CZ302596B6 - Zpusob zpracování biomasy jetele lucního - Google Patents

Abstract

Reší se zpusob zpracování extrahované biomasy jetele lucního (Trifolium pratense L.) za úcelem prumyslove realizovatelné izolace genistinu nebo genisteinu, zeleného barviva Na-Cu-chlorofylinu, karotenu a feofytinu. Genistein jako fytoestrogen se využívá k výrobe léku tlumících projevy klimakteria u žen. Ostatní látky jsou využitelné jako barviva v potravinárském popr. kosmetickém prumyslu. Zpusob získávání uvedených látek lze využít s výhodou jako soubežnou technologii pri zpracování jetele lucního na cukerné roztoky pro výrobu bioetanolu a melasy, a na pevná biopaliva.

Description

Způsob zpracování biomasy jetele lučního

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu zpracování rostlinné biomasy, zejména z jetele lučního. Účelem zpracování je izolace cenných a hospodářsky využitelných látek.

i o Dosavadní stav techniky

Z rostlinných materiálů lze získat hospodářsky využitelné látky jako např. genistin, genistein, zelené barvivo Na-Cu chlorofylin, karotcny či ťeoťytiny.

Genistin je glykosid genisteinu. Genistein patří mezi izoťlavony, odvozené od 4-benzopyronu (chrontonu), které se zařazují do skupiny přirozených barvi v, fiavonoidů. Spolu s kumestany tvoří izoťlavony skupinu rostlinných estrogenú (ťytoestrogenů), které mají účinek blízký ovariálním estrogenním hormonům; mohou blokovat ovulaci, působit na pohyb vajíček, měnit složení hlenu v krčku děložním, ovlivňovat pohyb spermií, ale i aktivitu hypoťýzy a tím hladinu gonado2o tropních hormonů v organismu, U samců potlačují vývoj varlat i spermií. Izoťlavony v píci mohou být příčinou neplodnosti zvířat.

Význam estrogenú není jen v hormonální antikoncepci, ale také jako léku ženám po klimakteriu v ochraně proti osteoporóze. Pravé estrogeny podle některých autorů však mohou zvýšit riziko vzniku rakoviny prsu, děložní sliznice a infarktu či mozkové mrtvice. Sledováním četnosti výskytu těchto onemocnění v zemích, kde strava obsahuje značné množství ťytoestrogenů se soudí, že lýtoestrogeny tuto nepříznivou vlastnost steroidních estrogenú nemají. Proto se už prakticky využívají k výrobě léků, které zeslabují projevy klimakteria. Kromě zajištění pevnosti kostí dochází k zlepšení stavu cév a poklesu LDL cholesterolu.

Genistein byl poprvé izolován už v roce 1899 z kručinky barvířské (Genista tinctoria L,), v jeteli lučním v roce 1961. Genistin izolovali HÓrhammer a Wagner (1962) z vlčího bobu mnoholistého (Lupinus polyphyllus Lindl). V roce 1981 izoloval genistein zvícího bobu a / jetele Kolár (1981).

Způsoby izolace ťytoestrogenů z rostlinného materiálu a způsoby výroby izolátů se liší. V chaosu analytických postupů a výrobních metod však dochází i k významným omylům. Někteří autoři považují za genistein látku zcela jinou, alkaloid 1 α-izopartem (Kettelbach 1953), jiní 5,7dihydroxy 4’ 6 dimethoxy-flavon. tj. pektolinarigenin (Cumow, Rossiter 1955), ačkoliv genis40 tcinje 5,7,4’-trihydroxy--izoflavon:

Na trhu existují např. preparáty pro ženy v menopauze, které obsahují izoťlavony v extraktu 45 z jetele lučního. Extrakce se provádí v horké vodní lázni, popř. s přídavkem ethanolu, kde se jetel luční několik hodin extrahuje, následně se lázeň filtruje, a na vakuové odparce se jemně odpaří

- 1 CZ 302596 B6 při nízké teplotě nebo kryoskopieky. Nevýhoda tohoto způsobů spočívá v tom. že ve výsledném produktu jsou obsaženy nejenom genistin, gen i stein resp. izotlavony. ale i veškeré ostatní látky, které jsou schopné vodní extrakce, a které nemusí být pro dosažení výsledného účinku preparátu žádoucí. Další nevýhoda spočívá v nízké efektivitě procesu a velké spotřebě biomasy.

s

Výroba samotného genistinu nebo genisteinu účinnou a průmyslově realizovatelnou izolací z jetele lučního hy výrazně přispěla k efektivitě celkového zpracování jetele lučního na cukerné roztoky pro výrobu bioethanolu, pro krmné účely, pro výrobu pevného biopaliva a technické celulázy, jak je tento proces popsán v přihlášce vynálezu PV 2006-754 „Způsob zpracování bιοί o masy trav, zejména víceletých pícnin, na cukernou surovinu pro výrobu bioetanolu“ a v užitném vzoru UV 17229 „Zařízení pro zpracování biomasy trav“.

Úkolem vynálezu je tedy nalezení takového způsobu průmyslového zpracování jetele lučního, který by umožňoval účinnou izolaci genistinu, genisteinu, případně dalších látek, byl by efektivní is a průmyslově realizovatelný i s menším množstvím biomasy, popř. s větším množstvím biomasy a s menší účinností.

Podstata vynálezu »0

Tento úkol řeší způsob zpracování biomasy jetele lučního podle vynálezu, jeho podstata spočívá v lom, že nadzemní hmota jetele lučního (Trifolium pratense L.) se předem spaří, dezintegruje se v temnu, a separuje se na kapalný podíl a pevný podíl. Pevný podíl se následně v temnu extrahuje v methanolové lázni s přídavkem CaCO₄ a Na₂C’Ov Extrakt se opět v temnu a za sníženého tlaku zahustí na sirup, který se poté digeruje a separuje na vodný extrakt a zbytkový podíl. Vodný extrakt se po zchlazení, sedimentaci a oddělení balastuíeh látek použije k přípravě směsi sestávající z 1 hmotn. dílu vodného extraktu, 0,5 hmotn. dílu lakového benzinu (s = 0,76 až 0,78), 1 hmotn. dílu ethyleteru, a 5 hmotn. dílů ethylesteru kyseliny octové. Tato směs se po protřepání destiluje v destilační koloně, kde se oddestílují tekavé složky, a zbytek se odpaří ve vakuu na

5o odparce k suchu. Výparek se dále vymyje methanolem, přebytečný methanol se oddestiluje, a zbytek se na vodní lázni zahustí k přerušované krystalizaci, při které vzniká krystalizát. fen se přivádí na kolonu sloupcové chromatografie s náplní tvořenou perlonovým prachem a eluuje se methanolem, přičemž vznikají dvě zóny sledovatelné v ultrafialovém světle, kde slabší zóna obsahuje genistin, který se následně z příslušné frakce krystal ízátu izoluje vakuovým odpařením methanolu. Genistin je možno transportovat a skladovat k dalšímu zpracování.

Ze všech možných způsobu je tato izolace nejjednodušší a snadno průmyslově realizovatelná, za cenu nižšího výtěžku, což vzhledem ke snadné dostupnosti a ceně suroviny lze připustit, id Samotný genistin není fyziologicky účinnou látkou, proto je v některých případech výhodné, pro získání fyziologicky účinné látky, zhydrolyzovat genistin na genistein na místě. Hydrolýza se s výhodou provádí tak, že k získanému genistinu se přidá H₂SO₄ a methanol, a směs se vaří pod zpětným chladičem až do odpaření alkoholu. Následně se vychladí při nízkých teplotách, přičemž se z roztoku vyloučí jemná sraženina, která se oddělí filtračním kelímkem, promyje se ledovou destilovanou vodou, a vysuší při 60 až 70 °C, čímž se získá genistein. Výhoda spočívá především v tom, že hydrolýza nezatěžuje vlastní farmaceutický podnik, který pro svoji produkci využívá již hotový genistein.

Při výrobě genistinu nebo genisteinu je možné izolovat i další komerčně využitelné látky, zejména karoteny a feofytiny. izolace se s výhodou provádí tak, že zbytkový podíl extrahované biomasy se dále extrahuje petroléterem a vzniklý extrakt se přivádí na kolonu sloupcové ehromalografie naplněnou petroIéterovou suspenzí 70 % sacharózy a 30 % kukuřičného škrobu, kde se po usazení vytvoří na náplni v koloně vrstva 1 až 1,5 cm silná bezvodého Na₂SO₄, a dále se sloupec promývá petroléterem, přičemž se vymývají karoteny. Dále je výhodné, když sloupec se dále promývá petroléterem s přídavkem 2 % hmotn. acetonu, přičemž se vymývá feoťytin a. Dal ším výhodným postupem se sloupec dále promývá petroléterem s přídavkem 3 % hmotn. acetonu, přičemž se vymývá feofytin b. Nakonec je výhodné, když se z promývacího roztoku destilací oddělí aceton, a zbytek se extrahuje ethanolem, zfiltruje se, a vzniklý extrakt se uloží k dalšímu zpracování.

s

Při zpracování jetelové biomasy lze také izolovat zelené barvivo Na-Cu-chlorofýlin, které je oproti chlorofylu stabilní na světle a rozpustné ve vodě. Izolace barviva se s výhodou provádí tak, že kapalný podíl a/nebo pevný podíl spařené, desintegrované a separované biomasy jetele lučního se smísí s 15 až 20% roztokem NaOH, směs se zahřívá na teplotu 60 až 70 °C, a následně se io odstředí. Supernatant se smíchá s 95% ethanolem v objemovém poměru 1:1, dále se přidá extrakt uložený po izolaci karotenů a feofytinů, a CuSO₄ v množství potřebném pro dosažení výsledné koncentrace CuSO₄ v rozmezí 8 až 10 %. Následně se postupně přidává HCI až do dosažení pH v rozmezí 2,5 až 3,0 a směs se při teplotě 60 až 70 °C míchá po dobu 50 až 60 min. Poté se směs nechá zchladnout, odstředí se, a usuší se surový Cu-chlorofylin. který' se následně pro vyčištění i s rozpouští v acetonu a překrystaluje znovu z ethanolu. K čistému Cu-chloroťylínu se potom přidá

5% roztok NaOH v ethanolu (pH = 11 až 12) a při sníženém tlaku se oddestiluje ethanol, přičemž zbytek tvoří Čistý Na-Cu-chlorofýlin. Pro průmyslové použití se čistý Na-Cu-chloroťylin dále koncentruje nebo suší.

?o Na-Cu-chlorofyl in i karoteny se používají např. jako přísady do různých výrobků, a to jako barviva, popř. i z důvodů svých jiných účinků (karoteny působí např. jako tzv. zhášeče volných radikálů). Feofytiny jsou rovněž využitelné jako přírodní hnědá barviva např. v potravinářství, kosmetice, apod.

Řešení podle předloženého vynálezu umožňuje nejenom průmyslovou izolaci výše uvedených látek, ale podstatná jeho výhoda spočívá v tom. že umožňuje komplexní a prakticky bezodpadové zpracování jetele lučního na komerčně a průmyslově využitelné suroviny. Jetel luční jako jedna ze základních zemědělských plodin se v důsledku této nové využitelnosti může pěstovat i v tzv. méně příznivých zemědělských oblastech, s novými oblastmi využití.

Příklady provedení vynálezu

Rozumí se, že dále popsané a zobrazené konkrétní příklady uskutečnění vynálezu jsou před stav o35 vány pro ilustraci, nikoli jako omezení příkladů provedení vynálezu na uvedené případy. Odborníci znalí stavu techniky najdou nebo budou schopni zjistit za použití rutinního experimentování vetší či menší počet ekvivalentů ke specifickým uskutečněním vynálezu, která jsou zde speciálně popsána. I tyto ekvivalenty budou zahrnuty v rozsahu následujících patentových nároků.

Čerstvá hmota jetele lučního se ošetří krátkým spařením přehřátou párou k inaktivaci enzymů. Pak se ihned a v temnu desintegruje, tzn. rozemele a separuje. Kapalný podíl KP jde k dalšímu zpracování na tzv. „džus“, oddělený pevný podíl PP se úplně nebo zčásti převede do výrobny fytobarviv. Zbývající část se využívá pro zpracování na cukerné roztoky podle PV 2006-754 aUV 17229.

Ve výrobně fytobarviv je umístěna extrakční baterie, v níž se pevná hmota extrahuje ve tmě methanolem s přídavkem l % hmotn. CaCO? a 0,5 % hmotn. Na₂CO? k zabránění tvorby feofytinu z chlorofylu. Výpočet parametrů extrakce a extrakční kolony je nutno provést podle stavu suroviny a úrovně její desintegraee po laboratorních zkouškách. Extrakt se za sníženého tlaku (vodní vývěva) a ve tmě zahustí na sirupovitou konzistenci. Zhruba lze říci, že najeden hmotnostní díl materiálu v sušině je potřeba 2,5 hmotn. dílu methanolu.

Sirup se třikrát digeruje hmotnostním dílem horké destilované vody a oddělí se. Tím se získají dvě frakce: vodný extrakt V a zbytkový podíl Z.

( Z 302596 B6

Připraví se sloupcová ehromatogralle. Kolona sc plní petroIéterovou suspenzí 70 % sacharózy a 30 % kukuřičného škrobu, po usazení se na náplni v koloně utvoří vrstva 1 až 1,5 cm silná bezvodého Na^SO). Zbytkový podíl Z se extrahuje petroléterem a extrakt se použije k chromatografií, Sloupce se promývá nejprve petroléterem, vymývají se karoteny. Pak se promývá petrol·> éterem s 2 % acetonu - vymyje se feofytin a. Pak se obsah acetonu zvýší na 3 % a vymývá se feofytin b.

Acetonový extrakt se destiluje, oddělí se aceton a zbytek po destilaci se extrahuje ethanolem.

Zllltruje se a vzniká extrakt E se uloží k dalšímu zpracování.

ID

Základní materiál (spařený, rozdrcený a separovaný jetel) se smísí s 15 až 20% roztokem NaOH a zahřívá po dobu 50 až 70 minut na teplotu 60 až 70 °C. Odstředí se, supernatant se smíchá s 05% ethanolem v objemovém poměru 1:1, přidá se extrakt E a takové množství CuSO₄, aby výsledná koncentrace Cu$O₄ byla 8 až 10 %. Postupně se přidává HCI do pH = 2,5 až 3,0 a při i> 60 až 70 °C se míchá 50 až 60 minut. Pak se ponechá v klidu 3 až 4 hodiny, odstředí se a surový

Cu -chlorofylin se usuší. Pak se rozpustí v acetonu, překrystaluje se znova z ethanolu (pH ” 11 až

12) a při sníženém tlaku se oddestiluje ethanol, který se tak získá zpět. Zbytek, čistý Na·-Čuch lorofylin se použije ve formě koncentrátu nebo se dále suší.

2(i Druhá část produktu vodní d i gesce, vodný extrakt V. se 24 hodin chladí v ehladnici. Vyloučené balastní látky se oddělí, čirý vodný extrakt se izoluje. Jeden hmotnostní díl extraktu se smísí s 0,5 hmotn. dílem lakového benzinu (s = 0,76 až 0,78). 1 hmotn. dílem ethyleteru a 5 hmotn. díly ethylesteru kyseliny octové a vzniklá směs S se třepe na třepačce 5 až 10 min. Převede se do destilační kolony, nejprve se oddestiluje ethyleter (34 °C), pak ethylester (77 °C) a když se destiluje lakový benzin (150 °C). destilace se přeruší, zbytek se ve vakuu (vodní vývěva) odpaří k suchu. Žlutý výparek se vymyje množstvím methanolu, které odpovídá hmotnostnímu dílu materiálu v sušině, kterým byla zahájena výroba. Přebytek methanolu se oddestiluje, zbytek se na vodní lázni za normálního tlaku zahustí k přerušované krystalizaci.

Připraví se druhá sloupcová chromatografíe, délka sloupců v trubicích 60 cm, vnitřní průměr 6 cm. Plní se perlonovým prachem (ULTRAMID K 228 BM 2, BASF Německo). Na kolonu se přivádí 100 mg krystalizátu K, eluuje sc methanolem rychlostí 20 kapek/min, tvoří se 2 zóny, slabší obsahuje gen i stín. Pohyb zón sloupcem lze sledovat UV světlem a tak oddělit obě frakce krystalizátu. Methanol se od genistinu oddělí vakuovým odpařením, čímž se získává čistý genis3? tin.

Na přání odběratele je možno vyrobený genistin zhydrolyzovat na genistein. K 100 mg genistinu se přidá 20 ml 10% H₂SO₄, 5 ml methanolu a 3 hodiny se vaří pod zpětným chladičem. Ke konci se alkohol odpaří a směs se vychladí v mrazničce. Z roztoku se vylučuje jemná sraženina, oddělí io se filtračním kelímkem, promyje se ledovou destilovanou vodou a vysuší při 60 až 70 °C. Výtěžek by měl být asi 60 mg genisteinu.

-4CZ 302596 B6

Analytika

	genistin	genistein
Teplota tání °C	253	298
Elementární analýza	CziHaoOw M/-432,18 C * 59,56 H = 5,20	C13H10O5 Mv = 270,2 C = 66,88 H = 3,90
Papírová chromatografie Papír Schleicher - Schull, č. 2043 b, g4	soustava butanol - kys. octová - voda (4:1:5) Rf=0,80 detekce: 0,5% vodný roztok Echtblausalz B (Merck), pak postňk 0,1 M NaOH	soustava butanol - kys. octová - voda (4:1:5) Rf=0,93 detekce stejná jako u genistinu

Průmyslová využitelnost

Řešení podle vynálezu lze využít k průmyslové výrobě genistinu nebo genisteinu a dalších látek in jako např. zeleného barviva Na- Cu-chlorofý linu, karotcnů a feofytinú, zejména jako součást a doplněk zpracování biomasy jetele lučního na cukerné roztoky pro výrobu biocthanoiu a melasy a na pevná biopaliva.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   20 1. Způsob zpracování biomasy jetele lučního, vyznačující se tím, že nadzemní hmota jetele lučního (Trifolium pratense L.) se předem spaří, dezintegruje se v temnu, separuje se na kapalný podíl (KP) a pevný podíl (PP) a pevný podíl (PP) se následně v temnu extrahuje v methanolové lázni s přídavkem CaCO₃ a Na₂CO₃, extrakt se opět v temnu a za sníženého tlaku zahustí na sirup, který se poté digeruje a separuje na vodný extrakt (V) a zbytkový podíl (Z), kde

   25 vodný extrakt (V) se po zchlazení, sedimentaci a oddělení balastních látek použije k přípravě směsi (S) sestávající z 1 hmotn. dílu vodného extraktu (V), 0,5 hmotn. dílu lakového benzinu (s - 0,76 až 0.78), 1 hmotn. dílu ethyleteru, a 5 hmotn. dílů ethylesteru kyseliny octové, tato směs (S) se po protřepání destiluje v destilaění koloně, kde se oddestilují těkavé složky, a zbytek se odpaří ve vakuu na odparce k suchu, výparek se dále vymyje methanolem, přebytečný methanol

   50 se oddestiluje, a zbytek se na vodní lázni zahustí k přerušované krystalizaci, při které vzniká krystal izát (K), který se přivádí na kolonu sloupcové chromatografie s náplní tvořenou perlonovým prachem a eluuje se methanolem, přičemž vznikají dvě zóny sledovatelné v ultrafialovém světle, kde slabší zóna obsahuje genistin. který' se následně z příslušné frakce krystalizátu (K) izoluje vakuovým odpařením methanolu.
2. 2. Způsob podle nároku 1. vyznačující se tím, že získaný genistin se zhydrolyzuje na genistein.

   - s CZ 302596 B6
3. 3. Způsob podle nároku 2, vy z n a č u j í c í se t í m, že k získanému gen i stínu se přidá IBSOj a methanol, směs se vaří pod zpětným chladičem až do odpaření alkoholu, a následně se vychladí pri nízkých teplotách, přičemž se z roztoku vyloučí jemná sraženina, která se oddělí

   5 filtračním kelímkem, promyje sc ledovou destilovanou vodou, a vysuší při 60 až 70 °C. čímž se získá genistei n.
4. 4. Způsob podle nároku i, vyznačující sc tím. že zbytkový podíl (Z) extrahované biomasy se dále extrahuje petroléterem a vzniklý extrakt se přivádí na kolonu sloupcové chrolo matografie naplněnou pelroléterovou suspenzí 70 % sacharózy a 30 % kukuřičného škrobu, kde se po usazení vytvoří na náplni v koloně vrstva 1 až 1,5 cm silná bezvodého Na₂SOj, a dále se sloupec promývá petroléterem, přičemž se vymývají karoteny.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující s c tím, žc sloupec se dále promývá petrol15 éterem s přídavkem 2 % hmotn, acetonu, přičemž se vymývá feotýtin a,
6. 6. Způsob podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím. Že sloupec se dále promývá petroléterem s přídavkem 3 % hmotn. acetonu, přičemž se vymývá feofytin b.

   2o
7. 7. Způsob podle alespoň jednoho z nárokjů 5 nebo 6, vyznačující sc tím. že z promývacího roztoku se destilací oddělí aceton, a zbytek se extrahuje ethanolem, zfiltruje se, a vzniklý extrakt {F.) se uloží k dalšímu zpracování.
8. 8. Způsob podle nároků I a 7, vyznačující se tím, že kapalný podíl (KP) a/nebo

   25 pevný podíl (PP) spařené, dezintegrované a separované biomasy jetele lučního se smísí s 15 až 20% roztokem NaOH. směs se zahřívá na teplotu 60 až 70 °C, následně se odstředí, a supernatanl se smíchá s 95% ethanolem v objemovém poměru 1:1, dále se přidá extrakt (E) a CuSO₄ v množství potřebném pro dosažení výsledné koncentrace C11SO4 v rozmezí 8 až 10 %, následné se postupně přidává HCI až do dosažení pH v rozmezí 2,5 až 3,0 a směs se při teplotě 60 až 70 ^CC /o míchá po dobu 50 až 60 min, poté se nechá zchladnout, odstředí se, a usuší se surový Cu chloroíylin, který se následně pro vyčištění rozpouští v acetonu a překrystaluje znovu z ethanolu, k čistému Cu-ehlorofylinu se potom přidá 5% roztok NaOH v ethanolu (pH =11 až 12) a při sníženém tlaku se oddestiluje ethanol, přičemž zbytek tvoří čistý Na-Cu-chlorofylin.

   55 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že čistý Na-Cu-chlorofylin se dále koncentruje nebo suší.