CN116209361A - 用于减少氨产生的动物饲料组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包含从草丝兰属的非木本植物中提取的皂苷的动物饲料组合物。通常构成水溶性部分的所述含皂苷的提取物可用作基础动物饲料的添加剂，以减少氨的产生。在某些实施方案中，本发明的含皂苷的组合物可以抑制蛋白水解微生物，减少氨并改善动物福利和动物表现。在其他实施方案中，向非人类动物施用本发明的含皂苷的组合物通过抑制脲酶来抑制气态氨的释放。本发明的所述组合物可以施用于非人类动物，特别是家禽，以减少氨排放。在某些实施方案中，所述动物饲料组合物包含基础动物饲料和来自草丝兰属的非木本植物的提取物，所述提取物包含25(27)‑脱氢岩藻抑素、5(6),25(27)‑脱氢丝兰苷C、5(6)‑二脱氢丝兰苷C、岩藻抑素、丝兰苷或它们的混合物。

Description

用于减少氨产生的动物饲料组合物
背景技术
植物产生种类繁多的有机化合物，其中绝大多数似乎并不直接参与植物的生长和发育。这些物质，传统上被称为次级代谢物或植物天然产物，通常分布在植物界的有限分类群中。次级代谢物的功能在很大程度上仍然未知，但许多化合物与对植物有用的属性有关，例如防止食草动物和防止微生物感染，作为传粉媒介和种子传播动物的引诱剂，以及作为影响植物物种间竞争的化合物(化感物质)。人们对植物天然产物越来越感兴趣，因为这些产物通常在不同种类的行业中具有广泛的应用，这些行业包括制药行业、化妆品行业、食品行业、洗涤剂行业等等。
一组特定的所关注的植物次级代谢物是皂苷。皂苷是糖基化的化合物，可以被分为三萜、类固醇或甾体糖苷生物碱。皂苷由一个或两个偶联至糖苷配基的糖部分组成(分别为单糖链皂苷和双糖链皂苷)。皂苷可以通过酸水解或酶促方法被水解为皂苷元和糖部分。皂苷一般是水溶性高分子量化合物，分子量在600至超过2,000道尔顿的范围内。
它们的疏水性(糖苷配基)和亲水性(糖)部分的不对称分布赋予这些化合物两亲特性，这在很大程度上决定了它们的类洗涤剂性质。降低表面张力的能力使皂苷有可能非常适合用于化妆品和洗涤剂行业。
皂苷还具有与胆固醇形成不溶性复合物的能力，这使得一些皂苷适合在制药行业中用作降胆固醇剂。其他皂苷与可用于疫苗策略的免疫刺激性复合物的形成有关。
目前，皂苷广泛开发的一个主要局限性是可商购获得的皂苷相对昂贵。花费很大一部分是由于含有大量皂苷的植物提取物的数量有限。目前，可商购获得的含有皂苷的植物提取物包括肥皂草(Saponaria officinalis)、皂树皮和茎、欧洲栗(Castanea sativa)种子以及各种丝兰属(Yucca)物种的提取物。
因此，含有皂苷的植物提取物在广泛的不同行业中受到普遍关注。因此，本领域越来越需要皂苷提取物的替代来源，并且这些植物来源应优选地是便宜的、容易获得的，并且优选地皂苷含量应相对较高。
发明内容
本发明人现已发现从草丝兰属(Hesperaloe)的非木本植物中提取的水溶性固体包含一种或多种皂苷，其可用作基础动物饲料的添加剂以减少氨的产生。在某些实施方案中，本发明的含皂苷的组合物可以抑制蛋白水解微生物，减少氨并改善动物福利和动物表现。在其他实施方案中，向非人类动物施用本发明的含皂苷的组合物通过抑制脲酶来抑制气态氨的释放，所述脲酶催化尿素水解成二氧化碳和氨，导致气态氨的释放。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了新的药物、膳食补充剂和食品成分组合物，其对于非人类动物食用是安全的，减少了氨排放，具有有益的健康效果，并且可以增强用其治疗的动物的生长。
在其他实施方案中，本发明提供了新的药物、膳食补充剂和食品成分组合物，所述组合物包含至少一种选自来源于草丝兰属的非木本植物的提取物、级分、活性化合物和植物化学物质或它们的混合物的组分，所述草丝兰属包括例如假丝兰(Hesperaloefunifera)、夜丝兰(Hesperaloe nocturna)、红丝兰(Hesperaloe parviflora)和江氏丝兰(Hesperaloe chiangii)。新的药物、膳食补充剂和食物成分组合物可以任选地含有一种或多种药学上和饮食上可接受的植物化学活性物质、稀释剂、媒介物、载体和活性物质或它们的混合物。
在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了一种动物饲料添加剂，所述动物饲料添加剂包含来源于草丝兰属的非木本植物的水溶性固体。优选地，水溶性固体包含至少约2重量％的皂苷，更优选地至少约5重量％的皂苷，并且还更优选地至少约10重量％的皂苷，诸如约2至约30重量％的皂苷，诸如约5至约25重量％的皂苷，其中重量百分比基于水溶性固体的总绝干重计。在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了一种动物饲料组合物，所述动物饲料组合物包含基础动物饲料和来源于草丝兰属的非木本植物的皂苷混合物。在某些实施方案中，皂苷的混合物可包含25(27)-脱氢岩藻抑素(图2A)、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷C(图2B)、5(6)-二脱氢丝兰苷(图2C)、岩藻抑素或丝兰苷C中的一种或多种。
在其他实施方案中，本发明提供了治疗、控制或预防非人类动物，特别是鸟类，更特别是家禽中的一种或多种病症的方法，所述方法通过向所述非人类动物施用药物、膳食补充剂或食物成分组合物进行，所述组合物包含至少一种选自来源于草丝兰属的非木本植物的提取物、级分、活性化合物和植物化学物质或它们的混合物的组分。例如，可将来源于草丝兰属生物质的含皂苷的组合物施用于非人类动物，以减少环境氨和气味。在一个特别优选的实施方案中，本发明的皂苷组合物可以口服施用于家禽，以减少环境氨和气味。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种动物饲料组合物，所述动物饲料组合物包含基础动物饲料；以及从草丝兰属的非木本植物中提取并包含至少一种皂苷的水溶性组合物。在一个特别优选的实施方案中，基于饲料的总质量计，皂苷的总量在每100千克饲料约1.0至约30.0克的范围内。
附图说明
图1A和1B分别展示了三萜皂苷和甾体皂苷；并且
图2A-C展示了根据本发明从草丝兰属的非木本植物中提取的各种新型皂苷，包括25(27)-脱氢岩藻抑素(图2A)、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷C(图2B)和5(6)-二脱氢丝兰苷C(图2C)。
定义
如本文所用，术语“生物质”通常指草丝兰属的整个植物和植物器官(即，叶、茎、花、根等)，所述草丝兰属包括例如假丝兰、夜丝兰、红丝兰和江氏丝兰。
如本文所用，术语“甘蔗渣”通常是指已经被切割成一定尺寸并且然后经受高压使得所得材料具有比其来源的生物质更少的液体的生物质。高压可通过使用压缩压力，诸如通过机器提供的压缩压力来实现，所述机器诸如一个或多个相对的反向旋转辊、机械压力机、螺杆压力机以及通过直接液压和将压力施加于生物质并去除胞间和胞内液的其他过程。
如本文所用，术语“碾磨”通常指施加足够的压力以迫使胞间和胞内液从生物质中分离出来。
如本文所用，术语“皂苷”通常指包含糖苷的糖组分(称为糖基)和非糖组分(称为糖苷配基)。根据糖苷配基的结构，皂苷可以分为三萜皂苷，如图1A所示，或甾体皂苷，如图1B所示。皂苷的糖苷配基部分可以是五环三萜或四环三萜，它们二者均含有30个碳原子。甾体皂苷或三萜皂苷可以是单糖链的、双糖链的或三糖链的。单糖链皂苷具有单个糖，通常连接在C-3处。双糖链皂苷具有两个糖，通常一个糖通过C-3处的醚键连接，另一个糖通过C-28处的酯键连接或通过C-20处的醚键连接(分别为五环三萜皂苷和四环三萜皂苷)或通过C-26处的醚键连接(呋甾烷皂苷)。
如本文所用，术语“水溶性固体”通常指在使提取物离心、过滤并且使所有水蒸发之后剩余的干物质。用于测量本发明的生物质提取物的水溶性固体的程序在下文测试方法部分中详细描述。水溶性固体可以相对于生物质的绝干质量以百分比表示。
如本文所用，术语“水不溶性固体”通常指在测量水溶性固体的过程中通过离心和过滤除去的提取物部分，如下文测试方法部分所述。
如本文所用，“减少用本发明的含皂苷的组合物治疗的非人类动物的氨排放”是指相对于未治疗的非人类动物减少排放的氨气。在一些实施方案中，当与未治疗的动物相比时，氨排放减少约10％至约30％。在一些实施方案中，当排放标准化为动物活重时，氨排放减少约15％至约25％。在一些实施方案中，动物的氨排放的减少不会显著负面影响动物，例如降低体重或降低进食质量。
如本文所用，“减少用本发明的含皂苷的组合物治疗的非人类动物的二氧化碳排放”是指相对于未治疗的动物减少排放的二氧化碳气体。在一些实施方案中，当二氧化碳排放被标准化为动物活重时，与未治疗的动物相比，二氧化碳排放减少约5％。
术语“有效量”在施用的上下文中是指施用于需要治疗的非人类动物的皂苷的量，与未治疗的动物相比，该量足以减少动物的氨或二氧化碳排放。
具体实施方式
本发明涉及新的药物、膳食补充剂和食品成分组合物，所述组合物包含至少一种选自来源于草丝兰属的非木本植物的提取物、级分、活性化合物和植物化学物质或它们的混合物的组分，所述草丝兰属包括例如假丝兰、夜丝兰、红丝兰和江氏丝兰，任选地含有药学上和饮食上可接受的植物化学活性物质、稀释剂、媒介物、载体和活性物质或者它们的混合物。在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了一种动物饲料添加剂，所述动物饲料添加剂包含来源于草丝兰属的非木本植物的水溶性固体。
可将含有新皂苷的药物、膳食补充剂和食物成分组合物施用于非人类动物以减少气体排放，特别是氨和二氧化碳。本发明的组合物特别适用于治疗非人类动物，包括例如牛、鸡、猪、羊和马物种。例如，本发明的方法和组合物可以用于治疗牛、鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鹅、猪和绵羊。在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗家禽，并且具体而言可施用于家禽以减少气体排放。
在某些实施方案中，药物、膳食补充剂和食物成分组合物包含皂苷的混合物。以这种方式，本发明的组合物可以包含基于组合物的绝干重计至少2重量％的皂苷，如通过下文测试方法部分中阐述的总皂苷测定法所测量。在一个特定实施方案中，根据本发明使用的含有皂苷的组合物包含至少约2重量％的皂苷，更优选地至少约5重量％的皂苷，并且还更优选地至少约10重量％的皂苷，诸如约2至约30重量％的皂苷，诸如约10至约25重量％。据信，组合物的作用与所存在的皂苷的总量有关。因此，本领域的技术人员将理解，如果需要一定量的皂苷，则可以通过改变所施用的一定浓度组合物的体积、改变一定体积组合物的浓度或它们二者来实现。
用于配制本发明的药物、膳食补充剂和食物成分组合物的皂苷优选提取自草丝兰属的非木本植物。来源于草丝兰属的皂苷可以具有至少一种以下糖苷配基或皂苷元：卡姆皂苷元(kammogenin)、门诺皂苷元(manogenin)、静特诺皂苷元(gentrogenin)、海柯皂苷元(hecogenin)、提果皂苷元(tigogenin)、萨尔萨皂苷元(sarsapogenin)、克洛皂苷元(chlorogenin)和吉托皂苷元(gitogenin)或者它们相应的异构体或氧化或还原形式，以及至少一种以下糖苷部分(酸或盐的形式)：葡萄糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖或半乳糖。在其他实施方案中，甾体皂苷可以包括苦参苷(agamenoside)、龙舌兰糖苷(agaveside)、龙舌兰皂苷(agavoside)、马圭皂苷(magueyside)、龙舌兰苷(agavasaponi)、康塔拉皂苷(cantalasaponin)、剑麻皂苷(sisalsaponin)、加布里酮苷(gabrittonoside)、东诺苷(dongnoside)或海葵苷(amolonin)，或者其他甾体皂苷。
提取物可以从草丝兰属的非木本植物中回收，所述回收通过使用至少一种溶剂来提取生物质，尤其是叶，更特别地植物的冠部以上的叶来进行，所述溶剂选自由以下各项组成的组：水、甲醇、乙醇、丁醇和异丙醇以及它们的混合物。例如，在一个实施方案中，所述方法包括使生物质与包含水的提取剂溶液接触，并且使水溶性级分与不溶性生物质级分分离。在其他实施方案中，除水之外，提取剂溶液还可以包含表面活性剂、溶剂和任选地含有提取物的汁液。含有提取物的汁液可以来自例如早期提取步骤或早期碾磨步骤。
草丝兰属生物质的简单水提取可以产生包含糖、多糖、无机盐、皂苷和皂苷元的粗制水提取物。粗提物还可以这样产生：使用甲醇或者甲醇和水的混合物作为溶剂来提取生物质，所述生物质可以此前已经用丙酮或乙醚提取过，以除去脂质和色素。在其他情况下，生物质可以用4:1乙醇-水溶剂来提取，随后用非极性溶剂诸如己烷对提取物进行脱脂。在某些情况下，可以对脱脂的提取物进行进一步处理，以分离特定的水溶性组分，诸如皂苷，所述水溶性组分可以通过与丁醇混合并分离丁醇相而从脱脂的提取物中纯化，以产生基本上不含蛋白质和游离糖和多糖的皂苷的混合物。
还可以使用热水提取剂。例如，在一个实施方案中，水溶性固体可以从草丝兰属生物质，尤其是叶中提取，所述提取通过用热水乙醇或异丙醇(75至95重量％的醇)来进行。然后可以过滤和浓缩水性醇提取液，并且可以通过将提取液与非极性溶剂诸如己烷混合来除去脂溶性物质。然后可以通过用极性溶剂诸如丁醇进一步提取脱脂的提取物来制备基本上纯的皂苷组合物。
出于制备本发明的组合物和用于本方法的目的，简单水提取物可以是优选的，虽然其他提取方法也在本发明的范围内。在一个特别优选的实施方案中，可以将草丝兰属生物质切成一定大小、压榨并且用水性溶剂提取，以除去水溶性提取物，诸如无机盐、糖、多糖、有机酸和皂苷。收集水溶性提取物，并且可以通过本领域熟知的技术来浓缩水溶性提取物，所述技术例如蒸发、喷雾干燥、滚筒干燥等等。可以将提取物浓缩直到其具有约20至约100重量％固体，诸如约20至约95重量％固体，诸如约20至约80重量％固体的固含量。
在一个特别优选的实施方案中，水溶性提取物通过以下步骤来浓缩：将提取物溶液进料至雾化设备进行喷雾干燥。合适的雾化设备包括但不限于旋转轮雾化器、压力喷嘴雾化器和双流体喷嘴雾化器。旋转轮、压力喷嘴和双流体喷嘴雾化器是本领域的普通技术人员已知的并且包括可从许多来源诸如GEA Process Engineering商购获得的喷雾干燥器中的那些。
在某些实施方案中，可以使用辊、螺杆和其他形式的压力机来碾磨生物质以分离甘蔗渣和水溶性固体。在某些优选的实施方案中，生物质在一个或多个相对的反向旋转辊的辊隙之间通过，以最大限度地机械除去汁液。然后甘蔗渣可以在随后的碾磨步骤中与汁液接触，如将在下文更全面地描述。在某些情况下，可以将生物质切成一定大小并在碾磨前清洁。可以使用本领域熟知的方法来进行切割和清洁。在一个特别优选的实施方案中，在不使用水或其他溶剂的情况下清洁生物质以除去碎片诸如污垢。
在其他实施方案中，水溶性固体可以通过扩散从生物质中回收。在扩散过程中，使生物质与液体接触以提取液体组分。通常，生物质通过首先切割而不是剪切或压碎来制备，以尽量减少对纤维的损害并避免产生过量的细屑。然后将所制备的生物质反复洗涤，通常使用溶剂来洗涤，以提取生物质中所含的液体。溶剂可以是前述溶剂中的任一者。示例性处理溶剂是水，尤其是热水，诸如加热至约40至约90℃的温度的水。溶剂可以循环和重复使用，以使得用于第一次提取的溶剂被重复用作提取后续制备的生物质的溶剂。
各种类型的扩散器是本领域已知的，并且可以适用于如本文所述的生物质。合适的扩散器包括环形扩散器、塔式扩散器或滚筒扩散器。示例性扩散系统例如在美国专利号4,182,632、4,751,060、5,885,539和6,193,805中有所讨论，这些专利的内容据此以与本公开一致的方式并入。许多其他扩散方法和用于所述扩散方法的装置是已知的并且可以适用于本文所述的方法。一个这种扩散器是连续回路、逆流、浅床冠型III渗滤提取器，可从Crown Iron Works,Blaine,MN商购获得。
可以通过上文讨论的任何合适的提取方法来提取切割的或未切割的生物质。在一个特别优选的实施方案中，用于提取的溶剂包括水。本领域的技术人员将认识到，提取溶剂与生物质的比率将根据溶剂、待提取的生物质的量和提取程序而变化。在某些优选的实施方案中，提取溶剂是水，并且提取溶剂与生物质的比率基于提取溶剂的升数与绝干生物质的千克数计为约1:5至约1:100，诸如约1:5至约1:50，更优选地约1:5至约1:20。
提取溶剂的pH可以在约pH 5.0和8.0之间，例如，在约pH 6.0和约pH 8.0之间，在约pH 6.5和约pH 7.5之间。在一个特定实施方案中，提取溶剂是具有在约pH 6.5和约pH7.5之间的pH的水。在其中提取包括用原汁液吸涨的那些实施方案中，吸涨流体可以具有约4.0至约5.0的pH。
提取可以在约25和约90℃之间的温度下进行，例如，在约30和约80℃之间、在约35和约75℃之间、在约40和约70℃之间、在约45和约65℃之间或在约50至约60℃之间。
在其中提取过程是分批提取过程的实施方案中，提取的持续时间范围可以是约0.25至约24小时，例如，约0.5至约2小时，约1至约8小时，或约1至约6小时。
在其中提取过程是连续过程的实施方案中，提取的持续时间范围可以是约0.25至约5小时，例如，约0.5至约3小时。
在提取后，可以通过过滤将水不溶性生物质材料与水溶性固体分离，以提供含有无机盐、糖、多糖、有机酸和皂苷的滤液(本文称为“第一滤液”)。分离可以通过任何合适的手段实现，包括但不限于重力过滤、板框式压滤机、错流过滤器、筛网过滤器、那斯克(Nutsche)过滤器、带式过滤器、陶瓷过滤器、膜式过滤器、微型过滤器、纳米过滤器、超滤器或离心。任选地各种过滤助剂诸如硅藻土、膨润土、沸石等等也可以用于该过程。
在分离后，可以调节第一滤液的pH以除去另外的杂质。在一个实施方案中，可以通过用碱处理来将第一滤液的pH调节至约8.5和约10.0之间并缓慢搅拌，所述碱例如氧化钙或氢氧化钙(滤液体积的约1.0％)。
在其他情况下，可将第一滤液浓缩或进行进一步处理，以分离特定的皂苷混合物或单独的皂苷。在其他情况下，可以进一步纯化澄清汁液，以去除糖、多糖和有机酸，从而产生包含皂苷并基本上不含去除糖、多糖和有机酸的组合物。前述杂质可通过将汁液或第一滤液与水不混溶的极性溶剂如具有4至6个碳原子的醇如丁醇、戊醇、己醇和环己醇混合来去除。可以对含有皂苷的溶剂相进行进一步处理，以使皂苷与醇相分离。这可以通过多种方式实现，包括例如通过冷却、通过使溶剂提取物脱水，或通过添加有机溶剂，所述有机溶剂可与醇溶剂混溶但是其中皂苷是不溶性的。合适的沉淀溶剂包括例如乙醚、石油醚、丙酮和氯仿。
在一个特别优选的实施方案中，皂苷通过闪蒸从醇中分离。闪蒸是制备化学中已知的技术，用于从液体混合物中快速除去挥发性组分。通过在减压下在大表面积上产生溶液的薄膜而将挥发性液体快速转化为蒸气相，从而从溶液中除去挥发性液体，通常伴随着溶液温度升高至高于环境温度但是低于大气压下溶液的沸点。选择薄膜的实际厚度及其施用区域，以提供最佳蒸发和易用性，但是蒸发可以是基本上瞬时的(因此称为“闪蒸”)。闪蒸避免了可以降解目标产物的长时间高温使用，并且能够除去几乎所有醇组分，这使得剩余的溶液适用于下一步采用的喷雾干燥的优选规范。醇可从该步骤回收并在提取过程中重复使用。
通过超滤膜可以进一步增加醇提取物的皂苷含量，而不会显著改变皂苷组成或使皂苷组成丧失。这种皂苷含量在85％-90％范围内的浓缩皂苷级分可以在液态下进一步纯化或简化为干燥状态。可以通过反相固相提取和制备型反相HPLC的组合来回收单独的皂苷。或者，可以通过反相固相提取和制备型反相HPLC的组合来直接分离含有皂苷的醇提取物。
在另外其他实施方案中，皂苷可以从根据本发明制备的汁液中纯化，包括使汁液与盐和溶剂混合以形成第一溶液的步骤。溶剂可以包括一种或多种选自以下的溶剂：乙酸、丙酮、乙腈、苯、1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、叔丁醇、四氯化碳、氯苯、氯仿、环己烷、1,2-二氯乙烷、二乙二醇、乙醚、二甘醇二甲醚、1,2-二甲氧基乙烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、1,4-二噁烷、乙醇、乙酸乙酯、乙二醇、甘油、庚烷、六甲基磷酰胺、六甲基磷三酰胺、己烷、甲醇、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、N-甲基-2-吡咯烷酮、戊烷、全氯乙烯、石油醚、1-丙醇、2-丙醇、吡啶、四氢呋喃、甲苯、三乙胺、三氟甲苯、水、二甲苯或上述物质的任何组合。在一些实施方案中，溶剂是水。盐可以选自碱金属盐、碱土金属盐、过渡金属盐、铵盐或前述的组合。在某些优选的实施方案中，添加至植物提取物以形成溶液的盐是碱土金属盐。在特别优选的实施方案中，盐是氯化钙(CaCl2)、氯化镁(MgCl2)或它们的混合物。
第一溶液的pH通常被调节至约6.0至约9.0，诸如约6.0至约8.0，诸如约6.0至约7.0的pH。然后可以将至少一种磷酸盐添加至第一溶液，以形成离子-多糖复合沉淀物。有用的磷酸盐包括例如磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸钠(Na3PO4)或二磷酸氢钠(Na2H2PO7)。
沉淀的离子-多糖复合物可以通过过滤除去以产生第二溶液，所述第二溶液可以进一步澄清以产生纯化的皂苷的提取物。任选地，可以通过现有技术中已知的任何过滤技术来浓缩提取物。优选地，纯化的皂苷的提取物的浓缩通过纳滤、超滤和渗滤，或这些技术的任何组合来进行。在一些实施方案中，皂苷提取物基本上不含蛋白质。在一些实施方案中，皂苷提取物基本上不含多糖。在一些实施方案中，皂苷提取物基本上不含酚类化合物。
从生物质中回收的水溶性固体的量可以根据提取效率而变化，然而，在某些情况下，每千克绝干生物质可以提取约100至约400克水溶性固体，诸如每千克可以提取约120至约350克，诸如每千克可以提取约150克至约300克。在所提取的水溶性固体中，基于水溶性固体的绝干重计，总皂苷可以占至少约5重量％，诸如至少10重量％，诸如至少20重量％，诸如约5至约40重量％，诸如约10至约30重量％。在某些情况下，可以从生物质中提取的总皂苷的量的范围可以是每千克绝干生物质约10至约400克，诸如约20至约300克，诸如约25至约200克，诸如约10至约100克。在某些情况下，在提取过程中从生物质中除去的材料的量(基于绝干克/千克绝干生物质计)的范围可以如下表1所示。
表1
Figure BDA0004113861590000081
可以根据本发明从草丝兰属生物质提取的皂苷的总量的范围可以是每千克绝干生物质约10至约100克，诸如约20至约80克，诸如约25至约75克。皂苷可以作为原汁液的一部分、作为干燥的水溶性固体组合物的一部分、作为部分纯化的组合物或作为包含皂苷的混合物的基本上纯的组合物提供。
在某些实施方案中，从草丝兰属生物质中提取的皂苷可包含一种或多种选自以下的皂苷：25(27)-脱氢岩藻抑素(图2A)、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷(图2B)、5(6)-二脱氢丝兰苷(图2C)、岩藻抑素和丝兰苷。
用于本发明的组合物可以通过使来自草丝兰属生物质的水性提取物与一种或多种多羟基醇共混来制备，所述多羟基醇包括甘油、丙二醇、聚亚烷基二醇诸如聚乙二醇和聚丙二醇以及聚甘油。优选的多羟基醇具有小于约八个碳原子。甘油和丙二醇是特别优选的多羟基醇。
所述组合物还可以包含糖，糖可以存在于水性提取物中或可以在配制过程中提取后添加。可用于本发明的组合物的糖包括单糖诸如葡萄糖、二糖诸如蔗糖和多糖诸如淀粉。
在另外其他实施方案中，根据本发明的实施方案的组合物可以包含本领域已知的对非人类动物的维持和健康有益的各种其他添加剂。例如，组合物还可以包含诸如维生素E、维生素A丙酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、D-活性动物甾醇(维生素D3的来源)、酵母组分、干燥的蛋固体、干酪蛋白和干乳清的组分。
本发明的含有皂苷的组合物可以是液体或干燥形式。例如，含有皂苷的草丝兰属提取物可以被干燥成粉末形式。通过这种形式，可以将含有皂苷的组合物作为丸剂或大丸剂或者与其他组分混合成诸如饲料配给物施用于动物。例如，含有皂苷的组合物的干粉制剂可以通过微成分机器添加至饲料配给物中，或者添加至饲料混合卡车中，并充分混合以确保均匀分布在饲料中。含有皂苷草丝兰属提取物也可以是液体形式，含有一定量的载体液体，诸如水。通过这种形式，可以将含有皂苷的组合物作为液体灌施剂施用于动物。
本发明的含有皂苷的组合物可以作为喂养方案的一部分以单剂量、多剂量施用于有需要的非人类动物。例如，非人类动物可以接受初始剂量，然后接受较少量的后续维持剂量。非人类动物可以在一天内接受多剂量的含有皂苷的组合物或者可以在多天内接受多剂量。
在某些实施方案中，可以用与未治疗的对照动物相比有效改善动物的摄食特征和/或改善动物的生产特征的量的含皂苷的组合物治疗非人类动物，尤其是鸟类，并且更尤其是家禽。生产特征可以包括畜体质量等级、产量等级、平均日增重等。在一个实施方案中，当作为饲料添加剂施用于家禽时，每100千克饲料中皂苷的量优选为至少约1g/100kg，诸如约1至约50g/100kg，诸如约2至约40g/100kg。
在特别优选的实施方案中，通过将皂苷包含在动物饲料中来向有需要的非人类动物施用皂苷。基础动物饲料可以是干饲料或液体饲料，并且本发明的组合物可以配制成液体、浆料、干粉、干颗粒混合物、糊状物、小球或块状物。合适的饲料可以通过施用含有皂苷的提取物(诸如混合或喷雾)与动物饲养中常用的合适的基础动物饲料来制备。可用于本发明的典型基础动物饲料可包含以下中的一种或多种：玉米粉、玉米芯粗粉、大豆粉、苜蓿粉、稻壳、粗大豆、棉籽油粉、骨粉、磨碎的玉米、玉米芯粉、粗小麦粉、石灰石、磷酸二钙、氯化钠、尿素、干酒糟、维生素和/或矿物质混合物、甘蔗糖蜜或其他液体载体等。此类基础动物饲料促进了皂苷的均匀分布和施用。
在又其他实施方案中，含有皂苷的草丝兰属提取物可以被配制成脲酶抑制组合物。本发明的脲酶抑制组合物可以包含足以提供脲酶抑制活性的量的草丝兰属提取物。在某些情况下，当施用以抑制脲酶时，基于组合物的总重量计，组合物中的总皂苷为至少约为1重量％，并且更优选地至少约2重量％，并且还更优选地至少约5重量％。在某些优选的实施方案中，本发明的脲酶抑制组合物包含一种或多种从草丝兰属中提取的皂苷，其中皂苷包括25(27)-脱氢岩藻抑素(图2A)、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷(图2B)、5(6)-二脱氢丝兰苷(图2C)、岩藻抑素或丝兰苷。
脲酶抑制组合物可以作为动物饲料提供，从而简化了给药。该组合物可以包含从草丝兰属中提取的皂苷组合物和动物饲料，诸如上面讨论的那些，并且可以以各种方式配制。例如，脲酶抑制组合物可以配制成液体、浆料、干粉、干颗粒混合物、糊状物、小球、块状物等。组合物可以以丸剂、大丸剂或液体灌服的形式施用于动物。在某些情况下，通过将有效量的来源于草丝兰属的皂苷与动物的饲料口粮一起施用，可以抑制脲酶并减少氨排放。例如，在一些实施方案中，可以将含有来源于草丝兰属的皂苷的组合物(诸如液体组合物)与动物的水混合。
测试方法
水溶性固体
可以使用加速溶剂提取系统(ASE)诸如DionexTMASETM350(Thermo FisherScientific,Waltham,MA)来测定总生物质水溶性固体。将大约10克收获的生物质在烘箱中干燥至恒重，通常在125℃下干燥4小时。在干燥后，准确称量1.5-2.0克绝干生物质，记录重量(Wb)，精确到0.001克。使用水作为溶剂，使用下表中列出的条件提取生物质。生物质与溶剂的比率通常为21:1，并进行五个连续的水提取循环。在每个提取循环结束时，收集液相，在大约40℃的真空下干燥，记录干燥材料的重量(Wi)，精确到0.001克。水溶性固体的总重量(We)通过对从每个提取循环中回收的固体的重量求和来计算(Wi)。然后使用以下等式来确定总水溶性固体占绝干生物质的百分比：水溶性固体(重量％)＝We/Wb*100。
压力(psi) 1500
温度(℃) 40
静态时间(分钟) 10
循环(次数) 5
生物质提取物中的总水溶性固体可以通过以下步骤来测定：取出适当的等分试样，通常为约10-50ml，转移到干净、预先称量的离心管中。称量试管，精确至0.001克，并以7000rpm离心20分钟。计算提取物的重量(W1)。然后将上清液转移至干净、预先称量的烧杯(D0)中，并称量。然后将装有样品的烧杯放置于140℃的热风烘箱中过夜干燥。将烧杯从烘箱中取出并干燥冷却至室温，然后进行称量，精确到0.001克(D1)。基于提取物的重量计，可溶性固体的重量百分比使用以下公式确定：
Figure BDA0004113861590000101
D1＝空烧杯的质量+干燥的可溶性固体，D0＝空烧杯的质量，W1＝生物质的初始绝干质量。
总皂苷
总皂苷的测量通常如Makkar,Harinder P.S.,Sidhuraju,P.,Becker,Klaus(2007)Plant Secondary Metabolites,第17章,第93-100页所述。标准皂苷溶液通过以下步骤来制备：称量10mg薯蓣皂苷元(MilliporeSigma>93％)，溶于16mL甲醇中，并添加4mL蒸馏水。将溶液充分混合，得到0.5mg/mL薯蓣皂苷元溶于80％甲醇溶剂的溶液。通过将不同量的标准(0、10、20、40、60、80和100μL)转移至13毫米玻璃管中，从而使用所述标准来生成校准曲线。添加80％甲醇水溶液至总体积为100μL。
在测试前，通过用水稀释来将生物质提取物样品调整至约0.5重量％总固体，以确保吸光度结果落在皂苷标准校准曲线范围内。将稀释的提取物样品(20μL)移入13毫米玻璃试管中，并用80μL甲醇将体积调至100μL。每个样品一式三份进行测试。
向每个样品中添加100μL香草醛试剂(通过将800mg香草醛溶解于10mL99.5％乙醇(分析级)中来制备)，然后添加1.0mL 72％(v/v)硫酸(72％(v/v)硫酸通过将72mL硫酸(分析级，95％，w/w)添加至28mL蒸馏水中来制备)。将溶液充分混合并在60℃下加热10分钟。然后将样品在冰浴中冷却，并将1mL溶液转移至相应的比色杯中，并读取544nm下的吸光度。样品中的皂苷的总质量可以根据如下标准吸光度曲线来计算：
皂苷(μg)＝[斜率]×测得吸光度-[截距]
实施例
本发明的提取物通过以下步骤来制备：收获成熟的假丝兰的冠部以上的叶，将叶切成约0.50至约8.0cm的碎屑，并使用甘蔗串联压机来压榨切碎的生物质，串联压机的每个碾磨机具有3个辊。使生物质通过串联碾磨机三次。在串联的第一碾磨机之前添加吸涨水。收集粗汁液并使该汁液通过25mm过滤器并在平底锅蒸发器(Leader Evaporator Company,Swanton,VT)中加热至沸腾以使提取物浓缩至29％固体。基于水溶性固体的绝干重计，水溶性固体包含21重量％的总皂苷。将浓缩的汁液用水稀释以得到包含5重量％的总皂苷的组合物。
为了比较，制备了含有5重量％的从丝兰中提取的总皂苷的组合物。丝兰衍生的皂苷以商品名FOAMATIONTM销售(可自Ingredion,Westchester,IL商购获得)并以50重量％的总皂苷的形式提供。将FOAMATIONTM用水稀释以得到包含5重量％的皂苷的组合物。
为了测试脲酶抑制剂的功效，将2.0mL假定的抑制剂和2.0mL刀豆脲酶(稀释至10mg/mL)(Sigma Diagnostics,St.Louis,Mo.,Sigma U-4002)添加到比色杯中。向该混合物中，向比色杯中添加18mL尿液，并将混合物温育2小时。使用Gastec的标准氨(NH3)检测管系统(型号1M 003MJ1，由Gastec Corporation,Kanagawa,Japan提供)测定氨的释放。用本发明的组合物实现的氨减少示于下表2中。
表2
Figure BDA0004113861590000111
实施方案
第一实施方案：一种动物饲料组合物，所述动物饲料组合物包含基础动物饲料；以及包含至少一种皂苷的草丝兰属的非木本植物的水溶性提取物。
第二实施方案：如第一实施方案所述的动物饲料组合物，其中所述组合物是液体、浆料、干粉、干颗粒混合物、糊状物或固体。
第三实施方案：如第一或第二实施方案所述的动物饲料组合物，其中所述基础动物饲料包含以下中的一种或多种：玉米粉、玉米芯粗粉、大豆粉、苜蓿粉、稻壳、粗大豆、棉籽油粉、骨粉、磨碎的玉米、玉米芯粉、粗小麦粉、石灰石、磷酸二钙、氯化钠、尿素或干酒糟。
第四实施方案：如第一至第三实施方案中任一项所述的动物饲料组合物，其中所述基础动物饲料包含水并且是液体。
第五实施方案：如第一至第四实施方案中任一项所述的动物饲料组合物，其中皂苷的总量在每100kg动物饲料约1至约100g的范围内。
第六实施方案：如第一至第五实施方案中任一项所述的动物饲料组合物，其中所述至少一种皂苷由以下组成：卡姆皂苷元、门诺皂苷、静特诺皂苷元、海柯皂苷元、提果皂苷元、萨尔萨皂苷元、克洛皂苷元和吉托皂苷元或它们相应的异构体或氧化或还原形式，以及至少一种选自葡萄糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖或半乳糖的糖苷部分。
第七实施方案：如第一至第六实施方案中任一项的动物饲料组合物，其中所述至少一种皂苷是25(27)-脱氢岩藻抑素(图2A)、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷C(图2B)、5(6)-二脱氢丝兰苷(图2C)、岩藻抑素或丝兰苷C。
第八实施方案：如第一至第七实施方案中任一项所述的动物饲料组合物，其中所述水溶性固体的质量在每千克基础动物饲料约100至约1,000g的范围内。
第九实施方案：如第一至第八实施方案中任一项所述的动物饲料组合物，其中所述水溶性固体包含约10至约25重量％的皂苷。
第十实施方案：向非人类动物施用如实施方案一至九中任一项所述的动物饲料组合物，以减少环境氨和气味，提供降胆固醇效果，减少炎症，提供抗原生动物效果，控制寄生线虫，促进体重增加或提高饲料转化效率。
第十一实施方案：向家禽口服施用如实施方案一至九中任一项所述的动物饲料组合物以减少环境氨和气味。
第十二实施方案：一种脲酶抑制剂，所述脲酶抑制剂包含含有至少一种皂苷的草丝兰属的非木本植物的提取物。
第十三实施方案：一种蛋白水解微生物抑制剂，所述抑制剂包含含有至少一种皂苷的草丝兰属的非木本植物的提取物。

Claims (25)

1.一种用于减少气体排放的动物饲料组合物，所述饲料包含：
a.基础动物饲料；以及
b.来自草丝兰属的非木本植物的提取物，所述提取物包含25(27)-脱氢岩藻抑素、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷C、5(6)-二脱氢丝兰苷C、岩藻抑素、丝兰苷或它们的混合物。
2.如权利要求1所述的动物饲料组合物，所述动物饲料组合物包含每100kg基础动物饲料约1至约100g总皂苷。
3.如权利要求1所述的动物饲料组合物，其中提取物固体还包含糖、蛋白质、脂质或它们的混合物。
4.如权利要求1所述的动物饲料组合物，其中所述提取物基本上不含糖、蛋白质和脂质。
5.如权利要求1所述的动物饲料组合物，其中所述提取物包含至少约90％的水溶性固体。
6.如权利要求1所述的动物饲料组合物，其中所述提取物包含小于约2％的水不溶性固体。
7.如权利要求1所述的动物饲料组合物，其中所述提取物包含25(27)-脱氢岩藻抑素、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷、5(6)-二脱氢丝兰苷、岩藻抑素和丝兰苷。
8.如权利要求1所述的动物饲料组合物，其中所述非木本植物选自假丝兰、夜丝兰、红丝兰和江氏丝兰。
9.如权利要求1所述的动物饲料组合物，所述动物饲料组合物包含每千克基础动物饲料约100至约1,000g水溶性固体。
10.如权利要求1所述的动物饲料组合物，其中所述提取物包含约5至约25重量％的皂苷。
11.如权利要求10所述的动物饲料组合物，其中所述皂苷包含25(27)-脱氢岩藻抑素、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷C、5(6)-二脱氢丝兰苷、岩藻抑素和丝兰苷C的混合物。
12.一种减少非人类动物的气体排放的方法，所述方法包括向所述非人类动物施用饲料组合物，所述饲料组合物包含基础动物饲料和来自草丝兰属的非木本植物的提取物，所述提取物包含至少一种皂苷。
13.如权利要求12所述的方法，其中皂苷的总量在每100kg动物饲料约1至约100g的范围内。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述提取物还包含糖、蛋白质和脂质。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述提取物基本上不含糖、蛋白质和脂质。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述至少一种皂苷选自25(27)-脱氢岩藻抑素、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷C、5(6)-二脱氢丝兰苷、岩藻抑素和丝兰苷C。
17.如权利要求12所述的方法，其中所述提取物包含25(27)-脱氢岩藻抑素、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷C、5(6)-二脱氢丝兰苷、岩藻抑素和丝兰苷C的混合物。
18.如权利要求12所述的方法，其中所述饲料组合物包含每千克基础动物饲料约100至约1,000g水溶性固体。
19.如权利要求12所述的方法，其中所述提取物包含约10至约25重量％的皂苷。
20.如权利要求12所述的方法，其中所述气体排放物是氨或二氧化碳。
21.如权利要求12所述的方法，其中所述非人类是牛、禽、猪、羊或马科物种。
22.如权利要求12所述的方法，其中所述饲料组合物经口服施用。
23.如权利要求12所述的方法，其中所述饲料组合物是液体、浆料、干粉、干颗粒混合物、糊状物或固体。
24.如权利要求12所述的方法，其中所述基础动物饲料包含以下中的一种或多种：玉米粉、玉米芯粗粉、大豆粉、苜蓿粉、稻壳、粗大豆、棉籽油粉、骨粉、磨碎的玉米、玉米芯粉、粗小麦粉、石灰石、磷酸二钙、氯化钠、尿素或干酒糟。
25.如权利要求12所述的方法，其中所述基础动物饲料包含水并且是液体。
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