CN108531577A - Jam-a基因或蛋白在治疗类风湿关节炎基因重组药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明鉴定了一种在类风湿关节炎病人外周血淋巴细胞中高表达的连接黏附分子A(JAM‑A),并证实高表达的连接黏附分子A能有效减弱淋巴细胞向外周骨关节的迁移,抑制免疫反应、抑制关节炎症、降低骨质破坏程度,有效缓减RA病情。本发明涉及基因工程、生物技术制药领域的产品,其药物的生产工艺简单,易于扩大规模生产,工艺条件容易控制,生产周期短。主要涉及连接黏附分子A基因或者链接黏附分子A基因所编码的蛋白的应用,更具体的涉及连接粘附分子A基因或者蛋白在制备基因重组类类风湿关节炎药物中的应用。将连接粘附分子A与基因工程载体重组,制备出能提高连接粘附分子A表达的基因重组药物,就能有效的治疗类风湿关节炎的病情,其药物剂型可以是注射剂型或口服型。
Description
技术领域
本发明属于基因工程、生物技术制药领域的产品,主要涉及连接粘附分子A(Junctional Adhesion Molecules A, JAM-A)基因或者蛋白的应用,更具体的涉及连接粘附分子A基因或者蛋白在制备治疗类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)基因重组药物中的应用,即将连接粘附分子A 基因与其他基因载体重组,制备出具有有效控制类风湿关节炎的药物,其药物剂型可以是注射剂型或口服型。
背景技术
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种以慢性滑膜炎症为主要表现,最终导致软骨吸收、骨破坏和骨纤维化的自身免疫功能紊乱疾病,类风湿关节炎在全世界的患病率为0.42-0.54%,在我国25个省的疾病流行病学调查中显示我国的患病率为0.32-0.36%,是引起青壮年劳动力丧失最主要的原因之一。类风湿关节炎具有易复发、难治愈的特点,在关节炎中它是致残率较高的疾病。类风湿关节炎还常常伴有关节外的系统性损害,其病理特征为关节中淋巴细胞、巨噬细胞的浸润增多,滑膜被覆细胞层数和基质成分增多以及新血管翳的形成,主要是细胞免疫调节功能紊乱导致免疫应答反应失衡所引起的,其中T细胞激活是炎症的核心。类风湿关节炎的发生和发展是一个由淋巴系统、多种细胞因子共同参与的自身免疫过程,其发病机制复杂,目前还未能完全明确,也缺乏有效的临床治疗手段。目前临床上治疗类风湿关节炎的常用药物分为四大类,即非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)、免疫抑制剂、糖皮质激素和植物药,如甲氨蝶呤(甲氨蝶呤)、硫唑嘌呤、环磷酰胺等,但是长时间使用这些药物会使较多患者出现不良反应,导致不能耐受而停用。
连接粘附分子A(Junctional Adhesion Molecules A, JAM-A)又称为JAM1,血小板F11受体(platelet F11 receptor),血小板粘附分子(Platelet Adhesion Molecule),主要定位于表皮细胞和内皮细胞的紧密连接(Tight Junction)以及T淋巴细胞、B淋巴细胞等免疫细胞膜上。在血管内皮细胞连接处的连接粘附分子A在维持血管张力,在参与宿主免疫反应、血管生成等反应中起着极其重要的作用。T、B淋巴细胞膜表面的连接粘附分子A蛋白可以通过远膜端的V型免疫球蛋白样功能区域和淋巴细胞功能相关分子(LymphocyteFunction-associated Antigen 1,LFA-1)等蛋白顺式结合,介导淋巴细胞迁移和血小板聚集等功能。连接粘附分子A在多种疾病中出现功能异常后可以使紧密连接的稳定状态发生改变,如参与心血管疾病、乳腺癌、结肠癌等肿瘤疾病、色素膜炎和溃疡性结肠炎等疾病的细胞迁移过程。
类风湿关节炎发病过程中血管内皮细胞之间的紧密连接结构和功能均发生异常改变,导致细胞间的完整性降低,免疫细胞、炎性细胞因子和多种蛋白酶得以容易地穿过内皮细胞屏障进入血管外的细胞外基质,血管内皮细胞紧密连接处连接粘附分子A蛋白表达往往呈下调表达趋势,造成关节的滑膜和软骨出现炎性细胞侵润,最终导致关节骨质破坏和功能残损。本发明分析连接粘附分子A在外周血淋巴细胞上的表达分布,探索外周血淋巴细胞上连接粘附分子A的功能以及对类风湿关节炎发病及治疗的影响,涉及连接粘附分子A基因的新应用,旨在寻找连接粘附分子A在制备类风湿关节炎药物中潜在的价值。
发明内容
本发明提出了类风湿关节炎治疗的新思路,结合类风湿关节炎发病机制基因水平的研究与连接粘附分子A基因所具有的对多组下游基因的调节作用,从而给类风湿关节炎患者带来了治愈的希望。连接粘附分子A基因或连接粘附分子A基因所编码的连接粘附分子A蛋白,属于基因工程、生物技术制药领域的产品,其药物的生产工艺简单,易于扩大规模生产,工艺条件容易控制,生产周期短。
首先,检测到连接粘附分子A蛋白的上调表达有利于减缓类风湿关节炎的病情。对37例健康正常人和48例类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞膜表面的连接粘附分子A表达进行分析,结果显示经过药物治疗的类风湿关节炎患者淋巴细胞膜上表达的连接粘附分子A蛋白比健康人高,而T淋巴细胞上的增高是引起这一现象的原因,与此同时,类风湿关节炎病人的病情因为治疗得到较大的改善。但是未接受规范药物治疗的类风湿关节炎患者的淋巴细胞膜上的连接粘附分子A蛋白与健康人相比,表达水平并无明显改变。提示外周血淋巴细胞膜上的连接粘附分子A的表达升高能减轻类风湿关节炎的发病,提示连接粘附分子A在类风湿关节炎发病中可能起着负调控的作用。
其次,连接粘附分子A的上调表达能减缓淋巴细胞的迁移而减轻类风湿关节炎的发病。采集15例健康正常人的外周血并分离淋巴细胞,采用0.01μg/mL浓度的甲氨蝶呤(0.01μg/mL的甲氨蝶呤能提高连接粘附分子A的表达)处理5天后采用流式细胞术和细胞迁移实验分析连接粘附分子A表达的变化和淋巴细胞迁移能力的变化。结果显示,0.01μg/mL浓度的甲氨蝶呤对人淋巴细胞的连接粘附分子A基因表达和蛋白质表达水平具有上调的作用,而淋巴细胞的迁移能力也随之减弱。采用J10.4 抗体拮抗连接粘附分子A功能后,甲氨蝶呤抑制淋巴细胞迁移的作用被部分抵消,说明高表达的连接粘附分子A能抑制淋巴细胞迁移能力,从而减轻类风湿关节炎的发病,这对类风湿关节炎的治疗有着极其重要的意义。
最后,在小鼠胶原诱导型关节炎模型中抑制连接粘附分子A的功能加强类风湿关节炎的病情发展。将C57BL/6小鼠购回后适应性饲养1周,从尾根部皮内免疫牛II型胶原蛋白建立CIA模型,并设置空白对照组,免疫后的小鼠在第14天后出现关节炎,随机分成三组,第一组为CIA模型组,不做任何治疗;第二组为连接粘附分子A特异抗体J10.4治疗CIA模型组,在CIA发病的高峰时期,即在使用胶原蛋白免疫后20天时,隔日尾静脉注射1mg/kg的J10.4中和抗体,连续注射10天。第三组为IgG阴性对照组,同样隔日尾静脉注射1mg/kg的IgG抗体,连续注射10天。结果显示在整个小鼠类风湿关节炎建模和J10.4治疗的过程中,实验组和对照组在体重上并没有明显的差异,说明在整个建模过程中,小鼠的正常生长活动并没有受到明显的抑制。从临床评分可以看出胶原诱导型关节炎组的小鼠成功的诱发了关节炎。从小鼠的脚踝影像学外观我们也可以看出,胶原诱导型关节炎小鼠关节发生肿胀变形,组织化学HE染色也可以看出,胶原诱导关节炎小鼠脚踝关节内滑膜组织增生和炎症产生。而经过J10.4治疗的胶原诱导型小鼠在整个建模期间,小鼠在发病的恢复期发生延长。从影像学外观也能看出,相对于未用J10.4治疗的小鼠,J10.4治疗的关节炎小鼠关节肿胀程度更高一些,组织化学HE染色也可以看出J10.4治疗的小鼠脚踝关节内滑膜组织增生和炎症比未治疗组更高一些。
附图说明
图1. 连接粘附分子A在健康正常人和类风湿关节炎病人、健康正常人和未接受正规治疗类风湿关节炎病人外周血淋巴细胞膜表面的表达分布。流式细胞术检测结果表明,类风湿关节炎组的总淋巴细胞和T淋巴细胞中分别有12.75%和8.87%的细胞表达连接粘附分子A,而健康正常人的这一数值为5.16%和2.95%,健康正常人和类风湿关节炎病人的连接粘附分子A表达水平差异显著(P<0.01);而两组间B淋巴细胞膜上的连接粘附分子A蛋白表达水平并无明显差异(P>0.05)(图1A)。但是健康正常人和未接受正规治疗的类风湿关节炎患者的总淋巴细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞膜上的连接粘附分子A蛋白与健康对照组相比均无明显变化(P>0.05)(图1C)。为排除流式细胞术分析时由淋巴细胞数目不同而导致的误差,所以对健康对照组和类风湿关节炎组、健康对照组和未接受正规治疗类风湿关节炎病人组的外周血淋巴细胞数目进行比较和统计分析,结果显示健康对照组和类风湿关节炎组、健康对照组和未接受正规治疗类风湿关节炎病人组间的总淋巴细胞数、T淋巴细胞数和B淋巴细胞数间没有差异(P>0.05)(图1B、图1D)。说明流式细胞学方法检测所得的结果真实反映了各组的连接粘附分子A蛋白变化水平,未受淋巴细胞数目的影响。
图2. 常见的类风湿关节炎治疗药物能有效提高连接粘附分子A的表达。流式细胞术检测发现,人淋巴细胞经0.01μg/mL的甲氨蝶呤处理5天后连接粘附分子A基因表达升高,总淋巴细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞中分别有13.59%、3.9%和1.75%的细胞表达连接粘附分子A,而未处理的淋巴细胞的这一数值分别为7.1%、1.97%和0.52%,两组之间的差异有显著统计学意义(P<0.01) (图2A-B)。同样为了排除检测时由于淋巴细胞数目不同而导致的误差,对0.01μg/mL的甲氨蝶呤处理组和对照组淋巴细胞数目进行比较和统计分析发现两组间的总淋巴细胞数、T淋巴细胞数和B淋巴细胞数目间没有差异(P>0.05) (图2C),说明流式细胞术检测的连接粘附分子A的表达差异是真实存在的。荧光实时定量PCR检测也发现,人淋巴细胞经0.01μg/mL的甲氨蝶呤处理5天后连接粘附分子A基因表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05) (图2D)。
图3. 连接粘附分子A的表达升高能有效降低淋巴细胞的迁移能力。接种相同数量的健康正常人和类风湿关节炎病人淋巴细胞经4小时的体外细胞迁移后,结果表明类风湿关节炎患者的淋巴细胞迁移的数目高于健康正常人淋巴细胞的数目,差异有统计学意义(P<0.01) (图3A)。说明淋巴细胞的迁移能力增强是导致类风湿关节炎发病的一个重要原因。另外,经过0.01μg/mL的甲氨蝶呤与类风湿关节炎病人淋巴细胞共同培养5天后进行体外细胞迁移试验,结果发现与对照组相比,甲氨蝶呤处理组能够降低淋巴细胞的迁移能力,差异有统计学意义(P<0.01)(图3B),说明链接粘附分子A的表达升高能有效抑制淋巴细胞的迁移。另外使用连接粘附分子A的特异性抗体J10.4对淋巴细胞膜表面的连接粘附分子A进行封闭。结果显示,与对照IgG处理的淋巴细胞相比,用J10.4抑制连接粘附分子A处理后的细胞体外迁移能力有了显著的升高,差异具有统计学意义(P<0.01)(图3C),而甲氨蝶呤能够有限的抑制由J10.4引起的淋巴细胞迁移(图3D)。说明提高连接粘附分子A的表达可以抑制淋巴细胞向病灶迁移,最终减轻类风湿关节炎的发病。
图4. 抑制连接粘附分子A的功能能明显延长关节炎小鼠的发病,关节肿胀及骨破坏。采用弗氏佐剂和牛II型胶原蛋白乳化混合物免疫小鼠建立胶原诱导型关节炎动物模型,建模期间,随着饲养时间的增加,小鼠体重也随之增加,统计结果显示正常对照组和胶原诱导性关节炎模型组(图4A)、J10.4治疗组和其对照IgG处理组(图4C)之间的小鼠体重呈稳定增长趋势,无明显差异,未观察到腹泻,毛色和精神状态差等不良反应,治疗接近一个月后,体重增长与正常饲养小鼠相当,说明J10.4抑制连接粘附分子A治疗后相对安全,副作用小。从临床观察小鼠的关节炎指数变化分析可以看出,胶原诱导性关节炎模型组小鼠的关节炎肿胀指数一直持续,关节炎评分较高(图4B)。从影像学外观分析可以看出,相对于正常饲养小鼠(图4E),胶原诱导性关节炎模型组小鼠在接受牛II型胶原蛋白免疫后,在第18天观察时间点出现了双侧后足趾和足底皮肤表皮发红,轻度肿胀,严重的可以表现为足趾、足背、踝关节皮肤表皮发红,伴有轻度肿胀的关节炎发病特征,而且随时间增加,小鼠的关节炎指数平均值升高,直至第39天关节炎指数仍然较高,说明小鼠的胶原诱导型关节炎动物模型构建成功(图4F)。同时,组织化学HE染色也可以看出,相对于正常饲养小鼠(图4I),胶原诱导关节炎小鼠脚踝关节内滑膜组织增生和炎症产生(图4J)。而经过J10.4治疗的胶原诱导型小鼠在整个建模期间,小鼠的关节炎肿胀指数在发病的恢复期发生延长(图4D)。从影像学外观也能看出,相对于未用J10.4治疗的小鼠(图4H),J10.4治疗的关节炎小鼠关节肿胀程度更高一些(图4G),组织化学HE染色也可以看出J10.4治疗的小鼠脚踝关节内滑膜组织增生和炎症比未治疗组(图4L)更高一些(图4K),结果显示抑制连接粘附分子A的功能能延缓类风湿关节炎的恢复过程。
具体实施方式
实施例1:JAM-A蛋白在健康人和RA患者外周血淋巴细胞的表达。
1. 血样的采集及分组。
本发明所采集的外周血样在采血前将实验用途告知志愿者和类风湿关节炎患者并签署知情同意书,血样采集和相关实验操作均通过昆明医科大学第一附属医院和云南大学医学院的伦理审查。
本发明采集48例类风湿关节炎患者外周血(类风湿关节炎组,RA),均来自昆明医科大学第一附属医院风湿免疫科。37例健康成年人自愿者外周血(正常组,CON),采自昆明医科大学第一附属医院和云南大学的志愿者。每名患者和自愿者都经过两名风湿免疫科主治医师询问病史并进行专科体检,临床实验室检测类风湿因子和环瓜氨酸肽抗体(ACCP)。摄双手正位X片,经影像科专科医师读片并出具影像报告,综合分析得出临床诊断或者排除类风湿关节炎诊断。48例类风湿关节炎患者中有9例未接受过DMARDs、糖皮质激素或者生物制剂中的任何一种药物治疗,按照美国风湿病学会的标准可认为未接受规范的治疗,被称为未治疗组(Untreated)。
2. 连接粘附分子A蛋白在外周血淋巴细胞的表达分布。
采集好类风湿关节炎患者和志愿者外周血后,采用Ficoll 400 (北京索莱宝科技有限公司,Code No.P8610-200) 试剂密度梯度离心的方法分离类风湿关节炎患者和健康人的外周血单核细胞(PBMC)并分装成空白管、同型对照管、单染管和双染管,每管加入100uL细胞悬液。空白管不做任何处理,同型对照管中加入抗体FITC-IgG1 (CodeNo.555748)或PE-IgG1 (Code No.555749)。单染管加入抗体FITC-CD3 (Code No.555332)或FITC-CD19 (Code No.555412)或PE-CD321 (Code No.552556)。双染管加入FITC-CD3(Code No.555332)+PE-CD321 (Code No.552556)或FITC-CD19 (Code No.555412)+ PE-CD321 (Code No.552556),抗体均购自美国BD公司,每管加抗体10μL。其中CD3检测T淋巴细胞,CD19检测B淋巴细胞,CD321检测淋巴细胞膜上的连接粘附分子A蛋白表达水平,加入相应流式细胞术抗体后4℃避光孵育30min后,每管加1ml PBS重悬洗涤细胞,300g离心5min;弃上清,用500ul PBS重悬后用流式细胞仪检测(Becton Dickinson, USA)。得到的数据采用SPSS 19.0软件进行分析,独立样本间的数据比较使用t检验进行分析,选取P值为0.05,P<0.05 时认为差异有统计学意义,P<0.01 时认为差异有显著统计学意义,分析统计结果见图1。
实施例2:JAM-A的表达对淋巴细胞迁移能力的影响。
1. 常见的类风湿关节炎治疗药物能有效提高连接粘附分子A的表达。
收集0.01μg/mL甲氨蝶呤处理5天的淋巴细胞,提取总RNA并使用Takara公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Takara公司,Code No.DRR047A) 试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA。采用如下引物荧光定量PCR分析连接粘附分子A的表达:
Human 连接粘附分子A (301-409, 109bp):
Forward: 5'- CGGGAAGACACTGGGACATA- 3';
Reverse: 5'-CTGTAGGCTTGGATGGAGGC -3';
Human β-actin(939-1143, 205bp):
Forward: 5'- TGACGTGGACATCCGCAAAG-3';
Reverse:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。
扩增程序为94℃预变性3min; 94℃ 30s、58℃ 45s、72℃ 2min、36个循环; 72℃延伸10min。荧光定量PCR结果显示人淋巴细胞经0.01μg/mL的甲氨蝶呤处理5天后连接粘附分子A基因表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术分析处理的细胞同样说明甲氨蝶呤处理5天后连接粘附分子A基因在总淋巴细胞和T淋巴细胞表面的表达升高(见图2)。
2.淋巴细胞的体外迁移实验。
使用AP48-well Bodyen Chamber (Neuro Science, USA)对甲氨蝶呤处理后的淋巴细胞(稀释至2000个/50ul)进行细胞迁移实验。首先将细胞外基质(ECM)(Sigma公司,Code No.E0282)用RPMI 1640培养基稀释至0.01mg/mL,然后涂布至聚碳酸酯膜的一侧表面。然后在迁移小室的下室加入RPMI 1640培养基和终浓度为100ng/mL的人重组SDF-1α蛋白(R&D公司,Code No.350-NS),并铺上聚碳酸酯膜,涂有ECM的一面向下,聚碳酸酯膜与下室的液面间不留气泡,放上胶垫和上层盖板并用螺母与下室固定,并在上层小室中加入淋巴细胞50μL。上层的淋巴细胞包括健康正常人的淋巴细胞(RPMI 1640正常培养)、类风湿关节炎病人的淋巴细胞(RPMI 1640正常培养)、甲氨蝶呤处理5天的类风湿关节炎病人的淋巴细胞(RPMI 1640培养中含有终浓度为0.01 μg/mL的甲氨蝶呤)。另外还包括甲氨蝶呤+J10.4处理的类风湿关节炎病人的淋巴细胞,即甲氨蝶呤处理5天的类风湿关节炎病人的淋巴细胞中预留一部分细胞并在进行细胞迁移实验前30 min 加入终浓度1µg/mL的J10.4(Sigma公司,Code No. SAB4200468)抗体。还有甲氨蝶呤+Ig G1处理的类风湿关节炎病人的淋巴细胞,即甲氨蝶呤处理5天的类风湿关节炎病人的淋巴细胞中预留一部分细胞并在进行细胞迁移实验前30 min 加入终浓度1µg/mL的IgG1同型抗体。处理好细胞后置于37℃,5% CO2孵育4h后轻轻拆开Chamber上层小室,用镊子小心揭下趋化小室聚碳酸酯膜,刮去上层沉积的淋巴细胞、4%的多聚甲醛室温固定30min、Hoechst33342(1:1000,Thermo, USA)室温避光孵育5min后置于荧光显微镜下检测淋巴细胞的迁移率。结果发现,类风湿关节炎患者的淋巴细胞迁移的细胞数高于健康人淋巴细胞的数目(P<0.01)(图3A),而经过甲氨蝶呤处理后的类风湿关节炎病人的淋巴细胞的迁移低于未处理的类风湿关节炎病人的淋巴细胞(P<0.01)(图3B)。使用连接粘附分子A的特异性抗体J10.4对淋巴细胞膜表面的连接粘附分子A进行封闭后,与未经药物处理而正常培养5天的对照组细胞相比,淋巴细胞的迁移能力并未改变(P>0.05)。说明外周血淋巴细胞膜上连接粘附分子A的表达提高能够有效的抑制免疫淋巴细胞的迁移,减轻类风湿关节炎患者的免疫应答而达到控制类风湿关节炎发病的目的,所以提高连接粘附分子A的表达在类风湿关节炎的治疗中发挥着重要的作用。
实施例3:连接粘附分子A的中和抗体J10.4治疗胶原诱导型关节炎(CIA)小鼠。
1. 实验小鼠分组。
挑选6-8周,体重为22-26g的C57BL/6雌性小鼠(北京维通利华公司,清洁级),尾根部皮内免疫牛II型胶原蛋白建立CIA模型,将小鼠免疫的时间定义为第0天(Day 0)。正常对照组8只(Control group,CON),发病鼠共24只,随机分成三组,第一组为CIA模型组,不做任何治疗;第二组为连接粘附分子A特异抗体J10.4治疗CIA模型组,在CIA发病的高峰时期,即在使用胶原蛋白免疫后20天时,隔日尾静脉注射1mg/kg的J10.4中和抗体,连续注射10天。第三组为IgG阴性对照组,免疫时间与J10.4时间同步,计量为1mg/kg。
2. 小鼠胶原诱导型关节炎的诱发。
将冻干的牛II型胶原蛋白溶解于0.1mol/L冰乙酸溶液中,浓度为2mg/ml,搅拌并于4℃过夜。将II胶原溶液与等体积的完全弗氏佐剂(Sigma公司, Code No.5881)混合,冰浴至完全乳化,用振荡仪涡旋至匀浆。然后选择距离小鼠尾根约1.5cm处进行皮内注射,每只小鼠注射0.2ml(胶原蛋白0.2mg ),注射完毕将C57BL/6小鼠放回饲养笼中,观察活动、摄食、饮水和有无死亡等变化,注射部位皮肤有无破溃感染。
3. 小鼠体重及关节炎指数的观察。
从C57BL/6小鼠灌胃前至实验结束,每隔3天(72 h)于早晨固定时间点使用同一台电子秤对小鼠进行体重测定,为减少误差,每只小鼠测量3次,计算平均值。同时固定时间点对小鼠双前肢及双后肢进行关节炎指数(AI)评分并分别记录,依据关节表皮颜色、关节肿胀的不同程度及累及关节的数目,每侧肢体的分值从0分至4分,每只小鼠的关节炎指数为四肢评分相加之和,最小0分,最大16分。其评分标准为:0分(无红肿)、1分(脚趾发红及轻度肿胀)、2分(脚趾至踝关节发红及轻度肿胀)、3分(踝关节及足底发红及中度肿胀)、4分(踝关节及肢体发红伴重度肿胀)。当一只小鼠的关节炎指数达到4分时,即认为在该只小鼠成功诱发了胶原诱导型关节炎(见图4)。
4. 小鼠关节的组织化学HE染色观察。
在Day35天时处死每一个实验组中一只小鼠,取下四肢,浸入10% PFA中固定48h,再浸入脱钙液中脱钙10-15天,经过乙醇由低浓度到高浓度逐级脱水,即70%乙醇过夜,80%乙醇过夜,95%乙醇两次各2h,100%乙醇两次各1.5h,然后二甲苯两次各40min,最后通过58-60℃浸蜡并包埋标本,并于石蜡切片机切片,厚度为5-10μm,贴于载玻片上。将标本置于65℃烘箱烤片30min,浸入二甲苯中15min,换成新的二甲苯浸泡10min,然后从高浓度的乙醇到低浓度的乙醇进行逐级复水,依次选择100%乙醇浸泡5min,95%乙醇浸泡2min,80%乙醇浸泡2min,70%乙醇2min。自来水冲洗后将切片放入苏木素溶液中染色20min,自来水冲洗返篮1-2h。然后用1%伊红染色20s,依次经过95%乙醇2min,100%乙醇2min脱水。玻片风干后,盖上盖玻片封片,并置于倒置显微镜下观察关节腔和关节连接部位的组织和细胞形态,拍照。
Claims (3)
1.连接黏附分子A(Junctional Adhesion Molecules A, JAM-A)基因或连接黏附分子1(Junctional Adhesion Molecules 1, JAM-1)蛋白在制备治疗类风湿关节炎基因重组药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于:特异提高连接黏附分子A(JAM-A)基因或者蛋白的表达,抑制外周血免疫淋巴细胞向外周关节组织的迁移。
3.如权利要求1所述的应用,其基因工程类药物剂型是注射剂型或口服型。
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