WO2001052840A1 - UTILISATION D'ISOFLAVONES ET/OU D'EXTRAITS DE PRUNIER D'AFRIQUE POUR LA PREPARATION D'UNE COMPOSITION DESTINEE A INHIBER L'ACTIVITE DE LA 5α-REDUCTASE, EN PHARMACIE NOTAMMENT EN DERMATOLOGIE, EN COSMETIQUE ET EN TANT QU'ADDITIF ALIMENTAIRE - Google Patents

UTILISATION D'ISOFLAVONES ET/OU D'EXTRAITS DE PRUNIER D'AFRIQUE POUR LA PREPARATION D'UNE COMPOSITION DESTINEE A INHIBER L'ACTIVITE DE LA 5α-REDUCTASE, EN PHARMACIE NOTAMMENT EN DERMATOLOGIE, EN COSMETIQUE ET EN TANT QU'ADDITIF ALIMENTAIRE Download PDF

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Definitions

  • isoflavones and / or extracts of African plum for the preparation of a composition intended to inhibit the activity of 5 ⁇ -reductase, in pharmacy in particular in dermatology, in cosmetics and as a food additive.
  • the present invention relates to the use of at least one product chosen from the group consisting of isoflavones, extracts of African plum and mixtures thereof, for the preparation of a composition intended to inhibit the 5 ⁇ -reductase activity, in particular for the treatment of prostatic hypertrophy, prostatic adenoma, acne, hyperseborrhea, alopecia, hirsutism.
  • the invention also relates to cosmetic treatment methods, in particular for oily skin, as well as to the use of the products described as additives in a food for humans and / or animals.
  • 5 ⁇ -reductase is a microsomal NADPH dependent enzyme which exists in the form of two isoenzymes synthesized from two different genes.
  • the type 1 isoenzyme of 5 ⁇ -reductase is found mainly in the liver and skin, more particularly in the sebaceous glands of non-genital skin and scalp, and appears at puberty.
  • the type 2 isoenzyme is predominant in the prostate and in the skin of the differentiated sexual territories: genital area, beard, and plays a role in sexual differentiation.
  • Table 1 The distribution of type 1 and 2 isoenzymes of 5 ⁇ -reductase in the skin and the cutaneous appendages in humans can be illustrated by table 1 below.
  • Too high activity of 5 ⁇ -reductase thus causes too high levels of androgen in the form of DHT in the prostate, resulting in overstimulation of the latter resulting in a unwanted growth which can lead to the pathology of prostatic hypertrophy, or even to prostatic adenoma, most often requiring surgical intervention.
  • pathologies of dermatological type, can be observed in men or women as resulting from an overactivity of 5 ⁇ -reductase, namely, in particular acne, hirsutism or even alopecia.
  • the type 1 isoenzyme of 5-reductase in the sebaceous glands, as well as in the hair follicle.
  • the 5 ⁇ -reductase type 2 isoenzyme is localized mainly at the level of the internal epithelial sheath, as well as at the level of the dermal papilla of the hair. However, this latter location remains to be specified.
  • Androgenic alopecia whose pathophysiology is very close to that of acne, is the most common alopecia and probably the one where the demand for therapy is the highest. 5 ⁇ -reductase seems to play a key role in this pathology. Indeed, men suffering from a genetic deficiency in type 2 isoenzyme of 5 ⁇ -reductase do not develop androgenetic alopecia.
  • the extract of Serenoa Repens is also known, as a reference as a 5 ⁇ -reductase inhibitor, the extract of Serenoa Repens having the advantage, compared to finasteride, of a natural origin as plant extract allowing a better comparison for tested products also of natural origin.
  • Serenoa Repens also known as Sabal serrulatum, is a small palm that can be found in the United States (Florida) in North Africa and in Spain.
  • the present invention thus relates to the use of at least one product chosen from the group consisting of isoflavones, extracts of African plum and mixtures thereof, for the preparation of a composition intended to inhibit the 5 ⁇ -reductase type 1 activity
  • the expression “and the mixtures of the latter” above naturally includes in particular mixtures of isoflavones, mixtures of extracts of African plum or mixtures of isoflavones (s) and African plum extract (s).
  • composition is intended to inhibit the type 1 isoenzyme of 5 ⁇ -reductase
  • the isoflavones which can be used according to the invention can be obtained by chemical synthesis or are natural substances extracted from natural products, in particular from plants.
  • the isoflavones that can be used can also be a mixture of isoflavones of natural and synthetic origin.
  • R1 represents a hydrogen atom or a hydroxy group
  • R2 represents a hydrogen atom or a methoxy group
  • R6 represents a hydroxy group or a methoxy group. More particularly, RI, R2 and R6 can take the following meanings:
  • TAB 2, 4, 4'-trihydroxideoxybenzoine
  • isoflavones of aglycone form of formula (I) as defined above.
  • the glycosylated forms of isoflavones are hydrolyzed under the action of beta-glucosidases.
  • the glycosylated (daidzine and genistin) and acylated forms are the most abundant. Chemical or enzymatic acid hydrolysis can transform these conjugated forms into daidzein and genistein, which are more absorbable.
  • the use according to the invention is characterized in that the product is chosen from synthetic or natural isoflavones, from the group consisting of genistin, daidzin, glycitin, acetyldaidzin, acetylgenistin, acetylglycitin, malonyldaidzin, malonylgenistin, malonylglycitin, la 2,4,4'- trihydroxyoxybenzoine (THB), daidzein, genistein, glycitein, formononectin, biochanin A, genistein-4'-0-glucoside, 2'-hydroxygenistein- 7-0-glucoside, genistein-C-8-glucoside, and mixtures thereof.
  • TTB 2,4,4'- trihydroxyoxybenzoine
  • a product chosen from the group consisting of genistin, genistein and mixtures of the latter is particularly preferred to use according to the invention.
  • genistin genistein
  • mixtures of the latter there are no known natural sources as rich in isoflavones as soy.
  • the methods for purifying isoflavones from soy products, especially seeds, bean sprouts (or “sprouted soybeans"), soy milks including ground and molasses and fermented products (in particular Tofu and Tempeh) are good. known to those skilled in the art.
  • Table 2 below illustrates the isoflavone levels (micrograms / gram) in soybeans from Iowa crops (Wang and Murphy, "Isoflavone composition of American and Japanese Soybeans in Iowa: effects of variety, crop year, and location ", J. Agric. Food Chem. 1994, 42, 1674-1677).
  • Table 2 example of isoflavone contents in soybeans
  • soy milk it is traditionally obtained hot by grinding the seeds after skinning, in an alkaline medium. Heat treatment is performed to inhibit the antitrypsic factors.
  • the amounts of isoflavones present in soy milk are variable. Table 3 below is an illustration of the isoflavone contents of soy milk.
  • ground materials or molasses resulting from the production of soy milk also represent a source of soy isoflavones.
  • soy isoflavone extracts is thus meant according to the invention the soy isoflavone extracts obtained from the various soy products described above (seeds, soybeans (or “sprouted soybeans”), soy milks including ground and molasses and fermented products (in particular Tofu and Tempeh)), extracts which have optionally been purified and / or concentrated to increase their isoflavone contents, according to methods well known to those skilled in the art.
  • said product is chosen from extracts of soy isoflavones. Mention may in particular be made of the extract of soy isoflavones sold by the
  • Genosten 4000 R is a soluble soy extract enriched with isoflavones obtained after concentration by successive evaporations of the soy molasses. This process does not use any organic solvent. Analytical data for this product can be found in the examples below.
  • Lupine is also an interesting natural source of isoflavones. Mention may in particular be made of the variety of "yellow lupine” in the stems of which the glycosylated isoflavones genistin, 2'-hydroxygenistein-7-0-glucoside, genistein-4'-0-glucoside and genistein-C have been identified. 8-glucoside, the respective formulas of which are described above (Rafal Franski et al, "Application of mass spectrometry to structural identification of flavonoid monoglycosides isolated from shoot of lupine (lupinus luteus L.)", Acta Biochimica Polonica, vol. 46, N ° 2/1999, 459-473).
  • the use according to the invention is thus also characterized in that the product is chosen from extracts of isoflavones of lupine, that is to say, by analogy with the definition above for extracts of isoflavones of soybeans , among the extracts of isoflavones which can be obtained from lupine products.
  • the extracts of African plum or "Pygeum Africanum” are well known to those skilled in the art. They are mainly made from the bark of the African plum tree. These are sterolic extracts of African plum, such as that sold by the company Euromed under the name "Pygeum”.
  • the African plum extract has the following fatty acid weight distribution: from 30 to 40% in oleic acid, from 7 to 12% in linoleic acid, from 40 to 55% in palmitic acid and less than 3% in linolenic acid.
  • the sterol content is between 13 and 18% and the overall acid number of the extract is less than 45.
  • the plum extract which is further characterized by a relative ⁇ -sitosterol content of 65 to 80%.
  • the plum extract is preferred, which is further characterized by an unsaponifiable content of 15 to 18%.
  • the plum extract suitable for use according to the present invention can for example have the following specifications:
  • the product as described above is used according to the invention, in the form of soy isoflavone (s), African plum extract (s) or a mixture of these, according to a proportion of between approximately 0.001 and approximately 100% by weight (use in pure form possible of the said product), preferably between approximately 0.01 and approximately 70% by weight, and more particularly still between approximately 0.1 and 10% by weight, relative to the total weight of the composition.
  • composition prepared by the use according to the invention can also comprise a pharmaceutically, dermatologically or cosmetically acceptable excipient.
  • Any excipient suitable for the dosage forms known to those skilled in the art can be used, for administration by topical, oral, enteral or parenteral, in particular rectal route.
  • this excipient can be adapted for obtaining a composition in the form of an oily solution, of a water-in-oil emulsion, an emulsion oil-in-water, a microemulsion, an oily gel, an anhydrous gel, a cream, a dispersion of vesicles, microcapsules or microparticles, or even gelatin or vegetable soft capsules or capsules.
  • an excipient suitable for administration by the external topical route or by the rectal route is used.
  • the advantageous effect of inhibiting the activity of the 5 ⁇ -reductase type 1 provided by the use according to the invention makes it possible to use the composition thus prepared for therapeutic treatments, notably dermatological, and cosmetic.
  • the use according to the invention is characterized in that the composition is intended for the treatment of pathologies and / or skin disorders linked to a congenital exaggeration or acquired from the activity of type 1 5 ⁇ -reductase.
  • composition is intended for the treatment of acne.
  • composition is intended for the treatment of hyperseborrhea.
  • composition is intended for the treatment of alopecia.
  • the use according to the invention is also characterized in that the composition is intended for the treatment of hirsutism.
  • the present invention also relates to a cosmetic treatment method for oily skin, characterized in that a cosmetic composition is applied to the skin containing at least one product chosen from the group consisting of isoflavones, plum extracts of Africa as defined above and mixtures of these, as described above.
  • a subject of the invention is also a method of cosmetic treatment for hair loss, characterized in that a cosmetic composition is applied to the scalp containing at least one product chosen from the group consisting of isoflavones, extracts of African plum as defined above and mixtures thereof, as described above.
  • the subject of the invention is also a method of cosmetic treatment of excess hairiness, characterized in that it is applied to the areas of the skin with excess hairiness a cosmetic composition containing at least one product chosen from the group consisting of isoflavones, African plum extracts as defined above and mixtures of these, as described above.
  • a cosmetic composition containing at least one product chosen from the group consisting of isoflavones, African plum extracts as defined above and mixtures of these, as described above.
  • these last two cosmetic treatment methods make it possible to improve the appearance by visibly reducing the unsightly phenomena of hair loss linked to alopecia and the phenomena of excess pilosity linked to hirsutism.
  • said product is present in the composition in a proportion of between approximately 0.001 and approximately 100% by weight (use in pure form possible, without excipient), preferably between approximately 0.01 and approximately 70% by weight, and more particularly still between approximately 0.1 and 10% by weight, relative to the total weight of the composition.
  • the cosmetic composition applied according to the cosmetic method of the invention also contains at least one cosmetically acceptable excipient as described above.
  • Another subject of the invention is the use of at least one compound chosen from the group consisting of isoflavones, African plum extracts as defined above and mixtures of the latter, as described below. above, as an additive in food for humans and / or animals.
  • This food use is preferably characterized in that said additive is present in the food in a proportion of between approximately 0.001 and approximately 100% by weight, preferably between approximately 0.01 and approximately 70% by weight, and more particularly still between about 0, 1 and 10% by weight, relative to the total weight of the food.
  • the invention also relates to the use of extracts of African plum as defined above for the preparation of a composition intended to inhibit the activity of type 2 5 ⁇ -reductase.
  • Another subject of the invention is also the use of extracts of African plum as defined above for the preparation of a composition intended for the treatment of prostatic hypertrophy.
  • extracts of African plum as defined above can be used for the preparation of a composition intended for the treatment and of prostatic adenoma, and in particular for the preparation of such a composition for the administration rectally.
  • Genosten 4000 The soy isoflavone extract tested, called Genosten 4000, was supplied by the company Nutrinov.
  • Soluble soy extract enriched with isoflavones obtained by a physical extraction technique, without the use of organic solvents.
  • Total isoflavone content 4000 +/- 200 mg / 100 g
  • Typical profile Daidzine 200 Genistin 280 Malonyldaidzine 900
  • the Pygeum Africanum extract tested was supplied by the company Euromed.
  • Lipido-sterolic extract of Pygeum Africanum from pygeum bark Lipido-sterolic extract of Pygeum Africanum from pygeum bark.
  • Example 1 Evaluation of the inhibitory activity on the activity of 5 ⁇ -reductase by measuring the level of 5-dihydrotestosterone formed from testosterone by DU145 cells.
  • Prostate DU 145 cells are from a tumor line obtained from a carcinoma of the prostate (ATCC number HTB 81).
  • MEM medium (ref. 0410265), glutamine and gentamycin come from Gibco.
  • Fetal calf serum (SVF) comes from DAP and is used decomplemented (45 mm at 56 ° C). the plastics used for cultivation (boxes and plates) come from Costar. Testosterone comes from Sigma.
  • a stock solution of ethanol at 10 mg / ml is prepared from each of the products tested.
  • the concentration range used for the experiments is as follows: 0, 5, 10, 50, 100 and 500 micrograms / ml. (Dilution carried out in the culture medium). The volume of extract added per well being 20 microliters / well, the solutions to be prepared are concentrated 50X.
  • a 10 mM testosterone stock solution is prepared in ethanol. At the time of use, this solution is diluted 1: 1000 in the culture medium and 10 microliters are added per well.
  • Prostatic DU 145 cells are cultured at 37 ° C., 5% CO 2 in MEM medium containing glutamine (2 mM), gentamycin (50 micrograms / ml) and 10% of SNF. Their subculture rate is 1:10.
  • the cells are cultured in 6-well plates at the rate of 2.10 * 5 DU 145 per well / 1 ml of medium containing only 1% of SNF.
  • the cells are maintained for 3 days at 37 ° C., 5% CO 2.
  • the culture medium contained in the wells is eliminated and replaced by new medium containing 1% SNF.
  • Testosterone (0.1 micromolar final) as well as the extracts at different concentrations are added to the medium at the rate of 10 and 20 microliters / well respectively.
  • the "control" wells correspond to cells incubated in the presence of testosterone and an Ethanol equivalent. This makes it possible to subtract the effect of the solvent on the cultures and to determine the percentage of DHT formed in the absence of inhibitor).
  • the cells are then incubated at 37 ° C, 5% CO2. After 3 hours, the culture supernatants are collected and frozen at -80 ° C until the assay.
  • the extract of Serenoa Repens chosen as a reference substance, inhibits the activity of 5-alpha reductase. This result therefore validates the test.
  • the Pygeum Africanum extract tested is active in the inhibition of 5-alpha reductase.
  • MCF fibroblast culture medium
  • MEM designation given to the culture medium, Minimum Essential medium
  • 5 ⁇ -DHT 5 ⁇ -dihydrotestosterone
  • products such as an extract of soy isoflavones (Genosten 4000, described above), genistein and genistin (purified isoflavones, commercial products Sigma), a extract of Pygeum Africanum, of an extract of Serenoa Repens chosen as reference, on the activity of 5 ⁇ -reductase.
  • An in vitro model of normal human dermal fibroblast cultures was chosen.
  • test products were supplied by EXPANSCIENCE and were stored at + 4 ° C until the time of their use.
  • Radioactive testosterone (labeled with tritium in position 1, 2, 6 and 7, specific activity 79 Ci / mmol) was supplied by AMERSHAM, non-radiolabelled testosterone was supplied by SIGMA.
  • Analytical quality reagents came from SIGMA, MERCK,
  • the fibroblast culture medium consisted of MEM / M199 (3: 1, v / v) supplemented with penicillin (50 IU / ml), streptomycin (50 ⁇ g / ml), sodium bicarbonate (0 , 2%, w / v) and SNF (10%, v / v).
  • the test system consisted of normal human dermal fibroblasts grown in a monolayer.
  • the fibroblasts were isolated from a residue of abdominal plasty performed on a 51-year-old woman (subject BIOPREDIC n ° I0013).
  • the cells were used on the fifth passage, they were cultured until the monolayers converge in the MCF medium at 37 ° C. in a humid atmosphere containing 5% CO 2 .
  • the fibroblast incubation medium consisted of MCF supplemented with tritiated testosterone (1.6 x 10 '7 M, or 6.32 ⁇ Ci / ml) and non-radiolabelled testosterone (3.84 x 10 "6 M).
  • tritiated testosterone 1.6 x 10 '7 M, or 6.32 ⁇ Ci / ml
  • non-radiolabelled testosterone 3.84 x 10 "6 M
  • the test products and the finasteride were taken up in DMSO before being diluted in the incubation medium.
  • the final concentration of DMSO was kept constant and equal to 1% (v / v) in each dilution of test and reference products.
  • the fibroblast cultures were pre-incubated in the presence of the test products or of the reference product for 2 hours before the addition of the substrate, testosterone.
  • the test products and the reference product were prepared in the MCF medium.
  • the fibroblast cultures were incubated in the presence of the test products or of the reference product prepared in the MIF medium for 22 hours (or 24 hours, indicated with the results) at 37 ° C. in a humid atmosphere containing 5% CO 2 . Control cultures were incubated in the MIF medium in the absence of test products and of reference product.
  • DMSO control were incubated in MIF medium containing 1% (v / v) of DMSO. Each experimental condition was tested in triplicate.
  • the cells were subjected to the action of ultrasound in the MIF medium.
  • the cell lysates thus obtained were extracted with dichloromethane. After evaporation, the dry residues were taken up in methanol and were deposited on silica plates 60F 25 (MERCK, reference 5554).
  • the metabolism of testosterone to 5 ⁇ -dihydrotestosterone under the various experimental conditions was calculated: the results (areas of the peaks of 5 ⁇ -dihydrotestosterone counted by the BERTHOLD scanner) were expressed in pmoles of 5 ⁇ -dihydrotestosterone formed by culture well. They were also expressed as a percentage of the 5 ⁇ -reductase activity present in the 'DMSO control' group.
  • the data groups (control group and treated groups) were treated by a factor analysis of variance (ANONA 1, p ⁇ 0.05), followed by a DU ⁇ ETT test (p ⁇ 0.05).
  • the effect of the test and reference products was compared with the 'DMSO control' group.
  • Genistein tested at 0.1; 1 and 10 ⁇ g / ml, significantly inhibited (p ⁇ 0.05) by 32%; 33% and 31% respectively the activity of 5 ⁇ -reductase. At 100 ⁇ g / ml, it significantly inhibited (p ⁇ 0.05) by 61% the activity of 5 ⁇ -reductase.
  • soy isoflavone extract tested at 10 and 100 ⁇ g / ml, inhibited the activity of 5 ⁇ -reductase by 22 and 17% respectively.
  • the Serenoa Repens extract tested at 10 and 100 ⁇ g / ml, inhibited the activity of 5 ⁇ -reductase by 15 and 35% respectively. At 1 ⁇ g / ml, it had no effect.
  • the Serenoa Repens extract tested at 10 and 100 ⁇ g / ml, inhibited the activity of 5 ⁇ -reductase by 15 and 35% respectively. At 1 ⁇ g / ml, it had no effect (table paragraph 3.3.2).
  • the results are expressed in pmoles of 5 ⁇ -DHT formed / culture well.
  • the results are expressed in pmoles of 5 ⁇ -DHT formed / culture well.
  • the results are expressed in pmoles of 5 ⁇ -DHT formed / culture well.
  • the results are expressed in pmoles of 5 ⁇ -DHT formed / culture well.
  • Example 3 composition of a shampoo for oily hair.
  • Soy Isoflavone 2,000 EXAMPLE 5 Composition of an Emulsion for Oily Skin

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Abstract

La présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un produit choisi dans le groupe constitué par les isoflavones, les extraits de prunier d'Afrique et les mélanges de ces derniers, pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de la 5α-réductase. Cette utilisation permet d'obtenir un effet remarquable d'inhibition de l'activité de la 5α-réductase procurant ainsi une nouvelle réponse pour le traitement des pathologies et/ou désordres dermatologiques liés à une exagération congénitale ou acquise de l'activité de la 5α-réductase, notamment pour le traitement de l'hypertrophie prostatique, de l'adénome prostatique, de l'acné, de l'hyperséborrhée, de l'alopécie et de l'hirsutisme. L'invention se rapporte également à des méthodes de traitement cosmétique, notamment de la peau grasse, ainsi qu'a l'utilisation de ces produits décrits en tant qu'additifs dans un aliment pour l'être humain et/ou l'animal.

Description

Utilisation d'isoflavones et/ou d'extraits de prunier d'Afrique pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de la 5α-réductase, en pharmacie notamment en dermatologie, en cosmétique et en tant qu'additif alimentaire.
La présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un produit choisi dans le groupe constitué par les isoflavones, les extraits de prunier d'Afrique et les mélanges de ces derniers, pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de la 5α-réductase, notamment pour le traitement de l'hypertrophie prostatique, de l'adénome prostatique, de l'acné, de l'hyperséborrhée, de l'alopécie, de l'hirsutisme. L'invention se rapporte également à des méthodes de traitement cosmétique, notamment de la peau grasse, ainsi qu'à l'utilisation des produits décrits en tant qu'additifs dans un aliment pour l'être humain et/ou l'animal.
La 5α-réductase est une enzyme microsomiale NADPH dépendante qui existe sous forme de deux isoenzymes synthétisées à partir de deux gènes différents. L'isoenzyme de type 1 de la 5α-réductase est retrouvée essentiellement dans le foie et la peau, plus particulièrement dans les glandes sébacées de la peau non génitale et du cuir chevelu, et apparaît à la puberté. L'isoenzyme de type 2 est prédominante dans la prostate et au niveau de la peau des territoires sexuels différenciés : région génitale, barbe, et joue un rôle dans la différenciation sexuelle. La répartition des isoenzymes de type 1 et 2 de la 5α-réductase au niveau de la peau et des annexes cutanées chez l'homme peut être illustrée par le tableau 1 ci-après.
Il existe un certain nombre de pathologies pour lesquelles une exagération congénitale ou acquise de l'activité de la 5α-réductase est responsable en totalité ou en majorité des troubles observés. Par exemple, chez l'homme, cette enzyme 5α-réductase, principalement localisée dans les tissus génitaux et dans la peau, catalyse l'hydroxylation de la testostérone en 5α-réductase dihydrotestostérone (DHT). Or, comme la DHT est un androgène bien plus actif que la testostérone (environ 2 fois plus), les effets de cette dernière sont amplifiés dans les tissus où est produite la DHT. Une activité trop élevée de la 5α-réductase provoque ainsi des teneurs en androgène sous forme de DHT trop élevées dans la prostate, d'où une surstimulation de cette dernière se traduisant en une croissance indésirable pouvant mener à la pathologie de l'hypertrophie prostatique, voire à l'adénome prostatique, nécessitant le plus souvent une intervention chirurgicale.
Tableau 1 ; répartition des isoenzymes de type 1 et 2 de la 5α-réductase au niveau de la peau et des annexes cutanées chez l'homme
Figure imgf000003_0001
D'autres pathologies, de type dermatologique, peuvent être observées chez l'homme ou la femme comme résultant d'une suractivité de la 5α-réductase à savoir, en particulier l'acné, l'hirsutisme ou encore l'alopécie.
Dans la peau, l'activité de la 5α-réductase est plus importante dans la glande sébacée que dans les autres structures. Par ailleurs, les glandes séborrhéiques montrent une activé 5α-réductase plus importante que celles des autres territoires cutanés. Par conséquent, le niveau de sécrétion sébacée physiologique semble étroitement lié à l'activité de cette enzyme. Chez l'acnéïque, il existe une hyperactivité de la 5α-réductase. Plus qu'une augmentation des taux sériques des androgènes, c'est une augmentation des précurseurs en DHT, facteur principal de la fonction sébacée, qui participent à l'acné. La peau grasse ou (séborrhée), outre son aspect disgracieux, constitue un terrain sur lequel peuvent survenir des complications. Elle atteint les zones où les glandes sébacées sont nombreuses et résulte principalement d'une surstimulation androgénique de la production sébacée par ces glandes spécifiques. L'hyperséborrhée participe à la survenue des lésions d'acné vulgaire.
Dans le cuir chevelu, on retrouve l'isoenzyme de type 1 de la 5 -réductase au niveau des glandes sébacées, ainsi qu'au niveau du follicule pileux. L'isoenzyme de type 2 de la 5α-réductase est localisée majoritairement au niveau de la gaine épithéliale interne, ainsi qu'au niveau de la papille dermique du cheveu. Cependant cette dernière localisation reste à préciser.
L'alopécie androgénique, dont la physiopathogénie est très voisine de celle de l'acné, est la plus fréquente des alopécies et sans doute celle où la demande de thérapeutique est la plus forte. La 5α-réductase semble jouer un rôle primordial dans cette pathologie. En effet, les hommes atteints d'un déficit génétique en isoenzyme de type 2 de la 5α-réductase ne développent pas d'alopécie androgénétique.
Compte tenu de ce qui précède, la recherche s'est orientée vers la mise au point d'inhibiteurs de la 5α-réductase. Certains stéroïdes comme la progestérone ont été testés dans ce sens, mais sa métabolisation rapide la rend inefficace in vivo. Pour être actif, l'inhibiteur de 5α-réductase doit être suffisamment stable pour bloquer l'activité de l'enzyme in vitro. Le finastéride, inhibiteur compétitif stéroïdien, rempli cette condition, mais il est plus actif sur l'isoenzyme de type 2 que sur l'isoenzyme de type 1 et ces deux isoenzymes n'ont que 50 % d'homologie sur la séquence de leurs acides aminés. C'est donc surtout dans l'hyperplasie bénigne de la prostate que le finastéride a déjà été testé.
Par ailleurs, on connaît également l'extrait de Serenoa Repens, comme référence en tant qu'inhibiteur de la 5α-réductase, l'extrait de Serenoa Repens présentant l'avantage, par rapport au finastéride, d'une origine naturelle en tant qu'extrait végétal permettant une meilleure comparaison pour des produits testés également d'origine naturelle. Serenoa Repens, également connu sous la dénomination Sabal serrulatum, est un petit palmier que l'on peut trouver aux Etats-Unis (Floride) en Afrique du Nord et en Espagne.
On a maintenant trouvé de manière tout à fait surprenante et inattendue que l'utilisation de certains composés d'origine végétale permet d'obtenir un effet remarquable d'inhibition de l'activité de la 5α-réductase de type 1 procurant ainsi notamment une nouvelle réponse pour le traitement des pathologies et/ou désordres dermatologiques évoqués ci-dessus.
La présente invention se rapporte ainsi à l'utilisation d'au moins un produit choisi dans le groupe constitué par les isoflavones, les extraits de prunier d'Afrique et les mélanges de ces derniers, pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de la 5α-réductase de type 1
Selon l'invention, l'expression "et les mélanges de ces derniers" ci-dessus englobe bien entendu en particulier des mélanges d'isoflavones, des mélanges d'extraits de prunier d'Afrique ou encore des mélanges d'isoflavones(s) et d'extrait(s) de prunier d'Afrique.
• En particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que la composition est destinée à inhiber l'isoenzyme de type 1 de la 5α-réductase
Les isoflavones utilisables selon l'invention peuvent être obtenues par synthèse chimique ou sont des substances naturelles extraites de produits naturels, notamment à partir des végétaux. Les isoflavones utilisables peuvent aussi être un mélange d'isoflavones d'origine naturelle et synthétique.
On distingue les formes aglycones des isoflavones et les formes glycosylées de ces dernières. Ces diverses formes sont illustrées par les formules suivantes.
Formes aglycones, de formule :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle RI représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy, R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe methoxy et R6 représente un groupe hydroxy ou un groupe methoxy. Plus particulièrement, RI, R2 et R6 peuvent prendre les significations suivantes :
RI R2 R6 Nom du composé
H H OH Daidzeine
OH H OH Genisteine
H OCH3 OH Glyciteine
H H OCH3 Formononectine
OH H OCH3 Biochanine A
Formes glycosylées, de formule
Figure imgf000006_0001
(H) dans laquelle R3, R4 et R5 représentent :
R3 R4 R5 Nom du composé
H H H Daidzine
OH H H Genistine
H OCH3 H Glycitine
H H COCH3 Acetyldaidzine
OH H COCH3 Acetylgenistine
H OCH3 COCH3 Acetylglycitine
H H COCH2COOH Malonyldaidzine
OH H COCH2 COOH Malonylgenistine
H OCH3 COCH2COOH Malonylglycitine On peut encore citer :
- la génistéin-4'-0-glucoside de formule
Figure imgf000007_0001
- la 2'-hydroxygénistéin-7-0-glucoside de formule :
Figure imgf000007_0002
- la génistéin-C-8-glucoside de formule
Figure imgf000007_0003
la 2, 4, 4'-trihydroxydeoxybenzoine (THB) de formule :
Figure imgf000007_0004
On préfère dans le cadre de la présente invention les isoflavones de forme aglycone, de formule (I) telle que définie ci-dessus. Les formes glycosylées des isoflavones sont hydrolysées sous l'action des béta-glucosidases. Les formes glycosylées (daidzine et génistine) et acylées sont les plus abondantes. Une hydrolyse acide chimique ou enzymatique peut transformer ces formes conjuguées en daidzéine et genistéine, plus absorbables. L'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que le produit est choisi parmi les isoflavones synthétiques ou d'origine naturelles, du groupe constitué par les génistine, daidzine, glycitine, acétyldaidzine, acétylgenistine, acétylglycitine, malonyldaidzine, malonylgénistine, malonylglycitine, la 2,4,4'- trihydroxydeoxybenzoine (THB), la daidzéine, la genistéine, la glycitéine, la formononectine, la biochanine A, la génistéin-4'-0-glucoside, la 2'-hydroxygénistéin- 7-0-glucoside, la génistéin-C-8-glucoside,et les mélanges de ces derniers.
On préfère tout particulièrement utiliser selon l'invention un produit choisi dans le groupe constitué par la génistine, la genistéine et les mélanges de ces derniers. On ne connaît pas de sources naturelles aussi riches en isoflavones que le soja. Les méthodes de purification des isoflavones à partir de produits du soja, notamment les graines, les germes de soja (ou "soja germé"), les laits de soja dont broyats et mélasses et les produits fermentes (en particulier Tofu et Tempeh) sont bien connues de l'homme du métier.
Le tableau 2 suivant illustre les teneurs en isoflavones (microgrammes/gramme) dans des graines de soja de récoltes de l'Iowa (Wang et Murphy, "Isoflavone composition of American and Japanese Soybeans in Iowa : effects of variety, crop year, and location", J. Agric. Food Chem. 1994, 42, 1674-1677). Tableau 2 : exemple de teneurs en isoflavones dans des graines de soja
Figure imgf000009_0001
Le soja germé est la source de soja la plus riche en isoflavones.
Concernant le lait de soja, il est traditionnellement obtenu à chaud par broyage des graines après dépelliculage, en milieu alcalin. Un traitement thermique est effectué pour inhiber les facteurs antitrypsiques.
Les quantités d'isoflavones présentes dans les laits de soja sont variables. Le tableau 3 suivant est une illustration des teneurs en isoflavones des laits de soja.
Tableau 3 : exemple de teneurs en isoflavones dans des laits de soja
Figure imgf000010_0001
Les broyats ou mélasses résultant de la production du lait de soja représentent également une source d'isoflavones de soja.
Par "extraits d'isoflavones de soja", on entend ainsi selon l'invention les extraits d'isoflavones de soja obtenus à partir des différents produits du soja décrits ci- dessus (graines, germes de soja (ou "soja germé"), les laits de soja dont broyats et mélasses et les produits fermentes (en particulier Tofu et Tempeh)), extraits qui ont éventuellement été purifiés et/ou concentrés pour augmenter leurs teneurs en isoflavones, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.
L'utilisation selon l'invention est ainsi également caractérisée en ce que ledit produit est choisi parmi les extraits d'isoflavones du soja. On peut en particulier citer l'extrait d'isoflavones de soja commercialisé par la
Société Nutrinov sous la dénomination Genosten 4000R. Il s'agit d'un extrait soluble de soja enrichi en isoflavones obtenu après concentration par évaporations successives des mélasses de soja. Ce procédé ne fait appel à aucun solvant organique. On trouvera des données analytiques sur ce produit dans les exemples ci-après.
Le lupin (lupinus) est également une source naturelle intéressante en isoflavones. On peut citer en particulier la variété du "lupin jaune" dans les tiges duquel ont notamment été identifiées les isoflavones glycosylées génistine, 2'- hydroxygénistéin-7-0-glucoside, génistéin-4'-0-glucoside et la génistéin-C-8-glucoside dont les formules respectives sont décrites ci-dessus (Rafal Franski et al, "Application of mass spectrometry to structural identification of flavonoid monoglycosides isolated from shoot of lupin (lupinus luteus L.)", Acta Biochimica Polonica, vol. 46, N° 2/1999, 459-473).
L'utilisation selon l'invention est ainsi également caractérisée en ce que le produit est choisi parmi les extraits d'isoflavones du lupin c'est-à-dire, par analogie avec la définition ci-dessus pour les extraits d'isoflavones du soja, parmi les extraits d'isoflavones pouvant être obtenus à partir des produits du lupin.
Les extraits de prunier d'Afrique ou "Pygeum Africanum" sont bien connus de l'homme du métier. Ils sont principalement issus de l'écorce du prunier d'Afrique. Il s'agit d'extraits stéroliques de prunier d'Afrique, tel que celui commercialisé par la société Euromed sous la dénomination "Pygeum". L'extrait de prunier d'Afrique dont l'utilisation est un objet de la présente invention présente la répartition en poids en acide gras suivante : de 30 à 40% en acide oléique, de 7 à 12% en acide linoléique, de 40 à 55% en acide palmitique et inférieur à 3% en acide linolénique. La teneur en stérols est comprise entre 13 et 18% et l'indice acide global de l'extrait est inférieur à 45.
On préfère tout particulièrement l'extrait de prunier qui se caractérise en outre par une teneur relative en β-sitostérol de 65 à 80%.
On préfère, dans le cadre de la présente invention, l'extrait de prunier qui se caractérise en outre par une teneur en insaponifiable de 15 à 18%. On préfère tout particulièrement l'extrait de prunier qui se caractérise en outre par une teneur en β- sitostérol de 65 à 80%.
L'extrait de prunier convenant à l'utilisation selon la présente invention peut par exemple présenter les spécifications suivantes :
Figure imgf000012_0001
On utilise en particulier selon l'invention le produit tel que décrit ci-dessus, sous forme d'isoflavone(s) de soja, d'extrait(s) de prunier d'Afrique ou d'un mélange de ces derniers, selon une proportion comprise entre environ 0,001 et environ 100 % en poids (utilisation sous forme pure possible dudit produit), de préférence entre environ 0,01 et environ 70 % en poids, et plus particulièrement encore entre environ 0,1 et 10 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
La composition préparée par l'utilisation selon l'invention peut en outre comprendre un excipient pharmaceutiquement, dermatologiquement ou cosmétiquement acceptable. On peut utiliser tout excipient adapté pour les formes galéniques connues de l'homme de métier, en vue d'une administration par voie topique, orale, entérale ou parentérale, notamment rectale.
En particulier, cet excipient peut être adapté pour l'obtention d'une composition sous forme d'une solution huileuse, d'une émulsion eau-dans-huile, une émulsion huile-dans-eau, une microémulsion, un gel huileux, un gel anhydre, une crème, une dispersion de vésicules, de microcapsules ou de microparticules, ou encore de gellules ou de capsules molles de gélatine ou végétales.
De préférence, on utilise un excipient adapté pour une administration par voie topique externe ou par voie rectale.
L'effet avantageux d'inhibition de l'activité de la 5α-réductase de type 1 fourni par l'utilisation selon l'invention permet de destiner la composition ainsi préparée à des traitements thérapeutiques, notamment dermatologiques, et cosmétiques.
Ainsi, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement des pathologies et/ou des désordres cutanés liés à une exagération congénitale ou acquise de l'activité de la 5α-réductase de type 1.
L'utilisation selon l'invention est également caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement de l'acné.
L'utilisation selon l'invention est également caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement de l'hyperséborrhée.
Enfin, l'utilisation selon l'invention est également caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement de l'alopécie.
L'utilisation selon l'invention est également caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement de l'hirsutisme. La présente invention a encore pour objet une méthode de traitement cosmétique de la peau grasse, caractérisée en ce qu'on applique sur la peau une composition cosmétique contenant au moins un produit choisi dans le groupe constitué par les isoflavones, les extraits de prunier d'Afrique tels que définis ci-dessus et les mélanges de ces derniers, tels que décrits ci-dessus. L'invention a par ailleurs pour objet une méthode de traitement cosmétique de la chute des cheveux, caractérisée en ce qu'on applique sur le cuir chevelu une composition cosmétique contenant au moins un produit choisi dans le groupe constitué par les isoflavones, les extraits de prunier d'Afrique tels que définis ci-dessus et les mélanges de ces derniers, tels que décrit ci-dessus. Enfin, l'invention a également pour objet une méthode de traitement cosmétique de l'excès de pilosité, caractérisée en ce qu'on applique sur les zones de la peau présentant des excès de pilosité une composition cosmétique contenant au moins un produit choisi dans le groupe constitué par les isoflavones, les extraits de prunier d'Afrique tels que définis ci-dessus et les mélanges de ces derniers, tels que décrits ci- dessus. En effet, à l'opposé des traitements médicaux hormonaux, ces deux dernières méthodes de traitement cosmétique permettent d'améliorer l'apparence en réduisant de manière visible les phénomènes disgracieux de chute de cheveux liés à l'alopécie et les phénomènes d'excès de pilosités liés à l'hirsutisme.
Selon un mode de mise en œuvre préféré de ces méthodes de traitements cosmétiques, ledit produit est présent dans la composition selon une proportion comprise entre environ 0,001 et environ 100 % en poids (utilisation sous forme pure possible, sans excipient), de préférence entre environ 0,01 et environ 70 % en poids, et plus particulièrement encore entre environ 0,1 et 10 % en poids, par rapport au poids total de la composition. Avantageusement, la composition cosmétique appliquée selon la méthode cosmétique de l'invention contient en outre au moins un excipient cosmétiquement acceptable tel que décrit ci-dessus.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'au moins un composé choisi dans le groupe constitué par les isoflavones, les extraits de prunier d'Afrique tels que définis ci-dessus et les mélanges de ces derniers, tels que décrits ci-dessus, en tant qu'additif dans un aliment pour l'être humain et/ou l'animal. Cette utilisation alimentaire est de préférence caractérisée en ce que ledit additif est présent dans l'aliment selon une proportion comprise entre environ 0,001 et environ 100 % en poids, de préférence entre environ 0,01 et environ 70 % en poids, et plus particulièrement encore entre environ 0, 1 et 10 % en poids, par rapport au poids total de l'aliment.
Les exemples suivants sont destinés à illustrer la présente invention et ne doivent en aucun cas être interprétés comme pouvant en limiter la portée.
A moins qu'il n'en soit précisé autrement, les pourcentages indiqués dans les exemples suivants sont des pourcentages en poids. Enfin, l'invention a également pour objet l'utilisation d'extraits de prunier d'Afrique tels que définis ci-dessus pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de la 5α-réductase de type 2. l'invention a également pour objet l'utilisation d'extraits de prunier d'Afrique tels que définis ci-dessus pour la préparation d'une composition destinée au traitement de l'hypertrophie prostatique.
En outre, les extraits de prunier d'Afrique tel que définis ci-dessus peuvent être utilisés pour la préparation d'une composition destinée au traitement et de l'adénome prostatique, et notamment pour la préparation d'une telle composition pour l'administration par voie rectale.
Bulletins analytiques des produits testés dans les exemples
L'extrait d'isoflavones de soja testé, dénommé Genosten 4000, a été fourni par la société Nutrinov.
Description : Extrait soluble de soja enrichi en isoflavones obtenu par une technique d'extraction physique, sans utilisation de solvants organiques.
Caractérisitiques physico-chimiques :
Densité 400 g/1
Humidité < 5 %
PH (solution aqueuse à 4%) 8
Solubilité dans l'eau 100 %
Composition :
Protéines 11 %
Lipides < 0.5 %
Glucides 60 %
Sodium 1500 mg/100g
Calcium < 100 mg/100g
Potassium 5500 mg/100g
Phosphore 300 mg/100g
Composition en isoflavones :
Teneur totale en isoflavones : 4000 +/- 200 mg/100 g Profil type : Daidzine 200 Génistine 280 Malonyldaidzine 900
Malonylgénistine 2080
Daidzéine 30
Genistéine 10
L'extrait de Pygeum Africanum testé a été fourni par la société Euromed.
Description : Extrait lipido-stérolique de Pygeum Africanum issu de l'écorce de pygeum.
Caractérisitiques physico-chimiques
Aspect pâte visqueuse de couleur marron prononcé, avec une odeur caractéristique
Solubilité Insoluble dans l'eau, soluble dans le chloroforme
Perte à la dessication 3 % max. Cendres 0.4 % max. Absorption UN Maxima à 242 ; 282 et 320 nm
Composition chimique
Indice d'acide 39 mg KOH/g
Composition en acides gras (%)
C12:0 0.3
C16:0 44.6
C18:0 5.6
C18:l 36.6
C18 :2 9.8
C18 :3 0.6
Teneur en insaponifiable 17.6 %
Stérols 14.7 Exemple 1 : Evaluation de l'activité inhibitrice sur l'activité de la 5α- réductase par mesure du taux de 5-dihydrotestostérone formée à partir de la testostérone par les cellules DU145.
1. Matériel et méthodes
1.1 Matériel
Les cellules prostatiques DU 145 sont issues d'une lignée tumorale obtenue à partir d'un carcinome de la prostate (N° ATCC HTB 81). Le milieu MEM (réf.0410265), la glutamine et la gentamycine viennent de chez Gibco. Le sérum de veau fœtal (SVF) vient de chez DAP et est utilisé décomplémenté (45 mm à 56°C). les plastiques servant à la culture (boîtes et plaques) viennent de chez Costar. La testostérone vient de chez Sigma.
1.2 Méthode 1.2.1 Préparation des gammes de produits
Une solution mère en éthanol à 10 mg/ml est préparée à partir de chacun des produits testés.
La gamme de concentration utilisée pour les expériences est la suivante : 0, 5, 10, 50, 100 et 500 microgrammes/ml. (Dilution effectuée dans le milieu de culture). Le volume d'extrait ajouté par puits étant de 20 microlitres/puits, les solutions à préparer sont concentrées 50X.
Préparation de la Testostérone
Une solution mère de testostérone à 10 mM est préparée dans l'éthanol. Au moment de son utilisation, cette solution est diluée au 1 :1000 dans le milieu de culture et 10 microlitres sont ajoutés par puits.
1.2.2. Expérience d'inhibition de la 5α-réductase des DU 145
Les cellules prostatiques DU 145 sont cultivées à 37°C, 5% CO2 dans un milieu MEM contenant de la glutamine (2mM), de la gentamycine (50 microgrammes/ml) et 10% de SNF. Leur taux de sous-culture est de 1:10.
Avant de lancer l'expérimentation, les cellules sont mises en culture dans des plaques 6 puits à raison de 2.10*5 DU 145 par puits/1 ml de milieu ne contenant que 1% de SNF. Les cellules sont maintenues 3 jours à 37°C, 5% CO2- Le jour de l'expérience, le milieu de culture contenu dans les puits est éliminé et remplacé par du milieu neuf contenant 1% de SNF. La testostérone (0,1 micromolaire final) ainsi que les extraits aux différentes concentrations sont ajoutés au milieu à raison de 10 et 20 microlitres/puits respectivement. (Les puits "contrôles" correspondent à des cellules incubées en présence de testostérone et d'un équivalent Ethanol. Ceci permet de soustraire l'effet du solvant sur les cultures et de déterminer le pourcentage de DHT formée en absence d'inhibiteur). Les cellules sont alors incubées à 37°C, 5% CO2- Au bout de 3 heures, les surnageants de culture sont collectés et congelés à -80°C jusqu'au dosage.
Mesure du taux de DHT formée
Principe: extraction des produits lipophiles par l'éther, concentration des échantillons en DHT par chromatographie d'affinité et dosage radio-immunologique Préparation des échantillons
- Après avoir agité au vortex les prélèvements, introduire les échantillons dans des flacons "SEPEX"
- Ajouter dans chaque tube 0,1 ml de la solution radioactive"3H-Rdt" (pour évaluation du rendement d'extraction). Boucher les flacons, les agiter un par un au vortex.
- Laisser reposer 30 min à température ambiante. Puis agiter de nouveau chaque flacon au vortex. - Ajouter dans chaque flacon : 5 ml d'éther éthylique.
- Boucher les flacons et les agiter manuellement de façon énergique. Laisser décanter quelques minutes.
- Congeler les phases aqueuses à -30°C, pendant au moins 1 heure.
- Recueillir la phase éthérée dans un tube à essai en boro-silicate de 5 ml correspondant. - Evaporer totalement la phase éthérée à l'aide du système évaporateur + bain-marie à
37°C.
Séparation de la DHT • Préparation des colonnes : Préparer les colonnes dans des pipettes de culture en verre de 5 ml avec 10 cm de chromatolithe A.
• Rinçage des colonnes : 3 ml d'iso-octane pur combitips (3 fois), en laissant couler par simple gravité.
• Elution des extraits éthérés secs - Chaque extrait sec est repris par 1 ml d'iso-octane pur, vortexer vigoureusement. Attendre 15 min à température ambiante. Réagiter au vortex.
- Lorsque les 3 ml d'iso-octane (lavage des colonnes) sont élues, transvaser les extraits éthérés secs repris par l'iso-octane sur la colonne. Laisser éluer.
- Rincer chaque tube "extrait sec" avec 1 ml d'iso-octane pur combitips, vortexer vigoureusement. Attendre 15 min à température ambiante. Réagiter au vortex et transvaser dans la colonne comme précédemment.
- Laver par 4 ml d'iso-octane pur.
• Recueil de la DHT
- Préparer le solvant d'élution (mélange à 6% iso-octane/acétate d'éthyl: 94/6 (v-v)) -Eluer par 6 ml (pipette) de ce mélange.
- Recueillir l'éluat DHT dans les tubes à essais en boro-silicate de 5 ml identifiés.
• Traitement de l'éluat DHT : Evaporer le solvant de l'éluat à l'aide du système évaporateur-bain-marie (37°C)
Dosage RIA
• Protocole de distribution : Rependre les échantillons par 0,5 ml de tampon RC, le Blanc par 1 ml de tampon Rcet, les Contrôles par 0,5 ml de tampon RC. Placer à l'étuve à 37°C 15 min Agiter de nouveau les tubes au sortir de l'étuve (1 min).
Dans des tubes à hémolyse en verre identifiés de 5 ml, mettre dans l'ordre: * Tampon : Activité Totale (AT): 0,7 ml de tampon RC, Activité Non Spécifique (N): 0,2 ml de tampon RC, Gamme : seul le point 0 de la gamme (noté BO) comporte 0,1 ml de tampon RC,
*Solution étalon (1000 à 7,8 pg/tube) : 0,1 ml de la solution étalon respective. * 0,1 ml d'extrait sec repris dans le tampon
- Puis, distribuer l'anti-sérum : 0,1 ml dans tous les tubes sauf AT et N.
- Puis, distribuer la solution de dosage "3HD" : 0,1 ml dans tous les tubes.
- Nortexer et recouvrir d'un parafilm.
- Incubation à 4°C, pendant lh30 minimum (24 h. maximum). • Préparation du charbon-dextran : Mettre la suspension de charbon-dextran dans un bêcher, puis, dans un bain d'eau glacé à 4°C, pendant au moins lh30.
• Rendement de purification en DHT
- Dans 6 petites fioles à scintillation (3 par série) déposer : 0,4 ml de tampon RC + 0,1 ml de la solution "3H-Rdt" (flacon du premier jour au réfrigérateur). Blancs : mettre 0,5 ml d'extrait sec reconstitué pour le blanc. Echantillons et contrôles : mettre 0,25 ml de tampon RC + 0,25 ml d'extrait.
- Ajouter 5 ml de liquide à scintillation dans toutes les fioles.
Séparation de la DHT libre de celle liée à l'anticorps - Mettre la suspension de charbon-dextran sous agitation magnétique, dans une bassine d'eau glacée.
- Ajouter 0,5 ml de charbon-dextran dans tous les tubes sauf AT en 2 min maximum.
- Nortexer, remettre les tubes dans l'eau glacée. Attendre 10 min exactement. Centrifuger à 4°C, 3400 rpm, pendant 11 min - Pipeter 0,5 ml de chaque surnageant (y compris AT) dans une petite fiole de comptage
- Ajouter 5 ml de liquide scintillant. Agiter, laisser s'équilibrer 30 min à température ambiante.
- Mettre à compter 2 min avec le compteur β (Beckman, LS 6000 SE). 2. Résultats - Evaluation de la conversion de la testostérone en 5- dihydrotestostérone par les cellules DU 145 - Détermination des IC 50
Tableau 4
Figure imgf000021_0001
3. Conclusions
L'extrait de serenoa Repens, choisi comme substance de référence, inhibe l'activité de la 5-alpha réductase. Ce résultat valide donc le test.
L'extrait de Pygeum Africanum testé est actif dans l'inhibition de la 5-alpha réductase.
Exemple 2 : Evaluation in vitro de l'activité de la 5-α réductase sur la conversion de la testostérone en 5α-dihydrotestostérone dans des cultures de fibroblastes dermiques humains normaux.
Abréviations utilisées dans ce qui suit :
3H : tritium
CCM : chromatographie en couche mince
Ci : Curie
DMSO : diméthyl sulfoxyde
Ml 99 : appellation donnée à un milieu de culture standard
MCF : milieu de culture des fibroblastes
MEM : appellation donnée au milieu de culture, Minimum Essential médium
MIF milieu d'incubation des fibroblastes
Rf facteur de rétention relatif
SNF sérum de veau fœtal
5α-DHT : 5α-dihydrotestostérone On se propose d'évaluer l'effet des produits tels qu' un extrait d'isoflavones de soja (Genosten 4000, décrit ci-dessus), de la genistéine et de la génistine (isoflavones purifiées, produits commerciaux Sigma), d'un extrait de Pygeum Africanum, d'un extrait de Serenoa Repens choisi comme référence, sur l'activité de la 5α-réductase. Un modèle in vitro de cultures de fibroblastes dermiques humains normaux a été retenu.
1. Matériels et méthodes
1.1 Produits à l'essai, produit de référence, et réactifs Les produits à l'essai ont été fournis par EXPANSCIENCE et ont été conservés à +4°C jusqu'au moment de leur utilisation.
La testostérone radioactive (marquée au tritium en position 1, 2, 6 et 7, activité spécifique 79 Ci/mmol) était fournie par AMERSHAM, la testostérone non- radiomarquée était fournie par SIGMA. Les réactifs de qualité analytique, provenaient de chez SIGMA, MERCK,
BDH, ALDRICH ou CARLO ERBA sauf indication contraire.
1.2 Système d'essai
Le milieu de culture des fibroblastes (MCF) était constitué par du MEM/M199 (3:1, v/v) additionné de pénicilline (50 Ul/ml), de streptomycine (50 μg/ml), de bicarbonate de sodium (0,2 %, p/v) et de SNF (10 %, v/v).
Le système d'essai était constitué de fibroblastes dermiques humains normaux cultivés en monocouche. Les fibroblastes ont été isolés à partir d'un résidu de plastie abdominale réalisée chez une femme de 51 ans (sujet BIOPREDIC n°I0013). Les cellules ont été utilisées au cinquième passage, elles ont été cultivées jusqu'à confluence des monocouches dans le milieu MCF à 37°C dans une atmosphère humide contenant 5 % de CO2. 1.3 Préparation des produits et incubation avec le système d'essai
Le milieu d'incubation des fibroblastes (MIF) était constitué de MCF additionné de testostérone tritiée (1,6 x 10'7 M, soit 6,32 μCi/ml) et de testostérone non radiomarquée (3,84 x 10"6 M). Les produits à l'essai et le finastéride ont été repris dans du DMSO avant d'être dilué dans le milieu d'incubation. La concentration finale en DMSO a été maintenue constante et égale à 1% (v/v) dans chaque dilution de produits à l'essai et de produit de référence.
Echelle de temps :
T-2 To T2
• • • Heures
•0- tf Ψ •»:-
θ : élimination du milieu MCF ft: pré-incubation des produits à l'essai et du produit de référence préparés dans le milieu MCF
Ψ: élimination des milieux MCF contenant les produits à l'essai ou le produit de référence : incubation des produits à l'essai et du produit de référence préparés dans le milieu MIF
•»>: détermination de l'activité de la 5α -réductase
Les cultures de fibroblastes ont été pré-incubées en présence des produits à l'essai ou du produit de référence pendant 2 heures avant l'ajout du substrat, la testostérone. Pour cette étape, les produits à l'essai et le produit de référence ont été préparés dans le milieu MCF.
Après la pré-incubation, les cultures de fibroblastes ont été incubées en présence des produits à l'essai ou du produit de référence préparés dans le milieu MIF pendant 22 heures (ou 24 heures, indiqué avec les résultats) à 37°C dans une atmosphère humide contenant 5 % de CO2. Des cultures témoins ont été incubées dans le milieu MIF en absence de produits à l'essai et de produit de référence. Des cultures
«témoin DMSO» ont été incubées dans le milieu MIF contenant 1% (v/v) de DMSO. Chaque condition expérimentale a été testée en triplicate.
1.4 Evaluation des effets
Après la période d'incubation, les cellules ont été soumises à l'action des ultrasons dans le milieu MIF. Les lysats cellulaires ainsi obtenus ont été extraits par du dichlorométhane. Après évaporation, les résidus secs ont été repris dans du méthanol et ont été déposés sur des plaques de silice 60F25 (MERCK, référence 5554).
Des standards non radiomarqués, la testostérone, la 5α-dihydrotestostérone et l'androstènedione, ont été déposés sur chacune des plaques. Le solvant de migration était un mélange de dichlorométhane et d'éther (7:3, v/v) A la fin de la migration, les plaques de silices ont été lues à l'aide d'un scanner de radioactivité BERTHOLD.
Les standards non radiomarqués ont été mis en évidence par pulvérisation d'acide sulfurique à 5 % (v/v) sur les plaques de chromatographie chauffées ensuite à 100°C pendant 10 minutes.
La comparaison des Rf (facteur de rétention relatif) déterminés pour les standards avec ceux obtenus pour les différents métabolites radioactifs a permis l'identification de ces derniers.
La métabolisation de la testostérone en 5α-dihydrotestostérone dans les différentes conditions expérimentales a été calculée : les résultats (aires des pics de 5α- dihydrotestostérone comptés par le scanner BERTHOLD) ont été exprimés en pmoles de 5α-dihydrotestostérone formées par puits de culture. Ils ont aussi été exprimés en pourcentage de l'activité 5α-réductase présente dans le groupe 'témoin DMSO'.
1.5 - Traitement des données
Les groupes de données (groupe témoin et groupes traités) ont été traités par une analyse de la variance à un facteur (ANONA 1, p<0,05), suivie par un test de DUΝΝETT (p<0,05). L'effet des produits à l'essai et du produit de référence a été comparé au groupe 'témoin DMSO'. Les effets des produits à l'essai ont été comparés entre eux par une analyse de la variance à deux facteurs (AΝONA 2, p<0,05, facteur 1 = concentration et facteur 2 = traitement). 2. Résultats et discussion
On se reportera au paragraphe 3 suivant pour les tableaux de résultats détaillés.
2.1. Génistine et genistéine
Dans les échantillons 'témoin DMSO' (0,1% v/v), la vitesse de métabolisation de la testostérone était de 11 ,40 +/- 0,75 pmoles de 5α-DHT formées en 24 heures par puits de culture (tableau paragraphe 3.1). Cette vitesse était conforme aux résultats déjà obtenus au laboratoire. La génistine, testée à 0,1 ; 1 et 10 μg/ml, n'avait pas d'effet d'inhibition significatif (p<0,05) sur l'activité de la 5α-réductase. A 100 μg/ml, ce produit inhibait significativement (p<0,05) de 32% l'activité de la 5α-réductase.
La genistéine, testée à 0,1 ; 1 et 10 μg/ml, inhibait significativement (p<0,05) de 32% ; 33% et 31% respectivement l'activité de la 5α-réductase. A 100 μg/ml, elle inhibait significativement (p<0,05) de 61 % l'activité de la 5α-réductase.
En conclusion, la genistéine est nettement plus active que la génistine.
2.2 Extrait d'isoflavones de soja Dans les cultures témoins, la vitesse de métabolisation de la testostérone était de 9,71 +/- 0,77 pmoles de 5α-DHT formées en 22 heures par puits de culture (tableau paragraphe 3.2). Cette vitesse était conforme aux résultats déjà obtenus au laboratoire.
L'extrait d'isoflavones de soja, testé à 10 et 100 μg/ml, inhibait respectivement de 22 et 17% l'activité de la 5α-réductase.
L'extrait de Serenoa Repens, testé à 10 et 100 μg/ml, inhibait respectivement de 15 et 35% l'activité de la 5α-réductase. A 1 μg/ml, il n'avait pas d'effet.
En conclusion, dans les conditions expérimentales retenues, les extraits d'isoflavones de soja et de Serenoa Repens (référence) inhibaient l'activité de la 5α réductase. L'extrait d'isoflavones de soja présente une activité d'inhibition de la 5α réductase supérieure à celle de l'extrait de Serenoa Repens. 2.3. Extrait de Pygeum Africanum
Dans les cultures témoins, la vitesse de métabolisation de la testostérone était de 9,71 +/- 0,77 pmoles de 5α-DHT formées en 22 heures par puits de culture (tableau paragraphe 3.3.). Cette vitesse était conforme aux résultats déjà obtenus au laboratoire.
Les effets des produits à l'essai ont été comparés à ceux obtenus en présence du finastéride, utilisé comme produit de référence en plus de l'extrait de Serenoa Repens. Le finastéride, testé à 3 et 30 ng/ml, inhibait respectivement l'activité de la 5α- réductase de 36 et 65% (tableau paragraphe 3.3.1). Ce résultat était attendu et valide l'étude.
L'extrait de Serenoa Repens, testé à 10 et 100 μg/ml, inhibait respectivement de 15 et 35% l'activité de la 5α-réductase. A 1 μg/ml, il n'avait pas d'effet (tableau paragraphe 3.3.2).
L'extrait de Pygeum Africanum, testé à 1, 10 et 100 μg/ml, inhibait respectivement de 33, 22 et 30% l'activité de la 5α-réductase (tableau paragraphe 3.3.2).
En conclusion, les extraits de Serenoa Repens et de Pygeum Africanum inhibaient de façon quasi identique l'activité de la 5α réductase.
3. Tableaux de résultats détaillés
3.1. Effet de la génistine et de la genistéine sur l'activité de la 5α- réductase dans des cultures de fibroblastes dermiques humains normaux, après 24 heures d'incubation
Figure imgf000027_0001
Les résultats sont exprimés en pmoles de 5α-DHT formées/puits de culture.
En gras : moyenne et écart type
En italique : pourcentage du groupe 'DMSO 0,1% (v/v)'
* : moyenne significativement différente du groupe 'DMSO 0,1% (v/v)'
ffet des extraits de Serenoa Repens et d'isoflavones de soja (Genosten 4000) sur l'activité de la 5α-réductase dans des cultures de flbroblastes dermiques humains normaux après 22 heures d'incubation
Figure imgf000028_0001
Les résultats sont exprimés en pmoles de 5α-DHT formées/puits de culture.
En gras : moyenne et écart type
En italique : pourcentage du groupe DMSO
* : moyenne significativement différente du groupe DMSO (p<0,05) ffet du finastéride et des extraits de Serenoa Repens et Pygeum Africanum sur l'activité de la 5α-réductase dans des cultures de flbroblastes dermiques humains normaux après 22 heures d'incubation
3.3.1. Finastéride
Figure imgf000029_0001
Les résultats sont exprimés en pmoles de 5α-DHT formées/puits de culture.
En gras : moyenne et écart type
En italique : pourcentage du groupe DMSO
* : moyenne significativement différente du groupe DMSO (p<0,05)
3.3.2. Extraits de Serenoa Repens et Pygeum Africanum
Figure imgf000029_0002
Les résultats sont exprimés en pmoles de 5α-DHT formées/puits de culture.
En gras : moyenne et écart type
En italique : pourcentage du groupe DMSO
* : moyenne significativement différente du groupe DMSO (p<0,05) Exemple 3 : composition d'un shampooing pour cheveux gras.
%
Aqua q.s.p. 100,000
Sodium Lauroamphoacetate 14,000
Coco-Glucoside 10,000
Magnésium Laureth Sulfate 5,000
PEG-40 Glyceryl Cocoate 3,450
PEG-150 Distearate 1,850
Sodium Coceth Sulfate 1,050
Citric Acid 0,450
Disodium EDTA 0,300
Parfum 0,200
Methylparaben 0,160
Butylparaben 0,060
Isoflavone de Soja 1,000
Pygeum Africanum 0,500
Exemple 4 : composition d'une émulsion pour peau grasse
%
Aqua q.s.p. 100
Di-C12-13 Alkyl Malate 10,000
Glycérine 5,000
PEG-5 Glyceryl Stéarate 3,500
Glyceryl Stéarate 1,500
Ceresin 1,500
PEG-40 Stéarate 1,500
Sorbitan Stéarate 1,000
Zinc PCA 1,000
Cetyl Alcohol 1,000
Polyacrylamide 1,000
C13-14 Isoparaffin 0,500
Parfum 0,500
Piroctone Olamine 0,300
Laureth-7 0,125
Sodium Polyacrylate 0,065
Citrate de glycérides de palme hydrogénés 0,040
Isoflavone de Soja 2,000 Exemple 5 : composition d'une émulsion pour peau grasse
%
Aqua q.! s.p. 100
Di-C12-13 Alkyl Malate 10,000
Glycérine 5,000
PEG-5 Glyceryl Stéarate 3,500
Glyceryl Stéarate 1,500
Ceresin 1,500
PEG-40 Stéarate 1,500
Sorbitan Stéarate 1,000
Zinc PCA 1,000
Cetyl Alcohol 1,000
Polyacrylamide 1,000
C13-14 Isoparaffin 0,500
Parfum 0,500
Piroctone Olamine 0,300
Laureth-7 0,125
Sodium Polyacrylate 0,065
Citrate de glycérides de palme hydrogénés 0,040
Pygeum Africanum 1,000
Acide Salycilique 1,000

Claims

Revendications
1. Utilisation d'au moins un produit choisi dans le groupe constitué par les isoflavones, les extraits de prunier d'Afrique et les mélanges de ces derniers, les extrait de prunier d'Afrique étant caractérisés en ce qu'ils présentent une répartition en acides gras de 30 à 40% en acide oléique, de 7 à 12% en acide linoléique, de 40 à 55% en acide palmitique et inférieur à 3% en acide linolénique, en ce que la teneur en stérols est comprise entre 13 et 18% et en ce que l'indice global de l'extrait est inférieur à 45, pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de la 5 -réductase de type 1.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les isoflavones selon la revendication 1 sont d'origine naturelle, synthétique ou un mélange d'isoflavones d'origine naturelle et synthétique.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le produit est choisi parmi les isoflavones de forme aglycone de formule (I)
Figure imgf000032_0001
dans laquelle RI représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy, R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe methoxy et R6 représente un groupe hydroxy ou un groupe methoxy.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le produit est choisi parmi les isoflavones synthétiques ou d'origine naturelles du groupe constitué par les génistine, daidzine, glycitine, acétyldaidzine, acétylgenistine, acetylglycitine, malonyldaidzine, malonylgénistine, malonylglycitine, la 2,4,4'-trihydroxydeoxybenzoine (THB), la daidzéine, la genistéine, la glycitéine, la formononectine, la biochanine A, la génistéin-4'-0- glucoside, la 2'-hydroxygénistéin-7-0-glucoside, la génistéin-C-8-glucoside et les mélanges de ces derniers.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que produit est choisi dans le groupe constitué par la génistine, la genistéine et les mélanges de ces derniers.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le produit est choisi parmi les extraits d'isoflavones du soja.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le produit est choisi parmi les extraits d'isoflavones du lupin.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le produit est utilisé selon une proportion comprise entre environ 0,001 et environ 100 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition préparée comprend un excipient pharmaceutiquement, dermatologiquement ou cosmétiquement acceptable.
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'excipient est adapté pour une administration par voie topique externe ou par voie rectale.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement des pathologies et/ou des désordres cutanés liés à une exagération congénitale ou acquise de l'activité de la 5α-réductase de type 1.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement de l'acné.
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement de l'hyperséborrhée.
14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement de l'alopécie.
15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement de l'hirsutisme.
16. Méthode de traitement cosmétique de la peau grasse, caractérisée en ce qu'on applique sur la peau une composition cosmétique contenant au moins un produit tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7.
17. Méthode de traitement cosmétique de la chute des cheveux, caractérisée en ce qu'on applique sur le cuir chevelu une composition cosmétique contenant au moins un produit tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7.
18. Méthode de traitement cosmétique de l'excès de pilosité, caractérisée en ce qu'on applique sur les zones de la peau présentant des excès de pilosité une composition cosmétique contenant au moins un produit tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7.
19. Méthode de traitement cosmétique selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisée en ce que ledit produit est présent dans la composition selon une proportion comprise entre environ 0,001 et environ 100 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
20. Méthode selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisée en ce que la composition cosmétique contient en outre au moins un excipient cosmétiquement acceptable.
21. Utilisation d'au moins un produit tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, en tant qu'additif dans un aliment pour l'être humain et/ou l'animal.
22. Utilisation selon la revendication 21, caractérisée en ce que le produit est présent dans l'aliment selon une proportion comprise entre environ 0,001 et environ 100 % en poids, par rapport au poids total de l'aliment.
23. Utilisation d'extraits de prunier d'Afrique tels que définis à la revendication 1 pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de la 5α-réductase de type 2.
24. Utilisation d'extraits de prunier d'Afrique tels que définis à la revendication 1 pour la préparation d'une composition destinée au traitement de l'hypertrophie prostatique.
25. Utilisation d'extraits de prunier d'Afrique tels que définis à la revendication 1 pour la préparation d'une composition destinée au traitement de l'adénome prostatique.
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