CZ302596B6 - Zpusob zpracování biomasy jetele lucního - Google Patents
Zpusob zpracování biomasy jetele lucního Download PDFInfo
- Publication number
- CZ302596B6 CZ302596B6 CZ20070252A CZ2007252A CZ302596B6 CZ 302596 B6 CZ302596 B6 CZ 302596B6 CZ 20070252 A CZ20070252 A CZ 20070252A CZ 2007252 A CZ2007252 A CZ 2007252A CZ 302596 B6 CZ302596 B6 CZ 302596B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- column
- methanol
- extract
- ethanol
- distilled
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 title abstract description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N genistein 7-O-beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=C2C(=O)C(C=3C=CC(O)=CC=3)=COC2=C1 ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N 0.000 claims description 37
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- ZCOLJUOHXJRHDI-FZHKGVQDSA-N Genistein 7-O-glucoside Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)c1cc(O)c2C(=O)C(c3ccc(O)cc3)=COc2c1 ZCOLJUOHXJRHDI-FZHKGVQDSA-N 0.000 claims description 20
- CJPNHKPXZYYCME-UHFFFAOYSA-N Genistin Natural products OCC1OC(Oc2ccc(O)c3OC(=CC(=O)c23)c4ccc(O)cc4)C(O)C(O)C1O CJPNHKPXZYYCME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- YCUNGEJJOMKCGZ-UHFFFAOYSA-N Pallidiflorin Natural products C1=CC(OC)=CC=C1C1=COC2=CC=CC(O)=C2C1=O YCUNGEJJOMKCGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N genistein Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=COC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 229940045109 genistein Drugs 0.000 claims description 17
- 235000006539 genistein Nutrition 0.000 claims description 17
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 16
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 13
- 241000379547 Trifolium medium Species 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 235000013526 red clover Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 claims description 9
- 229940099898 chlorophyllin Drugs 0.000 claims description 9
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 claims description 8
- 150000001746 carotenes Chemical class 0.000 claims description 8
- 235000005473 carotenes Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000004821 distillation Methods 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002292 Nylon 6 Polymers 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 claims description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 3
- ZQGOYEJYAYJFTL-BTMCAZCFSA-N pheophytin b Chemical compound N1C(C=C2[C@H]([C@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)C(=N2)C2=C3NC(=C4)C(C)=C3C(=O)[C@@H]2C(=O)OC)C)=C(C)C(C=C)=C1C=C1C(C=O)=C(CC)C4=N1 ZQGOYEJYAYJFTL-BTMCAZCFSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 239000006188 syrup Substances 0.000 claims description 3
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 240000002913 Trifolium pratense Species 0.000 claims description 2
- 235000015724 Trifolium pratense Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims 1
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 5
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 5
- 150000002515 isoflavone derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- CJWQYWQDLBZGPD-UHFFFAOYSA-N isoflavone Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC(OC)=C1C1=COC2=C(C=CC(C)(C)O3)C3=C(OC)C=C2C1=O CJWQYWQDLBZGPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000008696 isoflavones Nutrition 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 2
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 2
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 2
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 2
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 2
- MLYYOHQNXPDGGV-UHFFFAOYSA-N 3,5-dimethoxy-2-phenylchromen-4-one Chemical compound COC=1C(=O)C=2C(OC)=CC=CC=2OC=1C1=CC=CC=C1 MLYYOHQNXPDGGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DANYIYRPLHHOCZ-UHFFFAOYSA-N 5,7-dihydroxy-4'-methoxyflavone Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 DANYIYRPLHHOCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JNNRILAYMZYEQB-UHFFFAOYSA-N 6,4'-dimethoxy-5-hydroxyflavone 7-glucoside Natural products C1=CC(OC)=CC=C1C(OC1=C2)=CC(=O)C1=C(O)C(OC)=C2OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 JNNRILAYMZYEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001290610 Abildgaardia Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- QUGCGRKJBDNHBP-UHFFFAOYSA-N C1=C2C(=O)OC(C(=O)CC)=CC2=CC2=C1OCO2 Chemical compound C1=C2C(=O)OC(C(=O)CC)=CC2=CC2=C1OCO2 QUGCGRKJBDNHBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 244000302506 Genista tinctoria Species 0.000 description 1
- 235000006197 Genista tinctoria Nutrition 0.000 description 1
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 description 1
- 241000219745 Lupinus Species 0.000 description 1
- 241000219815 Lupinus polyphyllus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930182559 Natural dye Natural products 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006097 Ultramide® Polymers 0.000 description 1
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 235000002098 Vicia faba var. major Nutrition 0.000 description 1
- HRBMESHSNKKVBJ-OLKYXYMISA-N [(1r,4r,5r,7s)-8-benzyl-7-[[4-(dimethylamino)phenyl]carbamoyl]-8-azabicyclo[3.2.1]octan-4-yl] n-ethylcarbamate Chemical compound N1([C@@H]2C[C@@H]([C@H]1CC[C@H]2OC(=O)NCC)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)N(C)C)CC1=CC=CC=C1 HRBMESHSNKKVBJ-OLKYXYMISA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037118 bone strength Effects 0.000 description 1
- 239000001049 brown dye Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 235000019805 chlorophyllin Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- OTAFHZMPRISVEM-UHFFFAOYSA-N chromone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C=COC2=C1 OTAFHZMPRISVEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 229930016834 coumestan Natural products 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- -1 for example Chemical compound 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000012994 industrial processing Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000000978 natural dye Substances 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 1
- GPQLHGCIAUEJQK-UHFFFAOYSA-N pectolinarigenin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C1=CC(=O)C2=C(O)C(OC)=C(O)C=C2O1 GPQLHGCIAUEJQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KYDJXCOQYUPOKW-UHFFFAOYSA-N pectolinarigenin Natural products COc1c(O)cc2OC(=CC(=O)c2c1O)c3ccc(C)cc3 KYDJXCOQYUPOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003075 phytoestrogen Substances 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
Reší se zpusob zpracování extrahované biomasy jetele lucního (Trifolium pratense L.) za úcelem prumyslove realizovatelné izolace genistinu nebo genisteinu, zeleného barviva Na-Cu-chlorofylinu, karotenu a feofytinu. Genistein jako fytoestrogen se využívá k výrobe léku tlumících projevy klimakteria u žen. Ostatní látky jsou využitelné jako barviva v potravinárském popr. kosmetickém prumyslu. Zpusob získávání uvedených látek lze využít s výhodou jako soubežnou technologii pri zpracování jetele lucního na cukerné roztoky pro výrobu bioetanolu a melasy, a na pevná biopaliva.
Description
Způsob zpracování biomasy jetele lučního
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu zpracování rostlinné biomasy, zejména z jetele lučního. Účelem zpracování je izolace cenných a hospodářsky využitelných látek.
i o Dosavadní stav techniky
Z rostlinných materiálů lze získat hospodářsky využitelné látky jako např. genistin, genistein, zelené barvivo Na-Cu chlorofylin, karotcny či ťeoťytiny.
Genistin je glykosid genisteinu. Genistein patří mezi izoťlavony, odvozené od 4-benzopyronu (chrontonu), které se zařazují do skupiny přirozených barvi v, fiavonoidů. Spolu s kumestany tvoří izoťlavony skupinu rostlinných estrogenú (ťytoestrogenů), které mají účinek blízký ovariálním estrogenním hormonům; mohou blokovat ovulaci, působit na pohyb vajíček, měnit složení hlenu v krčku děložním, ovlivňovat pohyb spermií, ale i aktivitu hypoťýzy a tím hladinu gonado2o tropních hormonů v organismu, U samců potlačují vývoj varlat i spermií. Izoťlavony v píci mohou být příčinou neplodnosti zvířat.
Význam estrogenú není jen v hormonální antikoncepci, ale také jako léku ženám po klimakteriu v ochraně proti osteoporóze. Pravé estrogeny podle některých autorů však mohou zvýšit riziko vzniku rakoviny prsu, děložní sliznice a infarktu či mozkové mrtvice. Sledováním četnosti výskytu těchto onemocnění v zemích, kde strava obsahuje značné množství ťytoestrogenů se soudí, že lýtoestrogeny tuto nepříznivou vlastnost steroidních estrogenú nemají. Proto se už prakticky využívají k výrobě léků, které zeslabují projevy klimakteria. Kromě zajištění pevnosti kostí dochází k zlepšení stavu cév a poklesu LDL cholesterolu.
Genistein byl poprvé izolován už v roce 1899 z kručinky barvířské (Genista tinctoria L,), v jeteli lučním v roce 1961. Genistin izolovali HÓrhammer a Wagner (1962) z vlčího bobu mnoholistého (Lupinus polyphyllus Lindl). V roce 1981 izoloval genistein zvícího bobu a / jetele Kolár (1981).
Způsoby izolace ťytoestrogenů z rostlinného materiálu a způsoby výroby izolátů se liší. V chaosu analytických postupů a výrobních metod však dochází i k významným omylům. Někteří autoři považují za genistein látku zcela jinou, alkaloid 1 α-izopartem (Kettelbach 1953), jiní 5,7dihydroxy 4’ 6 dimethoxy-flavon. tj. pektolinarigenin (Cumow, Rossiter 1955), ačkoliv genis40 tcinje 5,7,4’-trihydroxy--izoflavon:
Na trhu existují např. preparáty pro ženy v menopauze, které obsahují izoťlavony v extraktu 45 z jetele lučního. Extrakce se provádí v horké vodní lázni, popř. s přídavkem ethanolu, kde se jetel luční několik hodin extrahuje, následně se lázeň filtruje, a na vakuové odparce se jemně odpaří
- 1 CZ 302596 B6 při nízké teplotě nebo kryoskopieky. Nevýhoda tohoto způsobů spočívá v tom. že ve výsledném produktu jsou obsaženy nejenom genistin, gen i stein resp. izotlavony. ale i veškeré ostatní látky, které jsou schopné vodní extrakce, a které nemusí být pro dosažení výsledného účinku preparátu žádoucí. Další nevýhoda spočívá v nízké efektivitě procesu a velké spotřebě biomasy.
s
Výroba samotného genistinu nebo genisteinu účinnou a průmyslově realizovatelnou izolací z jetele lučního hy výrazně přispěla k efektivitě celkového zpracování jetele lučního na cukerné roztoky pro výrobu bioethanolu, pro krmné účely, pro výrobu pevného biopaliva a technické celulázy, jak je tento proces popsán v přihlášce vynálezu PV 2006-754 „Způsob zpracování bιοί o masy trav, zejména víceletých pícnin, na cukernou surovinu pro výrobu bioetanolu“ a v užitném vzoru UV 17229 „Zařízení pro zpracování biomasy trav“.
Úkolem vynálezu je tedy nalezení takového způsobu průmyslového zpracování jetele lučního, který by umožňoval účinnou izolaci genistinu, genisteinu, případně dalších látek, byl by efektivní is a průmyslově realizovatelný i s menším množstvím biomasy, popř. s větším množstvím biomasy a s menší účinností.
Podstata vynálezu »0
Tento úkol řeší způsob zpracování biomasy jetele lučního podle vynálezu, jeho podstata spočívá v lom, že nadzemní hmota jetele lučního (Trifolium pratense L.) se předem spaří, dezintegruje se v temnu, a separuje se na kapalný podíl a pevný podíl. Pevný podíl se následně v temnu extrahuje v methanolové lázni s přídavkem CaCO4 a Na2C’Ov Extrakt se opět v temnu a za sníženého tlaku zahustí na sirup, který se poté digeruje a separuje na vodný extrakt a zbytkový podíl. Vodný extrakt se po zchlazení, sedimentaci a oddělení balastuíeh látek použije k přípravě směsi sestávající z 1 hmotn. dílu vodného extraktu, 0,5 hmotn. dílu lakového benzinu (s = 0,76 až 0,78), 1 hmotn. dílu ethyleteru, a 5 hmotn. dílů ethylesteru kyseliny octové. Tato směs se po protřepání destiluje v destilační koloně, kde se oddestílují tekavé složky, a zbytek se odpaří ve vakuu na
5o odparce k suchu. Výparek se dále vymyje methanolem, přebytečný methanol se oddestiluje, a zbytek se na vodní lázni zahustí k přerušované krystalizaci, při které vzniká krystalizát. fen se přivádí na kolonu sloupcové chromatografie s náplní tvořenou perlonovým prachem a eluuje se methanolem, přičemž vznikají dvě zóny sledovatelné v ultrafialovém světle, kde slabší zóna obsahuje genistin, který se následně z příslušné frakce krystal ízátu izoluje vakuovým odpařením methanolu. Genistin je možno transportovat a skladovat k dalšímu zpracování.
Ze všech možných způsobu je tato izolace nejjednodušší a snadno průmyslově realizovatelná, za cenu nižšího výtěžku, což vzhledem ke snadné dostupnosti a ceně suroviny lze připustit, id Samotný genistin není fyziologicky účinnou látkou, proto je v některých případech výhodné, pro získání fyziologicky účinné látky, zhydrolyzovat genistin na genistein na místě. Hydrolýza se s výhodou provádí tak, že k získanému genistinu se přidá H2SO4 a methanol, a směs se vaří pod zpětným chladičem až do odpaření alkoholu. Následně se vychladí při nízkých teplotách, přičemž se z roztoku vyloučí jemná sraženina, která se oddělí filtračním kelímkem, promyje se ledovou destilovanou vodou, a vysuší při 60 až 70 °C, čímž se získá genistein. Výhoda spočívá především v tom, že hydrolýza nezatěžuje vlastní farmaceutický podnik, který pro svoji produkci využívá již hotový genistein.
Při výrobě genistinu nebo genisteinu je možné izolovat i další komerčně využitelné látky, zejména karoteny a feofytiny. izolace se s výhodou provádí tak, že zbytkový podíl extrahované biomasy se dále extrahuje petroléterem a vzniklý extrakt se přivádí na kolonu sloupcové ehromalografie naplněnou petroIéterovou suspenzí 70 % sacharózy a 30 % kukuřičného škrobu, kde se po usazení vytvoří na náplni v koloně vrstva 1 až 1,5 cm silná bezvodého Na2SO4, a dále se sloupec promývá petroléterem, přičemž se vymývají karoteny. Dále je výhodné, když sloupec se dále promývá petroléterem s přídavkem 2 % hmotn. acetonu, přičemž se vymývá feoťytin a. Dal ším výhodným postupem se sloupec dále promývá petroléterem s přídavkem 3 % hmotn. acetonu, přičemž se vymývá feofytin b. Nakonec je výhodné, když se z promývacího roztoku destilací oddělí aceton, a zbytek se extrahuje ethanolem, zfiltruje se, a vzniklý extrakt se uloží k dalšímu zpracování.
s
Při zpracování jetelové biomasy lze také izolovat zelené barvivo Na-Cu-chlorofýlin, které je oproti chlorofylu stabilní na světle a rozpustné ve vodě. Izolace barviva se s výhodou provádí tak, že kapalný podíl a/nebo pevný podíl spařené, desintegrované a separované biomasy jetele lučního se smísí s 15 až 20% roztokem NaOH, směs se zahřívá na teplotu 60 až 70 °C, a následně se io odstředí. Supernatant se smíchá s 95% ethanolem v objemovém poměru 1:1, dále se přidá extrakt uložený po izolaci karotenů a feofytinů, a CuSO4 v množství potřebném pro dosažení výsledné koncentrace CuSO4 v rozmezí 8 až 10 %. Následně se postupně přidává HCI až do dosažení pH v rozmezí 2,5 až 3,0 a směs se při teplotě 60 až 70 °C míchá po dobu 50 až 60 min. Poté se směs nechá zchladnout, odstředí se, a usuší se surový Cu-chlorofylin. který' se následně pro vyčištění i s rozpouští v acetonu a překrystaluje znovu z ethanolu. K čistému Cu-chloroťylínu se potom přidá
5% roztok NaOH v ethanolu (pH = 11 až 12) a při sníženém tlaku se oddestiluje ethanol, přičemž zbytek tvoří Čistý Na-Cu-chlorofýlin. Pro průmyslové použití se čistý Na-Cu-chloroťylin dále koncentruje nebo suší.
?o Na-Cu-chlorofyl in i karoteny se používají např. jako přísady do různých výrobků, a to jako barviva, popř. i z důvodů svých jiných účinků (karoteny působí např. jako tzv. zhášeče volných radikálů). Feofytiny jsou rovněž využitelné jako přírodní hnědá barviva např. v potravinářství, kosmetice, apod.
Řešení podle předloženého vynálezu umožňuje nejenom průmyslovou izolaci výše uvedených látek, ale podstatná jeho výhoda spočívá v tom. že umožňuje komplexní a prakticky bezodpadové zpracování jetele lučního na komerčně a průmyslově využitelné suroviny. Jetel luční jako jedna ze základních zemědělských plodin se v důsledku této nové využitelnosti může pěstovat i v tzv. méně příznivých zemědělských oblastech, s novými oblastmi využití.
Příklady provedení vynálezu
Rozumí se, že dále popsané a zobrazené konkrétní příklady uskutečnění vynálezu jsou před stav o35 vány pro ilustraci, nikoli jako omezení příkladů provedení vynálezu na uvedené případy. Odborníci znalí stavu techniky najdou nebo budou schopni zjistit za použití rutinního experimentování vetší či menší počet ekvivalentů ke specifickým uskutečněním vynálezu, která jsou zde speciálně popsána. I tyto ekvivalenty budou zahrnuty v rozsahu následujících patentových nároků.
Čerstvá hmota jetele lučního se ošetří krátkým spařením přehřátou párou k inaktivaci enzymů. Pak se ihned a v temnu desintegruje, tzn. rozemele a separuje. Kapalný podíl KP jde k dalšímu zpracování na tzv. „džus“, oddělený pevný podíl PP se úplně nebo zčásti převede do výrobny fytobarviv. Zbývající část se využívá pro zpracování na cukerné roztoky podle PV 2006-754 aUV 17229.
Ve výrobně fytobarviv je umístěna extrakční baterie, v níž se pevná hmota extrahuje ve tmě methanolem s přídavkem l % hmotn. CaCO? a 0,5 % hmotn. Na2CO? k zabránění tvorby feofytinu z chlorofylu. Výpočet parametrů extrakce a extrakční kolony je nutno provést podle stavu suroviny a úrovně její desintegraee po laboratorních zkouškách. Extrakt se za sníženého tlaku (vodní vývěva) a ve tmě zahustí na sirupovitou konzistenci. Zhruba lze říci, že najeden hmotnostní díl materiálu v sušině je potřeba 2,5 hmotn. dílu methanolu.
Sirup se třikrát digeruje hmotnostním dílem horké destilované vody a oddělí se. Tím se získají dvě frakce: vodný extrakt V a zbytkový podíl Z.
( Z 302596 B6
Připraví se sloupcová ehromatogralle. Kolona sc plní petroIéterovou suspenzí 70 % sacharózy a 30 % kukuřičného škrobu, po usazení se na náplni v koloně utvoří vrstva 1 až 1,5 cm silná bezvodého Na^SO). Zbytkový podíl Z se extrahuje petroléterem a extrakt se použije k chromatografií, Sloupce se promývá nejprve petroléterem, vymývají se karoteny. Pak se promývá petrol·> éterem s 2 % acetonu - vymyje se feofytin a. Pak se obsah acetonu zvýší na 3 % a vymývá se feofytin b.
Acetonový extrakt se destiluje, oddělí se aceton a zbytek po destilaci se extrahuje ethanolem.
Zllltruje se a vzniká extrakt E se uloží k dalšímu zpracování.
ID
Základní materiál (spařený, rozdrcený a separovaný jetel) se smísí s 15 až 20% roztokem NaOH a zahřívá po dobu 50 až 70 minut na teplotu 60 až 70 °C. Odstředí se, supernatant se smíchá s 05% ethanolem v objemovém poměru 1:1, přidá se extrakt E a takové množství CuSO4, aby výsledná koncentrace Cu$O4 byla 8 až 10 %. Postupně se přidává HCI do pH = 2,5 až 3,0 a při i> 60 až 70 °C se míchá 50 až 60 minut. Pak se ponechá v klidu 3 až 4 hodiny, odstředí se a surový
Cu -chlorofylin se usuší. Pak se rozpustí v acetonu, překrystaluje se znova z ethanolu (pH ” 11 až
12) a při sníženém tlaku se oddestiluje ethanol, který se tak získá zpět. Zbytek, čistý Na·-Čuch lorofylin se použije ve formě koncentrátu nebo se dále suší.
2(i Druhá část produktu vodní d i gesce, vodný extrakt V. se 24 hodin chladí v ehladnici. Vyloučené balastní látky se oddělí, čirý vodný extrakt se izoluje. Jeden hmotnostní díl extraktu se smísí s 0,5 hmotn. dílem lakového benzinu (s = 0,76 až 0,78). 1 hmotn. dílem ethyleteru a 5 hmotn. díly ethylesteru kyseliny octové a vzniklá směs S se třepe na třepačce 5 až 10 min. Převede se do destilační kolony, nejprve se oddestiluje ethyleter (34 °C), pak ethylester (77 °C) a když se destiluje lakový benzin (150 °C). destilace se přeruší, zbytek se ve vakuu (vodní vývěva) odpaří k suchu. Žlutý výparek se vymyje množstvím methanolu, které odpovídá hmotnostnímu dílu materiálu v sušině, kterým byla zahájena výroba. Přebytek methanolu se oddestiluje, zbytek se na vodní lázni za normálního tlaku zahustí k přerušované krystalizaci.
Připraví se druhá sloupcová chromatografíe, délka sloupců v trubicích 60 cm, vnitřní průměr 6 cm. Plní se perlonovým prachem (ULTRAMID K 228 BM 2, BASF Německo). Na kolonu se přivádí 100 mg krystalizátu K, eluuje sc methanolem rychlostí 20 kapek/min, tvoří se 2 zóny, slabší obsahuje gen i stín. Pohyb zón sloupcem lze sledovat UV světlem a tak oddělit obě frakce krystalizátu. Methanol se od genistinu oddělí vakuovým odpařením, čímž se získává čistý genis3? tin.
Na přání odběratele je možno vyrobený genistin zhydrolyzovat na genistein. K 100 mg genistinu se přidá 20 ml 10% H2SO4, 5 ml methanolu a 3 hodiny se vaří pod zpětným chladičem. Ke konci se alkohol odpaří a směs se vychladí v mrazničce. Z roztoku se vylučuje jemná sraženina, oddělí io se filtračním kelímkem, promyje se ledovou destilovanou vodou a vysuší při 60 až 70 °C. Výtěžek by měl být asi 60 mg genisteinu.
-4CZ 302596 B6
Analytika
| genistin | genistein | |
| Teplota tání °C | 253 | 298 |
| Elementární analýza | CziHaoOw M/-432,18 C * 59,56 H = 5,20 | C13H10O5 Mv = 270,2 C = 66,88 H = 3,90 |
| Papírová chromatografie Papír Schleicher - Schull, č. 2043 b, g4 | soustava butanol - kys. octová - voda (4:1:5) Rf=0,80 detekce: 0,5% vodný roztok Echtblausalz B (Merck), pak postňk 0,1 M NaOH | soustava butanol - kys. octová - voda (4:1:5) Rf=0,93 detekce stejná jako u genistinu |
Průmyslová využitelnost
Řešení podle vynálezu lze využít k průmyslové výrobě genistinu nebo genisteinu a dalších látek in jako např. zeleného barviva Na- Cu-chlorofý linu, karotcnů a feofytinú, zejména jako součást a doplněk zpracování biomasy jetele lučního na cukerné roztoky pro výrobu biocthanoiu a melasy a na pevná biopaliva.
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY20 1. Způsob zpracování biomasy jetele lučního, vyznačující se tím, že nadzemní hmota jetele lučního (Trifolium pratense L.) se předem spaří, dezintegruje se v temnu, separuje se na kapalný podíl (KP) a pevný podíl (PP) a pevný podíl (PP) se následně v temnu extrahuje v methanolové lázni s přídavkem CaCO3 a Na2CO3, extrakt se opět v temnu a za sníženého tlaku zahustí na sirup, který se poté digeruje a separuje na vodný extrakt (V) a zbytkový podíl (Z), kde25 vodný extrakt (V) se po zchlazení, sedimentaci a oddělení balastních látek použije k přípravě směsi (S) sestávající z 1 hmotn. dílu vodného extraktu (V), 0,5 hmotn. dílu lakového benzinu (s - 0,76 až 0.78), 1 hmotn. dílu ethyleteru, a 5 hmotn. dílů ethylesteru kyseliny octové, tato směs (S) se po protřepání destiluje v destilaění koloně, kde se oddestilují těkavé složky, a zbytek se odpaří ve vakuu na odparce k suchu, výparek se dále vymyje methanolem, přebytečný methanol50 se oddestiluje, a zbytek se na vodní lázni zahustí k přerušované krystalizaci, při které vzniká krystal izát (K), který se přivádí na kolonu sloupcové chromatografie s náplní tvořenou perlonovým prachem a eluuje se methanolem, přičemž vznikají dvě zóny sledovatelné v ultrafialovém světle, kde slabší zóna obsahuje genistin. který' se následně z příslušné frakce krystalizátu (K) izoluje vakuovým odpařením methanolu.
- 2. Způsob podle nároku 1. vyznačující se tím, že získaný genistin se zhydrolyzuje na genistein.- s CZ 302596 B6
- 3. Způsob podle nároku 2, vy z n a č u j í c í se t í m, že k získanému gen i stínu se přidá IBSOj a methanol, směs se vaří pod zpětným chladičem až do odpaření alkoholu, a následně se vychladí pri nízkých teplotách, přičemž se z roztoku vyloučí jemná sraženina, která se oddělí5 filtračním kelímkem, promyje sc ledovou destilovanou vodou, a vysuší při 60 až 70 °C. čímž se získá genistei n.
- 4. Způsob podle nároku i, vyznačující sc tím. že zbytkový podíl (Z) extrahované biomasy se dále extrahuje petroléterem a vzniklý extrakt se přivádí na kolonu sloupcové chrolo matografie naplněnou pelroléterovou suspenzí 70 % sacharózy a 30 % kukuřičného škrobu, kde se po usazení vytvoří na náplni v koloně vrstva 1 až 1,5 cm silná bezvodého Na2SOj, a dále se sloupec promývá petroléterem, přičemž se vymývají karoteny.
- 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující s c tím, žc sloupec se dále promývá petrol15 éterem s přídavkem 2 % hmotn, acetonu, přičemž se vymývá feotýtin a,
- 6. Způsob podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím. Že sloupec se dále promývá petroléterem s přídavkem 3 % hmotn. acetonu, přičemž se vymývá feofytin b.2o
- 7. Způsob podle alespoň jednoho z nárokjů 5 nebo 6, vyznačující sc tím. že z promývacího roztoku se destilací oddělí aceton, a zbytek se extrahuje ethanolem, zfiltruje se, a vzniklý extrakt {F.) se uloží k dalšímu zpracování.
- 8. Způsob podle nároků I a 7, vyznačující se tím, že kapalný podíl (KP) a/nebo25 pevný podíl (PP) spařené, dezintegrované a separované biomasy jetele lučního se smísí s 15 až 20% roztokem NaOH. směs se zahřívá na teplotu 60 až 70 °C, následně se odstředí, a supernatanl se smíchá s 95% ethanolem v objemovém poměru 1:1, dále se přidá extrakt (E) a CuSO4 v množství potřebném pro dosažení výsledné koncentrace C11SO4 v rozmezí 8 až 10 %, následné se postupně přidává HCI až do dosažení pH v rozmezí 2,5 až 3,0 a směs se při teplotě 60 až 70 CC /o míchá po dobu 50 až 60 min, poté se nechá zchladnout, odstředí se, a usuší se surový Cu chloroíylin, který se následně pro vyčištění rozpouští v acetonu a překrystaluje znovu z ethanolu, k čistému Cu-ehlorofylinu se potom přidá 5% roztok NaOH v ethanolu (pH =11 až 12) a při sníženém tlaku se oddestiluje ethanol, přičemž zbytek tvoří čistý Na-Cu-chlorofylin.55 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že čistý Na-Cu-chlorofylin se dále koncentruje nebo suší.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20070252A CZ302596B6 (cs) | 2007-04-12 | 2007-04-12 | Zpusob zpracování biomasy jetele lucního |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20070252A CZ302596B6 (cs) | 2007-04-12 | 2007-04-12 | Zpusob zpracování biomasy jetele lucního |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2007252A3 CZ2007252A3 (cs) | 2008-10-22 |
| CZ302596B6 true CZ302596B6 (cs) | 2011-07-27 |
Family
ID=39856197
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20070252A CZ302596B6 (cs) | 2007-04-12 | 2007-04-12 | Zpusob zpracování biomasy jetele lucního |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ302596B6 (cs) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6020471A (en) * | 1996-09-13 | 2000-02-01 | Abbott Laboratories | Process for isolating phytoestrogens from plant protein |
| WO2000017217A1 (fr) * | 1998-09-21 | 2000-03-30 | Showa Sangyo Co., Ltd. | Procede de production de composition a base d'isoflavone, riche en genistine |
| WO2001052840A1 (fr) * | 2000-01-18 | 2001-07-26 | Laboratoires Pharmascience | UTILISATION D'ISOFLAVONES ET/OU D'EXTRAITS DE PRUNIER D'AFRIQUE POUR LA PREPARATION D'UNE COMPOSITION DESTINEE A INHIBER L'ACTIVITE DE LA 5α-REDUCTASE, EN PHARMACIE NOTAMMENT EN DERMATOLOGIE, EN COSMETIQUE ET EN TANT QU'ADDITIF ALIMENTAIRE |
| CZ2002257A3 (cs) * | 1999-07-23 | 2002-05-15 | Chiesi Farmaceutici S. P. A. | Stálý farmaceutický steroidní prostředek pro inhalaci |
| WO2003082888A1 (en) * | 2002-03-26 | 2003-10-09 | Wiley Organics, Inc. | Process for isolating genisting from mixtures of soy isoflavones |
| EP1391208A1 (de) * | 2002-08-21 | 2004-02-25 | Cognis Iberia, S.L. | Verfahren zur Herstellung von Pflanzenextrakten mit hohem Gehalt an Isoflavonen |
| CZ2006754A3 (cs) * | 2006-11-30 | 2008-06-11 | Jihoceská univerzita v Ceských Budejovicích, Zemedelská fakulta | Zpusob zpracování biomasy trav, zejména víceletých pícnin, na cukernou surovinu pro výrobu bioetanolu a/nebo krmiv, a na další produkty, zarízení k provádení tohoto zpusobu, a použití biomasy jetele lucního k tomuto zpracování |
-
2007
- 2007-04-12 CZ CZ20070252A patent/CZ302596B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6020471A (en) * | 1996-09-13 | 2000-02-01 | Abbott Laboratories | Process for isolating phytoestrogens from plant protein |
| WO2000017217A1 (fr) * | 1998-09-21 | 2000-03-30 | Showa Sangyo Co., Ltd. | Procede de production de composition a base d'isoflavone, riche en genistine |
| CZ2002257A3 (cs) * | 1999-07-23 | 2002-05-15 | Chiesi Farmaceutici S. P. A. | Stálý farmaceutický steroidní prostředek pro inhalaci |
| WO2001052840A1 (fr) * | 2000-01-18 | 2001-07-26 | Laboratoires Pharmascience | UTILISATION D'ISOFLAVONES ET/OU D'EXTRAITS DE PRUNIER D'AFRIQUE POUR LA PREPARATION D'UNE COMPOSITION DESTINEE A INHIBER L'ACTIVITE DE LA 5α-REDUCTASE, EN PHARMACIE NOTAMMENT EN DERMATOLOGIE, EN COSMETIQUE ET EN TANT QU'ADDITIF ALIMENTAIRE |
| WO2003082888A1 (en) * | 2002-03-26 | 2003-10-09 | Wiley Organics, Inc. | Process for isolating genisting from mixtures of soy isoflavones |
| EP1391208A1 (de) * | 2002-08-21 | 2004-02-25 | Cognis Iberia, S.L. | Verfahren zur Herstellung von Pflanzenextrakten mit hohem Gehalt an Isoflavonen |
| CZ2006754A3 (cs) * | 2006-11-30 | 2008-06-11 | Jihoceská univerzita v Ceských Budejovicích, Zemedelská fakulta | Zpusob zpracování biomasy trav, zejména víceletých pícnin, na cukernou surovinu pro výrobu bioetanolu a/nebo krmiv, a na další produkty, zarízení k provádení tohoto zpusobu, a použití biomasy jetele lucního k tomuto zpracování |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2007252A3 (cs) | 2008-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9446088B2 (en) | Preparation and use of a plant extract from solanum glaucophyllum with an enriched content of 1,25 dihydroxyvitamin D3 glycosides and quercetin glycosides | |
| Szent-Györgyi et al. | Constituents of the thymus gland and their relation to growth, fertility, muscle, and cancer | |
| JP2004537604A (ja) | ホップ抽出物、それらの製法、およびそれらの使用 | |
| Henbest et al. | 776. Isolation of a new plant-growth hormone, 3-indolylacetonitrile | |
| KR20130058790A (ko) | 형개 추출물을 유효성분으로 함유하는 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학 조성물 | |
| WO2019237595A1 (zh) | 木聚糖在制备预防或治疗骨质疏松的药物或食品中的应用 | |
| Anderson et al. | Analysis and Composition of Corn Pollen: Preliminary Report | |
| CA2601889C (en) | Corn fiber hulls as a food additive or animal feed | |
| CN103622972A (zh) | 化合物3α-Akebonolic acid的制备方法和在制备糖苷酶抑制剂药物中的应用 | |
| JP5615484B2 (ja) | ５α‐リダクターゼ阻害剤 | |
| CN116209361A (zh) | 用于减少氨产生的动物饲料组合物 | |
| CZ302596B6 (cs) | Zpusob zpracování biomasy jetele lucního | |
| Manzanilla Valdez et al. | Antidiabetic and hypotensive effect of Cnidoscolus aconitifolius (Mill) IM Johnst leaves extracts | |
| Manske | The natural occurrence of acetyl-ornithine | |
| Virginie et al. | Phytochemical Screening of Sclerocarya birrea (Anacardiaceae) and Khaya senegalensis (Meliaceae), antidiabetic plants | |
| Murti et al. | Chemical examination of the flowers of Pongamia glabra and a note on the glycosidic components of Butea frondosa flowers | |
| CN105669457A (zh) | 氯噻酮的药物组合物及其在生物医药中的应用 | |
| CN107595924B (zh) | 一种骨瓜提取物注射液制备方法及相应的药物组合物 | |
| US2202307A (en) | Vitamin concentration | |
| US2449076A (en) | Process of extracting antidiabetic substance from pancreas | |
| US3449760A (en) | Extraction of sapogenins from vegetable materials | |
| Bhargava et al. | Chemical examination of the seeds of Alangium Lamarki, Thwaites: Isolation of alangol | |
| Nwoke et al. | Nutritional and Phytochemical Properties of Aqueous Leaf Extract of Mistletoe (Tapinanthus Bangwensis) Grown on Orange Tree | |
| KR102210502B1 (ko) | 근육질환 예방 또는 치료용 조성물 | |
| US3076000A (en) | Esters of bile acid degradation products and a process for preparing same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20120412 |