JP2019513736A - Bckdhを調整する方法 - Google Patents
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Abstract
レプチンレベルを増加させるのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤。本発明はまた、満腹感をサポートするため、及び体重維持をサポートし、かつ/又は肥満を治療若しくは予防するための、そのような作用剤の使用にも関する。【選択図】 なし
Description
本発明は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を調整する(modulate)ことができる作用剤、及び特にレプチンレベルを増加させるのに使用するための、治療におけるそのような作用剤の使用に関する。本発明はまた、満腹感をサポートするため、及び体重維持をサポートし肥満を治療するための、そのような作用剤の使用に関する。本発明はまた、このような作用剤を特定する方法にも関する。
[背景技術]
肥満は、世界の多くの地域で流行の域に達している慢性の代謝障害である。肥満は、2型糖尿病、心臓血管疾患、脂質異常症、及びある特定の種類のがんなどの重篤な共存症の主要な危険因子である(World Health Organ Tech Rep Ser.(2000)894:i〜xii、1〜253)。
肥満は、世界の多くの地域で流行の域に達している慢性の代謝障害である。肥満は、2型糖尿病、心臓血管疾患、脂質異常症、及びある特定の種類のがんなどの重篤な共存症の主要な危険因子である(World Health Organ Tech Rep Ser.(2000)894:i〜xii、1〜253)。
肥満は、炭水化物、脂肪などからのエネルギーが過剰に蓄積された結果として、個体の体重が通常より重い状態を指す。余分な体重は、通常、皮下又は内臓周囲に脂肪の形態で保持される。
経験的データによれば、初期体重の少なくとも10%の減量(weight loss)が、肥満関連共存症のリスクを大幅に低下させることが示唆されている(World Health Organ.Tech.Rep.Ser.(2000)894:i〜xii,1〜253)。しかし、減量能力は対象間で大きく異なる。
エネルギー摂取量がエネルギー消費量を超える場合に肥満は誘発される。したがって、肥満を改善するために、脂肪、炭水化物などからのエネルギー摂取量を減少させる方法、又は生体内の代謝を促進することによってエネルギー消費量を増加させる方法が望まれる。そのため、食習慣及び運動の改善は、肥満及び肥満関連障害の予防及び改善のための有効な方法であると考えられる。例えば、低カロリー食(LCD)介入は減量に非常に有効であり得るものであり、概して、この減量に伴って肥満関連共存症、特に2型糖尿病のリスクが改善すると長い間認識されてきた(World Health Organ.Tech.Rep.Ser.(2000)894:i〜xii,1〜253)。
減量を促進するための数多くの方法が知られているが、減量介入期間が終了したら、対象は減少した体重がリバウンドするというリスクに直面する。そのような後退により、減量に関連した利益が減少する、又は潜在的には完全に元に戻る危険性がある。
したがって、減量を促進する改善された方法だけでなく、体重維持をサポートする(減少した体重がリバウンドするのを防止又は抑制する、したがって、減量介入後に達成されたものと同様のレベルに体重を維持するのをサポートする)ための方法が、依然として大いに必要とされている。このような改善により、肥満のための治療はより完全なものとなり、よって肥満関連障害のリスクは減少するであろう。特に、減少した体重がリバウンドするリスクを低下させるために、減量後の期間にうまく適用することができる方法が必要である。
レプチンは一般に、食欲抑制及び調節に関連すると理解されている。本出願の発明者らは、驚くべきことに、レプチン発現レベルとBCKDHB遺伝子の制御領域との間の関連を認めた。
[発明の概要]
本発明者らは、Diogenes研究から得られた減量介入データに対して、タンパク質の量的形質遺伝子座(pQTL)の解析を行った。この研究は、全ヨーロッパの無作為化対照食事介入研究であり、8つのヨーロッパの施設で肥満及び過体重の家族において減量及び体重維持に対する食事タンパク質及びグリセミックインデックスの影響を調査している(Larsenら(2009)Obesity Rev.11:76〜91)。簡潔に述べると、Diogenes研究では、スクリーニングした参加者に低カロリー食(LCD)期間(CID1)を設け、この期間では、過体重/肥満対象には8週間のModifast(登録商標)食(約800kCal/日)を遵守させ、次に体重維持期間(CID2)を続けた。
本発明者らは、Diogenes研究から得られた減量介入データに対して、タンパク質の量的形質遺伝子座(pQTL)の解析を行った。この研究は、全ヨーロッパの無作為化対照食事介入研究であり、8つのヨーロッパの施設で肥満及び過体重の家族において減量及び体重維持に対する食事タンパク質及びグリセミックインデックスの影響を調査している(Larsenら(2009)Obesity Rev.11:76〜91)。簡潔に述べると、Diogenes研究では、スクリーニングした参加者に低カロリー食(LCD)期間(CID1)を設け、この期間では、過体重/肥満対象には8週間のModifast(登録商標)食(約800kCal/日)を遵守させ、次に体重維持期間(CID2)を続けた。
本発明の状況において、pQTLは、LCD期間中のタンパク質レベルの変化に関与するゲノム遺伝子座である。本発明者らは、減量と相関する発現変化を示すタンパク質と関連するpQTLを詳細に解析した。
本発明者らは、減量と顕著に関連する、LCD期間中のレプチンの示差的発現を観察した。この発見は、レプチンが食欲抑制及び調節に関連するという当分野における認識と相関する。本発明者らはまた、レプチンの示差的発現と関連する最も好適なpQTLが、BCKDHB遺伝子の制御領域内に位置することを認めた。
BCKDHBは、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼE1 Bサブユニットをコードしており、このサブユニットは、分岐鎖アミノ酸(BCAA)ロイシン、イソロイシン及びバリンの分解に関与する酵素複合体の一部である。BCAA自体が食欲抑制と関連していることから、BCKDHBと食欲抑制及び調節との間に2つの独立した関連が立証されている。
したがって、本発明者らは、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)と食欲抑制及び調節との間の有意な関係を立証し、よって体重維持及び肥満の治療をサポートするための新しい介入を提供する。
したがって、一態様において本発明は、レプチンのレベルを増加させるのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤を提供する。
別の態様では、本発明は、対象の食欲を抑制するのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤を提供する。別の態様では、本発明は、満腹感をサポートする又は持続させるのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤を提供する。別の態様では、本発明は、対象の食物摂取を減少させるのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤を提供する。別の態様では、本発明は、対象における脂肪沈着を減少させるのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤を提供する。
別の態様では、本発明は、体重維持をサポートするための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。別の態様では、本発明は、肥満を治療又は予防するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。別の態様では、本発明は、対象の食欲を抑制するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。別の態様では、本発明は、満腹感を持続させるための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。別の態様では、本発明は、対象の食物摂取を減少させるための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。別の態様では、本発明は、対象における脂肪沈着を減少させるための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の作用剤を、体重維持をサポートする必要がある対象に投与することを含む、体重維持をサポートする方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の作用剤を、食欲を抑制する必要がある対象に投与することを含む、対象の食欲を抑制する方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の作用剤を、満腹感を持続させる必要がある対象に投与することを含む、満腹感を持続させる方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の作用剤を、食物摂取を減少させる必要のある対象に投与することを含む、対象の食物摂取を減少させる方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の作用剤を、脂肪沈着を減少させる必要がある対象に投与することを含む、対象における脂肪沈着を減少させる方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の作用剤を、肥満を治療又は予防する必要がある対象に投与することを含む、肥満を治療又は予防する方法を提供する。
一実施形態では、作用剤は、BCKDH E1 Bサブユニットの活性を増加させる。
BCKDH及び/又はBCKDH E1 Bサブユニットの活性は、本発明の作用剤の非存在下での活性と比較して増加し得る。BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)の活性は、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、50%、75%、100%又はそれ以上増加し得る。
BCKDH活性(特にBCKDH E1 Bサブユニット)は、例えば、BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)に対してアゴニスト作用を示す、又は細胞においてBCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)のレベルを増加させる、作用剤の使用によって増加させてもよい。
一実施形態では、作用剤は満腹感を増大又は持続させる。別の実施形態では、作用剤は対象の食物摂取を減少させる。別の実施形態では、作用剤は対象における脂肪沈着を減少させる。
一実施形態では、作用剤は、減量介入中又はその後に、好ましくは減量介入後に対象に投与される。減量介入は、例えば、食事療法(例えば低カロリー食)及び/又は運動療法であってもよい。
一実施形態では、作用剤は対象においてBCKDHのレベルを増加させる。好ましくは、作用剤は対象においてBCKDH E1 Bサブユニットのレベルを増加させる。これに関連して、「レベル」は、BCKDH又はBCKDH E1 Bサブユニットの量を指し、例えば、発現されたタンパク質の量を分析することによって、及び/又は対応するmRNAの存在量を分析することによって測定することができる。好ましくは、作用剤は、BCKDH及び/又はBCKDH E1 Bサブユニットの発現を増加させる。
例えば、BCKDH(特にBCKDH E1 B及び/又はAサブユニット)をコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入して、コードされたポリペプチドを細胞に発現させてもよい。したがって、本発明の作用剤は、BCKDH(特にBCKDH E1 B及び/又はAサブユニット)をコードするポリヌクレオチドの形態であってもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターなどのベクターの形態である。
BCKDH及び/又はBCKDH E1 Bサブユニットのレベルは、本発明の作用剤の非存在下でのレベルと比較して増加し得る。BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)のレベルは、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、50%、75%、100%又はそれ以上増加し得る。
一実施形態では、作用剤は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDHキナーゼ)の活性に影響を及ぼさない。一実施形態では、作用剤はフェノフィブラートではない。
一実施形態では、作用剤は、レスベラトロール若しくはバルプロ酸、又は植物生理活性物質から選択される。一実施形態では、作用剤は、表1aに記載された作用剤から選択される。一実施形態では、作用剤は2,4−ジニトロトルエンである。一実施形態では、作用剤は塩化アンモニウムである。一実施形態では、作用剤はベンゾ(a)ピレンである。一実施形態では、作用剤はクプリゾンである。一実施形態では、作用剤はジエチルニトロソアミンである。一実施形態では、作用剤は塩化メチル水銀である。一実施形態では、作用剤はピリニクス酸(pirinixic acid)である。一実施形態では、作用剤はクロム(VI)酸カリウムである。一実施形態では、作用剤はテトラクロロジベンゾダイオキシンである。一実施形態では、作用剤は、表1bに記載された作用剤から選択される。一実施形態では、作用剤は1,12−ベンゾペリレンである。一実施形態では、作用剤は、17−エチニル−5−アンドロステン−3,7,17−トリオール(17−ethynyl−5−androstene−3,7,17−triol)である。一実施形態では、作用剤は2,4−ジニトロトルエンである。一実施形態では、作用剤はアセトアミノフェンである。一実施形態では、作用剤はアミオダロンである。一実施形態では、作用剤は塩化アンモニウムである。一実施形態では、作用剤はアトラジンである。一実施形態では、作用剤はビスフェノールAである。一実施形態では、作用剤はカルバマゼピンである。一実施形態では、作用剤は四塩化炭素である。一実施形態では、作用剤はクロロプレンである。一実施形態では、作用剤はクロフィブラートである。一実施形態では、作用剤はエチニルエストラジオールである。一実施形態では、作用剤はフルオロウラシルである。一実施形態では、作用剤はフランである。一実施形態では、作用剤はケタミンである。一実施形態では、作用剤はピリニクス酸である。一実施形態では、作用剤はストレプトゾシンである。一実施形態では、作用剤はテトラサイクリンである。一実施形態では、作用剤はトポテカンである。一実施形態では、作用剤はツニカマイシンである。一実施形態では、作用剤はバンコマイシンである。一実施形態では、作用剤はビンクロゾリンである。
一実施形態では、作用剤は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDHキナーゼ)の活性を減少させる。
BCKDHキナーゼの活性は、本発明の作用剤の非存在下での活性と比較して減少し得る。BCKDHキナーゼの活性は、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、50%、75%、又は100%減少し得る。
作用剤は、例えば、BCKDHキナーゼ拮抗剤又は阻害剤であってもよい。好ましくは、作用剤は、siRNA、shRNA、miRNA、アンチセンスRNA、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子からなる群から選択される。ポリペプチドは、例えば抗体であってもよい。したがって、本発明の作用剤は、BCKDHキナーゼを標的とするsiRNA、shRNA、miRNA若しくはアンチセンスRNAをコードするポリヌクレオチド、又はポリペプチド(例えば抗体)の形態であってもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターなどのベクターの形態である。
一実施形態では、作用剤はBCKDHキナーゼのレベルを減少させる。これに関連して、「レベル」は、BCKDHキナーゼの量を指し、例えば、発現されたタンパク質の量を分析することによって、及び/又は対応するmRNAの存在量を分析することによって測定することができる。好ましくは、作用剤はBCKDHキナーゼの発現を減少させる。例えば、siRNA、shRNA、miRNA又はアンチセンスRNAは、BCKDHキナーゼの発現を低減させ得る。
BCKDHキナーゼのレベルは、本発明の作用剤の非存在下でのレベルと比較して減少し得る。BCKDHキナーゼのレベルは、例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、50%、75%、又は100%減少し得る。
一実施形態では、作用剤は、α−クロロイソカプロン酸若しくはα−ケトイソカプロン酸(KIC)であるか、又は表2に記載された作用剤から選択される。
本発明の作用剤は、本発明の方法によって特定された作用剤であってもよい。
別の態様では、本発明は、対象において体重維持をサポートすること、及び/又は肥満を治療若しくは予防することができる作用剤を特定する方法であって、
(a)分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)候補作用剤が、BCKDHポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
(a)分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)候補作用剤が、BCKDHポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
BCKDHポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性は、候補作用剤の存在下及び非存在下(すなわち対照実験)でのBCKDHポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性を比較することによって、分析することができる。
一実施形態では、BCKDHはBCKDH E1 Bサブユニットである。
一実施形態では、方法は、BCKDHを含む製剤を候補作用剤と接触させること、及びNAD+からNADHへの変換を測定すること、を含む。NAD+からNADHへの変換は、分光光度法により分析することができる。
別の態様では、本発明は、対象において体重維持をサポートすること、及び/又は肥満を治療若しくは予防することができる作用剤を特定する方法であって、
(a)分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDHキナーゼ)ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)候補作用剤が、BCKDHキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
(a)分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDHキナーゼ)ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)候補作用剤が、BCKDHキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
BCKDHキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性は、候補作用剤の存在下及び非存在下(すなわち対照実験)でのBCKDHキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性を比較することによって、分析することができる。
一実施形態では、方法は、ATPの存在下で、BCKDHキナーゼを含む製剤を候補作用剤と接触させること、及び基質中へのリン酸の取り込みを測定すること、又はATPからADPへの変換を測定すること、を含む。
別の態様では、本発明は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させる作用剤を特定する方法であって、
(a)BCKDHポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)候補作用剤が、BCKDHポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
(a)BCKDHポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)候補作用剤が、BCKDHポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
一実施形態では、BCKDHはBCKDH E1 Bサブユニットである。
一実施形態では、方法は、BCKDHを含む製剤を候補作用剤と接触させること、及びNAD+からNADHへの変換を測定すること、を含む。NAD+からNADHへの変換は、分光光度法により分析することができる。
別の態様では、本発明は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDHキナーゼ)の活性を減少させる作用剤を特定する方法であって、
(a)BCKDHキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)候補作用剤が、BCKDHキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
(a)BCKDHキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)候補作用剤が、BCKDHキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
一実施形態では、方法は、ATPの存在下で、BCKDHキナーゼを含む製剤を候補作用剤と接触させること、及び基質中へのリン酸の取り込みを測定すること、又はATPからADPへの変換を測定すること、を含む。
別の態様では、本発明は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)、好ましくはBCKDH E1 Bサブユニットの発現又はプロセシングを増加させる作用剤を特定する方法であって、
(a)細胞、好ましくはBCKDHを発現している細胞を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)候補作用剤がBCKDHの発現又はプロセシングを増加させるかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
(a)細胞、好ましくはBCKDHを発現している細胞を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)候補作用剤がBCKDHの発現又はプロセシングを増加させるかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDHキナーゼ)の発現又はプロセシングを減少させる作用剤を特定する方法であって、
(a)BCKDHキナーゼを発現している細胞を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)候補作用剤がBCKDHキナーゼの発現又はプロセシングを減少させるかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
(a)BCKDHキナーゼを発現している細胞を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)候補作用剤がBCKDHキナーゼの発現又はプロセシングを減少させるかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
本発明の方法は、対象の食欲を抑制することができる作用剤を特定するための、満腹感を増大又は持続させるための、対象の食物摂取を減少させるための、及び/又は対象における脂肪沈着を減少させるための、方法であってもよい。
別の態様では、本発明は、体重維持をサポートする、対象の食欲を抑制する、満腹感を増大若しくは持続させる、対象の食物摂取量を減少させる、対象における脂肪沈着を減少させる、かつ/又は肥満を治療若しくは予防する作用剤を特定する方法における、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)、特にBCKDH E1 Bサブユニット、若しくはBCKDHキナーゼ、又は前述のものをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
別の態様では、本発明は、体重維持をサポートする、対象の食欲を抑制する、満腹感を増大若しくは持続させる、対象の食物摂取を減少させる、対象における脂肪沈着を減少させる、かつ/又は肥満を治療若しくは予防するのに使用するための医薬を製造するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。
[発明を実施するための形態]
本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例によって記述する。
本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例によって記述する。
本発明の実施は、特に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、微生物学、及び免疫学の従来技術を使用する。このような技術は文献で説明されている。例えば、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel,F.M.et al.(1995 and periodic supplements)Current Protocols in Molecular Biology,Ch.9,13 and 16,John Wiley & Sons;Roe,B.,Crabtree,J.and Kahn,A.(1996)DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley & Sons;Polak,J.M.and McGee,J.O’D.(1990)In Situ Hybridization:Principles and Practice,Oxford University Press;Gait,M.J.(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press、並びに、Lilley,D.M.及びDahlberg,J.E.(1992)Methods in Enzymology:DNA Structures Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA,Academic Pressを参照のこと。これらの一般的なテキストの各々は、本明細書に参照により組み込まれる。
分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)
分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)は、分岐鎖アミノ酸(BCAA)バリン、ロイシン及びイソロイシンの異化作用において重要な役割を果たす、ミトコンドリア内膜上に位置するタンパク質複合体である。BCAA異化作用において、BCKDH複合体は、異化経路全体における律速段階である分岐鎖α−ケト酸の酸化的脱炭酸を触媒する。
分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)は、分岐鎖アミノ酸(BCAA)バリン、ロイシン及びイソロイシンの異化作用において重要な役割を果たす、ミトコンドリア内膜上に位置するタンパク質複合体である。BCAA異化作用において、BCKDH複合体は、異化経路全体における律速段階である分岐鎖α−ケト酸の酸化的脱炭酸を触媒する。
BCKDH複合体は、以下の3つのサブユニットからなる。
1.分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を示すE1サブユニット(EC1.2.4.4)。E1サブユニットは、BCKDHA及びBCKDHB遺伝子によってコードされるA鎖及びB鎖(それぞれα及びβとしても知られる)で構成される。
2.リポアミドアシルトランスフェラーゼ活性を示すE2サブユニット(EC 2.3.1.168)、及び
3.リポアミドデヒドロゲナーゼ活性を示すE3サブユニット(EC 1.8.1.4)。
2.リポアミドアシルトランスフェラーゼ活性を示すE2サブユニット(EC 2.3.1.168)、及び
3.リポアミドデヒドロゲナーゼ活性を示すE3サブユニット(EC 1.8.1.4)。
E2サブユニットは、BCKDH複合体のコアとして働き、八面体対称の24個の複製物として又は二十面体対称の60個の複製物として見出される。サブユニットE1及びE3は非共有結合を介してE2に結合し、それぞれ複数の複製物を有する。
BCKDH複合体中の変異、特にE1 Bサブユニット中に位置する変異は、メープルシロップ尿症(MSUP;Avarsson,A.et al.(2000)Structure 8:277〜291)を含めヒトにおける多くの障害に関連している。
一実施形態では、BCKDHはヒトBCKDHである。
BCKDH E1 Bサブユニットのアミノ酸配列の例は、NCBIアクセッション番号NP_000047.1で寄託された配列である。
BCKDH E1 Bサブユニットのアミノ酸配列の例は以下である:
MAVVAAAAGWLLRLRAAGAEGHWRRLPGAGLARGFLHPAATVEDAAQRRQVAHFTFQPDPEPREYGQTQKMNLFQSVTSALDNSLAKDPTAVIFGEDVAFGGVFRCTVGLRDKYGKDRVFNTPLCEQGIVGFGIGIAVTGATAIAEIQFADYIFPAFDQIVNEAAKYRYRSGDLFNCGSLTIRSPWGCVGHGALYHSQSPEAFFAHCPGIKVVIPRSPFQAKGLLLSCIEDKNPCIFFEPKILYRAAAEEVPIEPYNIPLSQAEVIQEGSDVTLVAWGTQVHVIREVASMAKEKLGVSCEVIDLRTIIPWDVDTICKSVIKTGRLLISHEAPLTGGFASEISSTVQEECFLNLEAPISRVCGYDTPFPHIFEPFYIPDKWKCYDALRKMINY
(配列番号1)
MAVVAAAAGWLLRLRAAGAEGHWRRLPGAGLARGFLHPAATVEDAAQRRQVAHFTFQPDPEPREYGQTQKMNLFQSVTSALDNSLAKDPTAVIFGEDVAFGGVFRCTVGLRDKYGKDRVFNTPLCEQGIVGFGIGIAVTGATAIAEIQFADYIFPAFDQIVNEAAKYRYRSGDLFNCGSLTIRSPWGCVGHGALYHSQSPEAFFAHCPGIKVVIPRSPFQAKGLLLSCIEDKNPCIFFEPKILYRAAAEEVPIEPYNIPLSQAEVIQEGSDVTLVAWGTQVHVIREVASMAKEKLGVSCEVIDLRTIIPWDVDTICKSVIKTGRLLISHEAPLTGGFASEISSTVQEECFLNLEAPISRVCGYDTPFPHIFEPFYIPDKWKCYDALRKMINY
(配列番号1)
BCKDH E1 Bサブユニットをコードするヌクレオチド配列の例は、NCBIアクセッション番号NM_000056.4で寄託された配列である。
BCKDH E1 Bサブユニットをコードするヌクレオチド配列の例は以下である:
ATGGCGGTTGTAGCGGCGGCTGCCGGCTGGCTACTCAGGCTCAGGGCGGCAGGGGCTGAGGGGCACTGGCGTCGGCTTCCTGGCGCGGGGCTGGCGCGGGGCTTTTTGCACCCCGCCGCGACTGTCGAGGATGCGGCCCAGAGGCGGCAGGTGGCTCATTTTACTTTCCAGCCAGATCCGGAGCCCCGGGAGTACGGGCAAACTCAGAAAATGAATCTTTTCCAGTCTGTAACAAGTGCCTTGGATAACTCATTGGCCAAAGATCCTACTGCAGTAATATTTGGTGAAGATGTTGCCTTTGGTGGAGTCTTTAGATGCACTGTTGGCTTGCGAGACAAATATGGAAAAGATAGAGTTTTTAATACCCCATTGTGTGAACAAGGAATTGTTGGATTTGGAATCGGAATTGCGGTCACTGGAGCTACTGCCATTGCGGAAATTCAGTTTGCAGATTATATTTTCCCTGCATTTGATCAGATTGTTAATGAAGCTGCCAAGTATCGCTATCGCTCTGGGGATCTTTTTAACTGTGGAAGCCTCACTATCCGGTCCCCTTGGGGCTGTGTTGGTCATGGGGCTCTCTATCATTCTCAGAGTCCTGAAGCATTTTTTGCCCATTGCCCAGGAATCAAGGTGGTTATACCCAGAAGCCCTTTCCAGGCCAAAGGACTTCTTTTGTCATGCATAGAGGATAAAAATCCTTGTATATTTTTTGAACCTAAAATACTTTACAGGGCAGCAGCGGAAGAAGTCCCTATAGAACCATACAACATCCCACTGTCCCAGGCCGAAGTCATACAGGAAGGGAGTGATGTTACTCTAGTTGCCTGGGGCACTCAGGTTCATGTGATCCGAGAGGTAGCTTCCATGGCAAAAGAAAAGCTTGGAGTGTCTTGTGAAGTCATTGATCTGAGGACTATAATACCTTGGGATGTGGACACAATTTGTAAGTCTGTGATCAAAACAGGGCGACTGCTAATCAGTCACGAGGCTCCCTTGACAGGCGGCTTTGCATCGGAAATCAGCTCTACAGTTCAGGAGGAATGTTTCTTGAACCTAGAGGCTCCTATATCAAGAGTATGTGGTTATGACACACCATTTCCTCACATTTTTGAACCATTCTACATCCCAGACAAATGGAAGTGTTATGATGCCCTTCGAAAAATGATCAACTATTGA
(配列番号2)
ATGGCGGTTGTAGCGGCGGCTGCCGGCTGGCTACTCAGGCTCAGGGCGGCAGGGGCTGAGGGGCACTGGCGTCGGCTTCCTGGCGCGGGGCTGGCGCGGGGCTTTTTGCACCCCGCCGCGACTGTCGAGGATGCGGCCCAGAGGCGGCAGGTGGCTCATTTTACTTTCCAGCCAGATCCGGAGCCCCGGGAGTACGGGCAAACTCAGAAAATGAATCTTTTCCAGTCTGTAACAAGTGCCTTGGATAACTCATTGGCCAAAGATCCTACTGCAGTAATATTTGGTGAAGATGTTGCCTTTGGTGGAGTCTTTAGATGCACTGTTGGCTTGCGAGACAAATATGGAAAAGATAGAGTTTTTAATACCCCATTGTGTGAACAAGGAATTGTTGGATTTGGAATCGGAATTGCGGTCACTGGAGCTACTGCCATTGCGGAAATTCAGTTTGCAGATTATATTTTCCCTGCATTTGATCAGATTGTTAATGAAGCTGCCAAGTATCGCTATCGCTCTGGGGATCTTTTTAACTGTGGAAGCCTCACTATCCGGTCCCCTTGGGGCTGTGTTGGTCATGGGGCTCTCTATCATTCTCAGAGTCCTGAAGCATTTTTTGCCCATTGCCCAGGAATCAAGGTGGTTATACCCAGAAGCCCTTTCCAGGCCAAAGGACTTCTTTTGTCATGCATAGAGGATAAAAATCCTTGTATATTTTTTGAACCTAAAATACTTTACAGGGCAGCAGCGGAAGAAGTCCCTATAGAACCATACAACATCCCACTGTCCCAGGCCGAAGTCATACAGGAAGGGAGTGATGTTACTCTAGTTGCCTGGGGCACTCAGGTTCATGTGATCCGAGAGGTAGCTTCCATGGCAAAAGAAAAGCTTGGAGTGTCTTGTGAAGTCATTGATCTGAGGACTATAATACCTTGGGATGTGGACACAATTTGTAAGTCTGTGATCAAAACAGGGCGACTGCTAATCAGTCACGAGGCTCCCTTGACAGGCGGCTTTGCATCGGAAATCAGCTCTACAGTTCAGGAGGAATGTTTCTTGAACCTAGAGGCTCCTATATCAAGAGTATGTGGTTATGACACACCATTTCCTCACATTTTTGAACCATTCTACATCCCAGACAAATGGAAGTGTTATGATGCCCTTCGAAAAATGATCAACTATTGA
(配列番号2)
一実施形態では、BCKDH E1 Bサブユニットは、配列番号1に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはこのアミノ酸配列は、配列番号1で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
一実施形態では、BCKDH E1 Bサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号2に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくはこのヌクレオチド配列にコードされるタンパク質は、配列番号1で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
一実施形態では、BCKDH E1 Bサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号1に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくはこのアミノ酸配列は、配列番号1で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
BCKDH E1 Aサブユニットのアミノ酸配列の例は、NCBIアクセッション番号NP_000700.1で寄託された配列である。
BCKDH E1 Aサブユニットのアミノ酸配列の例は以下である:
MAVAIAAARVWRLNRGLSQAALLLLRQPGARGLARSHPPRQQQQFSSLDDKPQFPGASAEFIDKLEFIQPNVISGIPIYRVMDRQGQIINPSEDPHLPKEKVLKLYKSMTLLNTMDRILYESQRQGRISFYMTNYGEEGTHVGSAAALDNTDLVFGQYREAGVLMYRDYPLELFMAQCYGNISDLGKGRQMPVHYGCKERHFVTISSPLATQIPQAVGAAYAAKRANANRVVICYFGEGAASEGDAHAGFNFAATLECPIIFFCRNNGYAISTPTSEQYRGDGIAARGPGYGIMSIRVDGNDVFAVYNATKEARRRAVAENQPFLIEAMTYRIGHHSTSDDSSAYRSVDEVNYWDKQDHPISRLRHYLLSQGWWDEEQEKAWRKQSRRKVMEAFEQAERKPKPNPNLLFSDVYQEMPAQLRKQQESLARHLQTYGEHYPLDHFDK
(配列番号3)
MAVAIAAARVWRLNRGLSQAALLLLRQPGARGLARSHPPRQQQQFSSLDDKPQFPGASAEFIDKLEFIQPNVISGIPIYRVMDRQGQIINPSEDPHLPKEKVLKLYKSMTLLNTMDRILYESQRQGRISFYMTNYGEEGTHVGSAAALDNTDLVFGQYREAGVLMYRDYPLELFMAQCYGNISDLGKGRQMPVHYGCKERHFVTISSPLATQIPQAVGAAYAAKRANANRVVICYFGEGAASEGDAHAGFNFAATLECPIIFFCRNNGYAISTPTSEQYRGDGIAARGPGYGIMSIRVDGNDVFAVYNATKEARRRAVAENQPFLIEAMTYRIGHHSTSDDSSAYRSVDEVNYWDKQDHPISRLRHYLLSQGWWDEEQEKAWRKQSRRKVMEAFEQAERKPKPNPNLLFSDVYQEMPAQLRKQQESLARHLQTYGEHYPLDHFDK
(配列番号3)
BCKDH E1 Aサブユニットをコードするヌクレオチド配列の例は、NCBIアクセッション番号NM_000709.3で寄託された配列である。
BCKDH E1 Aサブユニットをコードするヌクレオチド配列の例は以下である:
ATGGCGGTAGCGATCGCTGCAGCGAGGGTCTGGCGGCTAAACCGTGGTTTGAGCCAGGCTGCCCTCCTGCTGCTGCGGCAGCCTGGGGCTCGGGGACTGGCTAGATCTCACCCCCCCAGGCAGCAGCAGCAGTTTTCATCTCTGGATGACAAGCCCCAGTTCCCAGGGGCCTCGGCGGAGTTTATAGATAAGTTGGAATTCATCCAGCCCAACGTCATCTCTGGAATCCCCATCTACCGCGTCATGGACCGGCAAGGCCAGATCATCAACCCCAGCGAGGACCCCCACCTGCCGAAGGAGAAGGTGCTGAAGCTCTACAAGAGCATGACACTGCTTAACACCATGGACCGCATCCTCTATGAGTCTCAGCGGCAGGGCCGGATCTCCTTCTACATGACCAACTATGGTGAGGAGGGCACGCACGTGGGGAGTGCCGCCGCCCTGGACAACACGGACCTGGTGTTTGGCCAGTACCGGGAGGCAGGTGTGCTGATGTATCGGGACTACCCCCTGGAACTATTCATGGCCCAGTGCTATGGCAACATCAGTGACTTGGGCAAGGGGCGCCAGATGCCTGTCCACTACGGCTGCAAGGAACGCCACTTCGTCACTATCTCCTCTCCACTGGCCACGCAGATCCCTCAGGCGGTGGGGGCGGCGTACGCAGCCAAGCGGGCCAATGCCAACAGGGTCGTCATCTGTTACTTCGGCGAGGGGGCAGCCAGTGAGGGGGACGCCCATGCCGGCTTCAACTTCGCTGCCACACTTGAGTGCCCCATCATCTTCTTCTGCCGGAACAATGGCTACGCCATCTCCACGCCCACCTCTGAGCAGTATCGCGGCGATGGCATTGCAGCACGAGGCCCCGGGTATGGCATCATGTCAATCCGCGTGGATGGTAATGATGTGTTTGCCGTATACAACGCCACAAAGGAGGCCCGACGGCGGGCTGTGGCAGAGAACCAGCCCTTCCTCATCGAGGCCATGACCTACAGGATCGGGCACCACAGCACCAGTGACGACAGTTCAGCGTACCGCTCGGTGGATGAGGTCAATTACTGGGATAAACAGGACCACCCCATCTCCCGGCTGCGGCACTATCTGCTGAGCCAAGGCTGGTGGGATGAGGAGCAGGAGAAGGCCTGGAGGAAGCAGTCCCGCAGGAAGGTGATGGAGGCCTTTGAGCAGGCCGAGCGGAAGCCCAAACCCAACCCCAACCTACTCTTCTCAGACGTGTATCAGGAGATGCCCGCCCAGCTCCGCAAGCAGCAGGAGTCTCTGGCCCGCCACCTGCAGACCTACGGGGAGCACTACCCACTGGATCACTTCGATAAGTGA
(配列番号4)
ATGGCGGTAGCGATCGCTGCAGCGAGGGTCTGGCGGCTAAACCGTGGTTTGAGCCAGGCTGCCCTCCTGCTGCTGCGGCAGCCTGGGGCTCGGGGACTGGCTAGATCTCACCCCCCCAGGCAGCAGCAGCAGTTTTCATCTCTGGATGACAAGCCCCAGTTCCCAGGGGCCTCGGCGGAGTTTATAGATAAGTTGGAATTCATCCAGCCCAACGTCATCTCTGGAATCCCCATCTACCGCGTCATGGACCGGCAAGGCCAGATCATCAACCCCAGCGAGGACCCCCACCTGCCGAAGGAGAAGGTGCTGAAGCTCTACAAGAGCATGACACTGCTTAACACCATGGACCGCATCCTCTATGAGTCTCAGCGGCAGGGCCGGATCTCCTTCTACATGACCAACTATGGTGAGGAGGGCACGCACGTGGGGAGTGCCGCCGCCCTGGACAACACGGACCTGGTGTTTGGCCAGTACCGGGAGGCAGGTGTGCTGATGTATCGGGACTACCCCCTGGAACTATTCATGGCCCAGTGCTATGGCAACATCAGTGACTTGGGCAAGGGGCGCCAGATGCCTGTCCACTACGGCTGCAAGGAACGCCACTTCGTCACTATCTCCTCTCCACTGGCCACGCAGATCCCTCAGGCGGTGGGGGCGGCGTACGCAGCCAAGCGGGCCAATGCCAACAGGGTCGTCATCTGTTACTTCGGCGAGGGGGCAGCCAGTGAGGGGGACGCCCATGCCGGCTTCAACTTCGCTGCCACACTTGAGTGCCCCATCATCTTCTTCTGCCGGAACAATGGCTACGCCATCTCCACGCCCACCTCTGAGCAGTATCGCGGCGATGGCATTGCAGCACGAGGCCCCGGGTATGGCATCATGTCAATCCGCGTGGATGGTAATGATGTGTTTGCCGTATACAACGCCACAAAGGAGGCCCGACGGCGGGCTGTGGCAGAGAACCAGCCCTTCCTCATCGAGGCCATGACCTACAGGATCGGGCACCACAGCACCAGTGACGACAGTTCAGCGTACCGCTCGGTGGATGAGGTCAATTACTGGGATAAACAGGACCACCCCATCTCCCGGCTGCGGCACTATCTGCTGAGCCAAGGCTGGTGGGATGAGGAGCAGGAGAAGGCCTGGAGGAAGCAGTCCCGCAGGAAGGTGATGGAGGCCTTTGAGCAGGCCGAGCGGAAGCCCAAACCCAACCCCAACCTACTCTTCTCAGACGTGTATCAGGAGATGCCCGCCCAGCTCCGCAAGCAGCAGGAGTCTCTGGCCCGCCACCTGCAGACCTACGGGGAGCACTACCCACTGGATCACTTCGATAAGTGA
(配列番号4)
一実施形態では、BCKDH E1 Aサブユニットは、配列番号3に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはこのアミノ酸配列は、配列番号3で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
一実施形態では、BCKDH E1 Aサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号4に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくはこのヌクレオチド配列にコードされるタンパク質は、配列番号3で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
一実施形態では、BCKDH E1 Aサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号3に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくはこのアミノ酸配列は、配列番号3で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
BCKDH E1 A及びBサブユニットはミトコンドリアタンパク質であり、それらの配列はミトコンドリア標的シグナル配列を含み得る。このようなシグナル配列は、タンパク質がミトコンドリアを標的とする際に切断されることがあり、よってタンパク質はシグナル配列を欠く成熟型で天然に存在することがある。当業者は、適切なバイオインフォマティクス及び分子生物学技術を使用して、そのようなシグナル配列を容易に決定することができる。例えば、配列番号1の残基1〜50及び配列番号3の残基1〜45は、シグナル配列として機能し得る。
分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDHキナーゼ)
BCKDHの活性は、リン酸化/脱リン酸化サイクルによって制御される。分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDHキナーゼ)は、BCKDH E1 Aサブユニットのリン酸化によってBCKDH複合体を不活性化し、BCKDHホスファターゼは、BCKDH E1 Aサブユニットを脱リン酸化することによって複合体を活性化する。
BCKDHの活性は、リン酸化/脱リン酸化サイクルによって制御される。分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDHキナーゼ)は、BCKDH E1 Aサブユニットのリン酸化によってBCKDH複合体を不活性化し、BCKDHホスファターゼは、BCKDH E1 Aサブユニットを脱リン酸化することによって複合体を活性化する。
一実施形態では、BCKDHキナーゼはヒトBCKDHキナーゼである。
BCKDHキナーゼのアミノ酸配列の例は、NCBIアクセッション番号NP_005872.2で寄託された配列である。
BCKDHキナーゼのアミノ酸配列の例は以下である:
MILASVLRSGPGGGLPLRPLLGPALALRARSTSATDTHHVEMARERSKTVTSFYNQSAIDAAAEKPSVRLTPTMMLYAGRSQDGSHLLKSARYLQQELPVRIAHRIKGFRCLPFIIGCNPTILHVHELYIRAFQKLTDFPPIKDQADEAQYCQLVRQLLDDHKDVVTLLAEGLRESRKHIEDEKLVRYFLDKTLTSRLGIRMLATHHLALHEDKPDFVGIICTRLSPKKIIEKWVDFARRLCEHKYGNAPRVRINGHVAARFPFIPMPLDYILPELLKNAMRATMESHLDTPYNVPDVVITIANNDVDLIIRISDRGGGIAHKDLDRVMDYHFTTAEASTQDPRISPLFGHLDMHSGAQSGPMHGFGFGLPTSRAYAEYLGGSLQLQSLQGIGTDVYLRLRHIDGREESFRI
(配列番号5)
MILASVLRSGPGGGLPLRPLLGPALALRARSTSATDTHHVEMARERSKTVTSFYNQSAIDAAAEKPSVRLTPTMMLYAGRSQDGSHLLKSARYLQQELPVRIAHRIKGFRCLPFIIGCNPTILHVHELYIRAFQKLTDFPPIKDQADEAQYCQLVRQLLDDHKDVVTLLAEGLRESRKHIEDEKLVRYFLDKTLTSRLGIRMLATHHLALHEDKPDFVGIICTRLSPKKIIEKWVDFARRLCEHKYGNAPRVRINGHVAARFPFIPMPLDYILPELLKNAMRATMESHLDTPYNVPDVVITIANNDVDLIIRISDRGGGIAHKDLDRVMDYHFTTAEASTQDPRISPLFGHLDMHSGAQSGPMHGFGFGLPTSRAYAEYLGGSLQLQSLQGIGTDVYLRLRHIDGREESFRI
(配列番号5)
BCKDHキナーゼをコードするヌクレオチド配列の例は、NCBIアクセッション番号NM_005881.3で寄託された配列である。
BCKDHキナーゼをコードするヌクレオチド配列の例は以下である:
ATGATCCTGGCGTCGGTGCTGAGGAGCGGTCCCGGGGGCGGGCTTCCGCTCCGGCCCCTCCTGGGACCCGCACTCGCGCTCCGGGCCCGCTCGACGTCGGCCACCGACACACACCACGTGGAGATGGCTCGGGAGCGCTCCAAGACCGTCACCTCCTTTTACAACCAGTCGGCCATCGACGCGGCAGCGGAGAAGCCCTCAGTCCGCCTAACGCCCACCATGATGCTCTACGCTGGCCGCTCTCAGGACGGCAGCCACCTTCTGAAAAGTGCTCGGTACCTGCAGCAAGAACTTCCAGTGAGGATTGCTCACCGCATCAAGGGCTTCCGCTGCCTTCCTTTCATCATTGGCTGCAACCCCACCATACTGCACGTGCATGAGCTATATATCCGTGCCTTCCAGAAGCTGACAGACTTCCCTCCGATCAAGGACCAGGCGGACGAGGCCCAGTACTGCCAGCTGGTGCGACAGCTGCTGGATGACCACAAGGATGTGGTGACCCTCTTGGCAGAGGGCCTACGTGAGAGCCGGAAGCACATAGAGGATGAAAAGCTCGTCCGCTACTTCTTGGACAAGACGCTGACTTCGAGGCTTGGAATCCGCATGTTGGCCACGCATCACCTGGCGCTGCATGAGGACAAGCCTGACTTTGTCGGCATCATCTGTACTCGTCTCTCACCAAAGAAGATTATTGAGAAGTGGGTGGACTTTGCCAGACGCCTGTGTGAGCACAAGTATGGCAATGCGCCCCGTGTCCGCATCAATGGCCATGTGGCTGCCCGGTTCCCCTTCATCCCTATGCCACTGGACTACATCCTGCCGGAGCTGCTCAAGAATGCCATGAGAGCCACAATGGAGAGTCACCTAGACACTCCCTACAATGTCCCAGATGTGGTCATCACCATCGCCAACAATGATGTCGATCTGATCATCAGGATCTCAGACCGTGGTGGAGGAATCGCTCACAAAGATCTGGACCGGGTCATGGACTACCACTTCACTACTGCTGAGGCCAGCACACAGGACCCCCGGATCAGCCCCCTCTTTGGCCATCTGGACATGCATAGTGGCGCCCAGTCAGGACCCATGCACGGCTTTGGCTTCGGGTTGCCCACGTCACGGGCCTACGCGGAGTACCTCGGTGGGTCTCTGCAGCTGCAGTCCCTGCAGGGCATTGGCACGGACGTCTACCTGCGGCTCCGCCACATCGATGGCCGGGAGGAAAGCTTCCGGATCTGA
(配列番号6)
ATGATCCTGGCGTCGGTGCTGAGGAGCGGTCCCGGGGGCGGGCTTCCGCTCCGGCCCCTCCTGGGACCCGCACTCGCGCTCCGGGCCCGCTCGACGTCGGCCACCGACACACACCACGTGGAGATGGCTCGGGAGCGCTCCAAGACCGTCACCTCCTTTTACAACCAGTCGGCCATCGACGCGGCAGCGGAGAAGCCCTCAGTCCGCCTAACGCCCACCATGATGCTCTACGCTGGCCGCTCTCAGGACGGCAGCCACCTTCTGAAAAGTGCTCGGTACCTGCAGCAAGAACTTCCAGTGAGGATTGCTCACCGCATCAAGGGCTTCCGCTGCCTTCCTTTCATCATTGGCTGCAACCCCACCATACTGCACGTGCATGAGCTATATATCCGTGCCTTCCAGAAGCTGACAGACTTCCCTCCGATCAAGGACCAGGCGGACGAGGCCCAGTACTGCCAGCTGGTGCGACAGCTGCTGGATGACCACAAGGATGTGGTGACCCTCTTGGCAGAGGGCCTACGTGAGAGCCGGAAGCACATAGAGGATGAAAAGCTCGTCCGCTACTTCTTGGACAAGACGCTGACTTCGAGGCTTGGAATCCGCATGTTGGCCACGCATCACCTGGCGCTGCATGAGGACAAGCCTGACTTTGTCGGCATCATCTGTACTCGTCTCTCACCAAAGAAGATTATTGAGAAGTGGGTGGACTTTGCCAGACGCCTGTGTGAGCACAAGTATGGCAATGCGCCCCGTGTCCGCATCAATGGCCATGTGGCTGCCCGGTTCCCCTTCATCCCTATGCCACTGGACTACATCCTGCCGGAGCTGCTCAAGAATGCCATGAGAGCCACAATGGAGAGTCACCTAGACACTCCCTACAATGTCCCAGATGTGGTCATCACCATCGCCAACAATGATGTCGATCTGATCATCAGGATCTCAGACCGTGGTGGAGGAATCGCTCACAAAGATCTGGACCGGGTCATGGACTACCACTTCACTACTGCTGAGGCCAGCACACAGGACCCCCGGATCAGCCCCCTCTTTGGCCATCTGGACATGCATAGTGGCGCCCAGTCAGGACCCATGCACGGCTTTGGCTTCGGGTTGCCCACGTCACGGGCCTACGCGGAGTACCTCGGTGGGTCTCTGCAGCTGCAGTCCCTGCAGGGCATTGGCACGGACGTCTACCTGCGGCTCCGCCACATCGATGGCCGGGAGGAAAGCTTCCGGATCTGA
(配列番号6)
一実施形態では、BCKDHキナーゼは、配列番号5に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはこのアミノ酸配列は、配列番号5で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
一実施形態では、BCKDHキナーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号6に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくはこのヌクレオチド配列にコードされるタンパク質は、配列番号5で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
一実施形態では、BCKDHキナーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号5に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくはこのアミノ酸配列は、配列番号5で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
BCKDHキナーゼはミトコンドリアタンパク質であり、その配列はミトコンドリア標的シグナル配列を含み得る。このようなシグナル配列は、タンパク質がミトコンドリアを標的とする際に切断されることがあり、よってタンパク質はシグナル配列を欠く成熟型で天然に存在することがある。当業者は、適切なバイオインフォマティクス及び分子生物学的手法を使用して、そのようなシグナル配列を容易に決定することができる。例えば、配列番号5の残基1〜30は、シグナル配列として機能し得る。
減量及び体重維持
「減量」は、体重(例えば、キログラム)、体格指数(body mass index)(kg/m2)、ウェスト・ヒップ比(例えば、センチメートル)、体脂肪量(例えば、キログラム)、臀囲(例えば、センチメートル)、又は腹囲(例えば、センチメートル)などのパラメータの減少を指し得る。
「減量」は、体重(例えば、キログラム)、体格指数(body mass index)(kg/m2)、ウェスト・ヒップ比(例えば、センチメートル)、体脂肪量(例えば、キログラム)、臀囲(例えば、センチメートル)、又は腹囲(例えば、センチメートル)などのパラメータの減少を指し得る。
減量は、介入(例えば食事及び/又は運動療法)の終了時における前述のパラメータのうちの1つ以上の値を、介入開始時のそのパラメータの値から引くことによって計算することができる。
減量度(degree of weight loss)は、前述の体重表現型パラメータ(例えば、対象の体重(例えば、キログラム)又は体格指数(kg/m2)の変化パーセント)のうちの1つの変化(%)として表すことができる。例えば、対象は、その初期体重の少なくとも10%、その初期体重の少なくとも8%、又はその初期体重の少なくとも5%が減少し得る。単に一例として、対象は、その初期体重の5〜10%が減少し得る。
一実施形態では、初期体重の少なくとも10%の減量度は、肥満関連共存症のリスクを大幅に減少させる。
「体重維持」は、体重(例えば、キログラム)、体格指数(kg/m2)、ウェスト・ヒップ比(例えば、センチメートル)、体脂肪量(例えば、キログラム)、臀囲(例えば、センチメートル)、又は腹囲(例えば、センチメートル)などのパラメータが維持されることを指し得る。体重維持は、例えば、介入(例えば食事及び/又は運動療法)後に減少した体重を維持することを指し得る。
体重維持度は、ある期間にわたって前述のパラメータのうちの1つ以上の変化を求めることによって計算することができる。この期間は、例えば、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45又は50週間とすることができる。
本発明の作用剤によってサポートされる体重維持は、例えば、ある期間にわたって前述のパラメータの1つ以上の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、又は1%未満の変化(例えば増加)をもたらし得る。
体重維持度は、減量達成後のある期間中のリバウンドした体重として、例えば、減量を達成するまでの間に減少した体重のパーセンテージとして表すことができる。
本発明の作用剤によってサポートされる体重維持は、作用剤の投与後に対象の食欲を抑制することによってもたらされてもよい。そのため対象は、本発明の作用剤の非存在下での食欲と比較して減少した食欲を有し得る。
本発明の作用剤によってサポートされる体重維持は、作用剤の投与後に対象の食欲を調節することによってもたらされ得る。例えば減量介入期間の後に、対象はしたがって食欲の調節を維持することができ、したがって体重を維持することができる。
特に、本発明の作用剤は、減量介入(例えば食事又は運動療法)期間中及び/又はその後に、食欲抑制又は調節によって体重維持をサポートし得る。
一態様において、本発明は、例えば減量期間の後に、健康な体組成を維持するための本発明の作用剤の非治療的使用を提供する。
肥満
「過体重」は、成人では25〜30の体格指数(BMI)を有することと定義される。
「過体重」は、成人では25〜30の体格指数(BMI)を有することと定義される。
「体格指数」は、体重(kg)を身長(メートル)の二乗で割った比率を意味する。
「肥満」とは、動物、特にヒト及び他の哺乳動物の脂肪組織に蓄えられた天然の貯蔵エネルギーが、ある特定の健康状態又は死亡率の増加に関連する点まで増加した状態である。「肥満の」とは、成人では30を超えるBMIを有することと定義される。
「標準体重」は、成人では18.5〜25のBMIを有することと定義され、「低体重」は、18.5未満のBMIと定義され得る。
肥満は、世界の多くの地域で流行の域に達している慢性の代謝障害であり、2型糖尿病、心臓血管疾患、脂質異常症、及びある特定の種類のがんなどの重篤な共存症の主要な危険因子である(World Health Organ Tech Rep Ser.(2000)894:i−xii、1〜253)。
「肥満関連疾患」は、肥満個体において発症リスクが増加している任意の状態を指す。肥満関連障害は、糖尿病(例えば2型糖尿病)、脳卒中、コレステロール高値、心臓血管疾患、インスリン抵抗性、冠動脈心疾患、メタボリックシンドローム、高血圧及び脂肪肝を含む。
スクリーニング方法
本発明は、BCKDHの活性を増加させること、及び/又はBCKDHキナーゼの活性を減少させることができる作用剤を提供し、更にそのような作用剤を特定するための方法を提供する。
本発明は、BCKDHの活性を増加させること、及び/又はBCKDHキナーゼの活性を減少させることができる作用剤を提供し、更にそのような作用剤を特定するための方法を提供する。
本発明の作用剤は、定性的又は定量的結果のいずれかを提供する方法によって特定され得る。更に、そのような方法は、本発明の作用剤を特定するだけでなく特徴付けるために使用してもよい。
候補作用剤は、潜在的に関心対象となる任意の作用剤、例えばペプチド、ポリペプチド(例えば抗体)、核酸又は小分子であり得る。好ましくは、候補作用剤は、潜在的に治療上の関心対象となる化合物又は混合物である。好ましくは、候補作用剤は、哺乳動物、特にヒトにとって低毒性のものである。いくつかの実施形態では、候補作用剤は、植物又は動物抽出物などの天然化合物又は化合物の混合物を含む、栄養剤及び/又は食品原材料を含み得る。
候補作用剤は、作用剤のライブラリー、例えばコンビナトリアルケミストリー又はファージディスプレイライブラリーによって製造されたライブラリーの一部を形成してもよい。一実施形態では、候補作用剤は、植物生理活性分子のライブラリーの一部を形成する。
BCKDH活性
本発明はまた、BCKDHの活性を増加させることができる作用剤を特定するための方法、及びそのような方法によって特定される作用剤も提供する。BCKDHの活性は、例えばBCKDHの酵素活性を分析することによって、直接分析することができる。
本発明はまた、BCKDHの活性を増加させることができる作用剤を特定するための方法、及びそのような方法によって特定される作用剤も提供する。BCKDHの活性は、例えばBCKDHの酵素活性を分析することによって、直接分析することができる。
BCKDH活性を測定するための多くの技術が当技術分野において知られている。これらの技術は、細胞から単離されたBCKDHに適用され得る。BCKDHは、組み換え技術を使用して発現されていてもよい。BCKDHは精製されていることが好ましい。
一実施形態では、BCKDHは、例えばBCKDHの基質であるα−ケトイソ吉草酸の存在下で、NAD+からのNADHの生成を監視することによって分光光度法により測定される。そのようなアッセイ技術は、例えば、Hawes,J.W.et al.(2000)Methods Enzymol.324:200〜207において記載されている。
BCKDHキナーゼ活性
本発明はまた、BCKDHキナーゼの活性を増加させることができる作用剤を特定するための方法、及びそのような方法によって特定される作用剤も提供する。BCKDHキナーゼの活性は、例えばBCKDHキナーゼの酵素活性を分析することによって、直接分析することができる。
本発明はまた、BCKDHキナーゼの活性を増加させることができる作用剤を特定するための方法、及びそのような方法によって特定される作用剤も提供する。BCKDHキナーゼの活性は、例えばBCKDHキナーゼの酵素活性を分析することによって、直接分析することができる。
候補作用剤がタンパク質、例えばキナーゼなどの酵素の活性を低減させる能力は、IC50値で表され得る。IC50は、タンパク質の活性を50%低減させる(例えば、酵素活性を50%低減させる)のに必要な作用剤の濃度である。IC50値の計算は当技術分野においてよく知られている。本発明の作用剤は、BCKDHキナーゼの阻害のIC50値が、100μM未満、より好ましくは10μM未満、例えば1μM未満、100nM未満、又は10nM未満であることが好ましい。
キナーゼ活性を測定するための多くの技術が当技術分野において知られている。これらの技術は、細胞から単離されたキナーゼ、例えばBCKDHキナーゼに適用され得る。BCKDHキナーゼは、組み換え技術を使用して発現されていてもよい。BCKDHキナーゼは精製されていることが好ましい。
一実施形態では、キナーゼ活性は、基質中へのリン酸の取り込み、例えばBCKDH基質又はその好適な断片中への[γ−32P]標識ATPからの放射標識リン酸の取り込みを監視することによって測定される。そのようなアッセイ技術は、例えば、Hastie,C.J.et al.(2006)Nat.Protocols 1:968〜971において記載されている。
別の実施形態では、キナーゼ活性は、キナーゼ反応において生成されるADPの量を監視すること(例えばADP生成速度を監視すること)によって測定される。そのようなアッセイ系(例えばPromegaにより製造されている市販のADP−Glo(商標)Kinase Assayなど)は、ADP(キナーゼ反応において生成される)からATPへの再変換に基づくことができ、この再変換は、例えばルシフェラーゼによる発光シグナルの生成によって、検出することができる。このようなアッセイにおいて、発光シグナルはキナーゼ活性と相関する。このようなアッセイは、広範囲の精製されたキナーゼの活性に対する候補作用剤の影響を測定するのに特に好適であり、ハイスループットスクリーニングにおいて使用するために大変適している。
別の実施形態では、キナーゼ活性は、反応中のある特定の時点で残存するATPの量を監視すること(例えばATP消費速度を監視すること)によって測定される。このようなアッセイにおいて、シグナルは存在するATPの量と相関し、このATP量はキナーゼ活性とは逆相関する。このようなアッセイ系(例えばPromegaの市販のKinase−Glo(登録商標)Kinase Assayなど)は、ルシフェラーゼによる発光シグナルの生成に基づくことができる。
BCKDH及びBCKDHキナーゼ結合
本発明はまた、BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼに結合すること、これに代えて又はこれに加えてそのような結合を特徴付けることができる作用剤を特定する方法も提供する。例えば、方法は、絶対的な若しくは相対的な結合親和性、並びに/又は結合のエンタルピー及びエントロピーを測定することを可能にし得る。結合親和性は、平衡解離定数(Kd)又は結合定数(Ka)で表すことができる。
本発明はまた、BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼに結合すること、これに代えて又はこれに加えてそのような結合を特徴付けることができる作用剤を特定する方法も提供する。例えば、方法は、絶対的な若しくは相対的な結合親和性、並びに/又は結合のエンタルピー及びエントロピーを測定することを可能にし得る。結合親和性は、平衡解離定数(Kd)又は結合定数(Ka)で表すことができる。
候補作用剤とタンパク質との結合を特定するために、多くのアッセイ技術が当技術分野において知られている。用いられるアッセイ技術は、好ましくは、自動化及び/又は候補作用剤のハイスループットスクリーニングに適したものである。アッセイは、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、樹脂又は類似物などの使い捨て固相担体で行うことができる。
例えば、標的BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼは、固相担体、例えばマイクロビーズ、樹脂、マイクロタイタープレート又はアレイ上に固定化することができる。次に、候補作用剤を、固定化した標的タンパク質と接触させることができる。任意に、弱く又は非特異的に結合している作用剤を除去するために洗浄手順を適用してもよい。その後、標的タンパク質に結合している作用剤を検出及び特定することができる。結合した作用剤の検出を容易にするために、候補作用剤を、容易に検出可能なマーカーで標識してもよい。マーカーは、例えば、放射標識、酵素標識、抗体標識、蛍光標識、粒子(例えばラテックス又は金)標識又は類似物を含み得る。
あるいは、上記の手順を逆にしてもよく、候補作用剤を固定化してもよく、標的BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又は標的BCKDHキナーゼをかかる固定化した作用剤と接触させてもよい。任意に、弱く又は非特異的に結合した標的タンパク質を除去するために洗浄手順を適用してもよい。その後、BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼが結合する作用剤を、検出及び特定することができる。結合の検出を容易にするために、BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼを、上記のような容易に検出可能なマーカーで標識してもよい。
上記のアッセイに加えて、他の好適なアッセイ技術が当技術分野において知られている。そのような技術の例としては、ラジオアッセイ、蛍光アッセイ、ELISA、蛍光偏光、蛍光異方性、等温滴定型熱量測定(ITC)、表面プラズモン共鳴(SPR)などが挙げられる。これらのアッセイを、BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼに結合する作用剤を特定するために適用することができる。実際、ハイスループットスクリーニングを容易にするために、これらの技術の多くを自動化するためのプラットフォームが当技術分野において広く知られている。
BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼに対する候補作用剤の結合を詳細に理解するために、複数のアッセイ技術を使用してもよい。例えば、定性的な結合情報が得られるアッセイを方法の第1のステップとして使用して、その後、異なる技術を使用した更なるアッセイを行って、定量的な結合データ及び/又は標的タンパク質の活性に対する影響に関するデータを得てもよい。
上述のアッセイ技術を、競合的結合試験を行うように適合させてもよい。例えば、これらの技術は、候補作用剤の存在下でタンパク質の基質又は補因子への結合を分析するために、等しく好適である。したがって、上記の技術を使用して、タンパク質とその基質又は補因子との結合を調整する、よってタンパク質の活性に影響を有する作用剤をスクリーニング及び特定することが可能となる。例えば、これらのアッセイは、候補作用剤の存在下で、BCKDH E1サブユニットとチアミン二リン酸との、又はBCKDHキナーゼとATPとの結合を検出することを可能にする。
本発明の作用剤は、高い親和性で結合することが好ましい。例えば、本発明の作用剤は、BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼに、100μM未満、より好ましくは10μM未満、例えば1μM未満、100nM未満、又は10nM未満のKdで結合する。
結合親和性は、当技術分野において既知の標準的な技術、例えば、表面プラズモン共鳴、ELISAなど(例えば上記のような)を使用して測定することができ、解離(Kd)又は結合(Ka)定数のいずれかで定量することができる。
本発明の作用剤を特定するために、構造に指南されたin silicoスクリーニング(in silico structure−guided screening)などのバイオインフォマティクスに基づく手法もまた使用することができる。
BCKDH及びBCKDHキナーゼレベル
本発明は、BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)レベルを増加させるため及び/又はBCKDHキナーゼレベルを減少させるための作用剤を提供する。当該タンパク質のレベルは、細胞又は生物内でのそのタンパク質の発現レベルと同等とみなし得る。タンパク質レベルは、例えばそのタンパク質をコードするmRNAのレベルを分析することによって、直接又は間接的に分析することができる。
本発明は、BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)レベルを増加させるため及び/又はBCKDHキナーゼレベルを減少させるための作用剤を提供する。当該タンパク質のレベルは、細胞又は生物内でのそのタンパク質の発現レベルと同等とみなし得る。タンパク質レベルは、例えばそのタンパク質をコードするmRNAのレベルを分析することによって、直接又は間接的に分析することができる。
BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼの発現を分析するための方法は、タンパク質のレベルに対する候補作用剤の影響をスクリーニングするために本発明において用いることができる。
タンパク質の発現レベルを決定するための多くの技術が、当技術分野において知られている。これらの技術を、BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼの発現レベルに対する候補作用剤の影響を試験するために適用することができる。用いられる技術は、好ましくは、自動化及び/又は候補作用剤のハイスループットスクリーニングに適したものである。
例えば、レポーター部分と作動可能に連結されたBCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼをコードするポリヌクレオチドを有する細胞を使用して、スクリーニングを行うことができる。レポーター部分は、内因性BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼをコードする遺伝子に作動可能に連結することができる。あるいは、レポーター部分に作動可能に連結されたBCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼの外因性コピーを、細胞中に挿入してもよい。この実施形態では、天然のBCKDH及び/又はBCKDHキナーゼ発現を欠損するように細胞を改変してもよい。BCKDH及び/又はBCKDHキナーゼに連結されたレポーター部分は、互いに異なりかつ識別可能であってもよい。好適なレポーター部分としては、蛍光標識、例えば緑色、黄色、チェリー、シアン色又はオレンジ色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質が挙げられる。
「作動可能に連結した」は、記載されている構成要素が、意図されたように機能することを可能にする関係にあることと理解されるべきである。
そのような細胞を、候補作用剤と接触させることができ、BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼの発現レベルを、細胞内でのレポーター部分の発現レベルを分析することによって監視することができる。蛍光レポーター部分は、当技術分野において知られている多くの技術、例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別(FACS)及び蛍光顕微鏡法によって分析することができる。BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼの発現は、同一細胞内で別々に又は同時に分析することができる。BCKDH(特に、BCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼの発現レベルは、候補作用剤との接触の前後で比較することができる。あるいは、BCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼの発現レベルは、候補作用剤と接触させた細胞と対照細胞との間で比較することができる。
タンパク質、例えばBCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼの発現を分析するために、他の方法を使用してもよい。タンパク質発現は直接分析することができる。例えば、発現は、クマシー又は銀染色による可視化を用いたSDS−PAGE分析などの方法を使用して、定量的に分析することができる。あるいは発現は、タンパク質産物に結合する抗体プローブを用いてウェスタンブロッティング又は酵素結合免疫吸着法(ELISA)を使用して定量的に分析してもよい。前述のようにレポーター部分で標識したBCKDH(特にBCKDH E1 Bサブユニット)及び/又はBCKDHキナーゼもまた、これらの方法において使用することができる。あるいは、タンパク質発現は、例えば細胞内で転写されるタンパク質に対応するmRNAの量を試験することによって、間接的に分析することができる。これは、定量的逆転写PCR及びノーザンブロッティングなどの方法を使用して実現することができる。
同様の技術はまた、レプチンタンパク質発現の分析にも使用することができる。
作用剤
本発明は、BCKDHの活性を増加させること、及び/又はBCKDHキナーゼの活性を減少させることができる作用剤を提供し、更にそのような作用剤を特定するための方法を提供する。
本発明は、BCKDHの活性を増加させること、及び/又はBCKDHキナーゼの活性を減少させることができる作用剤を提供し、更にそのような作用剤を特定するための方法を提供する。
本発明の作用剤は、例えば、ペプチド、ポリペプチド(例えば抗体)、核酸(例えばsiRNA、shRNA、miRNA及びアンチセンスRNA)又は小分子であり得る。好ましくは、作用剤は、哺乳動物、特にヒトにとって低毒性のものである。いくつかの実施形態では、作用剤は、植物又は動物抽出物などの天然化合物又は化合物の混合物を含む、栄養剤及び/又は食品原材料を含み得る。
一実施形態では、本発明の作用剤はレスベラトロールである。レスベラトロール(3,5,4’−トリヒドロキシ−trans−スチルベン)は、損傷に反応して、又は病原体から攻撃を受けたときに、多くの植物が天然に産生するスチルベノイドでありファイトアレキシンである。レスベラトロール源となる食品としては、ブドウ果皮、ブルーベリー、ラズベリー及びクワが挙げられる。
一実施形態では、本発明の作用剤はバルプロ酸である。バルプロ酸は、てんかん、双極性障害及び片頭痛の治療において使用される医薬である。バルプロ酸は、欠神発作、部分発作及び全般発作を有する対象においててんかん発作を予防し得る。バルプロ酸の構造は以下である:
一実施形態では、本発明の作用剤はα−クロロイソカプロン酸である。α−クロロイソカプロン酸は、ロイシンの類似体であり、BCKDHキナーゼの最も強力な既知の阻害剤である(Skimomura,Y.et al.(2006)J.Nutr.136:250S〜253S)。α−クロロイソカプロン酸の構造は以下である:
一実施形態では、本発明の作用剤は、α−ケトイソカプロン酸(KIC)である。ロイシンのアミノ基転移反応生成物であるα−ケトイソカプロン酸は、BCKDHキナーゼの既知の生理学的阻害剤である(Shimomura,Y.et al.(2006)J.Nutr.136:250S〜253S)。α−ケトイソカプロン酸の構造は以下である:
特にBCKDH E1 Bサブユニットの活性に影響を及ぼすことによって、BCKDHの活性に影響を及ぼす作用剤の例としては、表1aに記載した作用剤が挙げられる(Davis AP,et al.The Comparative Toxicogenomics Database:update 2017.Nucleic Acids Res.2016 Sep 19)。
特にBCKDH E1 Aサブユニットの活性に影響を及ぼすことによって、BCKDHの活性に影響を及ぼす作用剤の例としては、表1bに記載した作用剤が挙げられる(Davis AP,et al.The Comparative Toxicogenomics Database:update 2017.Nucleic Acids Res.2016 Sep 19)。
BCKDHキナーゼの活性に影響を及ぼす作用剤の例としては、表2に記載した作用剤が挙げられる(Davis AP,et al.The Comparative Toxicogenomics Database:update 2017.Nucleic Acids Res.2016 Sep 19)。
本発明による使用のための作用剤は、例えば、塩又はエステル、特に薬学的に許容される塩又はエステルとして存在してもよい。
siRNA、shRNA、miRNA及びアンチセンスDNA/RNA
BCKDHキナーゼの発現は、転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)を使用して調整することができる。二本鎖RNA(dsRNA)によって介在される転写後遺伝子サイレンシングは、外来遺伝子の発現を調節するための保存された細胞防御機構である。トランスポゾン又はウイルスなどの要素のランダムな組み込みは、相同な一本鎖mRNA又はウイルスゲノムRNAの配列特異的な分解を活性化するdsRNAの発現を引き起こすと考えられる。サイレンシング効果は、RNA干渉(RNAi)として知られている(Ralph et al.(2005)Nat.Medicine 11:429〜433)。RNAiの機構では、長鎖dsRNAを約21〜25ヌクレオチド(nt)のRNA二本鎖にプロセシングする。これらの産物は、mRNA分解の配列特異的メディエーターである小分子干渉又はサイレンシングRNA(siRNA)と呼ばれる。分化した哺乳動物細胞において、30bpを超えるdsRNAが、タンパク質合成の停止及び非特異的mRNAの分解を引き起こすインターフェロン応答を活性化することが分かっている(Stark et al.(1998)Ann.Rev.Biochem.67:227〜64)。しかしながら、21ntのsiRNA二本鎖を使用することによってこの応答を回避することができ(Elbashir et al.(2001)EMBO J.20:6877〜88;Hutvagner et al.(2001)Science 293:834〜8)、培養された哺乳動物細胞において遺伝子機能を分析することが可能である。
BCKDHキナーゼの発現は、転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)を使用して調整することができる。二本鎖RNA(dsRNA)によって介在される転写後遺伝子サイレンシングは、外来遺伝子の発現を調節するための保存された細胞防御機構である。トランスポゾン又はウイルスなどの要素のランダムな組み込みは、相同な一本鎖mRNA又はウイルスゲノムRNAの配列特異的な分解を活性化するdsRNAの発現を引き起こすと考えられる。サイレンシング効果は、RNA干渉(RNAi)として知られている(Ralph et al.(2005)Nat.Medicine 11:429〜433)。RNAiの機構では、長鎖dsRNAを約21〜25ヌクレオチド(nt)のRNA二本鎖にプロセシングする。これらの産物は、mRNA分解の配列特異的メディエーターである小分子干渉又はサイレンシングRNA(siRNA)と呼ばれる。分化した哺乳動物細胞において、30bpを超えるdsRNAが、タンパク質合成の停止及び非特異的mRNAの分解を引き起こすインターフェロン応答を活性化することが分かっている(Stark et al.(1998)Ann.Rev.Biochem.67:227〜64)。しかしながら、21ntのsiRNA二本鎖を使用することによってこの応答を回避することができ(Elbashir et al.(2001)EMBO J.20:6877〜88;Hutvagner et al.(2001)Science 293:834〜8)、培養された哺乳動物細胞において遺伝子機能を分析することが可能である。
shRNAは、短いループ配列で隔てられた短い逆方向RNA反復配列からなる。これらは細胞機構によって19〜22ntのsiRNAに速やかにプロセシングされ、それによって標的遺伝子の発現が抑制される。
マイクロRNA(miRNA)は、その3’非翻訳領域(UTR)に結合することによって標的mRNAの翻訳を効果的に抑制する、小さな(長さ22〜25ヌクレオチド)ノンコーディングRNAである。マイクロRNAは、生物において天然に産生される小分子RNAの非常に大きな群であり、その少なくとも一部は、標的遺伝子の発現を制御する。マイクロRNAファミリーの当初のメンバーは、let−7及びlin−4である。let−7遺伝子は、線虫の発生過程で内因性タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御する、高度に保存された小さなRNA種をコードする。活性RNA種は、まず約70ntの前駆体として転写され、これが約21ntの成熟型に転写後プロセシングされる。let−7及びlin−4は両方とも、ヘアピンRNA前駆体として転写され、これがDicer酵素によって成熟型にプロセシングされる。
アンチセンスの概念は、修飾されている可能性もある短いDNA又はRNA分子を、細胞内のメッセンジャーRNAに選択的に結合させ、コードされたタンパク質の合成を防止することである。
標的タンパク質の発現を調整するためのsiRNA、shRNA、miRNA及びアンチセンスDNA/RNAの設計方法、並びにこれらの作用剤を目的の細胞に送達するための方法は、当技術分野においてよく知られている。更に、例えば組織特異的プロモーターを使用することによって、生物体内である特定の細胞タイプにおけるタンパク質の発現を特異的に調整する(例えば減少させる)ための方法は、当技術分野でよく知られている。
抗体
「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、選択された標的に結合することができる完全抗体又は抗体断片を指し、Fv、ScFv、F(ab’)及びF(ab’)2、モノクローナル及びポリクローナル抗体、改変抗体(キメラ、CDR移植及びヒト化抗体を含む)、並びにファージディスプレイ又は代替技術を使用して生成された人工選択抗体を含む。
「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、選択された標的に結合することができる完全抗体又は抗体断片を指し、Fv、ScFv、F(ab’)及びF(ab’)2、モノクローナル及びポリクローナル抗体、改変抗体(キメラ、CDR移植及びヒト化抗体を含む)、並びにファージディスプレイ又は代替技術を使用して生成された人工選択抗体を含む。
加えて、伝統的な抗体の代替物、例えば「アビボディ(avibody)」、「アビマー(avimer)」、「アンチカリン(anticalin)」、「ナノボディ(nanoboy)」及び「DARPin」もまた本発明で使用することができる。
抗体の製造方法は当業者に知られている。あるいは、抗体は商業的供給源から得てもよい。
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択された哺乳動物(例えば、マウス、ウサギ、ヤギ又はウマ)を免疫することができる。免疫した動物の血清を回収し、既知の手順に従って処理することができる。血清が他の抗原に対するポリクローナル抗体を含有する場合、ポリクローナル抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ポリクローナル抗血清を製造及び処理するための技術は、当技術分野において知られている。
本発明において使用される抗原(例えばタンパク質)に対するモノクローナル抗体もまた、当業者は容易に製造することができる。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を作製するための一般的方法はよく知られている。細胞融合によって、また、発がん性DNAを用いたBリンパ球の直接形質転換、又はEpstein−Barrウイルスを用いたトランスフェクションなどの他の技術によって、抗体を産生する不死細胞系を作出することができる。抗原に対して製造されたモノクローナル抗体のパネルは、様々な特性に関して、例えばアイソタイプ及びエピトープ親和性に関して、スクリーニングすることができる。
代替技術は、例えば、ファージが多種多様な相補性決定領域(CDR)を有するそのコートの表面上にscFv断片を発現する、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングを伴う。この技術は当技術分野でよく知られている。
抗原に対する抗体は、モノクローナル及びポリクローナルの両方とも、診断において特に有用であり、中和抗体は受動免疫療法において有用である。特にモノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体を産生させるために使用され得る。抗イディオタイプ抗体は、保護したい感染病原体の抗原の「内部イメージ(internal image)」を有する免疫グロブリンである。
抗イディオタイプ抗体を産生させるための技術は当技術分野において知られている。これらの抗イディオタイプ抗体はまた、治療のために、並びに抗原の免疫原性領域を解明するためにも有用であり得る。
ポリペプチド及びポリヌクレオチドの細胞への導入
本発明において使用するための作用剤は、例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチド及びポリペプチドはまた、本発明の方法又はスクリーニングアッセイの一部として細胞中に導入される必要がある。
本発明において使用するための作用剤は、例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチド及びポリペプチドはまた、本発明の方法又はスクリーニングアッセイの一部として細胞中に導入される必要がある。
本発明がポリペプチドを利用する場合、ポリペプチドは、細胞に直接投与されてもよく(例えばポリペプチド自体が投与されてもよい)、又は、対象とする細胞内でポリペプチドの発現を可能にする条件下で、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入することによって、投与されてもよい。ポリヌクレオチドは、ベクターを使用して細胞中に導入してもよい。
ベクターは、ある実体を1つの環境から別の環境に移動させることを可能にする、又は容易にするツールである。本発明によれば、また例として、組み換え核酸技術において使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント(例えば、異種cDNAセグメントなどの異種DNAセグメント)などの実体を標的細胞に移動させることができる。ベクターは、細胞内に異種核酸(例えばDNA又はRNA)を維持するのに、核酸のセグメントを含むベクターの複製を容易にするのに、又は核酸のセグメントにコードされるタンパク質の発現を容易にするのに、役立ち得る。ベクターは、非ウイルス性又はウイルス性であり得る。組み換え核酸技術において使用されるベクターの例としては、プラスミド、染色体、人工染色体及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターはまた、例えば裸の核酸(例えばDNA)であってもよい。最も単純な形態において、ベクター自体が目的のヌクレオチドであってもよい。
本発明において使用されるベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスベクターであってもよく、ポリヌクレオチドの発現用プロモーター及び場合によりプロモーターのレギュレーターを含む。
本発明において使用されるポリヌクレオチドを含むベクターは、形質導入及びトランスフェクションなどの当技術分野で知られている様々な技術を使用して細胞中に導入することができる。この目的に好適ないくつかの技術、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス及び単純ヘルペスウイルスなどの組み換えウイルスベクターによる感染、核酸の直接注入並びにバイオリスティック形質転換などが当技術分野において知られている。
非ウイルス性送達系としては、DNAトランスフェクション法が挙げられるが、これらに限定されない。ここで、トランスフェクションは、標的細胞に遺伝子を送達するための非ウイルス性ベクターを使用するプロセスを含む。
ポリペプチド又はポリヌクレオチドの移動は、細胞膜を物理的又は化学的に透過処理することができる、当技術分野において知られている方法のいずれかによって行うことができる。細胞透過性ペプチドもまた、細胞中にポリペプチドを移動させるために使用することができる。
加えて、本発明は、遺伝子ターゲティングプロトコール、例えばDNA修飾剤の送達を用いてもよい。
ベクターは発現ベクターであってもよい。本明細書に記載の発現ベクターは、転写可能な配列を含む核酸の領域を含む。よって、mRNA、tRNA、及びrRNAをコードする配列はこの定義に含まれる。
発現ベクターは、宿主細胞にコード配列を発現させることができる調節配列に作動可能に連結された、本発明において使用するためのポリヌクレオチドを含むことが好ましい。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、調節配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような方法で、ライゲーションされる。調節配列を、例えば、更なる転写制御エレメントを付加することによって修飾して、調節配列によって指令される転写のレベルを、転写モジュレーターに対してより反応性にしてもよい。
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、DNA又はRNAを含み得る。これらは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。遺伝コードの縮重の結果として、非常に多くの異なるポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードすることができるということが当業者には理解されるであろう。また、当業者であれば、本発明のポリペプチドを発現させる任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映させるために、通常の技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさない核酸置換を行うことができることが理解されるべきである。
本発明のポリヌクレオチドは、DNA又はRNAを含み得る。これらは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。遺伝コードの縮重の結果として、非常に多くの異なるポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードすることができるということが当業者には理解されるであろう。また、当業者であれば、本発明のポリペプチドを発現させる任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映させるために、通常の技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさない核酸置換を行うことができることが理解されるべきである。
ポリヌクレオチドは、当技術分野において利用可能な任意の方法によって変更することができる。そのような変更は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性又は寿命を向上させるために実施してもよい。
DNAポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、組み換えにより、合成により、又は当業者に利用可能な任意の手段によって製造することができる。これらはまた、標準的な技術によってクローニングされてもよい。
より長いポリヌクレオチドは、一般に、組み換え手段を使用して、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるクローニング技術を使用して、製造される。この技術では、クローニングしたい標的配列に隣接するプライマー(例えば約15〜30ヌクレオチド)のペアを作製し、これらのプライマーを、mRNA又はcDNA、例えば動物又はヒト細胞から得たmRNA又はcDNAに接触させ、所望の領域を増幅させる条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅された断片を単離し(例えばアガロースゲルで反応混合物を精製することによって)、増幅されたDNAを回収する。プライマーは、増幅されたDNAを好適なベクター中にクローニングすることができるように、好適な制限酵素認識部位を含むように設計され得る。
タンパク質
本明細書で使用する場合、「タンパク質」という用語は、単鎖ポリペプチド分子、並びに個々の構成ポリペプチドが共有結合又は非共有結合手段により連結されている、複数のポリペプチドの複合体を含む。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、モノマーがアミノ酸であり、それらがペプチド又はジスルフィド結合を介してつなぎ合わされている、ポリマーを指す。
本明細書で使用する場合、「タンパク質」という用語は、単鎖ポリペプチド分子、並びに個々の構成ポリペプチドが共有結合又は非共有結合手段により連結されている、複数のポリペプチドの複合体を含む。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、モノマーがアミノ酸であり、それらがペプチド又はジスルフィド結合を介してつなぎ合わされている、ポリマーを指す。
多様体、誘導体、アナログ、ホモログ、及び断片
本明細書で言及されている特定のタンパク質及びヌクレオチドに加えて、本発明は、それらの多様体(variant)、誘導体、アナログ、ホモログ及び断片も包含する。
本明細書で言及されている特定のタンパク質及びヌクレオチドに加えて、本発明は、それらの多様体(variant)、誘導体、アナログ、ホモログ及び断片も包含する。
本発明の状況において、任意の配列の多様体は、残基(アミノ酸残基又は核酸残基のいずれであっても)の特定の配列が、当該ポリペプチド又はポリヌクレオチドが内因性の機能のうちの少なくとも1つを保持するように変更されている、配列である。多様体配列は、天然に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド中に存在する少なくとも1つの残基の付加、欠失、置換、修飾、置き換え及び/又は多様性によって得ることができる。
本明細書で使用する「誘導体」という用語は、本発明のタンパク質又はポリペプチドに関して、その配列からの又はそれに対する1つ(以上)のアミノ酸残基の任意の置換、多様性、修飾、置き換え、欠失及び/又は付加を含み、ただし、得られるタンパク質又はポリペプチドはその内因性の機能のうちの少なくとも1つを保持する。
本明細書で使用する「アナログ」という用語は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関して、任意の模倣物、すなわち、模倣するポリペプチド又はポリヌクレオチドの内因性の機能のうちの少なくとも1つを保有する化合物を含む。
典型的には、アミノ酸置換は、例えば1、2又は3〜10又は20の置換を行ってもよく、ただし、変更された配列は必要な活性又は能力を保持する。アミノ酸置換は、天然に存在しないアナログの使用を含み得る。
本発明で使用されるタンパク質はまた、サイレントな変化をもたらし、結果として機能的に等価なタンパク質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有してもよい。内因性の機能が保持されている限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び/又は両親媒性の類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としてはリジン及びアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有する無電荷極性頭部を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びチロシンが挙げられる。
保存的な置換は、例えば下記の表3に従って行うことができる。2列目の同じ区画内のアミノ酸、好ましくは3列目の同じ行内にあるアミノ酸は、互いに置換することができる。
「ホモログ」という用語は、野生型アミノ酸配列又は野生型ヌクレオチド配列とある一定の相同性を有する実体を意味する。「相同性」という用語は、「同一性」と同等とみなすことができる。
本発明の状況において、相同配列は、対象配列と少なくとも50%、55%、65%、75%、85%又は90%同一、好ましくは少なくとも95%又は97%又は99%同一であり得るアミノ酸配列を含むと考えられる。典型的には、ホモログは、対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性は類似性(すなわち類似した化学的性質/機能を有するアミノ酸残基)に関して考察することもできるが、本発明の状況においては、相同性は配列同一性に関して表すことが好ましい。
本発明の状況において、相同配列は、対象配列と少なくとも50%、55%、65%、75%、85%又は90%同一、好ましくは少なくとも95%又は97%又は99%同一であり得るヌクレオチド配列を含むと考えられる。相同性は類似性に関して考察することもできるが、本発明の状況においては、相同性は配列同一性に関して表すことが好ましい。
好ましくは、本明細書に詳述されている配列番号のうちのいずれか1つに対してある同一性(%)を有する配列についての言及は、参照する配列番号の全長に対して記載の同一性(%)を有する配列を指す。
相同性比較は、目測で、又はより一般的には、容易に利用できる配列比較プログラムを用いて実施することができる。これらの市販のコンピュータプログラムにより、2つ以上の配列間の相同性又は同一性(%)を計算することができる。
相同性(%)は、連続的な配列に対して計算することができる。すなわち、一方の配列を他方の配列とアラインメントし、一方の配列中の各アミノ酸又はヌクレオチドを他方の配列中の対応するアミノ酸又はヌクレオチドと一度に1残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれている。典型的には、こうしたギャップなしアラインメントは、比較的短い残基数に対してのみ行われる。
これは極めて単純かつ一貫した方法であるが、例えば、それ以外の点では同一の配列ペアにおいて、アミノ酸又はヌクレオチド配列中の1つの挿入又は欠失により、後続する残基又はコドンがアラインメントから外れる場合があることを考慮していないため、グローバルアラインメントを実施する場合には、相同性(%)が大幅に低下する可能性がある。そのため、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに過度にペナルティを適用することなく、考えられる挿入及び欠失を考慮に入れた最適なアラインメントを生成するように設計されている。これは、局所相同性を最大にするように、配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸又はヌクレオチドに関して、2つの比較配列間の関係性がより高いことを反映する可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメントが、多数のギャップを有する配列アラインメントよりも高いスコアを達成するように、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てている。典型的には、ギャップの存在には比較的高いコストを課し、ギャップ中の後続する各残基にはより小さなペナルティを課す、「アフィンギャップコスト(Affine gap cost)」が使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。当然のことながら、ギャップペナルティが高いと、ギャップのより少ない最適化アラインメントが生成される。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、配列比較のためにこのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージを用いる場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは、ギャップについては−12であり、各伸長については−4である。
したがって、最大相同性(%)の算出には、まず、ギャップペナルティを考慮した最適アラインメントの生成が必要である。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータプログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージである(University of Wisconsin,U.S.A.;Devereux et al.(1984)Nucleic Acids Research 12:387)。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、BLASTパッケージ(Ausubel et al.(1999)同書18章参照)、FASTA(Atschul et al.(1990)J.Mol.Biol.403〜410)及びGENEWORKS suiteの比較ツールが挙げられるが、これらに限定されない。BLASTとFASTAは両方ともオフライン及びオンライン検索が利用可能である(Ausubel et al.(1999)同書7−58〜7−60頁参照)。しかしながら、いくつかの用途については、GCG Bestfitプログラムを使用するのが好ましい。BLAST2 Sequencesという別のツールもまた、タンパク質及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である(FEMS Microbiol.Lett.(1999)174(2):247〜50;FEMS Microbiol.Lett.(1999)177(1):187〜8)。
最終的な相同性(%)は同一性の点から測定することができるが、アラインメントプロセスそのものは、通常、イエスかノーか(all−or−nothing)のペア比較に基づいていない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを割り当てる、置換類似性スコア行列(scaled similarity score matrix)が通常使用される。一般的に使用されるこのような行列の例は、BLOSUM62行列(BLASTスイートプログラムのデフォルト行列)である。GCG Wisconsinプログラムは、通常、パブリックデフォルト値(public default value)、又は提供される場合はカスタムシンボル(customsymbol)比較表のいずれかを使用する(更なる詳細についてはユーザマニュアル参照)。いくつかの用途については、GCGパッケージ用のパブリックデフォルト値を用いるか、他のソフトウェアの場合は、BLOSUM62などのデフォルト行列を使用するのが好ましい。
ソフトウェアにより最適アラインメントが生成されたら、相同性(%)、好ましくは配列同一性(%)を算出することができる。典型的には、ソフトウェアは、配列比較の一部としてこれを行い、数値による結果を生成する。
「断片」もまた多様体であり、この用語は典型的には、機能的に又は例えばアッセイにおいて、対象となる、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの選択された領域を指す。したがって「断片」は、完全長ポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部分であるアミノ酸配列又は核酸配列を指す。
このような多様体は、部位特異的変異導入などの標準的な組み換えDNA技術を使用して調製することができる。挿入がなされる場合、挿入部位の両側の天然に存在する配列に相当する5’及び3’隣接領域と合わせて挿入部位をコードしている、合成DNAが作製され得る。隣接領域は、配列が適切な酵素により切断され、合成DNAが切断部分にライゲーションされ得るように、天然に存在する配列中の部位に対応する好都合な制限部位を含有する。次に、このDNAを本発明により発現させて、コードされているタンパク質を作製する。これらの方法は、DNA配列を操作するための当技術分野で知られている数多くの標準的な技術を単に例示するものであり、他の既知の技術も使用することができる。
コドン最適化
本発明で使用されるポリヌクレオチドは、コドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、国際公開第1999/41397号及び国際公開第2001/79518号において以前記載されている。異なる細胞は、特定のコドンの使用頻度が異なる。このコドンの偏りは、その細胞タイプにおける特定のtRNAの相対的な存在量の偏りに対応する。対応するtRNAの相対的な存在量に一致するように調整されるように配列中のコドンを変更することによって、発現を増加させることができる。同様の理由で、特定のタイプの細胞において低頻度であることが知られている対応するtRNAのコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることができる。したがって、更に高度な翻訳調節が利用可能である。哺乳動物細胞について、並びに様々な他の生物について、コドン使用頻度表は当技術分野において知られている。
本発明で使用されるポリヌクレオチドは、コドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、国際公開第1999/41397号及び国際公開第2001/79518号において以前記載されている。異なる細胞は、特定のコドンの使用頻度が異なる。このコドンの偏りは、その細胞タイプにおける特定のtRNAの相対的な存在量の偏りに対応する。対応するtRNAの相対的な存在量に一致するように調整されるように配列中のコドンを変更することによって、発現を増加させることができる。同様の理由で、特定のタイプの細胞において低頻度であることが知られている対応するtRNAのコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることができる。したがって、更に高度な翻訳調節が利用可能である。哺乳動物細胞について、並びに様々な他の生物について、コドン使用頻度表は当技術分野において知られている。
治療方法
本明細書において「治療」についてなされる全ての言及は、治癒的、緩和的、及び予防的治療を含むことを理解されたい。哺乳動物、特にヒトの治療が好ましい。ヒト及び動物の両方の治療が本発明の範囲内にある。
本明細書において「治療」についてなされる全ての言及は、治癒的、緩和的、及び予防的治療を含むことを理解されたい。哺乳動物、特にヒトの治療が好ましい。ヒト及び動物の両方の治療が本発明の範囲内にある。
投与
本発明において使用するための作用剤は単独で投与することもできるが、一般に、特にヒトの治療では、医薬担体、添加剤又は賦形剤と混合して投与される。
本発明において使用するための作用剤は単独で投与することもできるが、一般に、特にヒトの治療では、医薬担体、添加剤又は賦形剤と混合して投与される。
いくつかの実施形態では、作用剤は、栄養剤、食品添加物又は食品原材料であり、したがって好適な食品組成物中に配合することができる。よって、作用剤は、例えば、食品製品、飲料、ペットフード製品、栄養補助食品、ニュートラシューティカルズ又は栄養フォーミュラの形態で投与することができる。
投与量
当業者は、過度な実験を行うことなく、対象に投与するための本発明の作用剤の1つの適切な用量を容易に決定することができる。典型的には、医師は個々の患者に最も好適となる実際の投与量を決定するが、これは、用いる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用期間、年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与方法及び時間、排泄速度、併用薬物、特定の状態の重症度、並びに個々の受けている治療を含む様々な因子によって決まるであろう。当然ながら、より高い又はより低い投与量範囲が妥当である個々の事例があってもよく、こういった事例も本発明の範囲内である。
当業者は、過度な実験を行うことなく、対象に投与するための本発明の作用剤の1つの適切な用量を容易に決定することができる。典型的には、医師は個々の患者に最も好適となる実際の投与量を決定するが、これは、用いる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用期間、年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与方法及び時間、排泄速度、併用薬物、特定の状態の重症度、並びに個々の受けている治療を含む様々な因子によって決まるであろう。当然ながら、より高い又はより低い投与量範囲が妥当である個々の事例があってもよく、こういった事例も本発明の範囲内である。
対象
「対象」は、ヒト又はヒト以外の動物のいずれかを指す。
「対象」は、ヒト又はヒト以外の動物のいずれかを指す。
ヒト以外の動物の例としては、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒト以外の霊長類動物(特に高等霊長類動物)、イヌ、齧歯類動物(例えばマウス、ラット又はモルモット)、ブタ及びネコが挙げられる。ヒト以外の動物はコンパニオンアニマルであってもよい。
好ましくは、対象はヒトである。
実施例1
この研究は、Diogenes減量介入データに対し実施したタンパク質量的形質遺伝子座(pQTL)解析に関する。Diogenes研究は、全ヨーロッパの無作為化対照食事介入研究であり、8つのヨーロッパの施設において肥満及び過体重家族における減量及び体重維持に対する食事タンパク質及びグリセミックインデックスの影響を調査している(Larsenら(2009)Obesity Rev.11:76〜91)。簡潔に述べると、Diogenes研究では、スクリーニングした参加者に低カロリー食(LCD)期間(CID1)を設け、この期間で、過体重/肥満対象には8週間のModifast(登録商標)食(約800kCal/日)を遵守させ、次に体重維持期間(CID2)を続けた。
この研究は、Diogenes減量介入データに対し実施したタンパク質量的形質遺伝子座(pQTL)解析に関する。Diogenes研究は、全ヨーロッパの無作為化対照食事介入研究であり、8つのヨーロッパの施設において肥満及び過体重家族における減量及び体重維持に対する食事タンパク質及びグリセミックインデックスの影響を調査している(Larsenら(2009)Obesity Rev.11:76〜91)。簡潔に述べると、Diogenes研究では、スクリーニングした参加者に低カロリー食(LCD)期間(CID1)を設け、この期間で、過体重/肥満対象には8週間のModifast(登録商標)食(約800kCal/日)を遵守させ、次に体重維持期間(CID2)を続けた。
これは、Illuminaチップ上で遺伝子型を同定したありふれた多様体(common variant)と、介入中のタンパク質発現変化との間の関連を試験し、体格指数(BMI)変化に関連するタンパク質に注目した最初の研究である。
この研究において、Illuminaチップ上で観察されないSNPは、ヨーロッパ人の1000ゲノム(1000 Genome)集団を参照ゲノムとして用いて、Minimac3ツールを使用して補完(impute)した。以下の特定のQC閾値:MAF≧0.01及びHardy−Weinberg平衡からの有意なずれ(P>1.0e−6)を超えた多様体から、最も存在確率の高い(best−guess)遺伝子型(80%の最も存在確率の高いジェノタイプをもとに算出)を使用して、解析を行った。これらの新たなデータに基づいて新たなpQTL解析を行って、以前に関連していた領域中の更なる関連シグナルを抽出するか、又は新たな領域を特定した。
材料及び方法
データ
コホートには、血漿から抽出した1129のSomalogicタンパク質に関するCID1及びCID2における情報を有する498名の参加者が含まれていた。遺伝子データインピュテーション(imputation)により、QCプロセスを通過した4020756のSNPが導かれた。Somalogic技術を用いてタンパク質発現情報を得た。データを前処理し、品質を管理した。遺伝子発現(rnaSEQ技術、品質管理後、脂肪組織からの15000近くの転写物に関して情報が利用可能である)及びメタボロミクスデータもまた利用可能であり、この研究で使用した。
データ
コホートには、血漿から抽出した1129のSomalogicタンパク質に関するCID1及びCID2における情報を有する498名の参加者が含まれていた。遺伝子データインピュテーション(imputation)により、QCプロセスを通過した4020756のSNPが導かれた。Somalogic技術を用いてタンパク質発現情報を得た。データを前処理し、品質を管理した。遺伝子発現(rnaSEQ技術、品質管理後、脂肪組織からの15000近くの転写物に関して情報が利用可能である)及びメタボロミクスデータもまた利用可能であり、この研究で使用した。
方法
低カロリー食(LCD)の間のBMIと各タンパク質発現変化との関連を、線形回帰(「単変量」回帰)を用いて試験した。BMI変化を交絡補助因子(confounding cofactor)(性別、年齢及び施設)に関して回帰させ、残差をΔタンパク質発現に対して回帰させた。P値は、Benjamini−Hochbergの標準的な偽発見率補正を使用して多重検定補正した。
低カロリー食(LCD)の間のBMIと各タンパク質発現変化との関連を、線形回帰(「単変量」回帰)を用いて試験した。BMI変化を交絡補助因子(confounding cofactor)(性別、年齢及び施設)に関して回帰させ、残差をΔタンパク質発現に対して回帰させた。P値は、Benjamini−Hochbergの標準的な偽発見率補正を使用して多重検定補正した。
SNPとタンパク質発現との間のpQTL関連付けを、線形混合モデル(LMM)を使用して行った。LMMは、関連マッピングのための新しい選択方法であり、遺伝的な集団不均一性(ヨーロッパ各地の異なる参加者募集施設により生じた地理的集団構造)の補正を可能にする。基本的な手法は、チップ上の利用可能な全ての(又は一部の)SNPを使用して(このステップの間は推測された(imputed)SNPは使用しなかった)、ゲノムワイドなサンプル構造(研究における全ての患者の遺伝的バックグラウンド)をモデル化した遺伝的関係行列(GRM)を構築するというものである。ランダム効果モデルを用いてタンパク質発現分散への関与を推定し、この分散の成分の理由となる関連統計値をコンピュータ計算する。LMM関連方法は、ヒト及びモデル生物の研究における遺伝子多様体と形質との間の偽陽性関連を防止するのに有効である。本研究において、従属変数は、年齢、性別及び施設に関する回帰のタンパク質発現残差であり、独立変数はSNPであった。各タンパク質について、ゲノムワイド関連解析(GWAS)を行い、各SNPを独立に試験した。
研究中のSNPと同じ染色体に属する全てのSNPを除外する「loco」オプションでLMM演算処理にGCTAソフトウェアを使用して、多重共線性を回避した。研究中のSNP、及び連鎖不平衡の状態にある全てのSNPをGRMにおいて使用した場合、ヌルモデルの対数尤度は、そうであるべきものよりも高くなり、試験統計値のデフレーション(deflation)及び検出力の低下をもたらすであろう。この現象は「プロキシマルコンタミネーション(proximal contamination)」と呼ばれる。
全てのタンパク質についてGWAS pQTLを行った。介入中のBMI変化に関連するΔ発現を有するタンパク質について結果を抽出した。多重検定補正は適用しなかった。本発明者らの目的は、トランスクリプトミクス及びジェネティクス(ゲノム配列決定)を含むオミクス情報を用いて更に解析するためにpQTLを強調/優先することであった。
Rスクリプト(launch_locuszoom.R)で実行されるLocusZoomソフトウェアを使用して、1000ゲノム(1000 Genomes)ヨーロッパ人遺伝子データを参照(hg19)として使用して、結果をプロットした。
GeneMANIA(Zuberi,K.et al.(2013)Nucleic Acids Res.41(Web Server issue):W115−22)を使用して、遺伝子共発現を評価した。定義により、遺伝子発現研究においてそれらの発現レベルが複数の条件にわたって同様であれば、2つの遺伝子は連結されている(共発現される)。これらのデータの大部分はGene Expression Omnibus(GEO)から収集されており、出版物に関連するデータだけを収集している。
QCステップ、並列化pQTL GWAS、有意なシグナルの抽出及びプロットを含む結果抽出に対するMinimac補完データ出力によるRにパイプラインを書き込んだ。
LCD中の発現変化がBMI変化と関連していた「上位(top)」タンパク質のセットに基づいて、pQTL結果を抽出し、調査した。LCD中のタンパク質若しくは発現、BMI又は他の共変数の変化は、明記されていない限り、本発明の前後の発現/レベルの変化を意味する。
結果
解析を開始する前に、全てのタンパク質についてFDR q値<0.20、かつMAF>0.05のSNPを抽出した。次に、それらがシス/トランスに作用する影響を、対応するコード遺伝子の周囲の+/−500kbの位置によって評価した。q値は、所与の試験及びより小さいp値を(及びことによると、FDRを改善するならば更により大きいp値も)有する全ての試験を受けることによって被った偽発見率(FDR)の尺度となる。
解析を開始する前に、全てのタンパク質についてFDR q値<0.20、かつMAF>0.05のSNPを抽出した。次に、それらがシス/トランスに作用する影響を、対応するコード遺伝子の周囲の+/−500kbの位置によって評価した。q値は、所与の試験及びより小さいp値を(及びことによると、FDRを改善するならば更により大きいp値も)有する全ての試験を受けることによって被った偽発見率(FDR)の尺度となる。
全ての1129のタンパク質で、q値<0.05関連カットオフに達するシス作用性SNPはなかった。0.20の緩和FDRカットオフ(relaxing FDR cutoff)では、シス作用性SNPは特定されず、トランス作用性SNPだけが特定された。
LCD中のタンパク質発現変化
多重検定補正し、p値カットオフを5%に設定すると想定したら、減量介入中に55のタンパク質がBMIと正に、52が負に相関していた。LCD中にBMIと関連する全てのタンパク質に関して、Kendal相関τ相関係数に基づいて相関ヒートマップを構築した。Kendallτ順位相関は、2つの順序(又は順位変換)変数(Spearmanの変数に類似)間の統計的従属性に関するノンパラメトリック検定であるが、これはSpearmanのものとは異なり、同順位(タイ)を扱うことができる。階層的クラスタリングを用いて、潜在的クラスターを特定した。本発明者らによれば、おそらくこの大きなリストにおける非常に多くの偽陽性結果のために、タンパク質について明確な境界のある大きなブロックは観察されなかった。
多重検定補正し、p値カットオフを5%に設定すると想定したら、減量介入中に55のタンパク質がBMIと正に、52が負に相関していた。LCD中にBMIと関連する全てのタンパク質に関して、Kendal相関τ相関係数に基づいて相関ヒートマップを構築した。Kendallτ順位相関は、2つの順序(又は順位変換)変数(Spearmanの変数に類似)間の統計的従属性に関するノンパラメトリック検定であるが、これはSpearmanのものとは異なり、同順位(タイ)を扱うことができる。階層的クラスタリングを用いて、潜在的クラスターを特定した。本発明者らによれば、おそらくこの大きなリストにおける非常に多くの偽陽性結果のために、タンパク質について明確な境界のある大きなブロックは観察されなかった。
9のタンパク質に関して、P<1.0e−06の関連(BH多重検定補正後)が観察された。Bonferroniの補正後、これらの9のタンパク質間で、非常に有意に相関するブロックが認められた。多重検定補正した5%未満のp値を有するタンパク質ペアに関するKendall相関レベル。IL1RAP遺伝子コードタンパク質以外の全てを含むタンパク質について2つの反相関ブロックが観察された。
表4は、これらの9タンパク質の概要を、Somalogic ID、コード遺伝子名、UNIPROT ID、BMIとp値との相関方向(推定p値、PVAL:及びBenjamin−Hochberg法(BH)に基づいて多重検定補正されたp値、PBH)とともに示す。レプチン、成長ホルモン受容体、TIG2(ケメリン)及びSAPを含むタンパク質の第1のブロックは、LCD中のBMI変化と正に相関し、NRP1、SHBG、IGFBP−2、アンジオポエチン−2及びIL−1 R AcPを含む第2のブロックはBMI変化と負に相関していた。
下記の結果は、肥満及び/又は関連する形質に関与する可能性がある遺伝子において有望なpQTL結果を有するタンパク質に関するものである。他の遺伝子は、GWA pQTL強化シグナルを有さない、及び上位SNPが潜在的に関心対象となる遺伝子を標的化していないとして廃棄した。
レプチン
pQTL結果
「満腹ホルモン」であるレプチンは、空腹感を抑えることによってエネルギー収支を制御するのに役立つ、脂肪細胞によって生成されるホルモンである。肥満では、レプチンに対する感受性の減少が起こり、多量のエネルギーが蓄えられているにもかかわらず満腹感を感知できなくなる。減量中、レプチンレベルは低下し、食物摂取の感情的、認知的及び感覚的な調節に関与する領域において脳の活動が増加する。レプチンレベルが回復すると減量は維持され、脳活動の変化は元に戻る。このように、レプチンは、エネルギー貯蔵の減少を摂食行動に関連させる重要な因子である(Ahima,R.S.(2008)J.Clin.Invest.118:2380〜2383)。
pQTL結果
「満腹ホルモン」であるレプチンは、空腹感を抑えることによってエネルギー収支を制御するのに役立つ、脂肪細胞によって生成されるホルモンである。肥満では、レプチンに対する感受性の減少が起こり、多量のエネルギーが蓄えられているにもかかわらず満腹感を感知できなくなる。減量中、レプチンレベルは低下し、食物摂取の感情的、認知的及び感覚的な調節に関与する領域において脳の活動が増加する。レプチンレベルが回復すると減量は維持され、脳活動の変化は元に戻る。このように、レプチンは、エネルギー貯蔵の減少を摂食行動に関連させる重要な因子である(Ahima,R.S.(2008)J.Clin.Invest.118:2380〜2383)。
QQプロットは、関連シグナルの強化を示した(ゲノムインフレーション因子(genomic inflation factor)(GIF)=1.0147153,1.6930767×10−5)。この強化は、第6染色体上の特定領域を標的とする。
レプチンに関する上位10位のpQTL結果は、同じ標的領域中のSNPを含む(表5は、完全な連鎖不平衡(LD)にはない上位10位のSNPだけを示す)。この領域は、ncRNAを含み、BCKDHB遺伝子の制御領域中に位置する(http://www.genecards.org/cgi−bin/carddisp.pl?gene=BCKDHB&keywords=BCKDHB)。図1は、第6染色体のこの特定領域に関して拡大したマンハッタンプロットを示す。
BCKDHB酵素複合体は、ロイシン、イソロイシン及びバリンの通常の分解において1つのステップを担う。これらの3つのアミノ酸は、食事から得られ、多種類の食品、特に乳、肉、卵などのタンパク質が豊富な食品中に存在する。
トランス作用性SNP遺伝子型に基づいて層別化されたタンパク質発現は、図2に示す有意性にもかかわらず、発現の顕著な差異を明確にしなかった。しかしながら、SNPは一般に機能的多様体のサロゲートマーカーであるため、インピュテーションしたにもかかわらず真の原因となる多様体は利用できない可能性がある。
BCKDHB遺伝子発現分析
BCKDHB遺伝子に関して、rnaSEQからの発現データが利用可能であった。この遺伝子は、Benjamini−Hochberg法を使用した多重検定補正後に、LCD介入中に顕著に下方制御された(P=1.1e−11)。BMI変化に対する関連は、名目上のレベル(nominal level)(P=0.016)で観察されたが、多重検定補正を通過しなかった(P=0.179)。プロテオミクス及びrnaSEQデータを有する126名の参加者のサブセットに関して、有意な正の関連が観察された。BMIは、レプチン(P=1.6e−8)及びBCKDHB(P=2.4e−2)発現と正に関連(交絡補助因子についての補正後)しており、レプチンタンパク質の発現もまた、BCKDHB遺伝子発現と正の関連を示した(P=2.6e−3)。
BCKDHB遺伝子に関して、rnaSEQからの発現データが利用可能であった。この遺伝子は、Benjamini−Hochberg法を使用した多重検定補正後に、LCD介入中に顕著に下方制御された(P=1.1e−11)。BMI変化に対する関連は、名目上のレベル(nominal level)(P=0.016)で観察されたが、多重検定補正を通過しなかった(P=0.179)。プロテオミクス及びrnaSEQデータを有する126名の参加者のサブセットに関して、有意な正の関連が観察された。BMIは、レプチン(P=1.6e−8)及びBCKDHB(P=2.4e−2)発現と正に関連(交絡補助因子についての補正後)しており、レプチンタンパク質の発現もまた、BCKDHB遺伝子発現と正の関連を示した(P=2.6e−3)。
レプチン遺伝子とタンパク質発現は高度に相関(関連p値=3.15e−9)しており、LCD中のBCKDHBとレプチン(LEP)変化(p=2.8e−9)、及びより少ない程度ではあるがBCKDHBとレプチンタンパク質(p=0.0026)も同様であった。関連の方向は、試験した変数の全てのペアに関して同じ(正)であった。
メタボロミクスとの統合
BCKD酵素複合体は、ロイシン、イソロイシン及びバリンの分解に関与してエネルギーを供給するミトコンドリアにおいて活性である。Stroeveら(Stroeve,J.H.(2016)Obesity 24:379〜388)は、バリンが減量成功には不利に働くことを観察した。
BCKD酵素複合体は、ロイシン、イソロイシン及びバリンの分解に関与してエネルギーを供給するミトコンドリアにおいて活性である。Stroeveら(Stroeve,J.H.(2016)Obesity 24:379〜388)は、バリンが減量成功には不利に働くことを観察した。
ロイシン、バリン及びイソロイシンについて抽出されたメタボロミクスデータの分析から、全ての3つの分岐鎖アミノ酸(BCAA)はLCD中に示差的に発現された(ノンパラメトリックWilcoxon対応のある検定、表6及び図3)。
BCKDHB遺伝子発現は、LCD中のバリン及びロイシンの変化に関連していた(表7)が、イソロイシンとは関連していなかった。
上記明細書で言及した全ての出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された作用剤及び方法の様々な修正形態及び変形形態が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかとなるであろう。本発明を特定の好適な実施形態とともに記載したが、請求される本発明は、こうした特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、本発明を実施するための記載された方法の様々な修正は、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に明らかであり、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
Claims (16)
- レプチンレベルを増加させるのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)の活性を増加させることができる作用剤。
- 満腹感をサポートするのに使用するための、請求項1に記載の作用剤。
- 体重維持をサポートするのに、かつ/又は肥満を治療若しくは予防するのに使用するための、請求項1又は2に記載の作用剤。
- 前記作用剤が、BCKDH E1 Bサブユニットの活性を増加させる、請求項1〜3に記載の使用のための作用剤。
- 前記作用剤が、減量介入中又はその後に、好ましくは減量介入後に対象に投与される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用のための作用剤。
- 前記作用剤が、対象においてBCKDHのレベルを増加させる、好ましくは、前記作用剤が、対象においてBCKDH E1 Bサブユニットのレベルを増加させる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用のための作用剤。
- 前記作用剤が、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDHキナーゼ)の活性に影響を及ぼさない、請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用のための作用剤。
- 前記作用剤が、レスベラトロール若しくはバルプロ酸から選択されるか、又は表1a若しくは表1bに記載された作用剤から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用のための作用剤。
- 前記作用剤が、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDHキナーゼ)の活性を減少させ、好ましくは前記作用剤が、siRNA、shRNA、miRNA、アンチセンスRNA、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用のための作用剤。
- 前記作用剤が、BCKDHキナーゼのレベルを減少させる、請求項9に記載の使用のための作用剤。
- 前記作用剤が、α−クロロイソカプロン酸若しくはα−ケトイソカプロン酸(KIC)であるか、又は表2に記載された作用剤から選択される、請求項9又は10に記載の使用のための作用剤。
- 対象において体重維持をサポートすること、及び/又は肥満を治療若しくは予防することができる作用剤を特定する方法であって、
(a)分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ(BCKDH)ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)前記候補作用剤が、前記BCKDHポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法。 - 前記BCKDHが、BCKDH E1 Bサブユニットである、請求項12に記載の方法。
- 前記方法が、BCKDHを含む前記製剤を候補作用剤と接触させること、及びNAD+からNADHへの変換を測定すること、を含む、請求項12又は13に記載の方法。
- 対象において体重維持をサポートすること、及び/又は肥満を治療若しくは予防することができる作用剤を特定する方法であって、
(a)分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDHキナーゼ)ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
(b)前記候補作用剤が、前記BCKDHキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法。 - 前記方法が、ATPの存在下で、BCKDHキナーゼを含む前記製剤を候補作用剤と接触させること、及び基質中へのリン酸の取り込みを測定すること、又はATPからADPへの変換を測定すること、を含む、請求項15に記載の方法。
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