WO2001047354A1 - Modele animal predispose a l'apparition d'arthrite rhumatoide - Google Patents

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Toshihiro Nukiwa
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Definitions

  • the present invention relates to a rheumatoid arthritis-prone model rodent, a method for screening a substance for promoting or suppressing the onset of rheumatoid arthritis, a substance for promoting a symptom or a substance for suppressing a symptomatic image using the same, and a method for rheumatoid arthritis.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or improving symptoms.
  • Immunoglobulins are present in the body fluids of all vertebrates, from fish to mammals, are produced by lymphoid cells, and are classified into five classes by their physicochemical and immunological properties, namely IgG, Classified into IgM, IgA, IgD and IgE, the basic structure of the molecule is common to each class, and consists of a heavy chain of 50,000 to 70,000 and a light chain of 23,000. It is known to have ⁇ chains having structures called ⁇ ,, ⁇ , ⁇ chains corresponding to ⁇ ⁇ , GG, gM, AA, DD, gE.
  • F c R The receptor on the surface is called the F c receptor Yuichi (hereinafter “F c R”).
  • F c R The receptor on the surface
  • the molecules (immune glob rinse one per family I) with the same structure as I g, F c receptions evening one, receptor molecules for antigen on T lymphocytes, major histocompatibility antigens, 3 2 microglobulin Cancer Cancer fetal antigens and cell membrane proteins of lymphocytes are known.
  • the FcR is present on the surface of cells such as the immune system.
  • the Fc receptor (hereinafter referred to as “FcrR”), a receptor protein that specifically binds to the IgG a chain, is type I (CD64 antigen) based on similarity in gene structure. , Type II (CD32 antigen) and type I (CD16 antigen).
  • FCT RII unlike other FcRs, has low affinity for monomeric IgG and binds to multivalent IgG that has become an immunocomplex, resulting in monocytes, macrophages, It is widely expressed on hematopoietic stem cells, including polymorphonuclear leukocytes (PMN), mast cells, platelets, some T cell lymphocytes and some B cell lymphocytes.
  • FCT RII has three types of receptors, FcaRIIA, FcaRIIB, and FcaRIIC, which have different gene sequences, and all of them are located on chromosome 1Q23. It has been known.
  • the FcrRIIB has an amino acid sequence (ITIM: mmunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif) that does not associate with the a chain and transmits an inhibitory signal to the intracellular region. (Immunol. Rev. 125, 49-76, 1992, Science 256, 1808-1812, 1992).
  • ITIM mmunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif
  • the present inventors have already created F cr RIIB knockout mice (Nature 379, 346-349, 1996), and developed F cr RIIB knockout mice as II.
  • a mouse model of arthritis J. Exp. Med. 189, 187-194, 1999 was prepared by immunization with collagen type, but the arthritis pattern was similar to that of the DBAZ1J mouse. It was not useful.
  • CIA collagen-induced arthritis
  • adjuvant arthritis is known as animal models of human rheumatoid arthritis and inflammation.
  • CIA was induced by sensitizing rats with type II collagen based on the finding that antibodies to type II collagen were present in the serum and synovial fluid of rheumatoid arthritis patients at a considerable frequency.
  • An animal with arthritis that is closer to rheumatoid arthritis, as compared to adjuvant arthritis, because it has no mucocutaneous symptoms, can be induced in mice and rats, as well as monkeys, and may show tolerance to ashamed.
  • the onset of CIA is correlated with the MHC haplotype of the animal strain used.
  • H-2Q D BAZ1 J mouse
  • H-2r RIIIS / J mouse
  • H_ 2 d BAL BZc mouse
  • An object of the present invention is to provide a better rheumatoid arthritis model animal, that is, a rheumatoid arthritis prone model animal in which the degree of rheumatoid arthritis reaches the highest level and the incidence rate is 100%, as compared with the conventional CIA model animal.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a therapeutic agent for rheumatoid arthritis using the same. Disclosure of the invention
  • the present inventors immunize mice deficient in collagen-derived type II collagen (C-II) in FcaRIIB-deficient mice of haplotype H_2b, which are generally considered not to develop collagen arthritis (CIA).
  • C-II collagen-derived type II collagen
  • H_2b haplotype H_2b
  • CIA collagen-derived type II collagen
  • Fc cRIIB-deficient mice have high anti-type II collagen antibody titers and The image was similar to that of wild type DBA / 1J mice. Since the onset of CIA, an autoimmune disease, is restricted by the MHC haplotype, it was found that the deletion of FcrRIIB would release such restriction.
  • the DBA / 1J mice were backcrossed for eight generations over two and a half years, and the resulting Fc ⁇ -deficient DBAZ1J mice developed CIA, which had earlier arthritis than the DBA / 1J mice. And found that the symptoms worsened, and completed the present invention.
  • the present invention returns a rodent having a chromosome-deficient immunoglobulin Fca receptor Yuichi IIB gene function and a wild-type collagen arthritis-producing rodent of the same species as the rodent.
  • Rheumatoid arthritis-prone model rodents which are obtained by crossing and develop collagen arthritis when immunized with type II collagen, and rheumatoid arthritis-prone model rodents
  • the rodent model for rheumatoid arthritis according to claim 2, wherein a mouse whose gene function is deficient on the chromosome is backcrossed to a wild-type DBA / 1J mouse.
  • the present invention relates to a rheumatoid arthritis-prone model rodent (Claim 5) according to any one of Claims 1 to 4, which is a type II collagen derived from a bone joint.
  • the present invention provides a method for immunizing a rodent animal with a rheumatoid arthritis prone model according to any one of claims 1 to 5 with type II collagen, before or after immunization, or simultaneously with immunization, or when post-immune rheumatoid arthritis does not develop.
  • a method for screening for a substance that promotes a symptom of rheumatoid arthritis or a substance that suppresses a symptom of the disease which is evaluated using the degree of the symptom of collagen arthritis as an index (Claim 8)
  • the control is performed with a non-wild-type collagen arthritis non-onset rodent and a Z or wild-type collagen arthritis-onset rodent as a control.
  • the present invention relates to the method for screening for a substance for promoting the symptom of rheumatoid arthritis or a substance for suppressing the symptom of claim 8, which is characterized by performing a comparative evaluation.
  • the present invention also provides a rheumatoid arthritis onset promoting substance (claim 10) obtained by a method for screening a rheumatoid arthritis onset or substance for suppressing rheumatoid arthritis according to claim 6 or 7, and the claim 6 or 7.
  • a rheumatoid arthritis development inhibitor (claim 11) obtained by a screening method of a rheumatoid arthritis onset or substance, or a rheumatoid arthritis symptom promoting substance or symptom suppression according to claim 8 or 9.
  • a rheumatoid arthritis image promoting substance obtained by a method for screening a substance, or a rheumatoid arthritis obtained by a method for screening a rheumatoid arthritis symptom promoting substance or a symptom suppressing substance according to claim 8 or 9.
  • Treat patients who need a joint inflammation inhibitor (Claim 13) or a rheumatoid arthritis inhibitor A pharmaceutical composition comprising the rheumatoid arthritis inhibitory substance according to claim 11 as an active ingredient (claim 14) or a rheumatoid arthritis image inhibitory substance.
  • a pharmaceutical agent comprising the rheumatoid arthritis symptom-inhibiting substance according to claim 13 as an active ingredient (claim 15).
  • FIG. 1 shows the results of the incidence of arthritis in rheumatoid arthritis-prone model mice and DBA / 1J mice of the present invention.
  • FIG. 2 is a view showing the results of arthritis scores in a rheumatoid arthritis-prone model mouse of the present invention and a conventional DBA / 1J mouse.
  • a rodent in which immunoglobulin F receptor receptor (F cr ⁇ ) gene function is deficient on a chromosome refers to a rodent endogenous gene encoding F cr RIIB that is disrupted.
  • rodents such as mice and rats that have been inactivated by gene mutations such as deletion and substitution and have lost the function of expressing FcaRIIB.
  • the wild-type collagen arthritis (CIA) -onset rodent of the same species as the rodent is a rodent such as a mouse or rat having an MHC haplotype that develops CIA.
  • mice include DBAZ1J mice, RIIIS / J mice, and BALBZZc mice
  • specific examples of rats include Lewis rat and Wister ratterBBZDR rat.
  • DBA / 1J mouse strain because such a mouse is a mouse that develops collagen arthritis at a high rate, and the backcross to this mouse strain can further increase the incidence.
  • Rheumatoid arthritis-prone model rodents have at least a higher incidence and incidence of CIA when immunized with type II collagen compared to the above-mentioned rodents with wild-type CIA. This refers to rodents such as mice and rats with a high degree of criticism.
  • a method for producing a rodent in which the function of the FcaRIIB gene is deficient on the chromosome will be described below using the FcrRIIB knockout mouse as an example.
  • a mouse in which the function of the FcrRIIB gene is deficient on the chromosome can be prepared by the method described in the literature (Nature 379, 346-349, 1996) cited by the present inventors. Can be. Specifically, using a gene fragment obtained by a method such as PCR from a mouse gene library, the FcaRIIB gene is screened, and the screened FcrRIIB gene is screened using a virus vector or the like. Subclones and identify by DNA sequencing. By substituting the fragment containing the S 2 Ekison and EC i Ekison of this clone to pMC 1 neo gene cassette or the like, you prepare target Tobekuta scratch.
  • the linearized vector is introduced into ES cells by electroporation (electroporation) or the like, and homologous recombination is performed. From the homologous recombinants, G418 is obtained. An ES cell exhibiting resistance is selected, a clone of the cell is microinjected into a mouse blastocyst, and the blastocyst is returned to a foster parent mouse to produce a chimeric mouse. When this chimeric mouse is crossed with a wild-type mouse, a heterozygous mouse can be obtained, and by crossing this heterozygous mouse in and out, an FcRIIB knockout mouse can be obtained. Can be obtained.
  • the rheumatoid arthritis-prone model rodent of the present invention comprises the above-mentioned FcaRIIB gene function deficient on a chromosome, and a rodent of the same species as the rodent. It can be obtained by backcrossing the wild-type CIA-causing rodent with a conventional method. In the case of congenic strains (DBA / 1J strain), backcrossing of at least 12 generations is usually required. In the backcrossing of the present invention, it is necessary to carry out backcrossing more than once, especially more than 6 times. It is preferable in terms of the incidence rate and degree of onset, and it is more preferable to perform backcrossing at least eight times in order to obtain more uniform experimental results.
  • a plurality of backcrosses can be performed by rodents whose FcaRIIB gene function is defective on the chromosome and wild-type CIA-causing rodents of the same species as the rodents (for example, FcaRIIB knockout mice).
  • performing 6 backcrosses means that the sixth generation of hybrids ( F 6) F c ⁇ RIIB gene function obtained by crossing each other refers to deficient rodent animal on the chromosome.
  • the rheumatoid arthritis-prone model rodent of the present invention develops CIA by immunization using a type II collagen by a known method, but when compared to a wild-type CIA-onset rodent, Those with a high incidence and a high degree of onset are preferred.
  • the type II collagen used for causing CIA to develop in the rheumatoid arthritis-prone model rodent of the present invention is not particularly limited, and the type II collagen derived from the human joint and the type II collagen derived from the chicken joint are used.
  • type II collagen such as type II collagen, human serum-derived type II collagen, and human joint synovial fluid-derived type II collagen can be used.
  • type II collagen-derived type II Preferably, collagen is used.
  • the present invention can induce CIA in a rodent model with rheumatoid arthritis prevalent in the present invention. If any, onset promoting agents or onset inhibition of Riumachi arthritis c present invention in which a part of the peptide Ya amino acid sequence can be used as immunogens well as those mutated comprising a portion of the amino acid sequence of ⁇ collagen
  • the screening method of the substance is as follows.
  • a rodent model susceptible to rheumatoid arthritis is immunized with type II collagen, and is immunized before, during, or after immunization, or when post-immune rheumatoid arthritis does not develop.
  • the method of screening for a symptom promoting substance or a symptom suppressing substance for rheumatoid arthritis according to the present invention includes the steps of: A model rodent is immunized with type II collagen, and when rheumatoid arthritis develops, a test substance is administered to the rodent.
  • the method of administering the test substance in the above screening method is not particularly limited as long as it is a known administration method such as oral administration, intravenous injection, or intramuscular injection.
  • a method of evaluating the degree of onset of collagen arthritis as an index known methods for evaluating rheumatoid arthritis, such as the date, incidence, and degree of occurrence of swelling of the finger joint, can be used.
  • a method of evaluating the degree of the symptom as an index can be performed by observing the degree of symptom improvement such as swelling of the developed finger joint. At the time of these evaluations, it is preferable to perform comparative evaluation with a non-wild-type collagen arthritis-onset rodent or a wild-type collagen arthritis-onset rodent as a control.
  • the rheumatoid arthritis-promoting substance obtained by these screening methods is useful in elucidating the mechanism of CIA onset, and is also useful for elucidating the mechanism of CIA onset, and also suppresses the onset of rheumatoid arthritis and suppresses rheumatoid arthritis inflammation.
  • the substance is a therapeutic agent used to treat patients in need of a rheumatoid arthritis inhibitor or rheumatoid arthritis inhibitor. That is, it is useful as an agent for preventing and / or improving symptoms of chronic rheumatoid arthritis.
  • a rheumatoid arthritis onset inhibitor may be used for surgical treatment of rheumatoid arthritis.
  • ES clones were isolated from the ES cells that had undergone the above homologous recombination, and neomycin-resistant ES clones were screened against G418 and GAN C (ganciclovia), and homologous recombination was performed by the Southern blot method. The body was identified. Genomic DNA was isolated from the identified homologous recombinant and digested with Hindill to confirm that it contained the allelic allele containing the pMC1 neo gene cassette. . By microinjecting the confirmed ES clone into blastocysts, a chimeric mouse is produced, and the produced mouse is intercrossed with a wild-type C57BL / 6 (H-12b) mouse. In order to obtain a heterozygous mouse and a homozygous mouse, the heterozygous mouse was intercrossed to produce a deficient mouse in which the FcaRIIB gene was deleted on the chromosome. .
  • Example 1 (Preparation of rheumatoid arthritis-prone model mouse) The Fc ⁇ -deficient male mouse obtained in Reference Example 1 was bred with an H—2q DBA / 1J female mouse to produce a haplotype H—2Q FcaIIB +/— DBAZ l J mice and D BAZ l J mice are re-crossed, and the resulting haplotype H—2Q FC TIIB +/- one D BAZ 1 J mouse (F 2 ) and D BAZ l J mice are re-crossed.
  • Type collagen (pH 8.0) 4.0 mg / m 1 and incomplete Freund's adjuvant (IFA) consisting of liquid paraffin and surfactant 4.0 mg / m 1 mixed in a connected syringe
  • IFA incomplete Freund's adjuvant
  • Example 3 (Onset of CIA using rheumatoid arthritis-prone model mouse) Fc ⁇ -deficient DB AZ1J mouse (8 weeks old: no gender difference) prepared by the method described in Example 1 above was anesthetized with ether.
  • the ridge was shaved and a primary immunization was performed by intradermally injecting mice ⁇ containing two each of type II collagen and CFA into the mouse, and after the primary immunization, 21 and 2 days after the primary immunization Eyes contain type II collagen and IFA at 200 / g each Mumegillon 1001 was injected intradermally and immunized to cause CIA to develop in rheumatoid arthritis-prone model mice, and rheumatoid arthritis was evaluated as follows.
  • a rheumatoid arthritis-prone model rodent in which the degree of rheumatoid arthritis reaches the maximum value and the incidence is 100% can be obtained. Therefore, by using such a rodent model of rheumatoid arthritis-prone model of the present invention, it is possible to more efficiently develop and treat a specific drug for rheumatoid arthritis more efficiently than in a conventional mouse model or rat model of rheumatoid arthritis prone. Can do development.

Description

明 細 書 リゥマチ関節炎好発モデル動物 技術分野
本発明は、 リウマチ関節炎好発モデル齧歯類動物や、 これを用いたリ ゥマチ関節炎に対する発症促進物質若しくは発症抑制物質又は症像促進 物質若しくは症像抑制物質のスクリ一二ング方法や、 リウマチ関節炎の 予防や症状改善のための医薬組成物に関する。 背景技術
免疫グロブリン （ I g) は、 魚類から哺乳類に至る全ての脊椎動物の 体液中に存在し、 リンパ系細胞によって産生され、 物理化学的性質や免 疫学的性質によって 5つのクラス、 すなわち I g G， I g M， I g A, I g D及び I gE に分類され、 分子の基本構造は各クラス共通で、 分子 量 5〜 7万の H鎖と分子量 2. 3万の L鎖とから構成され、 I g G, I g M, I g A， I g D, I gE に対応してァ， , ひ， δ , ε鎖と呼ば れる構造の Η鎖を有することが知られている。 この I g分子をパパイン で分解して得られるヒンジ部から C末端までの H鎖 2本が S— S結合で 結ばれているものは F cフラグメントと呼ばれ、 この F cフラグメント が結合する細胞表面上の受容体は F c レセプ夕一 （以下 「F c R」 とい う） と呼ばれている。 また、 I gと同様の構造を持つ分子 （免疫グロブ リンス一パーファミリ一） には、 F c レセプ夕一、 Tリンパ球上の抗原 に対する受容体分子、 主要組織適合性抗原、 3 2ミクログロブリン、 癌 胎児性抗原及びリンパ球の細胞膜蛋白質等が知られている。
上記 F c Rは、 免疫系などの細胞の表面上に存在し、 その中でも体液 中の I g Gのァ鎖に特異的に結合する受容体蛋白質である F c ァレセプ ター （以下 「F c r R」 という） は遺伝子構造の類似性に基づいてタイ プ I ( C D 6 4抗原）、 II型 （ C D 3 2抗原）、 Π型 I ( C D 1 6抗原） の 3種に大きく分類されている。 これらのうち、 F C T RIIは、 他の F c Rとは異なりモノマーの I g Gに対して低親和性であり、 免疫複合体 となった多価 I g Gと結合し、 単球、 マクロファージ、 多形核白血球（P MN)、 マスト細胞、 血小板、 いくつかの T細胞リンパ球及びいくつかの B細胞リンパ球を含む造血幹細胞に広く発現する。 また、 F C T RIIに は遺伝子配列が異なる F c ァ RIIA、 F c ァ RIIB及び F c ァ RIICの 3 種類の受容体が存在しており、 いずれも染色体の 1 Q 2 3に位置してい ることが知られている。
上記 F c r RIIBは、 他の F c Rとは異なり、 ァ鎖と会合することな く、 しかも細胞内領域に抑制性シグナルを伝達するアミノ酸配列 （ I T I M ： 丄 mmunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif) を ¾してい る （Immunol. Rev.125, 49-76， 1992、 Science 256, 1808-1812, 1992)。 このような F c r RIIBの生理的機能を解明するために、 本発明者らは F c r RIIBノックァゥトマウスを既に作出し （Nature 379, 346-349, 1996)、 F c ァ RIIBノックアウトマウスを II型コラーゲンで免疫する ことによって関節炎モデルマウス （J. Exp. Med.189, 187-194, 1999) を作製しているが、 関節炎症像は D BAZ 1 Jマウスのものと同様であ り、 それほど有用なものではなかった。
他方、 ヒトの慢性関節リウマチや炎症の動物モデルとして、 コラーゲ ン関節炎 （collagen-induced arthritis： C I A) や、 アジュバント関節 炎が知られている。 C I Aは、 慢性関節リウマチ患者の血清や関節滑液 中に II 型コラーゲンに対する抗体がかなりの頻度で存在するとの知見 に基づいてラッ トを II 型コラーゲンで感作することにより誘導された 関節炎であり、 アジュバント関節炎と比較して、 皮膚粘膜症状がないこ と、 マウスやラッ トの他サルでも誘導可能なこと、 寛容憎悪傾向を示す ことがあることなど、 より慢性関節リゥマチに近い動物モデルとして知 られている。 また、 C I Aの発症には、 用いる動物の系統の有する MH Cハプロタイプと相関性があり、 マウスでは H— 2 Q (D BAZ 1 Jマ ウス）、 H - 2 r (RIIIS/ Jマウス） 及び H_ 2 d (BAL BZcマ ウス） 八プロタイプを有するマウスに発症率が高く、 H— 2 qの DBA / 1 Jマウスがよく使われ、 ラッ トでも L e w i s , W i s t e r , B B ZD Rなどがよく使用されている。
C I Aは遺伝的背景が明らかなマウスにおいてその解析が進み、 前記 のように、 ハプロタイプをもつ H_ 2 q (DBA/ 1 Jマウス）、 H - 2 r (RIIIS/ Jマウス） 及び H— 2 d (BAL B/cマウス） のマウス は疾患モデルマウスとして関節炎を誘導することができるが、 発症率は 1 0 0 %ではなく、 また関節炎の程度も最高値に達しないという問題点 があった。 本発明の課題は、 従来の C I Aモデル動物に比べて、 よりよ いリウマチ関節炎モデル動物、 すなわちリゥマチ関節炎の程度が最高値 に達し、かつ発症率が 1 0 0 %であるリウマチ関節炎好発モデル動物や、 これを用いたリゥマチ関節炎症の治療薬等のスクリーニング方法を提供 することにある。 発明の開示
本発明者らは、 一般的にコラーゲン関節炎 （C I A) が発症しないと されているハプロタイプ H _ 2 bの F c ァ RIIB欠損マウスにおいてゥ シ関節由来 II型コラーゲン （C一 II) を免疫することで C I Aを誘導で きることを報告している （J. Exp. Med.189, 187-194, 1999)。 この F c Ύ RIIB欠損マウスでは抗 II型コラーゲン抗体価が高く、 その関節炎症 像は野生型の D BA/ 1 Jマウスのものと同様であった。 自己免疫疾患 である C I Aの発症は MHCハプロタイプに拘束されていることから、 F c r RIIBの欠損によりかかる拘束の解除が起こるとの知見が得られ た。 そこで、 D BA / 1 Jマウスに 8世代、 2年半をかけて戻し交配し、 得られた F c τΠΒ欠損 DB AZ 1 Jマウスが発症する C I Aは、 D B A/ 1 Jマウスよりも早期に関節炎を発症し、 かつ症状が増悪すること を見い出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 免疫グロプリン F c ァ レセプ夕一 II B遺伝子機能 が染色体上で欠損した齧歯類動物と該齧歯類動物と同種の野生型コラー ゲン関節炎発症性齧歯類動物とを戻し交配することにより得られ、 II型 コラーゲンで免疫するとコラーゲン関節炎を発症することを特徴とする リウマチ関節炎好発モデル齧歯類動物 （請求項 1 ) や、 リウマチ関節炎 好発モデル齧歯類動物がリゥマチ関節炎好発モデルマウス又はリゥマチ 関節炎好発モデルラッ トであることを特徴とする請求項 1記載のリウマ チ関節炎好発モデル齧歯類動物 （請求項 2) や、 免疫グロブリン F c r レセプ夕一 II B遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスと野生型 D B A / 1 Jマウスとを戻し交配することを特徴とする請求項 2記載のリウマ チ関節炎好発モデル齧歯類動物 （請求項 3) や、 戻し交配を 6回以上行 うことを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載のリウマチ関節炎好発 モデル齧歯類動物 （請求項 4) や、 II型コラーゲンが、 ゥシ関節由来 II 型コラーゲンであることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載のリ ゥマチ関節炎好発モデル齧歯類動物 （請求項 5) に関する。
また本発明は、 請求項 1〜 5のいずれか記載のリゥマチ関節炎好発モ デル齧歯類動物を II型コラーゲンで免疫し、免疫の前後若しくは免疫と 同時に、 又は免疫後リウマチ関節炎の未発症時に、 該齧歯類動物に被検 物質を投与し、 コラーゲン関節炎の発症の程度を指標として評価するこ とを特徴とするリゥマチ関節炎の発症促進物質又は発症抑制物質のスク リーニング方法 （請求項 6 ) や、 コラーゲン関節炎の発症の程度を指標 として評価するに際し、 対照としての野生型コラーゲン関節炎非発症性 齧歯類動物及び Z又は野生型コラーゲン関節炎発症性齧歯類動物との比 較評価を行うことを特徴とする請求項 6記載のリウマチ関節炎の発症促 進物質又は発症抑制物質のスクリーニング方法 （請求項 7 ) や、 請求項 1〜 5のいずれか記載のリウマチ関節炎好発モデル齧歯類動物を II 型 コラーゲンで免疫し、 免疫後リウマチ関節炎の発症時に、 該齧歯類動物 に被検物質を投与し、 コラーゲン関節炎の症像の程度を指標として評価 することを特徴とするリウマチ関節炎の症像促進物質又は症像抑制物質 のスクリーニング方法 （請求項 8 ) や、 コラーゲン関節炎の症像の程度 を指標として評価するに際し、 対照としての野生型コラーゲン関節炎非 発症性齧歯類動物及び Z又は野生型コラーゲン関節炎発症性齧歯類動物 との比較評価を行うことを特徴とする請求項 8記載のリウマチ関節炎の 症像促進物質又は症像抑制物質のスクリーニング方法 （請求項 9 ) に関 する。
また本発明は、 請求項 6又は 7記載のリゥマチ関節炎の発症促進物質 又は発症抑制物質のスクリ一ニング方法により得られるリウマチ関節炎 発症促進物質 （請求項 1 0 ) や、 請求項 6又は 7記載のリウマチ関節炎 の発症促進物質又は発症抑制物質のスクリ一二ング方法により得られる リウマチ関節炎発症抑制物質 （請求項 1 1 ) や、 請求項 8又は 9記載の リウマチ関節炎の症像促進物質又は症像抑制物質のスクリ一ニング方法 により得られるリウマチ関節炎症像促進物質 （請求項 1 2 ) や、 請求項 8又は 9記載のリウマチ関節炎の症像促進物質又は症像抑制物質のスク リーニング方法により得られるリウマチ関節炎症像抑制物質 （請求項 1 3 ) や、 リウマチ関節炎発症抑制物質を必要としている患者を治療する のに用いられる治療薬であって、 有効成分として請求項 1 1記載のリウ マチ関節炎発症抑制物質を含んでなる医薬組成物 （請求項 1 4) や、 リ ゥマチ関節炎症像抑制物質を必要としている患者を治療するのに用いら れる治療薬であって、 有効成分として請求項 1 3記載のリウマチ関節炎 症像抑制物質を含んでなる医薬組成物 （請求項 1 5) に関する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明のリウマチ関節炎好発モデルマウスと D B A/ 1 J マウスにおける関節炎の発症率の結果を示す図である。
第 2図は、 本発明のリウマチ関節炎好発モデルマウスと従来の D BA / 1 Jマウスにおける関節炎スコアの結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明において、 免疫グロブリン F c ァレセプター ΠΒ ( F c r ΠΒ) 遺伝子機能が染色体上で欠損した齧歯類動物とは、 F c r RIIBをコ一 ドする齧歯類動物の内在性遺伝子が破壊 · 欠損 · 置換等の遺伝子変異に より不活性化され、 F c ァ RIIBを発現する機能を失なつたマウス、 ラ ッ ト等の齧歯類動物をいう。 また、 本発明において、 かかる齧歯類動物 と同種の野生型コラーゲン関節炎 （C I A) 発症性齧歯類動物とは、 C I Aを発症する MH Cハプロタイプを有するマウス、 ラッ ト等の齧歯類 動物であり、 マウスでは D BAZ 1 Jマウスや RIIIS/ Jマウスや BA L BZcマウス等を、 ラッ トでは L e w i sラッ トや W i s t e rラッ トゃ B BZDRラッ ト等を具体的に例示することができ、 特に D B A/ 1 Jマウス系統を用いることはかかるマウスがコラ一ゲン関節炎を高率 で発症するマウスであり、 このマウス系統に戻し交配することで更に発 症率を高めることができる点で好ましい。 そしまた、 本発明において、 リウマチ関節炎好発モデル齧歯類動物とは、 II型コラーゲンを用いて免 疫した場合に、 上記野生型 C I A発症性齧歯類動物と比較して、 少なく とも C I Aの発症率が高く、 また発症憎悪の程度が大きいマウス、 ラッ ト等の齧歯類動物をいう。 以下、 F c ァ RIIB遺伝子機能が染色体上で 欠損した齧歯類動物の作製方法を以下に F c r RIIBノックアウトマウ スを例に挙げて説明する。
F c r RIIB遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、 すなわち F c 7 RUBノックァゥトマウスは、 本発明者らの前掲の文献 （Nature 379, 346-349, 1996) に記載する方法等によって作製することができる。 具体 的には、 マウス遺伝子ライブラリ一から P C R等の方法により得られた 遺伝子断片を用いて、 F c ァ RIIB遺伝子をスクリーニングし、 スクリ —ニングされた F c r RIIB遺伝子を、 ウィルスベクタ一等を用いてサ ブクローンし、 DN Aシ一ケンシングにより特定する。 このクローンの S 2ェキソン及び E C iェキソンを含むフラグメントを pMC 1ネオ遺 伝子カセッ ト等に置換することによって、 ターゲッ トベクタ一を調製す る。 この線状化されたベクタ一をエレク ト口ポレーシヨン （電気穿孔） 法等によって E S細胞に導入し、 相同的組換えを行い、 その相同的組換 え体の中から、 G 4 1 8等に抵抗性を示す E S細胞を選択し、 その細胞 のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、 かかる 胚盤胞を仮親のマウスに戻し、 キメラマウスを作製する。 このキメラマ ウスを野生型のマウスとィン夕ークロスさせると、 ヘテロ接合体マウス を得ることができ、 また、 このへテロ接合体マウスをイン夕一クロスさ せることによって、 F c ァ RIIBノックアウトマウスを得ることができ る。
本発明のリウマチ関節炎好発モデル齧歯類動物は、 上記 F c ァ RIIB 遺伝子機能が染色体上で欠損した齧歯類動物を、 該齧歯類動物と同種の 前記野生型 C I A発症性齧歯類動物とを常法により戻し交配することに よって得ることができる。 コンジエニック系統 （DBA/ 1 J系統） と する場合には、 通常 1 2世代以上の戻し交配を必要とするが、 本発明に おける戻し交配においては、 複数回、 特に 6回以上行うことが C I Aの 発症率や発症憎悪の程度の点で好ましく、 さらに均一な実験結果を得ら れる点で 8回以上の戻し交配をすることがより好ましい。 複数回の戻し 交配は、 F c ァ RIIB遺伝子機能が染色体上で欠損した齧歯類動物と該 齧歯類動物 （例えば、 F c ァ RIIBノックアウトマウス） と同種の前記 野生型 C I A発症性齧歯類動物 （例えば、 DBAZ 1 Jマウス） との雑 種第 1代 （F と、 上記野生型 C I A発症性齧歯類動物とを交配し、 次いで得られた雑種第 2代 （F 2) と上記野生型 C I A発症性齧歯類動 物とを再び交配し、 以下かかる交配を繰り返していく ことにより行うこ とができ、 本発明において例えば 6回の戻し交配を行うとは、 雑種第 6 代 （F 6) 同士を交配して得られる F c ァ RIIB遺伝子機能が染色体上で 欠損した齧歯類動物をいう。
本発明のリウマチ関節炎好発モデル齧歯類動物は、 II型コラーゲンを 用いて公知の方法で免疫することにより C I Aを発症するが、 野生型 C I A発症性齧歯類動物と比較した場合、 C I Aの発症率が高く、 また発 症憎悪の程度が大きいものが好ましい。 また、 本発明のリウマチ関節炎 好発モデル齧歯類動物に C I Aを発症させるために用いられる II 型コ ラーゲンとしては特に限定されるものでなく、 ゥシ関節由来 II型コラー ゲン、 ニヮトリ関節由来 II型コラーゲン、 ヒト血清由来 II型コラーゲ ン、 ヒト関節滑液由来 II型コラーゲン等の市販の II型コラーゲンを用 いることができるが、 リウマチ関節炎好発モデルマウスの場合、 ゥシ関 節由来 II型コラーゲンを用いることが好ましい。 また、 本発明のリウマ チ関節炎好発モデル齧歯類動物に C I Aを誘導することができるもので あれば、 π型コラーゲンのアミノ酸配列の一部を含むぺプチドゃアミノ 酸配列の一部が変異したものなども免疫源として使用することができる c 本発明のリゥマチ関節炎の発症促進物質又は発症抑制物質のスクリー ニング方法は、 リゥマチ関節炎好発モデル齧歯類動物を II型コラーゲン で免疫し、 免疫の前後若しくは免疫と同時に、 又は免疫後リウマチ関節 炎の未発症時に、 該齧歯類動物に被検物質を投与し、 コラーゲン関節炎 の発症の程度を指標として評価することを特徴とし、 また、 本発明のリ ゥマチ関節炎の症像促進物質又は症像抑制物質のスクリ一二ング方法は、 リウマチ関節炎好発モデル齧歯類動物を II型コラーゲンで免疫し、免疫 後リウマチ関節炎の発症時に、 該齧歯類動物に被検物質を投与し、 コラ
—ゲン関節炎の症像の程度を指標として評価することを特徴とする。 上記スクリーニング方法における被検物質を投与する方法としては、 経口投与、 静脈注射、 筋肉注射等の公知の投与方法であれば特に制限さ れるものではない。 また、 コラーゲン関節炎の発症の程度を指標として 評価する方法としては、 指関節の腫脹等の発生日、 発生率、 発生の程度 等、 公知のリウマチ関節炎の評価方法を用いることができ、 コラーゲン 関節炎の症像の程度を指標として評価する方法としては、 発症した指関 節の腫脹等の症状改善の程度を観察することにより行うことができる。 そして、 これらの評価に際しては、 対照としての野生型コラーゲン関節 炎非発症性齧歯類動物や野生型コラーゲン関節炎発症性齧歯類動物との 比較評価を行うことが好ましい。
そして、 これらスクリーニング方法により得られるリゥマチ関節炎発 症促進物質ゃリゥマチ関節炎症像促進物質は、 C I A発症の機構を解明 する上で有用であり、 また、 リウマチ関節炎発症抑制物質やリウマチ関 節炎症像抑制物質は、 リウマチ関節炎発症抑制物質やリウマチ関節炎症 像抑制物質を必要としている患者を治療するのに用いられる治療薬、 す なわち慢性リウマチ関節炎の予防及び又は症状改善剤として有用である。 さらに、リゥマチ関節炎発症抑制物質ゃリゥマチ関節炎症像抑制物質は、 リゥマチ関節炎の外科的治療に用いることができる可能性がある。
以下に、 実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、 この発 明の技術的範囲はこれら実施例により限定されるものではない。
参考例 （F c ァ RIIB欠損マウスの作製）
1 2 9 /S v / J (H— 2 b) マウスのゲノム D NAライブラリ一を スクリ一ニングすることによって、 F c r RIIB遺伝子のゲノム D N A のク口一ンを単離した。 このクローンの S 2及び E C Jの 2つの独立した ェキソンを含む 2. 6 5 K bのフラグメントを p MC 1ネオ遺伝子カセ ッ ト （東洋紡社製） に、 置換することによってターゲッ トベクタ一を作 製した。 この線状化したべクタ一をエレク トロポレーシヨンによって E S細胞 （ J 1 ) に導入し、 相同的組換えを行った。
上記の相同的組換えを起こした E S細胞から E Sクローンを単離し、 G 4 1 8及び GAN C (ガンシクロビア） に対してネオマイシン耐性 E Sクロ一ンをスクリーニングし、 サザンブロッ ト法によって相同的組換 え体を同定した。 その同定された相同的組換え体からゲノム D N Aを単 離して、 H i n dillでダイジェス トし、 p MC 1ネオ遺伝子カセッ トを 含む夕一ゲティ ングされた対立遺伝子を含んでいることを確認した。 か かる確認された E Sクローンを胚盤胞中にマイクロインジェクションし、 キメラマウスを作製し、作製されたマウスを野生型の C 5 7 B L/ 6 (H 一 2 b ) マウスとインタークロスさせることによってヘテロ接合体マウ スを得て、 また、 ホモ接合体マウスを得るために、 このへテロ接合体マ ウスをインタークロスさせて、 F c ァ RIIB遺伝子が染色体上で欠損し た欠損マウスを作製した。
実施例 1 (リウマチ関節炎好発モデルマウスの作製） 参考例 1により得られた F c ァ ΠΒ欠損雄マウスを H— 2 qの D BA / 1 J雌マウスとを交配させて、 産まれてきたハプロタイプ H— 2 Qの F c ァ IIB+/— DBAZ l Jマウス と D BAZ l Jマウスとを再 び交配させて、 産まれてきたハプロタイプ H— 2 Qの F C TIIB +/一 D BAZ 1 Jマウス （F 2) と D BAZ l Jマウスとを再び交配させ、 以 下同様に交配を 8回繰り返し、 得られた 8回戻し交配マウス （ハプロ夕 イブ H_ 2 Qの F C TIIB +/— D B A/ 1 Jマウス） 同士を交配して、 ハプロタイプ H _ 2 Qの F c ァ ΠΒ— — （欠損） D BAZ 1 Jマウスを 作製した。
実施例 2 (アジュバンドの作製）
0. 0 2 Mの H C 1溶液に 0. 1 5 Mの N a OH溶液を加えた溶液（ p H 8. 0) に、 牛関節から調製した II型コラーゲン （コラーゲン技術株 式会社） を最終濃度で 4. OmgZm 1 になるように溶解し、 II型コラ 一ゲン溶液を作製した。 この II型コラーゲン 4. OmgZm l と、 流動 パラフィン、 界面活性剤及び結核死菌からなる完全フロイントアジュバ ンド （C FA) 4. 0 mg/m 1 とを連結シリンジ中で混合して、 また Π型コラ一ゲン （ p H 8. 0 ) 4. 0 mg/m 1 と、 流動パラフィンと 界面活性剤とからなる不完全フロイントアジュバント （ I F A) 4. 0 mg/m 1 とを連結シリンジ中で混合して、 2種類のオイルェマルジョ ンを作製した。
実施例 3 (リゥマチ関節炎好発モデルマウスを用いた C I Aの発症） 上記実施例 1記載の方法により作製した F c τΠΒ欠損 D B AZ 1 J マウス （ 8週齢 ： 雌雄差なし） をエーテルで麻酔し尾根部を剃毛し、 II 型コラーゲンと C F Aとをそれぞれ 2 含むェマルジヨン 1 0 0 ^ 1 をマウスの皮内に注射して一次免疫を行い、 その一次免疫後、 2 1 曰目と 4 2日目に II 型コラーゲンと I F Aとをそれぞれ 2 0 0 / g含 むェマルジヨン 1 0 0 1 を皮内に注射し免疫し、 リゥマチ関節炎好発 モデルマウスに C I Aを発症させ、 リゥマチ関節炎の評価を以下のよう に行った。
実施例 4 (関節炎の発症率と関節炎スコア）
C I A発症マウスの関節炎の評価を 1肢にっき、 症状なし ： 0点、 指 関節が 1本のみ腫脹： 1点、 2本以上の指関節： 2点、 関節全体の腫脹 ： 3点と点数化し、 計 1 2点満点で採点した。 また、 コントロールとして DBAZ 1 Jマウスを用いた。 図 1に示すよう.に、 コントロールの DB AZ 1 Jマウス （參： n= 5)では、 初回免疫で関節炎の発症率は 40 % で、 発症日 2 3. 3 ± 4. 6日であった。 また、 関節炎スコアは 3回免 疫後でも平均 8. 5点で最高値に達しなかった。 一方、 F c rllB欠損 D B AZ 1 Jマウス （□ ： n = 1 2 ) では初回免疫のみで全例関節炎を 発症し、 発症日も 1 7. 1 ± 1. 9日と早く、 2回目の免疫後には関節 炎スコアは全例満点の 1 2点となった。 以上のことから、 F c rllB欠 損 DBAZ 1 Jマウスは、 これまで。 I A (collagen-induced arthritis) において一般的に用いられてきた D B AZ 1 Jマウスと比較して、 発症 率及び関節炎スコアの高い、 効率の良い関節炎モデルマウスであること がわかった。 産業上の利用可能性
本発明によると、 II型コラーゲンで免疫すると、 リウマチ関節炎の程 度が最高値に達しかつ発症率が 1 0 0 %であるリゥマチ関節炎好発モデ ル齧歯類動物を得ることができる。 したがって、 かかる本発明のリウマ チ関節炎好発モデル齧歯類動物を用いることによって、 従来のリゥマチ 関節炎好発モデルマウスやラッ トにおける場合よりも、 一層効率的にリ ゥマチ特効薬の開発や治療法の開発を行うことができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 免疫グロプリン F c ァ レセプ夕一 Π Β遺伝子機能が染色体上で欠 損した齧歯類動物と該齧歯類動物と同種の野生型コラーゲン関節炎発症 性齧歯類動物とを戻し交配することにより得られ、 II型コラーゲンで免 疫するとコラーゲン関節炎を発症することを特徴とするリゥマチ関節炎 好発モデル齧歯類動物。
2 . リゥマチ関節炎好発モデル齧歯類動物がリゥマチ関節炎好発モデ ルマウス又はリウマチ関節炎好発モデルラッ トであることを特徴とする 請求項 1記載のリゥマチ関節炎好発モデル齧歯類動物。
3 . 免疫グロプリン F c ァ レセプ夕一 II B遺伝子機能が染色体上で欠 損したマウスと野生型 D B A Z 1 Jマウスとを戻し交配することを特徴 とする請求項 2記載のリウマチ関節炎好発モデル齧歯類動物。
4 . 戻し交配を 6回以上行うことを特徴とする請求項 1〜 3のいずれ か記載のリウマチ関節炎好発モデル齧歯類動物。
5 . II型コラーゲンが、 ゥシ関節由来 II型コラーゲンであることを特 徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載のリゥマチ関節炎好発モデル齧歯 類動物。
6 . 請求項 1〜 5のいずれか記載のリウマチ関節炎好発モデル齧歯類 動物を II型コラーゲンで免疫し、 免疫の前後若しくは免疫と同時に、 又 は免疫後リウマチ関節炎の未発症時に、 該齧歯類動物に被検物質を投与 し、 コラーゲン関節炎の発症の程度を指標として評価することを特徴と するリウマチ関節炎の発症促進物質又は発症抑制物質のスクリーニング 方法。
7 . コラーゲン関節炎の発症の程度を指標として評価するに際し、 対 照としての野生型コラーゲン関節炎非発症性齧歯類動物及び Z又は野生 型コラーゲン関節炎発症性齧歯類動物との比較評価を行うことを特徴と する請求項 6記載のリゥマチ関節炎の発症促進物質又は発症抑制物質の スクリ一ニング方法。
8 . 請求項 1〜 5のいずれか記載のリゥマチ関節炎好発モデル齧歯類 動物を II型コラーゲンで免疫し、 免疫後リゥマチ関節炎の発症時に、 該 齧歯類動物に被検物質を投与し、 コラーゲン関節炎の症像の程度を指標 として評価することを特徴とするリゥマチ関節炎の症像促進物質又は症 像抑制物質のスクリーニング方法。
9 . コラーゲン関節炎の症像の程度を指標として評価するに際し、 対 照としての野生型コラーゲン関節炎非発症性齧歯類動物及びノ又は野生 型コラーゲン関節炎発症性齧歯類動物との比較評価を行うことを特徴と する請求項 8記載のリウマチ関節炎の症像促進物質又は症像抑制物質の スクリ一ニング方法。
1 0 . 請求項 6又は 7記載のリゥマチ関節炎の発症促進物質又は発症 抑制物質のスクリ一ニング方法により得られるリゥマチ関節炎発症促進 物質。
1 1 . 請求項 6又は 7記載のリウマチ関節炎の発症促進物質又は発症 抑制物質のスクリ一ニング方法により得られるリウマチ関節炎発症抑制 物質。
1 2 . 請求項 8又は 9記載のリウマチ関節炎の症像促進物質又は症像 抑制物質のスクリ一ニング方法により得られるリゥマチ関節炎症像促進 物質。
1 3 . 請求項 8又は 9記載のリウマチ関節炎の症像促進物質又は症像 抑制物質のスクリ一ニング方法により得られるリウマチ関節炎症像抑制 物質。
1 4 . リウマチ関節炎発症抑制物質を必要としている患者を治療する のに用いられる治療薬であって、 有効成分として請求項 1 1記載のリウ マチ関節炎発症抑制物質を含んでなる医薬組成物。
1 5 . リウマチ関節炎症像抑制物質を必要としている患者を治療する のに用いられる治療薬であって、 有効成分として請求項 1 3記載のリウ マチ関節炎症像抑制物質を含んでなる医薬組成物。
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