CN108779495A - 调节bckdh的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够提高支链α‑酮酸脱氢酶(BCKDH)的活性以用于增大瘦蛋白水平的试剂。本发明还涉及此类试剂用于支持饱腹感以及用于支持体重维持和/或治疗或预防肥胖症的用途。

Description

调节BCKDH的方法
技术领域
本发明涉及能够调节支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)活性的试剂，以及此类试剂在治疗中的用途，特别是用于增大瘦蛋白水平的用途。本发明还涉及此类试剂用于支持饱腹感以及用于支持体重维持和治疗肥胖症的用途。本发明还涉及鉴定此类试剂的方法。
背景技术
肥胖症是一种慢性代谢障碍，在世界上的许多地区已达到了流行病程度。肥胖症是诸如2型糖尿病、心血管疾病、血脂异常和某些类型的癌症等严重并存病的主要风险因素(World Health Organ.Tech.Rep.Ser.(2000)894:i-xii,1-253)。
肥胖症是指来自碳水化合物、脂肪等的能量过量蓄积而导致个体体重超过正常值的病症。附加体重通常以脂肪的形式保留于皮肤下方或内脏周围。
经验数据表明，初始体重的至少10％的体重减轻导致肥胖症相关并存病的风险的显著降低(World Health Organ.Tech.Rep.Ser.(2000)894:i-xii,1-253)。然而，体重减轻能力显示出较大的个体间波动性。
肥胖症是在能量摄入量超过能量消耗量时引起的，因此为了减轻肥胖症，需要减少来自脂肪、碳水化合物等的能量摄入量的方法，或通过促进体内代谢来增加能量消耗量的方法。因此，饮食习惯和运动的改善被视为预防和减轻肥胖症和肥胖症相关障碍的有效方法。例如，人们早已认识到，低热量饮食(LCD)干预可以非常有效地降低体重，并且这种体重减轻通常伴随肥胖症相关并存病尤其是2型糖尿病的风险的改善(World HealthOrgan.Tech.Rep.Ser.(2000)894:i-xii,1-253)。
虽然已知多种方法用于促进体重减轻，但个体一旦完成体重减轻干预期，就面临着恢复所减轻体重风险。此类回归冒着降低或潜在地完全消除与体重减轻相关的任何有益效果的风险。
因此，不仅仍然迫切需要促进体重减轻的改善的方法，而且还需要用于支持体重维持的方法(防止或降低所减轻体重的恢复，并因此以类似于体重减轻干预后所实现的水平支持维持体重)。此类改善将为肥胖症提供更完整的治疗，因此降低肥胖症相关障碍的风险。具体地讲，需要可在体重减轻后的时段内成功应用的方法，从而降低任何所减轻体重的恢复的风险。
瘦蛋白通常被理解为与食欲抑制和控制相关。本申请的发明人已令人惊讶地观察到瘦蛋白表达水平与BCKDHB基因调控区之间的联系。
发明内容
本发明人对获自Diogenes研究的体重减轻干预数据进行蛋白质数量性状基因座(pQTL)分析。该研究是一项泛欧洲、随机化和对照膳食干预研究，这项研究在八个欧洲中心调查膳食蛋白和血糖指数对肥胖和超重家庭体重减轻和体重维持的作用(Larsen等人(2009)Obesity Rev.11:76-91)。简而言之，Diogenes研究使所筛选的参与者经受低热量饮食(LCD)阶段(CID1)，其中超重/肥胖个体遵循8周饮食(约800kCal/天)，继之以体重维护阶段(CID2)。
在本发明上下文中，pQTL是引起LCD阶段期间蛋白质水平变化的基因组基因座。发明人具体分析了与蛋白质相关联的pQTL，该蛋白质表现出与体重减轻相关的表达变化。
发明人观察到与体重减轻显著相关的LCD阶段期间的瘦蛋白差异表达，该发现关系到在瘦蛋白与食欲抑制和控制关联的领域中的理解。发明人还观察到，与瘦蛋白差异表达相关的最佳pQTL位于BCKDHB基因的调控区中。
BCKDHB编码支链α-酮酸脱氢酶E1 B亚基，其是参与支链氨基酸(BCAA)亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸分解的酶复合物的一部分。BCAA自身与食欲抑制相关，因此在BCKDHB与食欲抑制和控制之间已建立了两个独立的联系。
因此，发明人在支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)与食欲抑制和控制之间建立了显著的关系，因此提供新的干预以支持体重维持和肥胖症的治疗。
因此，在一个方面，本发明提供一种能够提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)的活性以用于增大瘦蛋白水平的试剂。
在另一方面，本发明提供一种能够提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)的活性以用于抑制个体食欲的试剂。在另一方面，本发明提供一种能够提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)的活性以用于支持或延长饱腹感的试剂。在另一方面，本发明提供一种能够提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)的活性以用于减少个体食物摄入的试剂。在另一方面，本发明提供一种能够提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)的活性以用于减少个体脂肪沉积的试剂。
在另一方面，本发明提供了能够提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)活性的试剂用于支持体重维持的用途。在另一方面，本发明提供了能够提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)活性的试剂用于治疗或预防肥胖症的用途。在另一方面，本发明提供了能够提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)活性的试剂用于抑制个体食欲的用途。在另一方面，本发明提供了能够提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)活性的试剂用于延长饱腹感的用途。在另一方面，本发明提供了能够提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)活性的试剂用于减少个体食物摄入的用途。在另一方面，本发明提供了能够提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)活性的试剂用于减少个体脂肪沉积的用途。
在另一方面，本发明提供了支持体重维持的方法，该方法包括将本发明的试剂施用给对其有需要的个体。在另一方面，本发明提供了抑制个体食欲的方法，该方法包括将本发明的试剂施用给对其有需要的个体。在另一方面，本发明提供了延长饱腹感的方法，该方法包括将本发明的试剂施用给对其有需要的个体。在另一方面，本发明提供了减少个体食物摄入的方法，该方法包括将本发明的试剂施用给对其有需要的个体。在另一方面，本发明提供了减少个体脂肪沉积的方法，该方法包括将本发明的试剂施用给对其有需要的个体。在另一方面，本发明提供了治疗或预防肥胖症的方法，该方法包括将本发明的试剂施用给对其有需要的个体。
在一个实施方案中，试剂提高BCKDH E1 B亚基的活性。
相比于不存在本发明试剂时的活性，BCKDH和/或BCKDH E1 B亚基的活性可得到提高。BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)的活性可例如提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％或更多。
可例如通过使用对BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)表现出激动作用或者增大细胞中BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)水平的试剂，使BCKDH活性(尤其是BCKDH E1 B亚基)得以提高。
在一个实施方案中，试剂增加或延长饱腹感。在另一个实施方案中，试剂减少个体食物摄入。在另一个实施方案中，试剂减少个体脂肪沉积。
在一个实施方案中，将试剂在体重减轻干预期间或之后，优选地在体重减轻干预之后施用给个体。体重减轻干预可为例如饮食方案(例如低热量饮食)和/或锻炼方案。
在一个实施方案中，试剂增大个体中BCKDH的水平。优选地，试剂增大个体中BCKDHE1 B亚基的水平。在该语境下，“水平”是指BCKDH或BCKDH E1 B亚基的量，并且可例如通过分析所表达蛋白质的量和/或通过分析所存在的对应mRNA的量进行测量。优选地，试剂提高BCKDH和/或BCKDH E1 B亚基的表达。
例如，可将编码BCKDH(尤其是BCKDH E1 B和/或A亚基)的多核苷酸引入细胞中，以提供细胞表达的编码的多肽。因此，本发明的试剂可为编码BCKDH(尤其是BCKDH E1 B和/或A亚基)的多核苷酸的形式。优选地，多核苷酸为载体，例如病毒载体的形式。
相比于不存在本发明试剂时的水平，BCKDH和/或BCKDH E1 B亚基的水平可得到提高。BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)的水平可例如提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％或更多。
在一个实施方案中，试剂不影响支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDH激酶)的活性。在一个实施方案中，试剂不为非诺贝特。
在一个实施方案中，试剂选自白藜芦醇或丙戊酸，或植物生物活性剂。在一个实施方案中，试剂选自表1a中所列的试剂。在一个实施方案中，试剂是2,4-二硝基甲苯。在一个实施方案中，试剂是氯化铵。在一个实施方案中，试剂是苯并(a)芘。在一个实施方案中，试剂是双环己酮草酰二腙(Cuprizone)。在一个实施方案中，试剂是二乙基亚硝胺。在一个实施方案中，试剂是氯化甲汞。在一个实施方案中，试剂是匹立尼酸。在一个实施方案中，试剂是铬(VI)酸钾。在一个实施方案中，试剂是四氯二苯二氧芑。在一个实施方案中，试剂选自表1b中所列的试剂。在一个实施方案中，试剂是1,12-苯并二萘嵌苯。在一个实施方案中，试剂是17-乙炔基-5-雄烯-3,7,17-三醇。在一个实施方案中，试剂是2,4-二硝基甲苯。在一个实施方案中，试剂是对乙酰氨基酚。在一个实施方案中，试剂是胺碘酮。在一个实施方案中，试剂是氯化铵。在一个实施方案中，试剂是阿特拉津。在一个实施方案中，试剂是双酚A。在一个实施方案中，试剂是卡马西平。在一个实施方案中，试剂是四氯化碳。在一个实施方案中，试剂是氯丁二烯。在一个实施方案中，试剂是安妥明。在一个实施方案中，试剂是乙炔雌二醇。在一个实施方案中，试剂是氟尿嘧啶。在一个实施方案中，试剂是呋喃。在一个实施方案中，试剂是开他敏。在一个实施方案中，试剂是匹立尼酸。在一个实施方案中，试剂是链脲霉素。在一个实施方案中，试剂是四环素。在一个实施方案中，试剂是拓扑替康。在一个实施方案中，试剂是衣霉素。在一个实施方案中，试剂是万古霉素。在一个实施方案中，试剂是乙烯菌核利。
在一个实施方案中，试剂降低支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDH激酶)的活性。
相比于不存在本发明试剂时的活性，BCKDH激酶的活性可能下降。BCKDH激酶的活性可例如降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、50％、75％或100％。
试剂可为例如BCKDH激酶拮抗剂或抑制剂。优选地，试剂选自siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、多核苷酸、多肽或小分子。多肽可为例如抗体。因此，本发明的试剂可为编码靶向BCKDH激酶或多肽(例如抗体)的siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA的多核苷酸形式。优选地，多核苷酸为载体，诸如病毒载体的形式。
在一个实施方案中，试剂降低BCKDH激酶的水平。在该语境下，“水平”是指BCKDH激酶的量，并且可例如通过分析所表达蛋白质的量和/或通过分析所存在的对应mRNA的量进行测量。优选地，试剂降低BCKDH激酶的表达。例如，siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA可降低BCKDH激酶的表达。
相比于不存在本发明试剂时的水平，BCKDH激酶的水平可能下降。BCKDH激酶的水平可例如降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、50％、75％或100％。
在一个实施方案中，试剂为α-氯异己酸或α-酮异己酸(KIC)，或选自表2所列的试剂。
本发明的试剂可为由本发明的方法鉴定的试剂。
在另一方面，本发明提供了一种鉴定能够在个体中支持体重维持和/或治疗或预防肥胖症的试剂的方法，包括以下步骤：
(a)使包含支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)多肽或多核苷酸的制剂与候选试剂相接触；以及
(b)检测候选试剂是否影响BCKDH多肽或多核苷酸的活性。
可通过将存在和不存在(即对照实验)候选试剂时BCKDH多肽或多核苷酸的活性进行比较来分析对BCKDH多肽或多核苷酸活性的影响。
在一个实施方案中，BCKDH为BCKDH E1 B亚基。
在一个实施方案中，该方法包括使包含BCKDH的制剂与候选试剂相接触，并且测量NAD+向NADH的转化率。可经分光光度测定法分析NAD+向NADH的转化率。
在另一方面，本发明提供了一种鉴定能够在个体中支持体重维持和/或治疗或预防肥胖症的试剂的方法，包括以下步骤：
(a)使包含支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDH激酶)多肽或多核苷酸的制剂与候选试剂相接触；以及
(b)检测候选试剂是否影响BCKDH激酶多肽或多核苷酸的活性。
可通过将存在和不存在(即对照实验)候选试剂时BCKDH激酶多肽或多核苷酸的活性进行比较来分析对BCKDH激酶多肽或多核苷酸活性的影响。
在一个实施方案中，该方法包括使包含BCKDH激酶的制剂与候选试剂在ATP存在下接触，并且测量掺入底物中的磷酸盐或者测量ATP向ADP的转化率。
在另一方面，本发明提供了一种鉴定提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)活性的试剂的方法，包括以下步骤：
(a)使包含BCKDH多肽或多核苷酸的制剂与候选试剂相接触；以及
(b)检测候选试剂是否影响BCKDH多肽或多核苷酸的活性。
在一个实施方案中，BCKDH为BCKDH E1 B亚基。
在一个实施方案中，该方法包括使包含BCKDH的制剂与候选试剂相接触，并且测量NAD+向NADH的转化率。可经分光光度测定法分析NAD+向NADH的转化率。
在另一方面，本发明提供了一种鉴定降低支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDH激酶)活性的试剂的方法，包括以下步骤：
(a)使包含BCKDH激酶多肽或多核苷酸的制剂与候选试剂相接触；以及
(b)检测候选试剂是否影响BCKDH激酶多肽或多核苷酸的活性。
在一个实施方案中，该方法包括使包含BCKDH激酶的制剂与候选试剂在ATP存在下接触，并且测量掺入底物中的磷酸盐或者测量ATP向ADP的转化率。
在另一方面，本发明提供了一种鉴定提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)，优选BCKDHE1 B亚基的表达或处理的试剂的方法，包括以下步骤：
(a)使细胞，优选表达BCKDH的细胞与候选试剂接触；以及
(b)检测候选试剂是否提高BCKDH的表达或处理。
在另一方面，本发明提供了一种鉴定降低支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDH激酶)的表达或处理的试剂的方法，包括以下步骤：
(a)使表达BCKDH激酶的细胞与候选试剂接触；以及
(b)检测候选试剂是否降低BCKDH激酶的表达或处理。
本发明的方法可为用于鉴定能够抑制个体食欲，增加或延长饱腹感，减少个体食物摄入和/或减少个体脂肪沉积的试剂的方法。
在另一方面，本发明提供了支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)，尤其是BCKDH E1 B亚基，或BCKDH激酶，或编码其的多核苷酸在鉴定支持体重维持，抑制个体食欲，增加或延长饱腹感，减少个体食物摄入，减少个体脂肪沉积，和/或治疗或防止肥胖症的试剂的方法中的用途。
在另一方面，本发明提供了能够提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)活性的试剂用于制备药物的用途，以用于支持体重维持，抑制个体食欲，增加或延长饱腹感，减少个体食物摄入，减少个体脂肪沉积，和/或治疗或预防肥胖症。
附图说明
图1
放大位于6号染色体的BCKDHB基因调控区中的区域的曼哈顿图。
图2
显示基于反式作用SNP基因型而分层的蛋白质表达不强调较强表达差异的箱线图。
图3
在低热量饮食(LCD)干预之前(1)和之后(2)亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的变量分布。
具体实施方式
现将通过非限制性示例来描述本发明的各优选特征和实施方案。
除非另外指明，本发明的实践将采用常规化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力范围之类。此类技术在文献中有所阐述。参见：例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)“MolecularCloning：A Laboratory Manual”，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.等人(1995 and periodic supplements)Current Protocols in MolecularBiology,Ch.9,13 and 16,John Wiley&Sons；Roe,B.、Crabtree、J.和Kahn,A.，1996年，“DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques”，John Wiley&Sons；Polak,J.M.和McGee,J.O’D.，1990年，“In Situ Hybridization:Principles and Practice”，Oxford University Press；Gait,M.J.，1984年，Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach,IRL Press；以及Lilley,D.M.And和Dahlberg,J.E.，1992年，Methodsin Enzymology:DNA Structures Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA,Academic Press。这些一般性文本中的每一个以引用的方式并入本文。
支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)
支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)是位于线粒体内膜上的蛋白质复合物，其在支链氨基酸(BCAA)缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的分解代谢中发挥关键作用。在BCAA分解代谢中，BCKDH复合物催化支链α-酮酸的氧化脱羧，这是总分解代谢途径中的限速步。
BCKDH复合物由三个亚基组成：
1.E1亚基(EC 1.2.4.4)，其表现出支链α-酮酸脱羧酶活性。E1亚基由A链和B链(也分别称为α和β链)构成，这些链由BCKDHA和BCKDHB基因编码；
2.E2亚基(EC 2.3.1.168)，其表现出硫辛酰胺酰基转移酶活性；以及
3.E3亚基(EC 1.8.1.4)，其表现出硫辛酰胺脱氢酶活性。
E2亚基充当BCKDH复合物的核心，并以24份拷贝按八面体对称或以60份拷贝按二十面体对称存在。亚基E1和E3各自以多个拷贝经由非共价键与E2连接。
BCKDH复合物中的突变(尤其是位于E1 B亚基中的突变)与人类的多种障碍相关，包括枫糖尿症(MSUP；A.等人(2000)Structure 8:277-291)。
在一个实施方案中，BCKDH是人BCKDH。
BCKDH E1 B亚基的示例性氨基酸序列是以NCBI登录号NP_000047.1保藏的序列。
BCKDH E1 B亚基的示例性氨基酸序列为：
编码BCKDH E1 B亚基的示例性核苷酸序列是以NCBI登录号NM_000056.4保藏的序列。
编码BCKDH E1 B亚基的示例性核苷酸序列为：
在一个实施方案中，BCKDH E1 B亚基包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，优选地其中该氨基酸序列基本上保留SEQ ID NO:1所表示的蛋白质的天然功能。
在一个实施方案中，编码BCKDH E1 B亚基的核苷酸序列包括与SEQ ID NO:2具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，优选地其中核苷酸序列编码的蛋白质基本上保留SEQ ID NO:1所表示的蛋白质的天然功能。
在一个实施方案中，编码BCKDH E1 B亚基的核苷酸序列包括编码与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，优选地其中氨基酸序列基本上保留SEQ ID NO:1所表示的蛋白质的天然功能。
BCKDH E1 A亚基的示例性氨基酸序列是以NCBI登录号NP_000700.1保藏的序列。
BCKDH E1 A亚基的示例性氨基酸序列为：
编码BCKDH E1 A亚基的示例性核苷酸序列是以NCBI登录号NM_000709.3保藏的序列。
编码BCKDH E1 A亚基的示例性核苷酸序列为：
在一个实施方案中，BCKDH E1 A亚基包含与SEQ ID NO:3具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，优选地其中氨基酸序列基本上保留SEQ ID NO:3所表示的蛋白质的天然功能。
在一个实施方案中，编码BCKDH E1 A亚基的核苷酸序列包括与SEQ ID NO:4具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，优选地其中核苷酸序列编码的蛋白质基本上保留SEQ ID NO:3所表示的蛋白质的天然功能。
在一个实施方案中，编码BCKDH E1 A亚基的核苷酸序列包括编码与SEQ ID NO:3具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，优选地其中氨基酸序列基本上保留SEQ ID NO:3所表示的蛋白质的天然功能。
BCKDH E1 A和B亚基是线粒体蛋白质，并且它们的序列可包括线粒体靶向信号序列。此类信号序列可在蛋白质靶向线粒体时被切割，因此蛋白质可以以于缺乏信号序列的成熟形式天然存在。技术人员能够易于使用适当的生物信息和分子生物学技术来测定此类信号序列。例如，SEQ ID NO:1的残基1-50和SEQ ID NO:3的残基1-45可充当信号序列。
支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDH激酶)
BCKDH的活性通过磷酸化/去磷酸化循环进行调节。支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDH激酶)通过BCKDH E1 A亚基的磷酸化使BCKDH复合物失活，而BCKDH磷酸酶通过BCKDH E1 A亚基的去磷酸化使复合物活化。
在一个实施方案中，BCKDH激酶是人BCKDH激酶。
BCKDH激酶的示例性氨基酸序列是以NCBI登录号NP_005872.2保藏的序列。
BCKDH激酶的示例性氨基酸序列为：
编码BCKDH激酶的示例性核苷酸序列是以NCBI登录号NM_005881.3保藏的序列。
编码BCKDH激酶的示例性核苷酸序列为：
在一个实施方案中，BCKDH激酶包含与SEQ ID NO:5具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，优选地其中氨基酸序列基本上保留SEQ ID NO:5所表示的蛋白质的天然功能。
在一个实施方案中，编码BCKDH激酶的核苷酸序列包括与SEQ ID NO:6具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，优选地其中核苷酸序列编码的蛋白质基本上保留SEQ ID NO:5所表示的蛋白质的天然功能。
在一个实施方案中，编码BCKDH激酶的核苷酸序列包括编码与SEQ ID NO:5具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，优选地其中氨基酸序列基本上保留SEQ ID NO:5所表示的蛋白质的天然功能。
BCKDH激酶是线粒体蛋白质，其序列可包括线粒体靶向信号序列。此类信号序列可在蛋白质靶向线粒体时被切割，因此蛋白质可以以于缺乏信号序列的成熟形式天然存在。技术人员能够易于使用适当的生物信息和分子生物学技术来测定此类信号序列。例如，SEQID NO:5的残基1-30可充当信号序列。
体重减轻和体重维持
“体重减轻”可指诸如体重(例如，单位为千克)、身体质量指数(kg/m2)、腰臀比(例如，单位为厘米)、脂肪质量(例如，单位为千克)、臀围(例如，单位为厘米)或腰围(例如，单位为厘米)等参数的减小。
体重减轻可通过以下方式计算：将干预(例如饮食和/或锻炼方案)结束时上述参数中一个或多个的值从干预开始时该参数的值中减去。
体重减轻的程度可表示为上述体重表型参数之一的百分比变化(例如，个体体重(例如，单位为千克)或身体质量指数(kg/m2)的百分比变化)。例如，个体可减轻其初始体重的至少10％，其初始体重的至少8％，或其初始体重的至少5％。仅以举例说明的方式，个体可减轻其初始体重的5％和10％之间。
在一个实施方案中，体重减轻程度为初始体重的至少10％可导致肥胖症相关并存病的风险显著降低。
“体重维持”可以指诸如体重(例如，单位为千克)、身体质量指数(kg/m2)、腰臀比(例如，单位为厘米)、脂肪质量(例如，单位为千克)、臀围(例如，单位为厘米)或腰围(例如，单位为厘米)等参数的维持。体重维持可指例如在干预(例如饮食和/或锻炼方案)后维持体重减轻。
体重维持的程度可通过以下方式来计算：确定在一段时间内一种或多种上述参数的变化。该段时间可为例如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50周。
本发明试剂所支持的体重维持可导致例如一段时间内一个或多个上述参数少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的变化(例如增加)。
体重维持的程度可表示为在实现体重减轻后的一段时间期间恢复的体重，例如表示为在实现体重减轻期间减轻的体重的百分比。
本发明试剂所支持的体重维持可通过施用试剂后抑制个体的食欲引起。因此相比于不存在本发明试剂时的食欲，个体可因此食欲下降。
本发明试剂所支持的体重维持可通过施用试剂后控制个体的食欲引起。个体可因此维持对其食欲的控制，并因此例如在体重减轻干预时段后维持其体重。
具体地，本发明的试剂可通过在体重减轻干预(例如饮食或锻炼方案)时段期间和/或之后抑制或控制食欲来支持体重维持。
在一个方面，本发明提供了本发明的试剂例如在体重减轻时间段之后维持健康身体组成的非治疗性用途。
肥胖症
“超重”被定义为成人的身体质量指数(BMI)介于25和30之间。
“身体质量指数”是指重量(千克)除以身高(米)的平方所得的比值。
“肥胖症”是指储存在动物(尤其是人和其他哺乳动物)脂肪组织中的天然能量储备增至与某些健康状况或死亡率上升有关的程度的一种病症。“肥胖”被定义为成人的BMI大于30。
成人的“正常体重”被定义为BMI达到18.5至25，而“体重不足”可被定义为BMI小于18.5。
肥胖症是一种慢性代谢障碍，在世界上的许多地区已达到了流行病程度，并且是诸如2型糖尿病、心血管疾病、血脂异常和某些类型的癌症等严重并存病的主要风险因素(World Health Organ.Tech.Rep.Ser.(2000)894:i-xii,1-253)。
“肥胖症相关障碍”是指肥胖个体有增高的发病风险的任何病症。肥胖症相关障碍包括糖尿病(例如，2型糖尿病)、中风、高胆固醇、心血管疾病、胰岛素抗性、冠心病、代谢综合征、高血压和脂肪肝。
筛选的方法
本发明提供能够提高BCKDH活性和/或降低BCKDH激酶活性的试剂，并且还提供用于鉴定此类试剂的方法。
本发明的试剂可用提供定性或定量结果的方法来鉴定。此外，此类方法可用于表征和鉴定本发明的试剂。
候选试剂可为任何具有潜在利益的试剂，例如肽、多肽(例如抗体)、核酸或小分子。优选地，候选试剂为具有潜在治疗利益的化合物或混合物。优选地，候选试剂对哺乳动物，特别是人类具有低毒性。在一些实施方案中，候选试剂可包括营养剂和/或食品成分，包括天然存在的化合物或化合物的混合物例如植物或动物提取物。
候选试剂可构成试剂库的一部分，例如由组合化学产生的库或噬菌体展示库。在一个实施方案中，候选试剂构成植物生物活性分子库的一部分。
BCKDH活性
本发明还提供了用于鉴定能够提高BCKDH活性的试剂的方法和由此类方法所鉴定的试剂。可直接分析BCKDH的活性，例如通过分析BCKDH的酶活性来分析。
本领域中已知许多技术用于测量BCKDH活性。这些技术可应用于已从细胞分离出的BCKDH。可使用重组技术来表达BCKDH。优选地，BCKDH已被纯化。
在一个实施方案中，通过例如在α-酮异戊酸(BCKDH的底物)存在下监测由NAD+产生的NADH，经分光光度测定法测定BCKDH。此类测定技术描述于例如Hawes,J.W.等人(2000)Methods Enzymol.324:200-207。
BCKDH激酶活性
本发明还提供了用于鉴定能够降低BCKDH激酶活性的试剂的方法和由此类方法所鉴定的试剂。可直接分析BCKDH激酶的活性，例如通过分析BCKDH激酶的酶活性来分析。
候选试剂降低蛋白质例如酶如激酶的活性的能力可以IC50值表示。Ic50为使得蛋白质的活性产生50％降低(例如酶活性的50％降低)所需试剂的浓度。IC50值的计算在本领域中是已知的。优选地，本发明的试剂对BCKDH激酶的抑制的IC50值小于100μM，更优选地小于10μM，例如小于1μM、小于100nM或小于10nM。
本领域中已知许多技术用于测量激酶活性。这些技术可应用于已从细胞分离出的激酶，例如BCKDH激酶。可使用重组技术来表达BCKDH激酶。优选地，BCKDH激酶已被纯化。
在一个实施方案中，通过监测掺入底物中的磷酸盐，例如从[γ-32P]标记的ATP掺入BCKDH底物或其合适片段中的放射性标记的磷酸盐来测定激酶活性。此类测定技术描述于例如Hastie,C.J.等人(2006)Nat.Protocols 1:968-971。
在另一个实施方案中，通过监测激酶反应中产生的ADP的量(例如监测ADP产率)来测定激酶活性。此类测定系统(例如Promega生产的商业ADP-GloTM激酶测定法)可基于(激酶反应中产生的)ADP向ATP的转化，其可例如经由荧光素酶产生的发光信号进行检测。在此类测定中，发光信号与激酶活性相关。此类测定法特别适用于测定候选试剂对宽范围的经纯化激酶活性的影响，并且非常适用于高通量筛选。
在另一个实施方案中，通过监测反应期间某些时间点保留的ATP的量(例如监测ATP消耗率)来测定激酶活性。在此类测定法中，信号与所存在ATP的量相关，其与激酶活性负相关。此类测定系统(例如由Promega生产的商业激酶测定法)可基于荧光素酶产生的发光信号。
BCKDH和BCKDH激酶结合
本发明还提供鉴定能够与BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶结合的试剂，以及另选地或除此之外表征此类结合的方法。例如，该方法允许测量绝对或相对结合亲和力，和/或结合的焓和熵。结合亲和力可以平衡解离(Kd)或缔合(Ka)常数表示。
本领域中已知许多测定技术用于鉴定候选试剂与蛋白质之间的结合。所采用的测定技术优选地为适于对候选试剂进行自动化和/或高通过量筛选的测定技术。可在诸如微量滴定板、微珠、树脂或类似物的固体载体上进行测定。
例如，靶BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶可固定在例如微珠、树脂、微量滴定板或阵列的固体载体上。然后可使候选试剂与固定的靶蛋白接触。任选地，可应用洗涤工序以去除弱特异性或非特异性结合试剂。然后可检测并鉴定任何与靶蛋白结合的试剂。为有利于结合试剂的检测，可用可易于检测的标志物标记候选试剂。标志物可包括例如放射性标记、酶标记、抗体标记、荧光标记，颗粒(例如乳胶或金)标记或类似物。
或者，可将上述工序颠倒，并且可将候选试剂固定并可使靶BCKDH(尤其是BCKDHE1 B亚基)和/或BCKDH激酶与所述固定的试剂接触。任选地，可应用洗涤工序以去除弱特异性或非特异性结合的靶蛋白。然后可检测并鉴定任何与BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶结合的试剂。为有利于结合的检测，可用如上所述的可易于检测的标志物标记BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶。
除了上述测定之外，其他合适的测定技术也是本领域中已知的。此类技术的示例包括放射性测定、荧光测定、ELISA、荧光偏振、荧光各向异性、等温滴定量热法(ITC)、表面等离子体共振(SPR)等。可应用这些测定法来鉴定结合BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶的试剂。实际上，用于对许多这些技术进行自动化以有利于高通过量筛选的平台是本领域中广泛已知的。
可使用不止一种测定技术来提供对候选试剂与BCKDH(特别是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶结合的详细理解。例如，可将提供定性结合信息的测定用作方法中的第一步骤，然后进行使用不同技术的另外的测定以提供定量结合数据和/或对靶蛋白活性影响数据。
上述测定技术可适于进行竞争结合研究。例如，这些技术同样适于分析蛋白质与底物或辅因子在存在候选试剂的情况下的结合。因此，将可能的是使用上述技术来筛选并鉴定调节蛋白质与其底物或辅因子之间的结合，因此对蛋白质的活性具有影响的试剂。例如，这些测定将允许在存在候选试剂的情况下检测BCKDH E1亚基与二磷酸硫胺之间，或BCKDH激酶与ATP之间的结合。
优选地，本发明的试剂将以高亲和力结合。例如，本发明的试剂将以小于100μM，更优选地小于10μM，例如小于1μM、小于100nM或小于10nM的Kd与BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶结合。
结合亲和力可使用本领域已知的标准技术例如表面等离子体共振、ELISA等等(例如如上所述)来测量，并且可以解离(Kd)或缔合(Ka)常数定量。
例如在计算机结构指导的筛选中，基于生物信息学的方法也可用于鉴定本发明的试剂。
BCKDH和BCKDH激酶水平
本发明提供了用于增大BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)水平和/或减小BCKDH激酶水平的试剂。相关蛋白的水平可等同于细胞或生物体中蛋白质的表达水平。可例如通过分析编码蛋白质的mRNA水平来直接或间接地分析蛋白质水平。
本发明中可采用分析BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶的表达的方法来筛选候选试剂对蛋白质水平的效应。
本领域中已知许多技术用于测定蛋白质的表达水平。可应用这些技术来测试候选试剂对BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶的表达水平的效应。所采用的技术优选地为适于对候选试剂进行自动化和/或高通过量筛选的技术。
例如，筛选可使用携带编码BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶的多核苷酸的细胞来进行，BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶可操作地连接至报告基因部分。报告基因部分可以可操作地连接至内源性BCKDH-(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶-编码基因。或者，可操作地连接至报告基因部分的BCKDH(尤其是BCKDH E1B亚基)和/或BCKDH激酶的外源拷贝可插入细胞中。在该实施方案中，细胞可被工程化为对天然BCKDH和/或BCKDH激酶表达具有缺陷。连接至BCKDH和/或BCKDH激酶的报告基因部分可为彼此不同的或区别明显的。合适的报告基因部分包括荧光标记，例如荧光蛋白如绿色、黄色、樱桃红色、青色或橙色荧光蛋白。
“有效连接”应被理解为是指组分处于允许使它们按照本身预期的方式发挥作用的关系。
可使此类细胞与候选试剂接触，并且可通过分析细胞中报告基因部分表达的水平来监测BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶的表达水平。可通过本领域中已知的许多技术例如流式细胞计量术、荧光激活细胞分选术(FACS)和荧光显微镜法来分析荧光报告基因部分。BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶的表达可单独地或同时在同一细胞内分析。可对与候选试剂接触之前和之后的BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶的表达水平进行比较。或者，可对与候选试剂接触的细胞与对照细胞之间的BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶的表达水平进行比较。
其它方法可用于分析蛋白质例如BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶的表达。可直接分析蛋白质表达。例如，可使用诸如SDS-PAGE分析通过考马斯(Coomassie)或银染色进行可视化的方法来对表达进行定量分析。或者，使用蛋白质印迹法或酶联免疫吸附测定(ELISA)通过结合蛋白质产物的抗体探针来对表达进行定量分析。用报告基因部分标记的BCKDH(尤其是BCKDH E1 B亚基)和/或BCKDH激酶(如上所述)还可用于这些方法中。或者，可例如通过研究与蛋白质对应的mRNA的量来间接分析蛋白质表达，所述mRNA在细胞中转录。这可使用诸如定量逆转录PCR和Northern印迹法的方法来实现。
类似的技术也可用于分析瘦蛋白蛋白质表达。
试剂
本发明提供能够提高BCKDH活性和/或降低BCKDH激酶活性的试剂，并且还提供用于鉴定此类试剂的方法。
本发明的试剂可为例如肽、多肽(例如抗体)、核酸(例如siRNA、shRNA、miRNA和反义RNA)或小分子。优选地，试剂对哺乳动物，特别是人类具有低毒性。在一些实施方案中，试剂可包括营养剂和/或食品成分，包括天然存在的化合物或化合物的混合物例如植物或动物提取物。
在一个实施方案中，本发明的试剂是白藜芦醇。白藜芦醇(3,5,4'-三羟基-反式-二苯乙烯)是多种植物响应于损伤或受到病原体攻击时天然产生的类二苯乙烯化合物和植物抗毒素。白藜芦醇的食物来源包括葡萄皮、蓝莓、树莓和桑树。
在一个实施方案中，本发明的试剂是丙戊酸。丙戊酸是用于治疗癫痫、双相性精神障碍和偏头痛的药物。其可防止具有失神发作、部分性发作和全身性发作的个体的发作。丙戊酸的结构为：
在一个实施方案中，本发明的试剂是α-氯异己酸。α-氯异己酸是亮氨酸类似物并且是已知的BCKDH激酶最有效的抑制剂(Skimomura,Y.等人(2006)J.Nutr.136:250S-253S)。α-氯异己酸的结构为：
在一个实施方案中，本发明的试剂为α-酮异己酸(KIC)。α-酮异己酸即亮氨酸的转氨产物是已知的BCKDH激酶生理抑制剂(Shimomura,Y.等人(2006)J.Nutr.136:250S-253S)。α-酮异己酸的结构为：
影响BCKDH活性，尤其是通过影响BCKDH E1 B亚基活性的示例性试剂包括表1a所述的试剂(Davis AP等人The Comparative Toxicogenomics Database:update2017.Nucleic Acids Res.2016年9月19日)。
化学名称 化学ID CAS RN 相互作用
2,4-二硝基甲苯 C016403 121-14-2 影响表达
氯化铵 D000643 12125-02-9 影响表达
抗风湿药 D018501 提高表达
苯并(a)芘 D001564 50-32-8 影响表达/影响反应
苯并(a)芘 D001564 50-32-8 提高表达
双环己酮草酰二腙 D003471 370-81-0 提高表达
二乙基亚硝胺 D004052 55-18-5 提高表达
氯化甲汞 C004925 115-09-3 提高表达
匹立尼酸 C006253 50892-23-4 提高表达
铬(VI)酸钾 C027373 7789-00-6 提高表达
四氯二苯二氧芑 D013749 1746-01-6 影响表达
丙戊酸 D014635 99-66-1 影响表达
丙戊酸 D014635 99-66-1 提高表达
万古霉素 D014640 1404-90-6 提高表达
表1a：提高支链α-酮酸脱氢酶E1 B亚基(BCKDHB)活性的试剂。
影响BCKDH活性，尤其是通过影响BCKDH E1 A亚基活性的示例性试剂包括表1b所述的试剂(Davis AP等人The Comparative Toxicogenomics Database:update2017.Nucleic Acids Res.2016年9月19日)。
化学名称 化学ID CAS RN 相互作用
1,12-苯并二萘嵌苯 C006718 191-24-2 提高表达
17-乙炔基-5-雄烯-3,7,17-三醇 C524733 影响结合
2,4-二硝基甲苯 C016403 121-14-2 影响表达
对乙酰氨基酚 D000082 103-90-2 影响表达
对乙酰氨基酚 D000082 103-90-2 提高表达
胺碘酮 D000638 1951-25-3 提高表达
氯化铵 D000643 12125-02-9 影响表达
阿特拉津 D001280 1912-24-9 提高表达
双酚A C006780 80-05-7 提高表达
卡马西平 D002220 298-46-4 影响表达
四氯化碳 D002251 56-23-5 提高表达
氯丁二烯 D002737 126-99-8 提高表达
安妥明 D002994 637-07-0 提高表达
乙炔雌二醇 D004997 57-63-6 提高表达
乙炔雌二醇 D004997 57-63-6 影响联合治疗/提高表达
氟尿嘧啶 D005472 51-21-8 影响表达
呋喃 C039281 110-00-9 影响结合
开他敏 D007649 6740-88-1 提高表达
氯化甲汞 C004925 115-09-3 提高表达
匹立尼酸 C006253 50892-23-4 提高表达
链脲霉素 D013311 18883-66-4 影响表达
四氯二苯二氧芑 D013749 1746-01-6 影响表达
四氯二苯二氧芑 D013749 1746-01-6 影响联合治疗/提高表达
四氯二苯二氧芑 D013749 1746-01-6 提高表达
四环素 D013752 60-54-8 提高表达
拓扑替康 D019772 123948-87-8 影响对物质的响应
衣霉素 D014415 11089-65-9 提高表达
丙戊酸 D014635 99-66-1 影响表达
万古霉素 D014640 1404-90-6 提高表达
乙烯菌核利 C025643 50471-44-8 提高表达
表1b：提高支链α-酮酸脱氢酶E1 A亚基(BCKDHA)活性的试剂。
影响BCKDH激酶活性的示例性试剂包括表2所述的试剂(Davis AP等人TheComparative Toxicogenomics Database:update 2017.Nucleic Acids Res.2016年9月19日)。
化学名称 化学ID CAS RN 相互作用
对乙酰氨基酚 D000082 103-90-2 影响表达
氯化铵 D000643 12125-02-9 影响表达
熊果苷 D001104 497-76-7 降低表达
阿特拉津 D001280 1912-24-9 降低表达
双酚A C006780 80-05-7 影响表达
二甲胂酸 D002101 75-60-5 降低表达
安妥明 D002994 637-07-0 降低表达
氯贝酸 D002995 882-09-7 影响联合治疗/影响表达
氯化亚钴 C018021 7646-79-9 降低表达
铜 D003300 7440-50-8 影响结合/降低表达
硫酸铜 D019327 7758-98-7 降低表达
酞酸二丁酯 D003993 84-74-2 降低表达
二乙基亚硝胺 D004052 55-18-5 影响联合治疗/影响表达
甲醛 D005557 50-00-0 降低表达
过氧化氢 D006861 7722-84-1 影响表达
次氯酸 D006997 7790-92-3 降低表达
酮内酯类 D048628 降低表达
甲氧基乙酸 C013598 625-45-6 影响表达
NSC 689534 C558013 影响结合/降低表达
赭曲毒素A C025589 303-47-9 降低表达
腐霉利 C035988 32809-16-8 降低表达
重铬酸钠 C016104 10588-01-9 降低表达
四氯二苯二氧芑 D013749 1746-01-6 影响反应/降低表达
四氯二苯二氧芑 D013749 1746-01-6 影响表达
四氯二苯二氧芑 D013749 1746-01-6 降低表达
毒胡萝卜素 D019284 67526-95-8 降低表达
衣霉素 D014415 11089-65-9 降低表达
丙戊酸 D014635 99-66-1 影响表达
表2：降低支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDH激酶)活性的试剂。
根据本发明使用的试剂可例如作为盐或酯，特别是药学上可接受的盐或酯存在。
siRNA、shRNA、miRNA和反义DNA/RNA
可使用转录后基因沉默(PTGS)来调节BCKDH激酶的表达。双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默为控制外源基因表达的保守细胞防御机制。据认为，诸如转座子或病毒之类的元件的随机整合引起dsRNA的表达，该表达激活同源单链mRNA或病毒基因组RNA的序列特异性降解。沉默效应被称为RNA干扰(RNAi)(Ralph等人(2005)Nat.Medicine 11:429-433)。RNAi的机制涉及将长dsRNA加工成约21-25核苷酸(nt)RNA的双链体。这些产物被称为小干扰或沉默RNA(siRNA)，是mRNA降解的序列特异性介导物。在分化的哺乳动物细胞中，已发现dsRNA>30bp可活化干扰素响应，导致蛋白质合成关闭和非特异性mRNA降解(Stark等人(1998)Ann.Rev.Biochem.67:227-64)。然而，可使用21nt siRNA双链体来绕过此响应(Elbashir等人(2001)EMBO J.20:6877-88；Hutvagner等人(2001)Science 293:834-8)，从而允许在培养的哺乳动物细胞中分析基因功能。
shRNA由小环序列组成的短的反向RNA重复序列组成。这些shRNA被细胞机器快速加工成19-22nt siRNA，从而抑制靶基因表达。
微小RNA(miRNA)为小的(长度为22-25个核苷酸)非编码RNA，该小的非编码RNA可通过与它们的3'非翻译区(UTR)结合而有效地减少靶mRNA的翻译。微小RNA是生物体中自然产生的一大群小RNA，其中的至少一些调控靶基因的表达。微小RNA家族的基础成员为let-7和lin-4。let-7基因编码小的、高度保守的RNA种类，其在蠕虫发育过程中调控内源性蛋白编码基因的表达。活性RNA种类开始被转录成～70nt的前体，在转录后加工成成熟的～21nt的形式。let-7和lin-4被转录成为发夹RNA前体，RNA前体通过Dicer酶被加工成它们的成熟形式。
反义概念是使细胞中的短的可能修饰的DNA或RNA分子与信使RNA选择性地结合并防止编码的蛋白质的合成。
用于设计调节靶蛋白质表达的siRNA、shRNA、miRNA和反义DNA/RNA的方法，以及用于将这些试剂递送至所关注的细胞的方法是本领域中熟知的。此外，本领域中熟知的是例如通过使用组织特异性启动子来对生物体内某些细胞类型的蛋白质表达进行特异性调节(例如降低)。
抗体
如本文所用，术语“抗体”是指能够结合所选靶标的完全抗体或抗体片段，并且包括Fv\ScFv\F(ab’)和F(ab’)2、单克隆和多克隆抗体、工程化抗体(包括嵌合抗体、CDR-移植抗体和人源化抗体)以及使用噬菌体展示或其它技术产生的人工选择抗体。
此外，本发明中还可使用经典抗体的替代形式，例如“阿维体(avibody)”、“阿维聚体(Avimer)”、“抗转运蛋白(anticalins)”、“纳体(nanobody)”和“锚蛋白重复蛋白(DARPin)”。
用于产生抗体的方法是技术人员已知的。或者，抗体可源自商业来源。
如果需要多克隆抗体，则可对选定的哺乳动物(例如小鼠、兔子、山羊或马)进行免疫。可收集来自免疫的动物的血清并根据已知工序进行处理。如果血清含有针对其他抗原的多克隆抗体，则多克隆抗体可通过免疫亲和层析来纯化。用于制备并加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。
针对本发明中使用的抗原(例如蛋白质)的单克隆抗体也可由技术人员容易地制备。通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的。永生化抗体生成细胞系可通过细胞融合产生，并且也通过其他技术如利用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)转染来产生。可筛选产生的针对抗原的单克隆抗体的图谱(panel)的各种性质，例如同种型和表位亲和力。
一种可选的技术涉及筛选噬菌体展示文库，其中例如噬菌体在其衣壳表面表达scFv片段以及各种互补性决定区(CDR)。此技术是本领域众所周知的。
针对抗原的抗体(单克隆和多克隆抗体两者)具体可用于诊断中，其中中和型的那些抗体可用于被动免疫疗法中。单克隆抗体具体可用于激发抗独特型抗体。抗独特型抗体是携带需要针对提供保护的传染剂抗原的“内部图像”的免疫球蛋白。
用于激发抗独特型抗体的技术是本领域已知的。这些抗独特型抗体也可用于治疗，以及用于阐明抗原的致免疫区。
向细胞中引入多肽和多核苷酸
用于本发明中的试剂可例如为多肽或多核苷酸。还需要将多核苷酸和多肽引入细胞中来作为本发明的方法或筛选测定的一部分。
在本发明利用多肽的情况下，可将多肽直接施用于细胞(例如，可施用多肽本身)，或通过将编码多肽的多核苷酸在允许于所关注的细胞中表达该多肽的条件下引入细胞中。可使用载体将多核苷酸引入细胞中。
载体是允许或有利于将实体从一种环境转移到另一种环境的工具。根据本发明并且以举例的方式，用于重组DNA技术的一些载体允许实体，诸如核酸区段(例如异源DNA区段，诸如异源cDNA区段)被转移至靶细胞。载体可用于维持细胞内的异源核酸(例如DNA或RNA)，从而有利于包含核酸区段的载体的复制，或有利于核酸区段所编码的蛋白质的表达。载体可为非病毒载体或病毒载体。用于重组核酸技术中的载体的示例包括但不限于质粒、染色体、人工染色体和病毒。载体还可为例如裸核酸(例如，DNA)。当载体呈其最简单的形式时，载体本身可为所关注的核苷酸。
可用于本发明中的载体可为例如质粒或病毒载体并且可包括用于多核苷酸表达的启动子以及任选的启动子的调控因子。
可使用多种本领域中已知的技术例如转导和转染将用于本发明中的包含多核苷酸的载体引入细胞中。适用于该目的的几种技术在本领域中是已知的，例如用重组病毒载体(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒和单纯性疱疹病毒载体)感染；以及直接注射核酸和基因枪转化。
非病毒递送体系包括但不限于DNA转染方法。此处，转染包括使用非病毒载体来将基因递送至靶细胞的方法。
多肽或多核苷酸的转移可通过本领域中已知的以物理方式或以化学方式使细胞膜透化的任意方法来进行。细胞穿透肽还可用于将多肽转移到细胞中。
此外，本发明可采用基因靶向方案，例如DNA修饰剂的递送。
载体可为表达载体。本文描述的表达载体可包含核酸区，所述核酸区包含能够被转录的序列。因此，编码mRNA、tRNA和rRNA的序列包括在此定义内。
表达载体优选地包含用于本发明中的多核苷酸，该多核苷酸有效连接至控制序列，该控制序列能够通过宿主细胞提供对编码序列的表达。“有效连接”至编码序列的调控序列的连接方式使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现。可例如通过添加另外的转录调控元件来修饰控制序列，以使得由控制序列引导的转录的水平更易于响应转录调节因子。
多核苷酸
本发明的多核苷酸可包括DNA或RNA。它们可为单链的或双链的。本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸可编码相同的多肽。此外，应当理解，本领域技术人员可使用常规技术进行下述核苷酸置换，该置换不影响本发明的多核苷酸编码的多肽序列，以反映其中将表达本发明的多肽的任何特定宿主生物体的密码子应用。
可通过本领域中可用的任何方法对多核苷酸进行修饰。可进行此类修饰以增强本发明多核苷酸的体内活性或存活期(life span)。
多核苷酸，例如DNA多核苷酸可通过重组、合成或通过技术人员可用的任何方法来制备。还可通过标准技术对它们进行克隆。
通常使用重组方法来制备较长的多核苷酸，例如使用聚合酶链反应(PCR)克隆技术。这将包括制备一对旁侧具有需要被克隆的靶序列的引物(例如大约15至30个核苷酸)，使该引物与获自动物或人类细胞的mRNA或cDNA进行接触，在引起所需区扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片断(例如通过琼脂糖凝胶纯化反应混合物)以及回收扩增的DNA。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点，使得扩增的DNA可被克隆到合适的载体中。
蛋白质
如本文所用，术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及多个多肽的复合物，在该复合物中，各个组成多肽通过共价方式或非共价方式连接。如本文所用，术语“多肽”和“肽”是指其中单体为氨基酸并通过肽键或二硫键接合在一起的聚合物。
变体、衍生物、类似物、同源物和片段
除了本文提到的具体蛋白质和核苷酸之外，本发明还涵盖变体、衍生物、类似物、同系物以及它们的片段。
在本发明的上下文中，任何给定序列的变体是这样的序列，其中各残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的具体序列已被修饰，修饰的方式为使得所讨论的多肽或多核苷酸保持其内源功能中的至少一种。可通过对天然存在的多肽或多核苷酸中存在的至少一个残基进行添加、缺失、置换、修饰、替代和/或变异来获得变体序列。
与本发明的蛋白质或多肽相关的本文所用的术语“衍生物”包括对来自序列的一个(或多个)氨基酸残基进行的任何置换、变异、修饰、替代、缺失和/或将一个(或多个)氨基酸残基添加至序列，前提条件是所产生的蛋白质或多肽保持其内源功能中的至少一种。
与多肽或多核苷酸相关的本文所用的术语“类似物”包括任何模拟物，即这样的化合物，所述化合物具有其所模拟的多肽或多核苷酸的内源功能中的至少一种。
通常，可例如从1、2或3至10或20个置换作出氨基酸置换，前提条件是被修饰的序列保持所需的活性或能力。氨基酸置换可包括使用非天然存在的类似物。
用于本发明中的蛋白质还可具有这样的氨基酸残基缺失、插入或置换，即缺失、插入或置换产生不活跃的变化并且导致功能上等同的蛋白质。还可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲特性的相似性做出有意的氨基酸置换，只要内源功能得以保持即可。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；包含具有相似亲水性值的不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
保守置换可例如按下表3进行。第二列同一格中的氨基酸，优选第三列同一行中的氨基酸可互相置换：
表3氨基酸的保守取代
“同系物”意指与野生型氨基酸序列或野生型核苷酸序列具有某种同一性的实体。术语“同源性”可等同于“同一性”。
在本发明上下文中，同源序列旨在包括可与个体序列具有至少50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性，优选具有至少95％或97％或99％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与个体氨基酸序列相同的活性位点等。尽管还可以相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，但在本发明的上下文中，优选地以序列同一性表达同源性。
在本发明上下文中，同源序列旨在包括可与个体序列具有至少50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性，优选具有至少95％或97％或99％同一性的核苷酸序列。尽管还可以相似性考虑同源性，但在本发明的上下文中，优选地以序列同一性表达同源性。
优选地，提及与本文详述的任何一个SEQ ID NO具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
同源性比较可通过肉眼进行，或更通常地，借助于易得序列比较程序进行。这些商购计算机程序可计算两个或更多个序列之间的同源性或同一性百分比。
同源性百分比可通过连续的序列来计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸或核苷酸与另一条序列中的相应氨基酸或核苷酸直接比较，一次一个残基。这称为“无空位”比对。通常，此类无空位比对仅在相对短数目的残基范围内进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其未能考虑例如在原本相同的序列对中，氨基酸或核苷酸序列中的一个插入或缺失可导致后面的残基或密码子不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致同源性百分比有大的降低。因此，大多数序列比较方法被设计为产生最佳比对，所述最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会过度罚掉整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法向比对结果中出现的每个空位赋予“空位罚分”，使得对于同样数目的相同氨基酸或核苷酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间具有较高的相关性)将获得比具有许多空位的序列比对结果更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap cost)”，其对空位的存在收取相对较高的成本，对空位中每一个后续残基收取较少的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生具有较少空位的最佳比对结果。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当使用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。例如当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时，氨基酸序列的默认空位罚分为：空位：-12，且每个延伸：-4。
因此，最大同源性百分比的计算首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit程序包(University ofWisconsin,U.S.A.；Devereux等人(1984)Nucleic Acids Research 12:387)。可进行序列比较的其它软件的示例包括但不限于例如：BLAST软件包(参见Ausubel等人(1999)出处同上-第18章)、FASTA(Atschul等人(1990)J.Mol.Biol.403-410(Atschul等人(1990)《分子生物学杂志》403-410))和比较工具的GENEWORKS套件。BLAST和FASTA可用于离线和在线检索(参见Ausubel等人(1999)出处同上，第7-58页至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。另一种工具即BLAST 2Sequences也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(FEMS Microbiol.Lett.(1999)174(2):247-50；FEMS Microbiol.Lett.(1999)177(1):187-8(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》(1999)174(2):247-50；《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》(1999)177(1):187-8))。
尽管最终的同源性百分比也可以同一性来量度，但比对过程本身通常不是基于全有或全无的(all-or-nothing)成对比较。相反，通常使用标度化相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离向每一成对比较赋予分值。通常使用的这种矩阵的例子是BLOSUM62矩阵(BLAST程序套件的默认矩阵)。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(关于进一步的细节参见用户手册)。对于一些应用而言，优选的是使用GCG软件包的公共默认值，或就其他软件而言，使用默认矩阵，诸如BLOSUM62。
一旦该软件产生了最佳比对，则可计算同源性百分比，优选序列同一性百分比。作为序列比较的一部分，该软件通常进行这些计算并产生数值结果。
“片段”也是变体，该术语通是常指多肽或多核苷酸中的在功能上或在例如测定中所关注的选定区域。“片段”因此是指属于全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。
此类变体可使用标准重组DNA技术如定点诱变来制备。在要制备插入物的情况下，可制备编码该插入物的合成DNA以及与天然序列对应的位于插入位点任一侧的5'和3'旁侧区。旁侧区将包含对应于天然序列中的位点的适宜的限制性位点，使得该序列可用适当的酶进行切割并且合成DNA可连接到切口中。然后根据本发明表达DNA以制备所编码的蛋白质。这些方法仅仅是说明许多本领域已知的用于操纵DNA序列的标准技术，其他已知的技术也可使用。
密码子优化
本发明中所用的多核苷酸可经过密码子优化。密码子优化此前在WO 1999/41397和WO 2001/79518中已有描述。不同的细胞在它们对特定密码子的用法上存在差异。此密码子偏向与特定tRNA在细胞类型中的相对丰度的偏向对应。通过改变序列中的密码子，使得将它们受到调控以匹配对应的tRNA的相对丰度，则有可能提高表达。同样，通过有意选择已知其对应的tRNA在特定细胞类型中稀有的密码子，有可能降低表达。因此，可获得额外程度的翻译控制。本领域已知哺乳动物细胞以及多种其他生物体的密码子用法表。
治疗方法
应认识到，本文对治疗的所有提及包括治愈性、缓和性和预防性治疗。优选哺乳动物，特别是人类的治疗。人类和兽医治疗均在本发明的范围之内。
施用
虽然用于本发明中的试剂可单独施用，但它们通常与药物载体、赋形剂或稀释剂混合施用，特别是对于人类疗法而言。
在一些实施方案中，试剂为营养剂、食品添加剂或食品成分，并可因此调配在合适的食品组合物中。因此，试剂可以例如食品、饮料、宠物食品、食物补充剂、营养保健品或营养配方食品的形式施用。
剂量
无需进行过多实验，技术人员可容易地确定向个体施用的本发明试剂之一的适当剂量。通常，医师会确定对个体患者最适合的实际剂量，并且该剂量将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用模式和时间、排泄速度、药物组合、特定病症的严重程度和个体正接受的疗法。当然也可存在有益的较高或较低剂量范围的个别情况，这在本发明的范围之内。
个体
“个体”是指人类或非人类动物。
非人类动物的示例包括脊椎动物例如哺乳动物，如非人类灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、狗、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠或豚鼠)、猪和猫。非人动物可为伴侣动物。
优选地，个体是人。
实施例
实施例1
本研究涉及对Diogenes体重减轻干预数据执行的蛋白质数量性状基因座(pQTL)分析。Diogenes研究是一项泛欧洲、随机化和对照膳食干预研究，这项研究在八个欧洲中心调查膳食蛋白和血糖指数对肥胖和超重家庭体重减轻和体重维持的作用(Larsen等人(2009)Obesity Rev.11:76-91)。简而言之，Diogenes研究使所筛选的参与者经受低热量饮食(LCD)阶段(CID1)，其中超重/肥胖个体遵循8周饮食(约800kCal/天)，继之以体重维护阶段(CID2)。
这是在致力于与身体质量指数(BMI)变化相关的蛋白质的干预期间，测试Illumina芯片上基因分型的常见变体与蛋白质表达变化之间关联的第一项研究。
在该研究中，将European 1000Genome群体用作参照基因组，使用Minimac3工具来估算未在Illumina芯片上观察到的SNP。使用通过特定QC阈值的变体的最佳推测基因型进行分析(基于80％最佳推测基因型计算)：MAF≥0.01，以及与Hardy-Weinberg平衡有显著差异(P>1.0e-6)。基于这些新数据，进行新的pQTL分析以在先前相关区域中提取更多关联信号或鉴定新区域。
材料和方法
数据
群组包括498名参与者，对于从血浆中提取的1129种Somalogic蛋白质，具有CID1和CID2的信息。遗传数据归集导致通过QC过程的4020756SNP。用Somalogic技术获得蛋白质表达信息。对数据进行预处理和质量控制。基因表达(rnaSEQ技术，对质量控制后得自脂肪组织的几乎15000种转录物可用的信息)和代谢数据也是可用的，并且用于该研究。
方法
使用线性回归(“一元”回归)测试低热量饮食(LCD)期间BMI与各蛋白质表达变化之间的关联。首先按照混杂辅因子(性别、年龄和中心)回归BMI变化，并且针对δ蛋白质表达回归残差。利用Benjamini-Hochberg标准假发现率校正，对多个测试校正P值。
SNP与蛋白质表达之间的pQTL相关性使用线性混合模型(LMM)实施。LMM是一种所选用于关联作图的新兴方法，其允许对遗传性群体异质性(由整个欧洲不同招募中心产生的地理人员结构)进行校正。基本方法是利用在芯片上可用的全部(或部分)SNP(该步骤期间未使用估算的SNP)，用于构建遗传相关矩阵(GRM)建模全基因组样品结构(研究中所有患者的遗传背景)。使用随机效应模型估计其对蛋白质表达变异的贡献，并且考虑该变异的分量计算关连性统计。在人类和模式生物研究中，LMM关联方法有效地防止遗传变异体与性状之间的假阳性关联。在本研究中，因变量是对年龄、性别和中心回归的蛋白质表达残差，而自变量是SNP。就每种蛋白质而言，对全基因组关联分析(GWAS)执行独立地测试各SNP。
GCTA软件用于LMM计算，并且“局部”选项排除了除避免多重共线性的所研究的SNP之外属于同一染色体的所有SNP。如果在GRM中使用所研究的SNP以及处于连锁不平衡的所有SNP，则无效模型的对数似然值将高于应有值并且导致检验统计量收缩和检验效能损失。该现象称为“近侧污染”。
对所有蛋白质进行GWAS pQTL。在干预期间，对具有与BMI变化相关的δ表达的蛋白质提取结果。对多个测试未应用校正。我们的目标是使用包括转录组学和遗传学(基因组测序)在内的其它组学信息来突出/优先考虑pQTL以供进一步分析。
使用1000Genomes European遗传数据作为参考(hg19)，使用R脚本(launch_locuszoom.R)中实现的locusZoom软件将结果绘制成图。
基因共表达用GeneMANIA(Zuberi,K.等人(2013)Nucleic Acids Res.41(web服务器公布):W115-22)进行评价。通过定义，如果两种基因的基因表达水平在基因表达研究中各条件下类似，则它们是关联的(共表达)。从基因表达综合数据库(GEO)收集大部分这些数据，并且仅收集与公布相关联的数据。
以R书写从Minimac推算的数据输出至提取结果(包括QC步骤、并行pQTL GWAS、提取明显信号和曲线)的传递途径。
基于LCD期间的表达变化与BMI变化相关联的一组“前”几种蛋白质，提取pQTL结果并进行探索。除非指明，LCD期间的蛋白质或表达、BMI或其它协变量的变化暗示干预之前和之后表达/水平的变化。
结果
在开始分析之前，对于所有蛋白质，提取FDR q-值<0.20且MAF>0.05的SNP。然后根据它们在对应编码基因周围的位置+/-500kb，评价它们的顺式/反式作用效应。q值测量了通过接受给定测试和p值较小(并可能甚至p值较大，如果它们改善FDR)的各个测试而产生的错误发现率(FDR)。
对于所有1129种蛋白质，并没有顺式作用SNP达到q值<0.05的关联截止。FDR截止放宽至0.20未鉴定出任何顺式作用SNP，仅鉴定出反式作用SNP。
LCD期间蛋白质表达变化
在对多个测试校正并假设设定为5％的p值截止之后，55种蛋白在体重减轻干预期间与BMI正相关，而52种负相关。对于LCD期间所有与BMI相关的蛋白质，基于Kendal相关性tau相关系数构建相关性热图，Kendall tau等级相关是用于两个顺序(或排列转化)变量之间统计相关性的非参数测试(类似于Spearman)，但其不同于Spearman之处在于可处理联系。分级群聚用于鉴定潜在集群。我们并未观察清楚描绘的较大蛋白质构件，这可能是因为该大型列表中的多个假阳性结果。
观察到9种蛋白质P<1.0e-06(在BH多次测试校正之后)的相关性。在这些9种蛋白质之间观察到极显著相关的构件，在Bonferroni校正之后，蛋白质对的Kendall相关度具有对多重测试校正的低于5％的p值。观察到两种反相关联的蛋白质构件，包括所有(除IL1RAP之外)基因编码蛋白质。
表4提供了这9种蛋白质Somalogic ID、编码基因名称、UNIPROT ID、BMI与p值(估计p值，PVAL；以及多重测试的校正p值，PBH，基于Benjamin-Hochberg方法(BH))的相关性方向的概述。在LCD期间，包括瘦蛋白、生长激素受体、TIG2(趋化素)和SAP在内的蛋白质第一构件与BMI变化正相关，而包括NRP1、SHBG、IGFBP-2、促血管生成素-2和IL-1 R AcP在内的第二构件与BMI变化负相关。
靶 基因 UNIPROT 相关性 PVAL PBH
生长激素受体 GHR P10912 正 5.2e-26 5.2e-26
瘦蛋白 LEP P41159 正 3.9e-21 3.9e-21
SHBG SHBG P04278 负 1.1e-16 1.1e-16
IGFBP-2 IGFBP2 P18065 负 2.8e-16 2.8e-16
NRP1 NRP1 O14786 负 8.5e-13 8.5e-13
TIG2 RARRES2 Q99969 正 4.9e-12 4.9e-12
促血管生成素-2 ANGPT2 O15123 负 8.5e-12 8.5e-12
IL-1 R AcP IL1RAP Q9NPH3 负 1.3e-11 1.3e-11
SAP APCS P02743 正 1.3e-09 1.3e-09
表4：LCD期间与BMI变化相关的前几种蛋白质。
下文结果涉及在可能涉及肥胖症和/或相关性状的基因中pQTL结果极具前景的蛋白质。其它基因由于不具有GWA pQTL富集的信号且前几种SNP未针对潜在关注的基因而被丢弃。
瘦蛋白
pQTL结果
瘦蛋白即“饱腹感激素”是由脂肪细胞形成的激素，有助于通过抑制饥饿来调节能量平衡。在肥胖症中，出现对瘦蛋白降低的敏感性，导致不能检测出饱腹感，尽管能量存储较高也是如此。瘦蛋白水平在体重减轻期间下降，在参与食物摄入情感、认知和感觉控制的区域中出现大脑活动增加。瘦蛋白水平的恢复维持体重减轻，并使大脑活动的变化逆转。因此，瘦蛋白是将减少的能量存储与饮食行为关联起来的关键因素(Ahima,R.S.(2008)J.Clin.Invest.118:2380-2383)。
QQ曲线图展示了关联信号的富集(基因组膨胀因子(GIF)＝1.0147153，1.6930767×10-5)。该富集针对6号染色体上的特定区域。
瘦蛋白的前十种pQTL结果包括相同目标区域中的SNP(表5仅显示不处于完全连锁不平衡(LD)的前10种SNP)。该区域包含ncRNA并且位于BCKDHB基因的调控区(http:// www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝BCKDHB&keywords＝BCKDHB)，图1显示放大6号染色体的该特定区域的曼哈顿图。
BCKDHB酶复合物导致亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸正常分解的一个步骤。这三种氨基酸获自于饮食，并且存在于许多种类的食物，尤其是富含蛋白质的食物如牛奶、肉和蛋中。
SnpID 染色体 bp Freq b p
rs1336257 6 81585576 0.2381 0.2255 1.111e-07
rs507451 6 81571792 0.2397 0.2223 1.377e-07
rs481481 6 81586692 0.2386 0.2238 1.408e-07
rs9344031 6 81400749 0.09607 0.3105 1.476e-07
rs4443477 6 81588425 0.238 0.2225 1.69e-07
rs115586175 6 81433261 0.09401 0.3112 1.694e-07
rs1981174 6 81588713 0.2385 0.2227 1.698e-07
rs534800 6 81648445 0.1353 0.266 2.149e-07
rs475407 6 81591054 0.237 0.2147 5.274e-07
rs16892128 6 81391023 0.09544 0.2948 6.665e-07
表5：用于瘦蛋白的前10个pQTL结果。
尽管在图2示出显著性，基于反式作用SNP基因型而分层的蛋白质表达并不强调较强的表达差异。然而，因为SNP通常替代功能变体的标志物，可能的情况是尽管归责，真正的基础变体却不可用。
BCKDHB基因表达分析
得自rnaSEQ的表达数据可用于BCKDHB基因。在用Benjamini-Hochberg方法对多重测试校正后，该基因在LCD干预期间显著下调(P＝1.1e-11)。与BMI变化的相关性以标称水平(P＝0.016)观察到，但并未通过多重测试校正(P＝0.179)。对于126名参与者子组观察到与蛋白质组和rnaSEQ数据显著正相关。BMI与瘦蛋白(P＝1.6e-8)和BCKDHB(P＝2.4e-2)表达正相关(在对混杂辅因子校正之后)，并且瘦蛋白蛋白质表达也显示与BCKDHB基因表达正相关(P＝2.6e-3)。
瘦蛋白基因和蛋白质表达高度相关(关联p值＝3.15e-9)，如LCD期间BCKDHB和瘦蛋白(LEP)变化(p＝2.8e-9)，以及在较低程度上BCKDHB和瘦蛋白蛋白(p＝0.0026)变化。对于所测试的所有成对变量，关联的方向是相同的(正)。
与代谢物组学结合
BCKD酶复合物在线粒体中呈活性，其中它参与亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的分解以提供能量。Stroeve等人(Stroeve,J.H.(2016)Obesity 24:379-388)观察到缬氨酸对体重减轻成功有负面贡献。
从亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸所提取的代谢组学数据分析中，使所有3种支链氨基酸(BCAA)在LCD期间差异表达(非参数威尔科克森成对测试，表6和图3)。
BCAA P值
缬氨酸 2.5e-11
异亮氨酸 2.7e-07
亮氨酸 1.5e-09
表6：在干预之前/之后比较BCAA的威尔科克森成对测试。
在表7中，LCD期间BCKDHB基因表达与缬氨酸和亮氨酸而非异亮氨酸的变化相关。
BCAA 估计值 Pr(>|t|) 校正的P
缬氨酸 0.63 0.0091 0.013
亮氨酸 0.65 0.0019 0.0058
异亮氨酸 0.22 0.22 0.22
表7：BCKDHB与代谢参数之间的关联。
在上述说明书中提到的所有出版物均以引用方式并入本文。本发明所述的试剂和方法的各种修改形式和变型形式在不脱离本发明范围和实质的情况下对本领域的技术人员将是显而易见的。虽然已结合具体优选实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解，受权利要求书保护的本发明不应不当地限于此类具体实施方案。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域技术人员显而易见的对用于实践本发明的所述模式的各种修改旨在落在以下权利要求书的范围内。

Claims (16)

1.一种能够提高支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)的活性以用于增大瘦蛋白水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂，用于支持饱腹感。
3.根据权利要求1和2所述的试剂，用于支持体重维持和/或治疗或预防肥胖症。
4.根据权利要求1至3使用的试剂，其中所述试剂提高BCKDH E1 B亚基的活性。
5.根据任一项前述权利要求使用的试剂，其中所述试剂在体重减轻干预期间或之后，优选地在体重减轻干预之后施用于个体。
6.根据任一项前述权利要求使用的试剂，其中所述试剂增大个体中BCKDH的水平，优选地其中所述试剂增大个体中BCKDH E1 B亚基的水平。
7.根据任一项前述权利要求使用的试剂，其中所述试剂不影响支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDH激酶)的活性。
8.根据任一项前述权利要求使用的试剂，其中所述试剂选自白藜芦醇或丙戊酸，或选自表1a或表1b所列的试剂。
9.根据权利要求1至6中任一项使用的试剂，其中所述试剂降低支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDH激酶)的活性，优选地其中所述试剂选自siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、多核苷酸、多肽或小分子。
10.根据权利要求9使用的试剂，其中所述试剂降低BCKDH激酶的水平。
11.根据权利要求9或10使用的试剂，其中所述试剂为α-氯异己酸或α-酮异己酸(KIC)，或选自表2所列的试剂。
12.一种鉴定能够在个体中支持体重维持和/或治疗或预防肥胖症的试剂的方法，包括以下步骤：
(a)使包含支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)多肽或多核苷酸的制剂与候选试剂相接触；以及
(b)检测所述候选试剂是否影响所述BCKDH多肽或多核苷酸的活性。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述BCKDH是BCKDH E1 B亚基。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述方法包括使包含BCKDH的制剂与候选试剂相接触，并且测量NAD+向NADH的转化率。
15.一种鉴定能够在个体中支持体重维持和/或治疗或预防肥胖症的试剂的方法，包括以下步骤：
(a)使包含支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDH激酶)多肽或多核苷酸的制剂与候选试剂相接触；以及
(b)检测所述候选试剂是否影响所述BCKDH激酶多肽或多核苷酸的活性。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法包括使包含BCKDH激酶的制剂与候选试剂在ATP存在下接触，并且测量掺入底物中的磷酸盐或者测量ATP向ADP的转化率。
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