CN102206667B - 重组质粒pET32a-hIL-23R-CHR及其构建表达 - Google Patents
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Abstract
本发明利用基因工程技术，构建了重组质粒pET32a-hIL-23R-CHR，并通过PCR法获得了8种hIL-23R-CHR突变体，突变体比天然形式具有更高的结构稳定性和活性，可用于自身免疫性疾病的治疗。本发明还提供了该重组质粒的构建以及产物的纯化方法。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及人IL-23R细胞因子受体区(hIL-23R-CHR)，构建了hIL-23R-CHR区和8个hIL-23R-CHR突变体，以及pET32a-hIL-23R-CHR的构建表达及其产物的纯化方法。
背景技术
1.IL-23R与IL-23的关系
IL-23是一个拥有异二聚体结构的造血细胞因子，由p40和p19两个亚基组成，结构上与IL-12共享p40亚基，功能类似于IL-12，可导致人类T细胞的增殖和IFN-γ的产生。与IL-12不同的是，IL-23对人类和鼠类只优先刺激记忆性T细胞而不是初始T细胞群。IL-23可作用于活化T细胞、记忆性T细胞和树突状细胞，产生IFN-γ和IL-12等细胞因子，在炎症性疾病、自身免疫性疾病的发病以及抗肿瘤和抗感染等方面发挥重要作用，有望成为新的免疫治疗因子。
IL-23R和IL-12Rβ1共同组成IL-23的受体复合物，其中，IL-12Rβ1是IL-12R的两个亚基之一，另一亚基是IL-12Rβ2。IL-23R是造血因子受体超家族的一个新的成员，位于人1号染色体上。IL-23R蛋白包含一个细胞外区域、一个单跨膜区域和一个有252个氨基酸的胞质区域。其胞外区不同于其他造血因子受体超家族成员的三个膜纤维蛋白连接，而是由一个信号序列、一个N端免疫球蛋白样结构域和2个细胞因子受体区域组成。IL-23与IL-12使用相同的Jak-stat信号分子，如Jak2、Tyk2、stat1、stat3、stat4和stat5，而IL-23R主要是运用Jak2和stat3信号分子。细胞对IL-12或IL-23的反应能力通过分别检测IL-12Rβ2和IL-23R的表达而测定。
2.IL-23R与TH17的关系
Th17是最近研究发现的一类不同于Th1和Th2细胞的CD4+T细胞亚群，此亚群细胞高表达IL-17，同时也产生IL-6和TNF-α。Th17细胞亚群的分化和功能均受Th1和Th2细胞因子的调控。目前Th17的确切调控机制仍不十分清楚，受多种细胞因子(IL-23、IL-12、IL-6、TGF-β、INF-γ等)、转录因子(RORgammat)的共同作用影响，具有自己独特的分化、发育途径。TGF-β1、IL-6是Th17细胞分化的启动者，IL-23是Th17细胞分化的促进者，IL-23在Th17细胞分化过程中具体的作用机制被认为与STAT-3有关，因为IL-23可以介导STAT-3的磷酸化过程，使STAT-3激活从而促进IL-17的分泌。IFN-γ、IL-4是Th17细胞分化的抑制因子。Socs3是一种重要的Th17细胞分化的负向调节蛋白，其机制可能是限制了STAT-3的磷酸化过程。Th17可以产生多种细胞因子，其中最主要的是IL-17。IL-17属于促炎因子，与许多炎症反应和自身免疫性疾病的发生和发展有关，如器官移植排斥反应、肿瘤及类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、哮喘等炎症免疫性疾病，这些患者的血清和病变组织中都能检测到IL-17。研究证实IL-23刺激TH17的扩增和维持，故IL-23R对TH17细胞亚群来说是一个关键的作用因子。IL23-IL23R-TH17-IL17轴在自身免疫性疾病中的致病性也已被证实。减少被IL-23刺激的IL-17的产生就可以减少EAE在小鼠模型中的发生，同时运用IL-17的抗体可以提供部分的保护作用。更进一步的研究表明，重组基因IL-23p19能够加剧小鼠的结肠炎，相反抗IL-23p19抗体的治疗就能够改善EAE。因此TH17细胞在炎症免疫性疾病中具有重要作用，可以作为一个新的药物作用靶分子。
3.IL-23R与炎症免疫性疾病的关系
研究表明，IL-23R与由TH17通路引起的炎症免疫性疾病密切相关。银屑病是一个常见的、慢性的T细胞介导的炎症性皮肤疾病。好发于15～30岁的人群，男女概率均等。从病理学来说，银屑病主要特点是血管变化、表皮的过度分化和炎症。银屑病有高度的遗传性，且具有多种因素的遗传特色。目前的生物学数据显示，IL-23/IL-23R通路可能是银屑病一个重要的干预治疗靶向。研究发现银屑病患者在皮肤损害处IL-23p19和p40mRNA的水平显著增高。另外在高表达IL-23的转基因小鼠模型中观察到由基底的角质化细胞构成的表达，它被认为在银屑病的病理学中发挥着重要的中轴作用。Ann Begovich等人为了能够更好的鉴定IL-23R遗传变异体与银屑病紧密相关，他们评估了SNPs与特定的临床表现包括好发年龄、家族史、银屑病关节炎和银屑病发病严重性的相关性，发现当对感染进行分级测定的时候，SNPrs6887695的效应显著不同。这些关于IL-23R与银屑病危险性相关的变异体的发现为IL-23通路可能是干预治疗银屑病的合适的通路提供了遗传学的证据。
炎症性肠病例如克罗恩病和溃疡性结肠炎，都属于慢性复发性胃肠道感染性疾病，可以导致腹痛、腹泻以及消化道出血，以肠道的慢性透壁性、节段性以及典型的肉芽肿性炎症为特征，好发于20～40岁，遗传因素在其发病中发挥了重要作用。牛津大学的Fraser Cummings JR等在604名克隆病、47名溃疡性结肠炎患者以及993名健康对照中进行了IL-23R基因型检测，发现在IL-23R着丝点部分具有多发的变异危险性，结果证实8个SNPs基因型检测都与克罗恩病显著相关，对于炎症性肠病而言IL-23R是一个易感基因。而BUNING等人则进一步验证了位于IL-23R上的SNP rs11209026(Arg381Gln)对于炎症性肠病来说是一个保护性的标志，起到了保护效应，但并不决定疾病的表型。
IL-23R的研究仍在继续，在对系统性红斑狼疮疾病相关性的研究中，Sánchez E等人在224名系统性红斑狼疮患者以及342名健康对照者中进行了IL-23R变异体的基因分型，结果显示在西班牙人种中IL-23R的多态性并未在系统性红斑狼疮的易感性或严重性方面发挥重要作用。另外，IL-23R SNPs在类风湿关节炎和多发性硬化疾病易感性中的作用还有待进一步探索。IL-23R基因的交替拼接的调节系统是复杂的，而优先表达某种IL-23R的拼接变体也有可能在某种癌症中发挥重要的作用。由此可见，对IL-23R特性的研究有可能进一步明确疾病的发病机制，并为疾病的临床治疗开拓新的方向。
本发明构建的pET32a-hIL-23R-CHR重组质粒经限制性内切酶验证以及DNA测序，证明质粒构建完全正确。本发明之所以构建hIL-23R-CHR重组质粒，因为该片段属于hIL-23R胞外区，是与IL-23结合的有效功能区，可以封闭IL-23的功能，进而可以防治由IL23-IL23R-TH17-IL17轴引起的自身免疫性疾病。
发明内容
本发明选择IL-23复合物中的一个亚单位-P19，利用与其结合的IL-23R受体蛋白为靶分子，构建表达了人IL-23R胞外区2个细胞因子受体区域(CHR)，以期其发挥类似于抗体效应，为自身免疫疾病的治疗提供新的可能。
本发明的第一个目的是提供表达hIL-23R-CHR的重组质粒，采用pET32a表达载体，hIL-23R-CHR基因序列见序列表1，氨基酸序列见序列表2。
本发明的第二个目的是提供hIL-23R-CHR区第176位苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)的突变体，命名为hIL-23R-CHR-A，其基因序列见序列表3，氨基酸序列见序列表4。
本发明的第三个目的是提供hIL-23R-CHR区第45位谷氨酸(E)突变成甘氨酸(G)的突变体，命名为hIL-23R-CHR-G，其基因序列见序列表5，氨基酸序列见序列表6。
本发明的第四个目的是提供hIL-23R-CHR区第49位谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)，第68位赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)，第72位色氨酸(W)突变为精氨酸(R)的突变体，命名为hIL-23R-CHR-R，其基因序列见序列表7，氨基酸序列见序列表8。
本发明的第五个目的是提供hIL-23R-CHR区第181位色氨酸(W)突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的突变体，命名为hIL-23R-CHR-W1，其氨基酸序列见序列表9。
本发明的第六个目的是提供hIL-23R-CHR区第182位谷氨酰胺(Q)突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的突变体，命名为hIL-23R-CHR-Q，其氨基酸序列见序列表10。
本发明的第七个目的是提供hIL-23R-CHR区第183位脯氨酸(P)突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的突变体，命名为hIL-23R-CHR-P，其氨基酸序列见序列表11。
本发明的第八个目的是提供hIL-23R-CHR区第184位色氨酸(W)突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的突变体，命名为hIL-23R-CHR-W2，其氨基酸序列见序列表12。
本发明的第九个目的是提供hIL-23R-CHR区第185位丝氨酸(S)突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的突变体，命名为hIL-23R-CHR-S，其氨基酸序列见序列表13。
亲和力实验证明8种hIL-23R-CHR突变体更易于与hIL-23结合，比hIL-23R-CHR具有更强的亲和力。
本发明的第十个目的是提供hIL-23R-CHR重组质粒的构建，通过以下步骤实现：
(1)PCR反应及其产物的鉴定、回收、纯化
以人白细胞cDNA文库为模板，以上下游引物进行PCR，选择LA Taq，扩增条件为：起始变性95℃5min，然后执行如下反应条件：95℃1min，55℃30s，72℃1min；30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收并纯化570bp片段。
(2)TA克隆
纯化后的PCR产物与pMD 18-T simple载体连接，连接产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂糖培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定。将pMD18-T-hIL-23R-CHR重组质粒进行测序鉴定。
(3)pET32a-hIL-23R-CHR的构建、酶切、测序鉴定
将构建成功的pMD18-T-hIL-23R-CHR和pET32a分别用NcoI和XhoI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳分离，并分别回收570bp的hIL-23R-CHR片段和线性化pET32a片段，两者在T4连接酶的作用下发生连接反应，连接产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂糖培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定。将pET32a-hIL-23R-CHR重组质粒进行测序鉴定。
本发明的第十一个目的是提供hIL-23R-CHR重组质粒的表达以及表达的融合蛋白的纯化方法，通过以下步骤实现：
(1)pET32a-hIL-23R-CHR融合蛋白表达
将pET32a-hIL-23R-CHR重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，涂布于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃烘箱中培养过夜，挑取单菌落至100ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养液中37℃放大培养。当细菌生长至OD600为0.8-1.0时加入0.2-1.0mM IPTG，16℃诱导培养12h。4℃8000rpm离心5min，收集菌体，然后用0.02M PB洗涤1-3次。
(2)pET32a-hIL-23R-CHR融合蛋白纯化
将收集的菌体溶于平衡缓冲液中(PH7.4-8.0，0.02M PB，0.5M NaCl，10mM咪唑)，500w，3s，间隔3s，4℃超声10min。破菌完全的菌液较澄清，置超速冷冻离心机中12000rpm、4℃离心20min。融合蛋白以天然的、可溶的结构形式存在于上清中，超声上清过0.45μm滤器后，缓慢加入Ni2+亲和柱，以便使融合蛋白上的6个组氨酸标签与层析柱内的Ni2+结合。用10个柱体积的平衡液平衡后，用5个柱体积的洗涤缓冲液(PH7.4-8.0，0.02M PB，0.5M NaCl，30mM咪唑；PH7.4-8.0，0.02M PB，0.5MNaCl，100mM咪唑)分别过柱，洗去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液(PH7.4-8.0，0.02M PB，0.5M NaCl，300mM咪唑)洗脱目的蛋白。
附图说明：
图1是PCR扩增产物的电泳图。
M：250bp DNA Ladder Marker；1：PCR产物(570bp)
图2是pMD18-T-hIL-23R-CHR的NcoI和XhoI双酶切鉴定图。
M：250bp DNA Ladder Marker；
1、2、3、4：pMD 18-T-hIL-23R-CHR/NcoI+XhoI(2600bp，570bp)
图3是pET32a-hIL-23R-CHR的NcoI和XhoI双酶切鉴定图。
M：250bp DNA Ladder Marker；
1、2、3、4：pET32a-hIL-23R-CHR/NcoI+XhoI(5400bp，570bp)
图4是表达、纯化的融合蛋白经15％SDS-PAGE分析图。
M：标准分子量蛋白Marker；
1：hIL-23R-CHR诱导前全菌；2、3、4：hIL-23R-CHR诱导后全菌；
5：纯化后的hIL-23R-CHR
图5是hIL-23R-CHR蛋白的Western blotting分析图。
M：预染蛋白Marker；
1：纯化后的hIL-23R-CHR；2.pET32a空质粒
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明重组表达质粒hIL-23R-CHR及其制备方法的简单改造，都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：pET32a-hIL-23R-CHR重组质粒的构建
(1)PCR反应及其产物的鉴定、回收、纯化
以人白细胞cDNA文库为模板，以上下游引物进行PCR，上游：5′-GCCCATGGCTCCGCCAGATATTCCTGATG-3′(NcoI)，下游：5′-CAGCTCGAGATGAAAAAACGGTGAGCTCCA-3′(XhoI)，其中CCATGG为NcoI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点，选择LA Taq，扩增条件为：起始变性95℃5min，然后执行如下反应条件：95℃1min，55℃30s，72℃1min；30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图1所示，可见扩增出570bp特异性的hIL-23R-CHR片段，回收并纯化570bp片段。
(2)TA克隆
纯化后的PCR产物与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂糖培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定。如图2所示，阳性克隆含有长度约2600bp和570bp的两条带，阳性克隆命名为pMD18-T-hIL-23R-CHR，将pMD18-T-hIL-23R-CHR重组质粒进行测序鉴定。
(3)pET32a-hIL-23R-CHR的构建、酶切、测序鉴定
将构建成功的pMD18-T-hIL-23R-CHR和pET32a分别用NcoI和XhoI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳分离，并分别回收570bp的hIL-23R-CHR片段和线性化pET32a片段，两者在T4连接酶的作用下发生连接反应，连接产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂糖培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定。如图3所示，阳性克隆含有长度约为5400bp和570bp的两条带，说明hIL-23R-CHR成功插入到pET32a中，阳性克隆命名为pET32a-hIL-23R-CHR，将pET32a-hIL-23R-CHR重组质粒进行测序鉴定，证实所构建的片段即为pET32a-hIL-23R-CHR的编码基因。
实施例2：hIL-23R-CHR-A突变体的构建
以pMD18-T-hIL-23R-CHR质粒为模板，以上下游引物进行PCR，上游：5′-GTGAGATGTCAAGAAGCAGG-3′，下游：5′-AAGGCTGCCAGTACCTTTTG-3′，扩增条件为：起始变性95℃5min，然后执行如下反应条件：95℃1min，55℃30s，72℃5min；30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收后，对其5′端进行磷酸化处理使自连，连接产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂糖培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行测序鉴定。
实施例3：hIL-23R-CHR-G突变体的构建
以pMD18-T-hIL-23R-CHR质粒为模板，以上下游引物进行PCR，上游：5′-GAGTTTAGAGACAGGAGAAG-3′，下游：5′-TGAGGTGAGATACTGTTGCT-3′，扩增条件为：起始变性95℃5min，然后执行如下反应条件：95℃1min，55℃30s，72℃5min；30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收后，对其5′端进行磷酸化处理使自连，连接产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂糖培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行测序鉴定。
实施例4：hIL-23R-CHR-R突变体的构建
以pMD 18-T-hIL-23R-CHR质粒为模板，以上下游引物进行PCR，上游：5′-AGAAGAAGAGCAACGGTATC-3′，下游：5′-AATATAGCTTGAGGTGA-3′，扩增条件为：起始变性95℃5min，然后执行如下反应条件：95℃1min，55℃30s，72℃5min；30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收后，对其5′端进行磷酸化处理使自连，连接产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂糖培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养过夜，小提质粒，设计引物进行二次PCR，上游：5′-CAAGGAGTACTTGGTTCGGG-3′，下游：5′-TAGTGCGTTTGCTGCTTGGA-3′，扩增条件为：起始变性95℃5min，然后执行如下反应条件：95℃1min，55℃30s，72℃5min；30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收后，对其5′端进行磷酸化处理使自连，连接产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂糖培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行测序鉴定。
实施例5：hIL-23R-CHR-W1突变体的构建
以pMD18-T-hIL-23R-CHR质粒为模板，以上下游引物进行PCR，上游：5′-AAAGGTAC-X-CAGCCTTGGAGTTCACTG-3′，下游：5′-TCAGGTGTTTTATGAAAAAA-3′，其中X为GCC、GTG、CTA、ATC、ATG、GAC、GAG、AAG、CGA、GGA、AGC、ACC、TGC、AAC或CAG，扩增条件为：起始变性95℃5min，然后执行如下反应条件：95℃1min，55℃30s，72℃5min；30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收后，对其5′端进行磷酸化处理使自连，连接产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂糖培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行测序鉴定。
实施例6：hIL-23R-CHR-Q突变体的构建
以pMD18-T-hIL-23R-CHR质粒为模板，以上下游引物进行PCR，上游：5′-AAAGGTACTGG-X-CCTTGGAGTTCACTG-3′，下游：5′-TCAGGTGTTTTATGAAAAAA-3′，其中X为GCC、GTG、CTA、ATC、ATG、GAC、GAG、AAG、CGA、GGA、AGC、ACC、TGC或AAC，扩增条件为：起始变性95℃5min，然后执行如下反应条件：95℃1min，55℃30s，72℃5min；30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收后，对其5′端进行磷酸化处理使自连，连接产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂糖培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行测序鉴定。
实施例7：hIL-23R-CHR-P突变体的构建
以pMD18-T-hIL-23R-CHR质粒为模板，以上下游引物进行PCR，上游：5′-AAAGGTACTGGCAG-X-TGGAGTTCACTG-3′，下游：5′-TCAGGTGTTTTATGAAAAAA-3′，其中X为GCC、GTG、CTA、ATC、ATG、GAC、GAG、AAG、CGA、GGA、AGC、ACC、TGC、AAC或CAG，扩增条件为：起始变性95℃5min，然后执行如下反应条件：95℃1min，55℃30s，72℃5min；30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收后，对其5′端进行磷酸化处理使自连，连接产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂糖培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行测序鉴定。
实施例8：hIL-23R-CHR-W2突变体的构建
以pMD18-T-hIL-23R-CHR质粒为模板，以上下游引物进行PCR，上游：5′-AAAGGTACTGGCAGCCT-X-AGTTCACTG-3′，下游：5′-TCAGGTGTTTTATGAAAAAA-3′，其中X为GCC、GTG、CTA、ATC、ATG、GAC、GAG、AAG、CGA、GGA、AGC、ACC、TGC、AAC或CAG，扩增条件为：起始变性95℃5min，然后执行如下反应条件：95℃1min，55℃30s，72℃5min；30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收后，对其5′端进行磷酸化处理使自连，连接产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂糖培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行测序鉴定。
实施例9：hIL-23R-CHR-S突变体的构建
以pMD18-T-hIL-23R-CHR质粒为模板，以上下游引物进行PCR，上游：5′-AAAGGTACTGGCAGCCTTGG-X-TCACTG-3′，下游：5′-TCAGGTGTTTTATGAAAAAA-3′，其中X为GCC、GTG、CTA、ATC、ATG、GAC、GAG、AAG、CGA、GGA、ACC、TGC、AAC或CAG，扩增条件为：起始变性95℃5min，然后执行如下反应条件：95℃1min，55℃30s，72℃5min；30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收后，对其5′端进行磷酸化处理使自连，连接产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂糖培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行测序鉴定。
实施例10：pET32a-hIL-23R-CHR融合蛋白的表达纯化方法
(1)pET32a-hIL-23R-CHR融合蛋白表达
将pET32a-hIL-23R-CHR重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，涂布于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃烘箱中培养过夜，挑取单菌落至100ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养液中37℃放大培养。当细菌生长至OD600为0.8-1.0时加入0.2-1.0mM IPTG，16℃诱导培养12h。4℃8000rpm离心5min，收集菌体，然后用0.02M PB洗涤1-3次。
(2)pET32a-hIL-23R-CHR融合蛋白纯化
将收集的菌体溶于平衡缓冲液中(PH7.4-8.0，0.02M PB，0.5M NaCl，10mM咪唑)，500w，3s，间隔3s，4℃超声10min。破菌完全的菌液较澄清，置超速冷冻离心机中12000rpm、4℃离心20min。融合蛋白以天然的、可溶的结构形式存在于上清中，超声上清过0.45μm滤器后，缓慢加入Ni2+亲和柱，以便使融合蛋白上的6个组氨酸标签与层析柱内的Ni2+结合。用10个柱体积的平衡液平衡后，用5个柱体积的洗涤缓冲液(PH7.4-8.0，0.02M PB，0.5M NaCl，30mM咪唑；PH7.4-8.0，0.02M PB，0.5MNaCl，100mM咪唑)分别过柱，洗去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液(PH7.4-8.0，0.02M PB，0.5M NaCl，300mM咪唑)洗脱目的蛋白。
(3)融合蛋白经15％SDS-PAGE分析和Western blotting分析
收集洗脱峰值的洗脱液进行15％SDS-PAGE电泳，双份点样，将左侧凝胶考马斯亮蓝R250液中染色，右侧凝胶转移至PVDF膜2h，取出膜，用5％的脱脂奶粉封闭过夜，加入鼠抗多聚组氨酸抗体(1∶1000-1∶5000)室温孵育2h，加入辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG(1∶1000-1∶5000)室温孵育2h，然后用DAB显色。将纯化后的融合蛋白透析除盐，冻干后，置于-20℃保存以备用。
pET32a-hIL-23R-CHR重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，在IPTG诱导下，能稳定而高效地表达hIL-23R-CHR融合蛋白，经15％SDS-PAGE分析和Western blotting分析表明，在40KDa出现hIL-23R-CHR目标表达条带，见图4和图5所示。
实施例11：pET32a-hIL-23R-CHR融合蛋白亲和力测定
将纯化的hIL-23R-CHR、hIL-23R-CHR-A、hIL-23R-CHR-G、hIL-23R-CHR-R、hIL-23R-CHR-W1、hIL-23R-CHR-Q、hIL-23R-CHR-P、hIL-23R-CHR-W2或hIL-23R-CHR-S与商业化的hIL-23按照不同摩尔比于37℃烘箱孵育2h，将hIL-23R-CHR或者8种hIL-23R-CHR突变体、hIL-23以及两者混合物分别上样，进行非变性凝胶电泳，然后银染检测，结果显示，当hIL-23R-CHR与hIL-23摩尔比为10∶1时，在高于两者条带之上，新生成一条明显的条带，分析该条带即为两者结合而形成的新的复合物，当hIL-23R-CHR-A与hIL-23摩尔比为8∶1，hIL-23R-CHR-G与hIL-23摩尔比为8∶1，hIL-23R-CHR-R与hIL-23摩尔比为6∶1，hIL-23R-CHR-W1与hIL-23摩尔比为6∶1，hIL-23R-CHR-Q与hIL-23摩尔比为5∶1，hIL-23R-CHR-P与hIL-23摩尔比为2∶1，hIL-23R-CHR-W2与hIL-23摩尔比为4∶1，hIL-23R-CHR-S与hIL-23摩尔比为4∶1时，可见复合物的形成，说明8种hIL-23R-CHR突变体更易于与hIL-23结合，比hIL-23R-CHR具有更强的亲和力。
Claims (4)
1.一种hIL-23R-CHR突变体蛋白，命名为hIL-23R-CHR-A，其特征为天然hIL-23R-CHR区第176位苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)，氨基酸序列见序列表SEQ ID NO：4。
2.一种hIL-23R-CHR突变体蛋白，命名为hIL-23R-CHR-G，其特征为天然hIL-23R-CHR区第45位谷氨酸(E)突变成甘氨酸(G)，氨基酸序列见序列表SEQ ID NO：6。
3.一种hIL-23R-CHR突变体蛋白，命名为hIL-23R-CHR-R，其特征为天然hIL-23R-CHR区第49位谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)，第68位赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)，第72位色氨酸(W)突变为精氨酸(R)，氨基酸序列见序列表SEQ ID NO：8。
4.权利要求1-3中所述3种突变体蛋白用于制备治疗hIL-23介导的自身免疫性疾病的药物的用途。
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| 车昌燕、张国华、刘力.人IL-23R胞外区基因的克隆及蛋白表达研究.《中国病原生物学杂志》.2009,第4卷(第5期),正文第1页左栏第1行至正文第3页右栏第37行. * |
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