CN105125548A - Jam-a蛋白在类风湿关节炎治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明鉴定了一种在类风湿关节炎病人外周血淋巴细胞中表达量高于正常健康人的连接黏附分子A(JAM-A)，并证实连接黏附分子A在功能上参与了外周血淋巴细胞迁移的调节，能有效减弱免疫淋巴细胞向外周骨关节的迁移，从而达到治疗类风湿关节炎的效果。并在小鼠胶原诱导关节炎(collagen？induced？arthritis，CIA)动物模型中获得了同样的治疗效果。本发明为临床类风湿关节炎病人的临床干预提供了治疗性的分子靶标。

Description

JAM-A蛋白在类风湿关节炎治疗中的应用

技术领域

本发明涉及连接黏附分子A(JunctionalAdhesionMoleculesA,JAM-A)蛋白在人体免疫系统淋巴细胞的表达水平和生理功能；涉及连接粘附分子A对外周血淋巴细胞迁移活动的调节及其在小鼠胶原诱导型关节炎(collageninducedarthritis,CIA)模型和在类风湿关节炎(Rheumatoidarthritis，RA)治疗中的应用。

背景技术

类风湿关节炎(RA)是一种以慢性滑膜炎症为主要表现，最终导致软骨吸收、骨破坏和骨纤维化的自身免疫功能紊乱疾病，类风湿关节炎在全世界的患病率为0.42-0.54%，在我国25个省的疾病流行病学调查中显示我国的患病率为0.32-0.36%，类风湿关节炎是引起青壮年劳动力丧失最主要的原因之一。类风湿关节炎具有易复发、难治愈的特点，在关节炎中它是致残率较高的疾病。类风湿性关节炎还常常伴有关节外的系统性损害，其病理特征为关节中淋巴细胞、巨噬细胞的浸润增多，滑膜被覆细胞层数和基质成分增多以及新血管翳的形成，即主要是细胞免疫调节功能紊乱导致免疫应答反应失衡所引起的，其中T细胞激活是炎症的核心。类风湿关节炎的发生和发展是一个由淋巴系统、多种细胞因子共同参与的自身免疫过程，其发病机制复杂，目前还未能完全明确，缺乏有效的临床治疗手段。目前临床上治疗类风湿关节炎的常用药物分为四大类，即非甾体抗炎药(nonsteroidalanti-inflammatorydrugs，NSAIDs)、免疫抑制剂、糖皮质激素和植物药，如甲氨蝶呤(甲氨蝶呤)、硫唑嘌呤、环磷酰胺等，但是长时间使用这些药物会使较多患者出现不良反应，导致不能耐受而停用。

连接粘附分子家族(JunctionalAdhesionMolecules，JAMs)属于免疫球蛋白超家族，主要由连接黏附分子A、连接黏附分子B(JAM-B)和连接黏附分子C(JAM-C)三种蛋白组成，其功能的发挥并不依赖钙离子。连接黏附分子A又称为JAM1，血小板F11受体(plateletF11receptor)，血小板粘附分子(PlateletAdhesionMolecule)，主要定位于表皮细胞和内皮细胞的紧密连接(TightJunction)以及T淋巴细胞、B淋巴细胞等免疫细胞膜上。在血管内皮细胞连接处的连接黏附分子A在维持血管张力，在参与宿主免疫反应、血管生成等反应中起着极其重要的作用。T淋巴细胞和B淋巴细胞膜表面的连接黏附分子A蛋白可以通过远膜端的V型免疫球蛋白样功能区域和淋巴细胞功能相关分子(LymphocyteFunction-associatedAntigen1，LFA-1)等蛋白顺式结合，介导淋巴细胞迁移和血小板聚集等功能。此外，连接黏附分子A在多种疾病中出现功能异常后可以使紧密连接的稳定状态发生改变，例如参与心血管疾病、乳腺癌、结肠癌等肿瘤疾病、色素膜炎和溃疡性结肠炎等疾病的细胞迁移过程。

类风湿关节炎发病过程中血管内皮细胞之间的紧密连接结构和功能均发生异常改变，导致细胞间的完整性降低，免疫细胞、炎性细胞因子和多种蛋白酶得以容易地穿过内皮细胞屏障进入血管外的细胞外基质，检测到血管内皮细胞紧密连接处连接黏附分子A蛋白表达下调，造成关节的滑膜和软骨出现炎性细胞侵润，出现细胞因子风暴，氧化应激水平过高，基质金属蛋白酶3(MMP-3)在局部对其中的胶原蛋白、蛋白聚糖、层粘连蛋白和纤维连接蛋白等进行水解，最终导致关节骨质破坏和功能残损。本发明则是分析连接黏附分子A在外周血淋巴细胞上的表达分布，探索外周血淋巴细胞上连接黏附分子A的功能以及对类风湿关节炎发病的影响，旨在寻找连接黏附分子A潜在的治疗类风湿关节炎的价值。

发明内容

本发明主要研究连接黏附分子A在类风湿关节炎发病和治疗过程中所起的作用，从分析健康正常人和类风湿关节炎患者连接黏附分子A在外周血淋巴细胞中的表达分布与功能入手，然后通过小鼠胶原诱导关节炎模型和细胞体外实验验证连接黏附分子A在关节炎发病以及治疗中的作用，目的是提供连接粘附分子A在治疗类风湿关节炎中的应用。

首先，检测连接黏附分子A蛋白在健康正常人和类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞表面的表达分布。对37例健康正常人和48例类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞膜表面的连接黏附分子A表达进行分析，结果显示连接黏附分子A蛋白在类风湿关节炎患者的淋巴细胞膜上的表达水平比健康人高，而T淋巴细胞上的增高是引起这一现象的原因。但是与健康人相比，未接受规范药物治疗的类风湿关节炎患者的淋巴细胞膜上的连接黏附分子A蛋白表达水平并无明显改变。进一步根据治疗用药情况将类风湿关节炎患者分为若干组并与未治疗组进行比较，结果发现采用甲氨蝶呤(MTX)治疗的类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞膜上连接黏附分子A的表达升高，而评判类风湿关节炎疾病活动程度的指标(DAS28/ESR、DAS28/CRP和SDAI)均下降，且外周血淋巴细胞膜上表达的连接黏附分子A与这些指标呈负相关，表明外周血淋巴细胞膜上的连接黏附分子A的表达升高能减轻类风湿关节炎的发病。

其次，在小鼠胶原诱导性关节炎模型中验证连接黏附分子A与类风湿关节炎发病和治疗的关系。将C57BL/6小鼠购回后适应性饲养1周后随机分为三组，每组小鼠数量为8只：⑴正常对照组(controlgroup，CON)，每隔3天使用灭菌蒸馏水对小鼠灌胃1次，共5次；⑵胶原诱导性关节炎模型组(collageninducedarthritisgroup，CIA)，每隔3天使用灭菌蒸馏水对小鼠灌胃1次，共5次，随后使用牛II型胶原蛋白进行动物免疫建立关节炎模型；⑶甲氨喋呤治疗关节炎组(MTXtreatmentgroup，MTX+CIA),每隔3天使用甲氨喋呤药物对小鼠灌胃1次，共5次，随后使用牛II型胶原蛋白进行动物免疫诱发关节炎模型。在实验第0天(Day0)进行首次灌胃前对小鼠采集血样进行第一次流式细胞学检测，另外，在实验第6天(Day6)、第15天(Day15)、第16天(Day16，即进行牛II型胶原蛋白免疫后的第二天)，第24天(Day24)和第30天(Day30)采集小鼠血液进行分析。结果显示，胶原诱导性关节炎小鼠外周血淋巴细胞膜表面的连接黏附分子A蛋白表达水平与正常组比较无差异，但是胶原诱导性关节炎小鼠经过甲氨蝶呤治疗后，小鼠的关节肿胀程度减轻而且外周血淋巴细胞膜表面的连接黏附分子A表达蛋白表达水平升高。进一步表明外周血淋巴细胞膜上连接黏附分子A的表达升高能够减轻类风湿关节炎的发病程度而起到很好的治疗作用。

最后，体外细胞学验证连接黏附分子A在类风湿关节炎治疗中的功能。采集30例类风湿关节炎患者和15例健康正常人的外周血并分离淋巴细胞，采用0.01μg/mL浓度的甲氨蝶呤处理5天后采用流式细胞术和细胞迁移实验分析连接黏附分子A表达的变化和淋巴细胞迁移能力的变化。结果显示，0.01μg/mL浓度的甲氨蝶呤对人淋巴细胞的连接黏附分子A基因表达和蛋白质表达水平具有上调的作用，而类风湿关节炎患者的淋巴细胞的迁移能力也随之减弱，采用J10.4抗体拮抗连接黏附分子A后，甲氨蝶呤抑制淋巴细胞迁移的作用被部分抵消，说明高表达的连接黏附分子A能抑制淋巴细胞迁移能力，从而减轻类风湿关节炎的发病，这对类风湿关节炎的治疗有着极其重要的意义。

附图说明

图1.连接黏附分子A在健康正常人和类风湿关节炎病人、健康正常人和未接受正规治疗类风湿关节炎病人外周血淋巴细胞膜表面的表达分布。流式细胞术检测结果表明，类风湿关节炎组的总淋巴细胞和T淋巴细胞中分别有12.75%和8.87%的细胞表达连接黏附分子A，而健康正常人的这一数值为5.16%和2.95%，说明健康正常人和类风湿关节炎病人的连接黏附分子A表达水平差异显著(P<0.01)；而两组间B淋巴细胞膜上的连接黏附分子A蛋白表达水平并无明显差异(P>0.05)(图1A)。但是健康正常人和未接受正规治疗的类风湿关节炎患者的总淋巴细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞膜上的连接黏附分子A蛋白与健康对照组相比均无明显变化(P>0.05)(图1C)。为排除流式细胞术分析时由淋巴细胞数目不同而导致的误差，所以对健康对照组和类风湿关节炎组、健康对照组和未接受正规治疗类风湿关节炎病人组的外周血淋巴细胞数目进行比较和统计分析，结果显示健康对照组和类风湿关节炎组、健康对照组和未接受正规治疗类风湿关节炎病人组间的总淋巴细胞数、T淋巴细胞数和B淋巴细胞数间没有差异(P>0.05)(图1B、图1D)。说明流式细胞学方法检测所得的结果真实反映了各组的连接黏附分子A蛋白变化水平，未受淋巴细胞数目的影响。

图2.连接黏附分子A在未接受正规治疗类风湿关节炎病人和使用甲氨蝶呤治疗的类风湿关节炎病人外周血淋巴细胞中的表达分布。流式细胞术结果显示未使用药物治疗的类风湿关节炎患者总淋巴细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞中分别有6.76%、4.19%和0.23%的细胞表达连接黏附分子A，而使用甲氨蝶呤治疗的类风湿关节炎患者的这一数值分别为29.19%、22.75%和0.9%，两组之间的差异有显著统计学意义(P<0.01)(图2A-C)。同样为了排除检测时由于淋巴细胞数目不同而导致的误差，对未治疗组和单用甲氨蝶呤治疗组患者的外周血淋巴细胞数目进行比较和统计分析发现两组间的总淋巴细胞数、T淋巴细胞数和B淋巴细胞数目间没有差异(P>0.05)(图2D)，说明流式细胞术检测的连接黏附分子A的表达差异是真实存在的。为了观察甲氨蝶呤是否能够改善类风湿关节炎病情，降低疾病活动程度，使用DAS28/ESR、DAS28/CRP和SDAI评价量表对未治疗组与单用甲氨蝶呤治疗组患者进行评分，结果显示单用甲氨蝶呤治疗组患者的DAS28/ESR(图2E)、DAS28/CRP(图2F)和SDAI(图2G)分值绝对值均有一定程度的降低，而且三种评分体系分组均能降低一个等级，提示甲氨蝶呤对类风湿关节炎病情具有确切的治疗作用。

图3.单用甲氨蝶呤治疗的类风湿关节炎病人外周血淋巴细胞连接黏附分子A蛋白表达水平与DAS28/ESR、DAS28/CRP和SDAI的相关性分析。结果显示单用甲氨蝶呤治疗的类风湿关节炎病人外周血总淋巴细胞连接黏附分子A蛋白表达水平与DAS28/ESR(图3A)、DAS28/CRP(图3B)和SDAI(图3C)成负相关，外周血T淋巴细胞和B淋巴细胞连接黏附分子A蛋白表达水平同样与DAS28/ESR(图3D,3G)、DAS28/CRP(图3E,3H)和SDAI(图3F,3I)呈负相关，即连接黏附分子A蛋白水平越高，患者病情活动程度越低，说明连接黏附分子A在外周血淋巴细胞的高表达对类风湿关节炎的治疗中起着重要的作用。

图4.小鼠胶原诱导型关节炎体重变化和关节炎指数变化。采用弗氏佐剂和牛II型胶原蛋白乳化混合物免疫小鼠建立胶原诱导型关节炎动物模型，建模期间，随着饲养时间的增加，小鼠体重也随之增加，统计结果显示正常对照组，胶原诱导性关节炎模型组、甲氨喋呤治疗关节炎组间小鼠的体重差异均无统计学意义(P>0.05)(图4A)。同时观察小鼠的关节炎指数变化，胶原诱导性关节炎模型组小鼠在接受牛II型胶原蛋白免疫后，在第18天观察时间点出现了双侧后足趾和足底皮肤表皮发红，轻度肿胀，严重的可以表现为足趾、足背、踝关节皮肤表皮发红，伴有轻度肿胀的关节炎发病特征，而且随时间增加，小鼠的关节炎指数平均值升高，直至第39天关节炎指数仍然较高，说明小鼠的胶原诱导型关节炎动物模型构建成功。同时，与胶原诱导型关节炎模型组相比，甲氨喋呤治疗关节炎组小鼠的关节肿胀程度轻，在实验第18天(Day18)观察时间点也出现了后足趾和足底皮肤表皮发红，轻度肿胀，但受累关节数目少，多为单侧后肢，双侧后肢关节同时发生关节炎症的小鼠数目较少，随着建模时间的增加，小鼠的关节炎得到很好的治疗，说明甲氨蝶呤能够治疗小鼠的关节炎(图4B)。

图5.连接黏附分子A在小鼠正常对照组与胶原诱导型关节炎模型组总淋巴细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞中的表达以及细胞数目变化。流式细胞术检测结果显示，胶原诱导型关节炎小鼠与正常饲养小鼠在实验的第16天(Day16)、24天(Day24)和30天(Day30)，外周血总淋巴细胞(图5A)、T淋巴细胞(图5B)和B淋巴细胞(图5C)膜上的连接黏附分子A蛋白表达水平与正常对照组的差异没有统计学意义(P>0.05)。为了排除由于淋巴细胞数目的不同而导致流式细胞术检测的误差，对正常对照组和胶原诱导型关节炎组的外周血淋巴细胞数目进行统计，发现小鼠的外周血总淋巴细胞(图5D)、T淋巴细胞(图5E)和B淋巴细胞(图5F)总数的差异不具有统计学意义(P>0.05)，说明流式细胞术检测结果真实可靠。

图6.连接黏附分子A在小鼠胶原诱导型关节炎组与甲氨蝶呤治疗关节炎组总淋巴细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞中的表达以及细胞数目变化。与胶原诱导型关节炎组小鼠相比，经过甲氨蝶呤治疗的关节炎小鼠在实验第16天(Day16)时外周血总淋巴细胞(图6A)、T淋巴细胞(图6B)和B淋巴细胞(图6C)膜上的连接黏附分子A蛋白水平比胶原诱导性关节炎组高，差异有统计学意义(P<0.05)。两组外周血的总淋巴细胞(图6D)、T淋巴细胞(图6E)和B淋巴细胞(图6F)数目间的差异并不具有统计学意义(P>0.05)，说明流式细胞术分析的差异是真实存在的。

图7.甲氨蝶呤对淋巴细胞存活以及表达量的影响。经0.01μg/mL，0.1μg/mL和1μg/mL三个浓度的甲氨蝶呤处理淋巴细胞6天后，发现0.01μg/mL(图7A)的甲氨蝶呤和0.1μg/mL(图7B)的甲氨蝶呤对淋巴细胞的存活均无明显影响，而1μg/mL(图7C)的甲氨蝶呤则对淋巴细胞的存活有明显的抑制作用。荧光实时定量PCR检测发现，人淋巴细胞经0.01μg/mL的甲氨蝶呤处理5天后连接黏附分子A基因表达升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，而0.1μg/mL和1μg/mL两个浓度的甲氨蝶呤对连接黏附分子A基因的表达无明显影响，差异无统计学意义(P>0.05)(图7D)。

图8.经0.01μg/mL浓度甲氨蝶呤处理5天后类风湿关节炎病人淋巴细胞连接黏附分子A表达变化。结果显示总淋巴细胞和T淋巴细胞膜上的连接黏附分子A蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)(图8A，图8C)；而B淋巴细胞膜上的连接黏附分子A蛋白表达水平无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)(图8B，图8C)。统计对照组和甲氨蝶呤处理组间的总淋巴细胞数、T淋巴细胞数和B淋巴细胞数发现他们之间的差异均无统计学意义(P>0.05)(图8D)。

图9.类风湿关节炎患者与健康正常人、甲氨蝶呤处理类风湿关节炎病人淋巴细胞体外细胞迁移试验。接种相同数量的健康正常人和类风湿关节炎病人淋巴细胞经4小时的体外细胞迁移后，结果表明类风湿关节炎患者的淋巴细胞迁移的数目高于健康正常人淋巴细胞的数目，差异有统计学意义(P<0.01)(图9A，9B)。另外，经过0.01μg/mL的甲氨蝶呤与类风湿关节炎病人淋巴细胞共同培养5天后进行体外细胞迁移试验，结果发现与对照组相比，甲氨蝶呤处理组能够降低淋巴细胞的迁移能力，差异有统计学意义(P<0.01)(图9C，9D)。说明甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎是通过提高连接黏附分子A蛋白的表达而抑制淋巴细胞的迁移实现的。

图10.连接黏附分子A的特异性抗体J10.4对淋巴细胞体外细胞迁移的影响。用甲氨蝶呤处理类风湿关节炎病人外周血淋巴细胞后，再使用连接黏附分子A的特异性抗体J10.4对淋巴细胞膜表面的连接黏附分子A进行封闭。细胞体外迁移实验发现与未经药物处理而正常培养5天的对照组细胞相比，甲氨蝶呤处理5天后的淋巴细胞经J10.4处理后细胞的迁移能力并未改变，差异没有统计学意义(P>0.05)。进一步说明连接黏附分子A的上调表达而抑制淋巴细胞的迁移是治疗类风湿关节炎的一个重要途径。

具体实施方式

实施例1：JAM-A蛋白在健康人和RA患者外周血淋巴细胞的表达。

1.血样的采集及分组。

本发明所采集的外周血样在采血前将实验用途告知志愿者和类风湿关节炎患者并签署知情同意书，血样采集和相关实验操作均通过昆明医科大学第一附属医院和云南大学医学院的伦理审查。

本发明采集48例类风湿关节炎患者外周血(类风湿关节炎组，RA)，均来自昆明医科大学第一附属医院风湿免疫科。37例健康成年人外周血(正常组，CON)，采自昆明医科大学第一附属医院和云南大学的志愿者。每名患者和自愿者都经过两名风湿免疫科主治医师询问病史并进行专科体检，临床实验室检测类风湿因子和环瓜氨酸肽抗体(ACCP)。摄双手正位X片，经影像科专科医师读片并出具影像报告，综合分析得出临床诊断或者排除类风湿关节炎诊断。48例类风湿关节炎患者中有9例未接受过DMARDs、糖皮质激素或者生物制剂中的任何一种药物治疗，按照美国风湿病学会的标准可认为未接受规范的治疗，被称为未治疗组(Untreated)。

2.连接黏附分子A蛋白在外周血淋巴细胞的表达分布。

采集好类风湿关节炎患者和志愿者外周血后，采用Ficoll400(北京索莱宝科技有限公司，CodeNo.P8610-200)试剂密度梯度离心的方法分离类风湿关节炎患者和健康人的外周血单核细胞(PBMC)并分装成空白管、同型对照管、单染管和双染管，每管加入100uL细胞悬液。空白管不做任何处理，同型对照管中加入抗体FITC-IgG1(CodeNo.555748)或PE-IgG1(CodeNo.555749)。单染管加入抗体FITC-CD3(CodeNo.555332)或FITC-CD19(CodeNo.555412)或PE-CD321(CodeNo.552556)。双染管加入FITC-CD3(CodeNo.555332)+PE-CD321(CodeNo.552556)或FITC-CD19(CodeNo.555412)+PE-CD321(CodeNo.552556)，抗体均购自美国BD公司，每管加抗体10μL。其中CD3检测T淋巴细胞，CD19检测B淋巴细胞，CD321检测淋巴细胞膜上的连接黏附分子A蛋白表达水平，加入相应流式细胞术抗体后4℃避光孵育30min后，每管加1mlPBS重悬洗涤细胞，300g离心5min；弃上清，用500ulPBS重悬后用流式细胞仪检测(BectonDickinson,USA)。得到的数据采用SPSS16.0软件进行分析，独立样本间的数据比较使用t检验进行分析，选取P值为0.05，P<0.05时认为差异有统计学意义，P<0.01时认为差异有显著统计学意义，分析统计结果见图1。

3.JAM-A在未治疗组和甲氨蝶呤治疗组患者外周血淋巴细胞的表达分布。

为了进一步探讨连接黏附分子A的表达上升在类风湿关节炎治疗中的临床意义，我们将48例患者的治疗用药进行详细分组，并选择国际风湿病学界公认的疾病活动指数28/血沉(DAS28/ESR)、疾病活动指数28/C反应蛋白(DAS28/CRP)和简化的疾病活动指数(SDAI)对接受不同治疗方案的类风湿关节炎患者的疾病活动程度进行计算。分析结果表明采用甲氨蝶呤治疗的类风湿关节炎患者连接黏附分子A的表达量远远高于未接受正规治疗的类风湿关节患者，疾病活动评分显示患者的病情活动程度得到很好的改善(见图2)。分析使用甲氨蝶呤治疗的患者外周血淋巴细胞的连接黏附分子A和疾病活动评分的相关性显示两者之间呈负相关，即连接黏附分子A的蛋白表达水平越高，患者的疾病活动程度越低(见图3)，由此可以看出，提高连接黏附分子A的表达能够很好的抑制类风湿关节炎的发展。

实施例2：JAM-A在胶原诱导型关节炎(CIA)小鼠外周血的表达分布。

1.实验小鼠分组。

挑选6-8周，体重为22-26g的C57BL/6雌性小鼠(北京维通利华公司，清洁级)，随机分成三组，第一组为正常对照组(Controlgroup，CON)，每隔3天使用灭菌蒸馏水对小鼠灌胃1次，共5次。第二组为胶原诱导性关节炎模型组(CIA)，每隔3天使用灭菌蒸馏水对小鼠灌胃1次，共5次，随后使用牛II型胶原蛋白(Chondrex公司，CodeNo.20021)进行动物免疫建立关节炎模型。第三组为甲氨喋呤治疗关节炎组(MTXtreatmentCIAgroup，MTX+CIA),每隔3天使用甲氨喋呤药物对小鼠灌胃1次，共5次，随后使用牛II型胶原蛋白进行动物免疫诱发关节炎模型。每组小鼠数量为8只，小鼠入组后进行体重测量后经统计学分析差异无显著性(P>0.05)。

将小鼠首次灌胃的时间定义为第0天(Day0)，然后每隔3天在同一时间点对小鼠进行灌胃，总共灌胃4次，时间为12天。在第15天(Day15)对胶原诱导性关节炎模型组(CIA)和甲氨喋呤治疗关节炎组(MTX+CIA)两组小鼠进行牛II型胶原蛋白免疫注射，而正常对照组(CON)不做任何处理。测量体重和评判关节炎指数的时间从实验的第0天(Day0)开始，每隔3天称取一次体重和评判一次关节炎指数。在实验第0天(Day0)首次灌胃前对小鼠采集血样进行第一次流式细胞学检测，另外在实验第6天(Day6)、第15天(Day15)、第16天(Day16，即进行牛II型胶原蛋白免疫后的第二天)，第24天(Day24)和第30天(Day30)采集小鼠血液进行流式细胞学检测。

2.小鼠胶原诱导型关节炎的诱发。

将冻干的II胶原蛋白溶解于0.1mol/L冰乙酸溶液中，浓度为2mg/ml，搅拌并于4℃过夜。将II胶原溶液与等体积的完全弗氏佐剂(Sigma公司,CodeNo.5881)混合，冰浴至完全乳化，用振荡仪涡旋至匀浆。然后选择距离小鼠尾根约1.5cm处进行皮内注射，每只小鼠注射0.2ml(胶原蛋白0.2mg)，注射完毕将C57BL/6小鼠放回饲养笼中，观察活动、摄食、饮水和有无死亡等变化，注射部位皮肤有无破溃感染。

3.小鼠体重及关节炎指数的观察。

从C57BL/6小鼠灌胃前至实验结束，每隔3天(72h)于早晨固定时间点使用同一台电子秤对小鼠进行体重测定，为减少误差，每只小鼠测量3次，计算平均值。同时固定时间点对小鼠双前肢及双后肢进行关节炎指数(AI)评分并分别记录，依据关节表皮颜色、关节肿胀的不同程度及累及关节的数目，每侧肢体的分值从0分至4分，每只小鼠的关节炎指数为四肢评分相加之和，最小0分，最大16分。其评分标准为：0分(正常)、1分(正常，无发红，无肿胀)、2分(足趾、足底皮肤表皮发红，轻度肿胀)、3分(足趾、足背、踝关节皮肤表皮发红，中度肿胀)、4分(足趾、足背、踝关节皮肤表皮明显发红，肢体僵硬)。当一只小鼠的关节炎指数达到4分时，即认为在该只小鼠成功诱发了胶原诱导型关节炎(见图4)。

4.小鼠血液样品采集及流式细胞术分析。

吸取新开封的肝素钠注射液加入灭菌PBS缓冲液中，按照1∶100的体积比进行稀释处理，充分混匀后抽取1mL分装于经过灭菌消毒的1.5mL离心管中，在盖口用记号笔编号后备用。使用下颌静脉采血法(submandibularbloodcollection)对小鼠进行穿刺采血。左手抓取固定小鼠的背部和下颌，使用一次性棉签蘸取75%乙醇消毒C57BL/6小鼠面部皮肤，再用无菌单包装的一次性采血针(5.0mm针头)紧贴小鼠下颌骨后缘垂直于皮面快速进针并迅速移开，若穿刺顺利可以感觉有明显突破感，将小鼠面部与地面成水平位，血液自穿刺部位滴出，第一滴血弃用，自第二滴血开始将血垂直滴入装有稀释肝素的1.5mL离心管中，每次每只采血0.2mL，待采血完毕时用无菌纱布压住出血口10-30s可止血，将小鼠轻放回饲养笼中。关闭离心管盖口，轻弹管壁混匀鼠血，立即裂解红细胞。

将裂解了红细胞的小鼠血液用PBS溶液稀释并分装于流式细胞管中，每管100μL，分别设置空白对照管、同型对照管、单染管、双染管。其中空白对照管不做任何处理，同型对照管分别加入PE-IgG1同型对照10μL(CodeNo.553972)或PE-IgG_2A同型对照10μL(CodeNo.553930)或IgG1同型对照抗体5μL(CodeNo.553923)+FITCAvidin5μL(CodeNo.554057)。单染管中分别加入PE-CD3抗体10μL(CodeNo.553064)或PE-CD19抗体10μL(CodeNo.553786)或CD321抗体10μL(CodeNo.MA1-81733)+FITCAvidin5μL(CodeNo.554057)。双染管中分别加入PE-CD3抗体10μL(CodeNo.553064)+CD321抗体10μL(CodeNo.MA1-81733)+FITCAvidin5μL(CodeNo.554057)或PE-CD19抗体10μL(CodeNo.553786)+CD321抗体10μL(CodeNo.MA1-81733)+FITCAvidin5μL(CodeNo.554057)，除CD321抗体购自Thermo公司外，其余抗体均购自BD公司。加入相应流式细胞术抗体后4℃避光孵育20min后，然后每管加1mlPBS重悬洗涤细胞，300g离心5min；弃上清，500ulPBS重悬后用流式细胞仪检测(BectonDickinson,USA)。检测结果显示，和临床类风湿关节炎病人的检测结果一致，正常对照组(CON)和胶原诱导型关节炎组(CIA)小鼠外周血总淋巴、T淋巴细胞和B淋巴细胞表面的连接黏附分子A的表达量并没有明显的差异(见图5)，而甲氨喋呤治疗关节炎组(MTX+CIA)小鼠外周血总淋巴、T淋巴细胞和B淋巴细胞表面的连接黏附分子A在关节炎发病早期的表达量明显高于胶原诱导型关节炎组(CIA)(见图6)，而此时小鼠的关节炎发病指数明显下降，进一步说明连接黏附分子A的上调表达在治疗关节炎中起着极其重要的作用。

实施例3：JAM-A对淋巴细胞迁移能力的影响。

1.甲氨蝶呤对淋巴细胞连接黏附分子A表达的影响。

选用0.01μg/mL，0.1μg/mL和1μg/mL三种终浓度的甲氨蝶呤处理人外周血淋巴细胞，向96孔细胞培养板的每个孔中接种的淋巴细胞数目为4×10⁴个，在固定间隔的时间点加入40μLCellTiter96^?AQueousOneSolutionCellProliferationAssay(MTS)(Promega公司，CodeNo.G3580)试剂，孵育4小时后用酶标仪测定OD值。结果发现的低浓度的甲氨蝶呤(0.01μg/mL和0.1μg/mL)对淋巴细胞的存活均无明显影响，而高浓度的甲氨蝶呤(1μg/mL)对淋巴细胞的存活有明显的抑制作用(见图7A-C)。

另外收集不同浓度甲氨蝶呤处理5天的淋巴细胞，提取总RNA并使用Takara公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)(Takara公司，CodeNo.DRR047A)试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA。采用如下引物荧光定量PCR分析连接黏附分子A的表达：

Human连接黏附分子A(301-409,109bp)：

Forward:5'-CGGGAAGACACTGGGACATA-3'；

Reverse:5'-CTGTAGGCTTGGATGGAGGC-3'；

Humanβ-actin(939-1143,205bp)：

Forward:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3';

Reverse:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。

扩增程序为94℃预变性3min;94℃30s、58℃45s、72℃2min、36个循环;72℃延伸10min。荧光定量PCR结果显示人淋巴细胞经0.01μg/mL的甲氨蝶呤处理5天后连接黏附分子A基因表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)(见图7D)。流式细胞术分析处理过的细胞同样也说明甲氨蝶呤处理5天后连接黏附分子A基因在总淋巴细胞和T淋巴细胞表面的表达升高(见图8)。

2.淋巴细胞的体外迁移实验。

我们使用AP48-wellBodyenChamber(NeuroScience,USA)对甲氨蝶呤处理后的淋巴细胞(稀释至2000个/50ul)进行细胞迁移实验。首先将细胞外基质(ECM)(Sigma公司，CodeNo.E0282)用RPMI1640培养基稀释至0.01mg/mL，然后涂布至聚碳酸酯膜的一侧表面，另一张则不涂布作为对照。然后在迁移小室的下室加入RPMI1640培养基和终浓度为100ng/mL的人重组SDF-1α蛋白(R&D公司，CodeNo.350-NS)，并铺上聚碳酸酯膜，涂有ECM的一面向下，聚碳酸酯膜与下室的液面间不留气泡，放上胶垫和上层盖板并用螺母与下室固定，并在上层小室中加入淋巴细胞50μL。上层的淋巴细胞包括健康正常人的淋巴细胞(RPMI1640正常培养)、类风湿关节炎病人的淋巴细胞(RPMI1640正常培养)、甲氨蝶呤处理5天的类风湿关节炎病人的淋巴细胞(RPMI1640培养中含有终浓度为0.01μg/mL的甲氨蝶呤)。另外还包括甲氨蝶呤+J10.4处理的类风湿关节炎病人的淋巴细胞，即甲氨蝶呤处理5天的类风湿关节炎病人的淋巴细胞中预留一部分细胞并在进行细胞迁移实验前30min加入终浓度1μg/mL的J10.4(Sigma公司，CodeNo.SAB4200468)抗体。还有甲氨蝶呤+IgG1处理的类风湿关节炎病人的淋巴细胞，即甲氨蝶呤处理5天的类风湿关节炎病人的淋巴细胞中预留一部分细胞并在进行细胞迁移实验前30min加入终浓度1μg/mL的IgG1同型抗体。处理好细胞后置于37℃，5%CO₂孵育4h后轻轻拆开Chamber上层小室，用镊子小心揭下趋化小室聚碳酸酯膜，刮去上层沉积的淋巴细胞、4%的多聚甲醛室温固定30min、Hoechst33342(1:1000，Thermo,USA)室温避光孵育5min后置于荧光显微镜下检测淋巴细胞的迁移率。结果发现，类风湿关节炎患者的淋巴细胞迁移的细胞数高于健康人淋巴细胞的数目(P<0.01)(图9A)，而经过甲氨蝶呤处理后的类风湿关节炎病人的淋巴细胞的迁移低于未处理的类风湿关节炎病人的淋巴细胞(P<0.01)(图9B)。使用连接黏附分子A的特异性抗体J10.4对淋巴细胞膜表面的连接黏附分子A进行封闭后，与未经药物处理而正常培养5天的对照组细胞相比，淋巴细胞的迁移能力并未改变(P>0.05)。说明外周血淋巴细胞膜上连接黏附分子A的表达提高能够有效的抑制免疫淋巴细胞的迁移，减轻类风湿关节炎患者的免疫应答而达到控制类风湿关节炎发病的目的，所以提高连接黏附分子A的表达在类风湿关节炎的治疗中发挥着重要的作用。

Claims (4)

1.连接黏附分子A(JunctionalAdhesionMoleculesA,JAM-A)或连接黏附分子1(JunctionalAdhesionMolecules1,JAM-1)在治疗类风湿关节炎中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述应用为以权利要求1中的基因或者蛋白质作为特异的分子作用靶点的应用。

3.如权利要求1所述的应用，其中所述应用为以权利要求1中的基因或者蛋白质表达上升对类风湿关节炎治疗的应用。

4.如权利要求1-3所述的应用，其特征在于特异作用于连接黏附分子A(JAM-A)以减少免疫淋巴细胞向外周关节组织的迁移到达治疗类风湿关节炎中的应用。