CN109337968A - 类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法 - Google Patents

类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法 Download PDF

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李振
郝慧琴
高玉亭
刘杨
王泽�
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Abstract

本发明涉及医疗技术领域，公开了类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT‑PCR检测标准曲线的建立方法，试验材料包括36只Wistar雌性大鼠、基础日粮、水、牛二型胶原以及甲氨蝶呤，建立方法包括以下步骤：试验动物处理后进行引物设计及合成，依次进行RT‑PCR扩增、测序、建立标准曲线以及进行结果分析。本发明以类风湿关节炎(CIA)大鼠为研究对象，通过引物设计、PCR扩增、克隆转化等进行序列测定，并进行Blast比对，说明CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA mRNA水平检测方法真实可靠，建立类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT‑PCR检测标准曲线，为后期研究其表达特性提供了准确的试验依据。

Description

类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立 方法
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，特别涉及类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)被认为是一种慢性自身免疫性关节疾病，其特征为全身性炎症，病因不明。全球大约0.5％-1％的成年人受到RA的影响。虽然疾病病因仍然未知，但研究滑膜中的各种炎性细胞(包括单核细胞/巨噬细胞、T细胞和B细胞、破骨细胞、树突细胞、内皮细胞和滑膜成纤维细胞)有助于进一步了解RA的发生及发展。
Cdk1(周期素依赖激酶1)是Ser/Thr蛋白激酶家族的成员。Cdk1在控制真核细胞周期中发挥关键作用，其磷酸化和去磷酸化也在细胞周期控制中起重要的调节作用。CD3D参与免疫系统，易引起T细胞发育功能的缺陷。RALB(resorcylic acid lactone beta)是一种低分子量GTP结合蛋白，属于onco蛋白的RAS家族。参与多种细胞过程，包括基因表达、细胞迁移、细胞增殖、致癌转化和膜运输。RelA是一种多效转录因子，存在于几乎所有细胞类型中，是一系列信号转导事件的终点，这些事件与炎症、免疫、分化、细胞等许多生物过程相关。鉴于Cdk1、CD3D、RALB和RelA在调控炎症反应中的重要作用。
发明内容
发明的目的在于提供类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法，本发明以类风湿关节炎(CIA)大鼠为研究对象，通过引物设计、PCR扩增、克隆转化等进行序列测定，并进行Blast比对，说明CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA mRNA水平检测方法真实可靠，建立类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线，为后期研究其表达特性提供了准确的试验依据，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法，试验材料包括36只Wistar雌性大鼠、基础日粮、水、牛二型胶原以及甲氨蝶呤，建立方法包括以下步骤：
S1：试验动物的处理
选取36只42±2日龄健康状况良好、Wistar雌性大鼠，根据每组间平均体重相近原则，随机分为3个试验组：I组，空白对照组(n＝12)：饲喂基础日粮+水；II组，模型CIA组(n＝12)：多点皮下注射牛二型胶原；III组，阳性对照组(n＝12)，造模成功后，甲氨蝶呤按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；试验结束后，麻醉、杀检、腹主动脉取血备用；采集3个不同试验组Wistar雌性大鼠脾脏相同部位，放入DEPC水处理过的EP管，迅速置于液氮中保存；
S2：引物设计及合成
根据NCBI网站提供的参考序列，使用Primer 5.0软件设计4对特异性引物，用于完整CDS区测定，并进行合成；
S3：RT-PCR扩增
PCR反应体系：正反向引物各0.6μL，cDNA模板0.8μL，ddH2O 5.5μL，2×Es TaqMaster Mix7.5μL，共15μL；扩增程序：94℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min，产物经3％琼脂糖凝胶电泳检测；
S4：测序
将回收出来的DNA片段连接至T3-Cloing-Vector，PCR仪25℃恒温10min，使连接产物与感受态细胞融合，37℃过夜培养，待LB固体培养基长出蓝白斑，挑取白色单菌落，LB液体培养基培养12-16h，菌液进行测序；
S5：标准曲线的建立
将反转录后的CIA大鼠cDNA模板按照10×稀释8个梯度，制备梯度标准品，每个PCR反应体系中起始模板浓度分别是：1.0、10×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7，使用ddH2O代替模板，作为阴性对照，荧光定量体系为：SYBRPrimix Ex TaqTM10μL，正反向引物各0.8μL，cDNA模板2.0μL，Rox Reference Dye II 0.4μL，ddH2O 6.0μL，总体积20μL，反应程序：95℃变性10s，95℃ 5s，60℃ 25s，共40个循环；
S6：进行结果分析。
进一步地，S1中Wistar雌性大鼠体重为170±10g。
进一步地，S1中所有Wistar雌性大鼠日粮均为大小鼠商品饲料，自由采食、自由饮水，试验时间为28d，所有试验Wistar雌性大鼠在预饲7d后进入正式试验期，正式试验为期21d。
进一步地，S2中引物使用前用灭菌超纯水溶解稀释至100μmol/μL，-20℃保存备用。
进一步地，S3中正反向引物的浓度为10μmol·L-1。
进一步地，S6包括以下步骤：
S6-1：CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA RT-PCR电泳结果
S6-2：蓝白斑筛选及序列测定结果
S6-3：标准曲线的建立。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出的类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法，以类风湿关节炎(CIA)大鼠为研究对象，通过引物设计、PCR扩增、克隆转化等进行序列测定，并进行Blast比对，说明CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA mRNA水平检测方法真实可靠，建立类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线，为后期研究其表达特性提供了准确的试验依据。
附图说明
图1为本发明的CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA琼脂糖电泳检测结果图；
图2为本发明的蓝白斑筛选示意图；
图3为本发明的Cdk1、CD3D、RALB和RelA cDNA序列比对结果图；
图4为本发明的Cdk1标准曲线、扩增曲线和熔解曲线图；
图5为本发明的CD3D标准曲线、扩增曲线和熔解曲线图；
图6为本发明的RALB标准曲线、扩增曲线和熔解曲线图；
图7为本发明的RelA标准曲线、扩增曲线和熔解曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例中：类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法，试验材料包括36只Wistar雌性大鼠、基础日粮、水、牛二型胶原以及甲氨蝶呤，建立方法包括以下步骤：
步骤一：试验动物的处理
选取36只42±2日龄健康状况良好、体重相近(170±10g)Wistar雌性大鼠，根据每组间平均体重相近原则，随机分为3个试验组：I组，空白对照组(n＝12)：饲喂基础日粮+水；II组，模型CIA组(n＝12)：多点皮下注射牛二型胶原；III组，阳性对照组(n＝12)，造模成功后，甲氨蝶呤按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；所有Wistar雌性大鼠日粮均为大小鼠商品饲料，自由采食、自由饮水。本试验时间为28d。所有试验Wistar雌性大鼠在预饲7d后进入正式试验期，正式试验为期21d。试验结束后，麻醉、杀检、腹主动脉取血备用；采集3个不同试验组Wistar雌性大鼠脾脏相同部位，放入DEPC水处理过的EP管，迅速置于液氮中保存；
步骤二：引物设计及合成
根据NCBI网站提供的参考序列，使用Primer 5.0软件设计4对特异性引物，用于完整CDS区测定，并进行合成；使用前用灭菌超纯水溶解稀释至100μmol/μL，-20℃保存备用。引物信息见表1。
表1本试验中所用引物序列
步骤三：RT-PCR扩增
PCR反应体系：正反向引物(10μmol·L-1)各0.6μL，cDNA模板0.8μL，ddH2O 5.5μL，2×Es Taq Master Mix(含染料)7.5μL，共15μL；扩增程序：94℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min，产物经3％琼脂糖凝胶电泳检测；
步骤四：测序
将回收出来的DNA片段连接至T3-Cloing-Vector，PCR仪25℃恒温10min，体系见表2，使连接产物与感受态细胞融合，37℃过夜培养，待LB固体培养基长出蓝白斑，挑取白色单菌落，LB液体培养基培养12-16h，菌液进行测序；
表2 DNA反应连接体系
步骤五：标准曲线的建立
将反转录后的CIA大鼠cDNA模板按照10×稀释8个梯度，制备梯度标准品，每个PCR反应体系中起始模板浓度分别是：1.0、10×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7，使用ddH2O代替模板，作为阴性对照，荧光定量体系为：SYBRPrimix Ex TaqTM10μL，正反向引物各0.8μL，cDNA模板2.0μL，Rox Reference Dye II 0.4μL，ddH2O 6.0μL，总体积20μL，反应程序：95℃变性10s，95℃ 5s，60℃ 25s，共40个循环；
步骤六：进行结果分析
(1)CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA RT-PCR电泳结果
提取CIA大鼠脾脏组织总RNA，电泳检测结果显示，5S、18S、28S条带单一、较亮，说明CIA大鼠总RNA质量较好，无降解。以反转录后的cDNA为模板进行Cdk1、CD3D、RALB和RelART-PCR温度梯度检测，设定温度分别为：60℃、58.3℃、56.3℃、53.9℃、50.7℃，经琼脂糖凝胶电泳检测(如图1中的A，B，C，D，其中A为CIA大鼠Cdk1琼脂糖电泳检测结果，B为CIA大鼠CD3D琼脂糖电泳检测结果，C为CIA大鼠RALB琼脂糖电泳检测结果，D为CIA大鼠RelA琼脂糖电泳检测结果)，图中1-5分别表示60℃、58.3℃、56.3℃、53.9℃、50.7℃，不同温度梯度下，均检测到扩增产物，且条带单一。表明Cdk1、CD3D、RALB和RelA引物特异性较强、无引物二聚体出现，可用于序列检测。
(2)蓝白斑筛选及序列测定结果
将PCR产物直接连接载体，转化大肠杆菌，蓝白斑筛选，提取质粒后送测序(图2)。与NCBI GenBank已登录的Cdk1、CD3D、RALB和RelA cDNA碱基序列比对，同源性均为100％(图3)，进一步证实Cdk1、CD3D、RALB和RelA引物可用于标准曲线的建立。
(3)标准曲线的建立
由图4-B，C、5-B，C、6-B，C和7-B，C可知，Cdk1和β-actin、CD3D和β-actin、RALB和β-actin、RelA和β-actin mRNA扩增动力学曲线平行性良好，起峰点清晰，曲线为S型；熔解曲线显示，峰单一，无引物二聚体和非特异性产物出现。表明本试验建立的Cdk1和β-actin、CD3D和β-actin、RALB和β-actin、RelA和β-actin mRNA相对定量检测方法满足试验要求。
图4-A、5-A、6-A、7-A为Cdk1、CD3D、RALB和RelA mRNA相对定量的标准曲线，结果显示，Cdk1和β-actin、CD3D和β-actin、RALB和β-actin、RelA和β-actin mRNA标准曲线呈良好的线性关系，扩增效率分别为96.0％和97.3％、107.4％和98.2％、102.5％和102.4％、106.2％和102.4％，R2(线性拟合度)分别为0.994和0.999、0.957和0.997、0.989和0.997、0.975和0.997。说明CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA mRNA水平检测方法真实可靠。
通过以上试验得出以下结论：
Cdk1、CD3D、RALB和RelA cDNA序列Blast结果显示，同源性均为100％，说明本发明设计的Cdk1、CD3D、RALB和RelA引物可用于标准曲线的建立。Cdk1、CD3D、RALB和RelA mRNA标准曲线呈良好的线性关系，扩增效率分别为96.0％和97.3％、107.4％和98.2％、102.5％和102.4％、106.2％和102.4％，R2分别为0.994和0.999、0.957和0.997、0.989和0.997、0.975和0.997。说明CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA mRNA水平检测方法真实可靠。
本发明通过引物设计、PCR扩增、克隆转化等进行序列测定，并进行Blast比对，结果显示：Cdk1、CD3D、RALB和RelA cDNA序列Blast结果显示，同源性均为100％，说明本试验设计的Cdk1、CD3D、RALB和RelA引物可用于标准曲线的建立。Cdk1、CD3D、RALB和RelA mRNA标准曲线呈良好的线性关系，扩增效率分别为96.0％和97.3％、107.4％和98.2％、102.5％和102.4％、106.2％和102.4％，R2分别为0.994和0.999、0.957和0.997、0.989和0.997、0.975和0.997。说明CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA mRNA水平检测方法真实可靠。
综上所述，本发明提出的类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法，以类风湿关节炎(CIA)大鼠为研究对象，通过引物设计、PCR扩增、克隆转化等进行序列测定，并进行Blast比对，说明CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA mRNA水平检测方法真实可靠，建立类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线，为后期研究其表达特性提供了准确的试验依据。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法，其特征在于，试验材料包括36只Wistar雌性大鼠、基础日粮、水、牛二型胶原以及甲氨蝶呤，建立方法包括以下步骤：
S1：试验动物的处理
选取36只42±2日龄健康状况良好、Wistar雌性大鼠，根据每组间平均体重相近原则，随机分为3个试验组：I组，空白对照组(n＝12)：饲喂基础日粮+水；II组，模型CIA组(n＝12)：多点皮下注射牛二型胶原；III组，阳性对照组(n＝12)，造模成功后，甲氨蝶呤按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；试验结束后，麻醉、杀检、腹主动脉取血备用；采集3个不同试验组Wistar雌性大鼠脾脏相同部位，放入DEPC水处理过的EP管，迅速置于液氮中保存；
S2：引物设计及合成
根据NCBI网站提供的参考序列，使用Primer 5.0软件设计4对特异性引物，用于完整CDS区测定，并进行合成；
S3：RT-PCR扩增
PCR反应体系：正反向引物各0.6μL，cDNA模板0.8μL，ddH2O 5.5μL，2×Es Taq MasterMix7.5μL，共15μL；扩增程序：94℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃5min，产物经3％琼脂糖凝胶电泳检测；
S4：测序
将回收出来的DNA片段连接至T3-Cloing-Vector，PCR仪25℃恒温10min，使连接产物与感受态细胞融合，37℃过夜培养，待LB固体培养基长出蓝白斑，挑取白色单菌落，LB液体培养基培养12-16h，菌液进行测序；
S5：标准曲线的建立
将反转录后的CIA大鼠cDNA模板按照10×稀释8个梯度，制备梯度标准品，每个PCR反应体系中起始模板浓度分别是：1.0、10×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7，使用ddH2O代替模板，作为阴性对照，荧光定量体系为：SYBR PrimixEx TaqTM10μL，正反向引物各0.8μL，cDNA模板2.0μL，Rox Reference Dye II 0.4μL，ddH2O6.0μL，总体积20μL，反应程序：95℃变性10s，95℃ 5s，60℃ 25s，共40个循环；
S6：进行结果分析。
2.根据权利要求1所述的类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法，其特征在于，S1中Wistar雌性大鼠体重为170±10g。
3.根据权利要求1所述的类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法，其特征在于，S1中所有Wistar雌性大鼠日粮均为大小鼠商品饲料，自由采食、自由饮水，试验时间为28d，所有试验Wistar雌性大鼠在预饲7d后进入正式试验期，正式试验为期21d。
4.根据权利要求1所述的类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法，其特征在于，S2中引物使用前用灭菌超纯水溶解稀释至100μmol/μL，-20℃保存备用。
5.根据权利要求1所述的类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法，其特征在于，S3中正反向引物的浓度为10μmol·L-1。
6.根据权利要求1所述的类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法，其特征在于，S6包括以下步骤：
S6-1：CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA RT-PCR电泳结果
S6-2：蓝白斑筛选及序列测定结果
S6-3：标准曲线的建立。
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