object. Weiterhin ist die Energie der Laserpulse, die für den Transport des biologischen Objekts verwendet wird, abhängig von der Art der Anwendung und der Art des biologischen Objekts. Furthermore, the energy that is used for the transport of the biological specimen of the laser pulses, depending on the type of application and the type of the biological object. Lebende Zellen werden beispielsweise mit einer anderen Energie der Laserpulse transportiert als Zellen eines histologischen Präparats. Living cells are, for example, with a different energy of the laser pulses transported as cells of a histological preparation. Vorzugsweise werden 2–10 Pulse mit einer Pulsenergie von 1–20 μJ und einer Frequenz von 95–105 Hz eingestrahlt. Preferably 2-10 pulses are radiated with a pulse energy of microjoules 1-20 and a frequency of 95-105 Hz.
  • [0031]
    Bei herkömmlichen Laser-Mikrodissektionssystemen wurde die Energie nach dem Ausschneiden für den Transport um beispielsweise 10–25% erhöht. In conventional laser Mikrodissektionssystemen the energy was increased after cutting for transportation for example, 10-25%. Dies ist mit dem hier beschriebenen Laser-Mikrodissektionsverfahren nicht immer notwendig, es können auch Laserpulse mit gleicher oder geringerer Energie eingestrahlt werden. This is not always necessary with this range of laser microdissection, it may be irradiated and laser pulses with the same or less energy. Somit wird eine Belastung der Transportimpulsstärke des biologischen Objekts verringert. Thus, a load on the feed pulse strength of the biological object is reduced. Die Laserpulse werden von dem Objektiv The laser pulses are of the lens 108 108 fokussiert und treffen auf das biologische Objekt, welches in einem nächsten Schritt focused and incident on the biological object, which in a next step 206 206 zu der Auffangvorrichtung to the collecting device 110 110 transportiert wird. is transported. Der Transport geschieht mittels eines von den Laserpulsen induzierten Transportprozesses. The transport takes place by means of an induced by the laser pulses transport process. Die Laserpulse werden dabei auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers The laser pulses are thereby to a substantially same area of ​​the wearer 104 104 eingestrahlt. irradiated. Das heißt, dass weder die Position des Halters This means that neither the position of the holder 109 109 noch die Position des Laserstrahls aktiv verändert wird. nor the position of the laser beam is actively changed. Aufgrund von Vibrationen können geringfügige Änderungen der relativen Position zwischen Laserstrahl und bestrahltem Bereich nicht ausgeschlossen werden. Due to vibrations slight changes in the relative position between laser beam and irradiated area can not be excluded. Solche Positionsänderungen sind jedoch für das hier beschriebene Verfahren unerheblich. However, such positional changes are irrelevant to the process described herein. Das biologische Objekt wird in einem Auffangbehälter The biological object is in a collection container 112 112 der Auffangvorrichtung the collecting device 110 110 aufgefangen. collected. Für das Auffangen mehrerer biologischer Objekte in unterschiedlichen Auffangbehältern kann die Auffangvorrichtung For collecting a plurality of biological objects in different collecting containers the collecting device can 110 110 mittels einer Positioniervorrichtung by means of a positioning device 111 111 verfahren werden. be moved. Durch das automatische Einstrahlen mehrerer Laserpulse auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich wird ein erfolgreiches Transportieren des biologischen Objekts ermöglicht. By automatically irradiating a plurality of laser pulses in a substantially equal area, a successful transport of the biological object is made possible. Im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren, bei denen nur ein Laserpuls für den Transport eingesetzt wird, ist die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Transports des biologischen Objekts mit dem hier beschriebenen Verfahren wesentlich höher. In comparison to conventional methods in which only one laser pulse for the transport is employed, the probability of a successful transport of the biological object with the method described herein is much higher. Auch wenn im Vergleich zu den herkömmlichen Verfahren geringere Laserpulsenergien eingesetzt werden, können trotzdem höhere Erfolgsquoten erreicht werden. Although lower laser pulse energies are used compared to the conventional methods, although higher success rates can be achieved. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Laser-Mikrodissektionsverfahren bereit, mit dem biologische Objekte erfolgreich und mit einer geringen thermischen Belastung der Transportimpulsstelle transportiert werden können. Thus, the present invention provides a laser microdissection prepared successfully with the biological objects, and can be transported with a low thermal load of the transport pulse location.
  • [0032]
    3 3 zeigt Abbildungen eines biologischen Materials shows images of a biological material 300 300 , von dem ein biologisches Objekt separiert werden soll. From which a biological object to be separated.
  • [0033]
    3a 3a zeigt zwei biologische Objekte shows two biological objects 301 301 und and 301 301 , die aus dem biologischen Material That from the biological material 300 300 entlang einer Schnittlinie along a section line 302 302 ausgeschnitten wurden. were cut. Des Weiteren wurde mit einem herkömmlichen Laser-Mikrodissektionsverfahren ein einzelner Laserpuls auf das biologische Objekt eingestrahlt, um das biologische Objekt zu einer Auffangvorrichtung zu transportieren. Furthermore, it was irradiated, a single laser pulse to the biological object with a conventional laser microdissection to transport the biological object to a collecting device. Bei beiden biologischen Objekten war der Versuch des Transports nicht erfolgreich, beide biologischen Objekte befinden sich nach dem Einstrahlen des Laserpulses noch auf dem Träger. Both biological objects the attempt of transportation was not successful, both biological properties are located after the irradiation of the laser pulse still on the carrier. Die Transportimpulsstelle The transport pulse location 303 303 , auf welche der Laserpuls eingestrahlt wurde, ist nach dem Einstrahlen deutlich verbreitert. In which the laser pulse was irradiated, is significantly widened after irradiation. Das biologische Objekt wurde mit dem Laserpuls nicht transportiert, jedoch fand eine Veränderung des biologischen Objekts aufgrund der hohen Belastung der Transportimpulsstelle statt, was eine weitere Verwendung des biologischen Objekts beeinträchtigen kann. The biological object is not transported by the laser pulse, but a change in the biological object took place due to the high burden of the transport pulse location, which may affect the continued use of the biological object.
  • [0034]
    3b 3b zeigt ebenfalls ein biologisches Material also shows a biological material 300 300 , aus welchem entlang einer Schnittlinie From which along a section line 304 304 ein biologisches Objekt ausgeschnitten wurde. a biological object was cut. Anschließend wurden, wie im kennzeichnenden Teil des Hauptanspruchs beschrieben, mehrere Laserpulse auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers eingestrahlt. , A plurality of laser pulses were as described in the characterizing part of the main claim subsequently irradiated to a substantially same area of ​​the wearer. Mittels eines von den Laserpulsen induzierten Transportprozesses wurde das biologische Objekt zu einer Auffangvorrichtung transportiert. By means of an induced by the laser pulses transportation process has been transported the biological object to a collecting device. Dementsprechend bleibt in dem biologischen Material Accordingly, there remains in the biological material 300 300 eine Lücke a gap 305 305 zurück. back. Für den Transport des biologischen Objekts wurden Laserpulse mit der gleichen Energie verwendet, die in To transport the biological object laser pulses were used with the same energy in 3a 3a verwendet wurde. has been used. Wie ersichtlich wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine höhere Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Transports des biologischen Objekts erreicht, als beim herkömmlichen Laser-Mikrodissektionsverfahren. As can be seen a higher probability of a successful transport of the biological object is achieved with the inventive method, as in the conventional laser microdissection. Weiterhin sind entlang der Schnittlinie Furthermore, along the section line 304 304 in in 3b 3b keine Veränderungen der Transportimpulsstelle aufgrund des Einstrahlens der Laserpulse erkennbar, was darauf schließen lässt, dass die Belastung der Transportimpulsstelle geringer ist als bei herkömmlichen Laser-Mikrodissektionsverfahren. No changes in feed pulse body on the basis of irradiating the laser pulses recognizable, which suggests that the burden of the transport pulse location is less than with conventional laser microdissection. Experimente haben gezeigt, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise für biologisches Material in Form von feuchten Kryo-Schnitten eine Verbesserung der Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Transportes von 50%, und für fetthaltiges Gewebe, wie beispielsweise dicke Gehirnschnitte, sogar eine Verbesserung der Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Transports von 100% erreicht wird. Experiments have shown that with the inventive method, for example, biological material in the form of moist cryo-sections to improve the probability of a successful transport of 50%, and for fatty tissue, such as thick brain slices, even an improvement of the probability of a successful transport of 100% is achieved.
  • Bezugszeichenliste LIST OF REFERENCE NUMBERS
  • 100 100
    Laser-Mikrodissektionssystem Laser microdissection
    101 101
    Mikroskopsystem microscope system
    102 102
    Steuereinheit control unit
    103 103
    Laserquelle laser source
    104 104
    Träger carrier
    105 105
    Eingabeeinheit input unit
    106 106
    Anzeigeeinheit display unit
    107 107
    Filter filter
    108 108
    Objektiv lens
    109 109
    Halter holder
    110 110
    Auffangvorrichtung catcher
    111 111
    Positioniervorrichtung positioning
    112 112
    Auffangbehälter receptacle
    113 113
    Linse lens
    201 201
    erster Verfahrensschritt first step
    202 202
    zweiter Verfahrensschritt Second step
    203 203
    dritter Verfahrensschritt third step
    204 204
    vierter Verfahrensschritt fourth step
    205 205
    fünfter Verfahrensschritt fifth step
    206 206
    sechster Verfahrensschritt sixth step
    300 300
    biologisches Material biological material
    301 301
    biologisches Objekt biological object
    302 302
    Schnittlinie intersection
    303 303
    Transportimpulsstelle Transport pulse location
    304 304
    Schnittlinie intersection
    305 305
    Lücke gap

Claims (16)

  1. Laser-Mikrodissektionsverfahren, wobei sich ein biologische Objekt auf einem Träger ( Laser microdissection, wherein a biological object on a support ( 104 104 ) befindet, der biologisches Material aufweist, von welchem das biologische Objekt separiert werden soll, und wobei mit einer Laserquelle ( ) Is comprising biological material from which the biological object to be separated, and wherein (with a laser source 103 103 ) ein Laserstrahl erzeugt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das von dem biologischen Material zu separierende biologische Objekt automatisch von mehreren Laserpulsen nacheinander bestrahlt wird, wobei die Laserpulse auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers ( ) Producing a laser beam, characterized in that the biological material to be separated from the biological object is automatically irradiated by several laser pulses one after the other, wherein the laser pulses (on a substantially same region of the wearer 104 104 ) eingestrahlt werden, um das biologische Objekt mittels eines von den Laserpulsen ausgelösten laserinduzierten Transportprozesses von dem Träger zu einer Auffangvorrichtung ( are radiated) to the biological object by means of a triggered by the laser pulses, laser induced transport process from the carrier (to a collecting device 110 110 ) zu transportieren. ) to transport.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserpulse für den Transport des biologischen Objekts auf ein und dieselbe Stelle des Trägers ( A method according to claim 1, characterized in that the laser pulses (for transporting the biological object at one and the same point of the carrier 104 104 ) eingestrahlt werden. are irradiated).
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserpulse durch Ansteuern der Laserquelle ( The method of claim 1 or 2, characterized in that the laser pulses (by driving the laser source 103 103 ) erzeugt werden. ) be generated.
  4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Objekt vor dem Einstrahlen der Laserpulse für den Transport des biologischen Objektes mittels eines Laserstrahls vollständig aus dem biologischen Material ausgeschnitten wird, so dass das biologische Objekt im Wesentlichen freipräpariert ist. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the biological object is completely cut out before the irradiation of the laser pulses for the transport of the biological object by means of a laser beam from the biological material such that the biological object is dissected substantially.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Objekt vor dem Einstrahlen der Laserpulse für den Transport des biologischen Objektes mittels eines Laserstrahls bis auf einen Steg aus dem biologischen Material ausgeschnitten wird, wobei die Laserpulse für einen nachfolgenden Transport auf den Steg eingestrahlt werden. The method of any of claims 1-3, characterized in that the biological object is cut out before the irradiation of the laser pulses for the transport of the biological object by means of a laser beam down to a web from the biological material, wherein the laser pulses to a subsequent transport Steg are irradiated.
  6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das biologischen Objekt mit Laserpulsen von derselben Laserquelle ( A method according to claim 4 or 5, characterized in that the biological object with laser pulses (from the same laser source 103 103 ) ausgeschnitten und transportiert wird, wobei nach dem Ausschneiden die Energie der Laserpulse derart eingestellt wird, dass die Energie der Laserpulse für den Transport geringer oder im Wesentlichen dieselbe ist wie die Energie der Laserpulse für das Ausschneiden. wherein the energy of the laser pulses is adjusted so after the cutting, that the energy of the laser pulses is the same low for the transport or substantially as the energy of the laser pulses for cutting is cut) and transported.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Objekt mit mehreren Laserpulsen bestrahlt wird, die auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers ( The method of any of claims 1-3, characterized in that the biological object is irradiated with several laser pulses (on a substantially same region of the wearer 104 104 ) eingestrahlt werden, um das biologische Objekt direkt aus dem biologischen Material herauszulösen und zu der Auffangvorrichtung ( be) irradiated to extract the biological object directly from the biological material, and (to the collecting device 110 110 ) zu transportieren. ) to transport.
  8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Energie der aufeinanderfolgenden Laserpulse, die für den Transport des biologischen Objektes automatisch nacheinander eingestrahlt werden, verändert wird. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the energy of said successive laser pulses are radiated automatically for the transport of the biological object sequentially, is changed.
  9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Einstrahlen der Laserpulse derart gesteuert wird, dass 2–10 Laserpulse mit einer Frequenz von 80–120 Hz und vorzugsweise von 95–105 Hz eingestrahlt werden. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the irradiation of the laser pulses is controlled such that 2-10 laser pulses at a frequency of 80-120 Hz, and preferably irradiated from 95-105 Hz.
  10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Transport des biologischen Objekts Probetransporte durchgeführt werden, um eine Energie der Laserpulse zu bestimmen, die notwendig ist, um das biologische Objekt zu transportieren. Method according to one of the preceding claims, characterized in that are performed before transportation of the biological sample transport object, to determine an energy of the laser pulses necessary to transport the biological object.
  11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Energie der Laserpulse durch Ansteuern eines elektrisch verstellbaren Filters ( Method according to one of the preceding claims, characterized in that the energy of the laser pulses (by driving an electrically adjustable filter 107 107 ) eingestellt wird. ) Is adjusted.
  12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserpulse in einer Ebene fokussiert werden, die 1–5 μm in axialer Richtung ober- oder unterhalb einer Objektebene liegt, in welcher sich das biologische Objekt befindet. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the laser pulses are focused in a plane which is above 1-5 microns in the axial direction or is below an object plane, in which the biological object is located.
  13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Einstrahlen der Laserpulse rechnergestützt erfolgt, und dass mehrere zuvor selektierte biologische Objekte mit jeweils mehreren Laserpulsen im selben Bereich bestrahlt werden, um diese biologischen Objekte jeweils zu einer Auffangvorrichtung ( Method according to one of the preceding claims, characterized in that the irradiation of the laser pulses is performed with computer assistance, and that several previously selected biological objects are irradiated with a respective plurality of laser pulses in the same area to these biological objects (in each case to a collecting device 110 110 ) zu transportieren. ) to transport.
  14. Laser-Mikrodissektionssystem, mit einer Laserquelle ( Laser microdissection system (including a laser source 103 103 ), und mit einem Halter ( (), And with a holder 109 109 ) zum Aufnehmen eines Trägers ( ) (To receive a carrier 104 104 ) mit einem biologischen Material, das ein von dem biologischen Material zu separierendes biologisches Objekt umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das Laser-Mikrodissektionssystem ( ) With a biological material that includes a biological material from the biological object to separierendes, characterized in that the laser microdissection system ( 100 100 ) eine Steuereinheit ( ) A control unit ( 102 102 ) umfasst, welche derart ausgestaltet ist, dass sie ein Einstrahlen von Laserpulsen derart steuert, dass das von dem biologischen Material zu separierende biologische Objekt automatisch von mehreren Laserpulsen nacheinander bestrahlt wird, wobei die Laserpulse auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers ( ) Comprises, which is configured such that it controls an irradiating laser pulses such that the biological of the biological material to be separated object is automatically irradiated with several laser pulses one after the other, wherein the laser pulses (on a substantially same region of the wearer 104 104 ) eingestrahlt werden, um das biologische Objekt mittels eines von den Laserpulsen ausgelösten laserinduzierten Transportprozesses von dem Träger ( are radiated) to the biological object by means of a triggered by the laser pulses, laser induced transport process (from the carrier 104 104 ) zu einer Auffangvorrichtung ( ) (To a collecting device 110 110 ) zu transportieren. ) to transport.
  15. Laser-Mikrodissektionssystem nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Laser-Mikrodissektionssystem ( Laser microdissection system according to claim 14, characterized in that the laser microdissection system ( 100 100 ) zum Durchführen eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1–13 ausgestaltet ist. ) Is configured for performing a method according to claims 1-13.
  16. Computerlesbares Speichermedium, in dem ein Steuerprogramm zum rechnergestützten Steuern eines Laser-Mikrodissektionssystems ( A computer readable storage medium in which a control program for controlling a computer-assisted laser microdissection ( 100 100 ) gespeichert ist, wobei das Steuerprogramm bei Ausführung in einem Computersystem zum Durchführen eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1–13 ausgestaltet ist. is stored), wherein the control program is configured, when executed in a computer system for performing a method according to claims 1-13.
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