WO2001044451A1 - Genes de cholesterol-esterase, adn recombine et procede de production de cholesterol-esterase - Google Patents

Genes de cholesterol-esterase, adn recombine et procede de production de cholesterol-esterase Download PDF

Info

Publication number
WO2001044451A1
WO2001044451A1 PCT/JP2000/007968 JP0007968W WO0144451A1 WO 2001044451 A1 WO2001044451 A1 WO 2001044451A1 JP 0007968 W JP0007968 W JP 0007968W WO 0144451 A1 WO0144451 A1 WO 0144451A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cholesterol
cholesterol esterase
amino acid
acid sequence
esterase
Prior art date
Application number
PCT/JP2000/007968
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kousuke Matsumoto
Keisuke Furukawa
Yasuji Koyama
Yoshio Ichikawa
Naoki Kajiyama
Original Assignee
Kikkoman Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kikkoman Corporation filed Critical Kikkoman Corporation
Publication of WO2001044451A1 publication Critical patent/WO2001044451A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01013—Sterol esterase (3.1.1.13)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cholesterol esterase gene, a recombinant DNA and a cholesterol esterase useful in the field of clinical diagnosis.
  • Cholesterol esterase is an enzyme that catalyzes the reaction of hydrolyzing cholesterol ester to produce cholesterol and fatty acids, and can be used for quantifying cholesterol in human blood, and is used as a diagnostic enzyme. Is widely used.
  • cholesterol 'esterase is already produced by many microorganisms (for example, Xanthomonas sp. No. 8 (13) described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 56355/1996). 16369)) These microorganisms are used for industrial-scale production.
  • An object of the present invention is to produce cholesterol esterase derived from Xanthomonas sp. No. 8 thru 13 by a genetic engineering technique.
  • a method for producing an enzyme is provided.
  • the present inventors have succeeded in cloning and isolating the cholesterol 'esterase structural gene derived from Xanthomonas sp. No. 8 to 13 and involved in the production of cholesterol esterase.
  • Recombinant DNA obtained by inserting a DNA fragment carrying the gene information into vector DNA is obtained, and this recombinant DNA is included in a strain belonging to the genus Escherichia or the like, and cholesterol.
  • a production system was constructed, and the present invention was completed.
  • the present invention provides a cholesterol esterase gene encoding the following protein (a) or (b).
  • the present invention provides a cholesterol / esterase gene obtained by introducing a mutation such as shirt fling based on the cholesterol / esterase gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides a cholesterol esterase gene derived from Xanthomonas sp. No. 81-13 and defined by the following restriction enzyme cleavage map.
  • the present invention provides a recombinant DNA, wherein any one of the above cholesterol.esterase genes is inserted into vector DNA.
  • the present invention also provides a transformant or a transductant containing the above-mentioned recombinant DNA.
  • the present invention provides a method for producing cholesterol esterase, which comprises culturing the above transformant or transductant in a medium and collecting cholesterol esterase from the culture. .
  • FIG. 1 shows a restriction enzyme cleavage map of a DNA fragment containing a gene encoding cholesterol esterase.
  • the cholesterol 'esterase gene of the present invention can be obtained, for example, as follows.
  • Xanthomonas sp. No. 81-13 (FERM P-16369) was cultured, for example, by the method described in Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Intersciense, 1989), and chromosome was obtained from the obtained strain. Extract the DNA.
  • a region with low degeneracy is selected based on the amino acid sequence of the purified cholesterol esterase to prepare a synthetic DNA probe.
  • the previously obtained chromosomal DNA is digested with an appropriate restriction enzyme, subjected to agarose gel electrophoresis, subjected to Southern hybridization with a synthetic DNA probe, and the site where the chromosomal DNA digested fragment and the synthetic DNA probe hybridize is analyzed. .
  • the chromosome DNA digested with the restriction enzyme is subjected to agarose gel electrophoresis, the hybridized site is cut out from the agarose gel, and DNA is extracted.
  • the plasmid vector used here is not particularly limited as long as it can produce the following chromosome library.For example, pUC19, pHSG298, pBR322, pKF3 (all of which are manufactured by Takara Shuzo) Manufactured).
  • a chromosome library is obtained by ligating the chromosome digested DNA fragment and the ring-opening plasmid that hybridize with the previously prepared synthetic probe with the DNA ligase. Using these plasmids, a suitable host cell is transformed according to a conventional method to obtain a transformant. Next, colony hybridization is performed to obtain a positive transformant. Prepare a plasmid from the positive transformant according to a conventional method. Thus, the recombinant DNA of the present invention is obtained.
  • the recombinant DNA thus obtained is cut with several types of restriction enzymes to prepare a restriction enzyme cleavage map.
  • a DNA fragment of about 1.9 kbp having a restriction enzyme cleavage map shown in FIG. 1 contains a cholesterol.esterase structural gene.
  • the nucleotide sequence of the recombinant DNA can be determined using the dideoxy method.
  • the cholesterol 'esterase structural gene derived from Xanthomonas sp. No. 8 to 13 is specifically a gene containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 one or more amino acids are deleted, substituted, added, or shuffled, and an amino acid that causes cholesterol 'esterase activity is obtained. All cholesterol 'esterase genes that encode an acid sequence are included in the present invention.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 one or more amino acids, preferably several amino acids are deleted, substituted, added, or shuffled, and cholesterol ′ Any method can be used to obtain the cholesterol / esterase gene encoding the amino acid sequence that provides esterase activity, for example, by generating a point mutation or deletion mutation in the gene.
  • Site-directed mutagenesis a method for selectively cleaving a gene, and then removing or adding a selected nucleotide and linking the gene, and an oligonucleotide mutagenesis method, which are well-known techniques for causing Can be
  • bases corresponding to amino acids at the N- and C-termini and oligonucleotides having a restriction enzyme site added thereto are synthesized, and these are used as primers.
  • the positive transformant obtained above was subjected to a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) using a plasmid containing the cholesterol / esterase gene as a type II, and appropriate restriction enzyme sites at both ends.
  • PCR polymerase chain reaction
  • cholesterol esterase-encoded DNA having This DNA fragment or the previously prepared DNA fragment of about 1.9 kbp was used to ligate a DNA sequence (eg, the promoter, operator, and expression region such as a ribosome binding site derived from E.
  • coli lactose operon containing the expression region (The Operon, P227, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980;) Insert the DNA into the restriction sites of the DNA.
  • vector DNA to be used include plasmid DNA and pacteriophage DNA.
  • the host cell is not particularly limited.
  • Escherichia Bacillus, Pseudomonas And yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, animal cells, insect cells, plant cells, and the like, each of which is transformed or transduced using a technique known in the art.
  • a bacterium preferably E. coli K-12, particularly preferably E. coli JM109 (Takara Shuzo) or X Blue (Funakoshi Co., Ltd.
  • Each strain can be obtained by carrying out transformation or transduction using the yeast as a host. Transformation or transduction can be performed by a method commonly used in the art, and examples thereof include an electrophoresis method, a calcium phosphate method, a spheroplast method, and a lipofection method. it can.
  • the cholesterol / estera was obtained using the cholesterol / esterase-producing strain belonging to the genus Escherichia obtained as described above.
  • the above transformant or transductant may be cultured by a usual solid culture method, but it is preferable to employ a liquid culture method as much as possible.
  • the culture medium for culturing the above-mentioned transformant or transductant is, for example, yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor or soybean or wheat koji leaching solution.
  • At least one kind of inorganic salts such as potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate is added to more than one nitrogen source If necessary, a saccharide raw material, vitamin, or the like is appropriately added.
  • the initial pH of the medium should be adjusted to 6-9.
  • the cultivation is preferably carried out at 25 to 45 ° C., preferably around 30 ° C. for 6 to 24 hours, by aeration and agitation deep culturing, shaking cultivation, stationary culturing and the like. After the completion of the culture, cholesterol esterase can be collected from the culture using ordinary enzyme collecting means.
  • the cells are separated from the culture by, for example, filtration, centrifugation, etc., and washed. Collecting cholesterol 'esterase from these cells Is preferred.
  • the cells can be used as they are, but a method of destroying the cells using various disrupting means such as an ultrasonic crusher, a French press, a dynamyl, etc., or a method using a cell wall lysing enzyme such as lysozyme. It is preferable to collect cholesterol / esterase from the cells by a method of lysing cell walls, a method of extracting enzymes from the cells using a surfactant such as Triton X-100, or the like.
  • a surfactant such as Triton X-100
  • a method used for ordinary enzyme purification can be used.
  • the obtained cholesterol esterase had the following physicochemical properties as described in JP-A-56 / 35555.
  • Substrate specificity Acts on cholesterol 'linoleate, cholesterol' oleate, cholesterol 'nomitate, cholesterol' octanolate, and cholesterol 'stearate, especially cholesterol 'It has the strongest effect on the ballet. It also has a small effect on cholesterol 'acetate.
  • Optimal pH and stable pH range The optimal pH is around 6.5.
  • the stable pH range is 5.5 to 8.5.
  • the activity of this enzyme was measured under the following conditions.
  • the amount of enzyme that hydrolyzes 1 mole of cholesterol ester per minute is defined as 1 unit.
  • Cholesterol 'esterase hydrolyzes the substrate cholesterol ester to produce cholesterol and fatty acids as described below.
  • the produced cholesterol is oxidized by the action of cholesterol oxidase to form 4-cholesten-3-one and hydrogen peroxide.
  • hydrogen peroxide is reacted with 4-aminoantipyrine and phenol in the presence of peroxidase, and the resulting quinonimine dye is colorimetrically determined.
  • Xanthomonas sp. No. 81-13 (FERM P-16369) was inoculated into 200 ml of the following LB medium and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours to obtain a culture.
  • the culture is harvested by centrifugation at 6,000 rpm for 10 minutes.
  • the cells were obtained. From the cells, 1.5 mg of chromosomal DNA was obtained according to the method described in Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Intersciense, 1989).
  • Purified cholesterol esterase 150Aig derived from Xanthomonas sp. No. 81-13 was applied to a protein sequencer (Applied Biosystems 473A) to determine the N-terminal amino acid sequence. Furthermore, 1.5 mg of cholesterol-esterase was digested with lysyl endopeptidase at 37 ° C for 20 hours, and the peptide fragments were separated by reversed-phase HPLC (Spectra Physics Model No. SP8800-010), and the 473A Peptide Sequencer was collected. (Applied Biosystems) to determine the internal amino acid sequence. Based on this sequence, a region with low degeneracy was selected, and the probe described in SEQ ID NO: 3 was synthesized using a DNA synthesizer (Applied Biosystems 392).
  • the probe synthesized in (2) was DIG-labeled using a DNA 5 'endlabling kit (manufactured by Behringer).
  • the Southern hybridization membrane was prepared by partially digesting the chromosomal DNA with SauIIIAI, separating it by 1.2% agarose gel electrophoresis, and subjecting it to Hybond-N + (Amersham) using a standard method. It was prepared by transferring using.
  • the Southern hybridization was performed using a DIG-Luminescent Detection kit (manufactured by Behringer). As a result, a band was detected around 2.0 kbp of the partially degraded chromosomal DNA.
  • E. coli DH5a (pX310P) (p This strain is obtained by transforming Escherichia coli (E. coli) DH5a (manufactured by Toyobo) using rasmid pX310P by an ordinary method. ), A plasmid was prepared according to a conventional method to obtain a recombinant DNA (pX310P) containing a DNA fragment of about 1.9 kbp.
  • nucleotide sequence was determined using a 370 DNA Sequencing System (manufactured by Applied Biosystems).
  • the amino acid sequence predicted from the nucleotide sequence contained the N-terminal amino acid sequence previously used as a probe.
  • a termination codon was confirmed on the same frame as the frame encoding the N-terminal amino acid sequence, and also coincided with the previously determined internal amino acid sequence. It was confirmed that the cholesterol-esterase gene was completely contained.
  • the cholesterol / esterase gene identified here encoded 1,581 bp in length and 526 amino acids. (SEQ ID NOS: 1 and 2)
  • primers described in SEQ ID NOS: 4 and 5 to which an Ndel site and a Spel site were added were prepared.
  • PCR method only the structural gene was amplified using the primer prepared above, and pUTE500K ' Ligation was performed using T4Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) at the Ndel site and the Spel site in JP-A-8-205861.
  • This plasmid was named pCHE-XE.
  • Escherichia coli DH5a (manufactured by Toyobo) was transformed in a conventional manner to obtain a transformant, Escherichia coli DH5a (pCHE-XE).
  • Escherichia coli DH5a (pCHE-XE) was sent to the Ministry of International Trade and Industry, Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Institute of Biotechnology and Industrial Technology, FERM BP-6968 on December 13, 1999 Has been deposited as
  • Escherichia coli (E. coli) DH5a (pX310P) and E. coli (E. coli) DH5a (pCHE-XE) obtained above were mixed with 50A6 g / ml kanamycin in an LB medium (1% tributone, 0.5% yeast extract, (1.0% sodium chloride, pH 7.0) After shaking culture in 10 ml at 30 ° C for 16 hours, disrupt the culture by sonication, centrifuge, and measure the enzyme activity as described above for the supernatant. The cholesterol and esterase activities measured by the method were 1.0 and 3.2 U / ml, respectively.
  • a unique cholesterol esterase gene derived from Xanthomonas sp. No. 81-13 can be obtained, which is transformed by a recombinant DNA having a DNA fragment containing the gene incorporated into a vector.
  • the novel microorganism has remarkably excellent cholesterol / esterase producing ability, and can efficiently produce cholesterol / esterase.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

明 細 書 コ レステロール · エステラーゼ遺伝子、 組み換え体 D NA及びコ レステ ロール ' エステラーゼの製造法
技術分野
本発明は、 臨床診断分野で有用なコレステロール · エステラーゼ遺伝 子、 組み換え体 D N A及びコ レステロール · エステラーゼの製造法に関 する。 背景技術
コ レステロ一ル · エステラーゼは、 コレステロールエステルを加水分 解し、 コ レステロールと脂肪酸を生ずる反応を触媒する酵素であり、 ヒ 卜の血中コ レステロールの定量に用いることができ、 診断用酵素と して 広く利用されている。
コレステロール ' エステラーゼは、 既に多くの微生物によって生産さ れるこ とが報告されており、 （例えば、 特開平 1卜 56355 号公報記載のキ サン トモナス（Xanthomonas)sp. No.8卜 13(FERM P-16369)等） これらの微 生物によ り、 工業的規模での生産が行われている。
しかしながら、 これらの方法によるときには、 生産量が低いという問 題点があり、 安定性の高いコ レステロール ' エステラーゼの信頼性が高 くかつ安価な製造法の開発が望まれている。 発明の開示
本発明は、 キサン トモナス sp. No.8卜 13 由来のコ レステロ一ル · エス テラーゼを遺伝子工学的手法によ り生産するこ とを目的と して、 その生 産の元となるコ レステロール · エステラーゼ遺伝子及びコ レステロ一 ル · エステラーゼ遺伝子を含む D NA断片、 更に、 該遺伝子を含む組み 換え体 D N A及び該組み換え体 D N Aを用いるコ レステロール · エステ ラーゼの製造法を提供する。
本発明者等は、 鋭意検討を重ねた結果、 キサン トモナス sp. No.8卜 13 由来のコ レステロール ' エステラーゼ構造遺伝子のクローニング及び該 遺伝子の単離に成功し、 コ レステロール . エステラーゼの生産に関与す る遺伝子情報を担う D N A断片をべクタ一 D N Aに揷入した組み換え体 D NAを得、 この組み換え体 D N Aをエツシェリシァ（Escherichia)属等 に属する菌株に含ませ、 効率よ く コ レステロール . エステラーゼを生産 するシステムを構築し、 本発明を完成した。
即ち、 本発明は、 以下の（ a )または（b )のタ ンパク質をコー ドするコ レステロール · エステラーゼ遺伝子を提供する。
( a )配列番号 1 に示されるァミ ノ酸配列からなるタンパク質
(b )アミ ノ酸配列（ a )において、 1 も しく は複数のアミ ノ酸が欠失、 置 換も しく は付加されたァミ ノ酸配列からなり、 かつコレステロール . ェ ステラーゼ活性を有するタンパク質
また本発明は、 配列番号 1 記載のァミ ノ酸配列を コー ドするコ レステ ロール · エステラーゼ遺伝子をも とにシャツフ リ ング等の変異を導入し て得られるコレステロール · エステラーゼ遺伝子を提供する。
また本発明は、 キサン トモナス sp.No.81- 13 に由来し、 下記の制限酵 素開裂地図で規定されるコ レステロール · エステラーゼ遺伝子を提供す る。
Sal I Sal I
Sau3A I Pvu II Not I (Hinc II) Pst I (Hinc II) Sau3A I コレステロール 'エステラーゼ遺伝子 一►
0.14 ' 0.19 0.24 0.33 0.39 0.32 0.11 0.14
(kbp) さらにまた本発明は、 上記いずれかのコ レステロール . エステラーゼ 遺伝子をべクタ一 D NAに挿入したことを特徴とする組み換え体 D NA を提供する。 また本発明は、 上記の組み換え体 D N Aを含む形質転換体または形質 導入体を提供する。
さ らにまた本発明は、 上記の形質転換体または形質導入体を培地に培 養し、 培養物からコ レステロール ' エステラーゼを採取するこ とを特徴 とするコ レステロール · エステラーゼの製造法を提供する。
本明細書は本願の優先権の基礎である 日本国特許出願平成 11 年第 353795号の明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 コ レステロール · エステラーゼをコー ドする遺伝子を含有す る D N A断片の制限酵素開裂地図を示す。 発明を実施するための形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明のコ レステロール ' エステラーゼ遺伝子は、 例えば、 次のよう にして得るこ とができる。
先ず、 キサン トモナス sp. No.81-13(FERM P- 16369)を、 例えば、 Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Intersciense, 1989)言己載の方法 等によ り培養し、 得られた菌株から染色体 D N Aを抽出する。
次いで、 精製コ レステロ一ル · エステラーゼのアミ ノ酸配列に基づい て、 縮重の少ない領域を選択して、 合成 D NAプローブを作製する。 先 に得られた染色体 D N Aを適当な制限酵素で消化して、 ァガロースゲル 電気泳動に供し、 合成 D N Aプローブとサザンハイプリ ダイゼーショ ン を行い、 染色体 D N A消化断片と合成 D N Aプローブがハイブリ ダィズ する部位を解析する。 同様に制限酵素で消化した染色体 D N Aをァガロ ースゲル電気泳動に供し、 ハイプリ ダイズした部位をァガロースゲルか ら切り出し、 D NAを抽出する。
一方、 予め適切なプラスミ ドベクタ一を先に調製した染色体 DNA消化 断片の末端と結合可能な切断断片を生じる制限酵素で消化した後、 アル カリ フォスファタ一ゼでタ 1理し、 ァガロース電気泳動に供し、 開環ブラ スミ ドをゲルから切り出し、 抽出する。 ここで用いられるプラスミ ドべ クタ一は、 下記の染色体ライブラ リ一を作製できるものであれば特に限 定されるものではないが、 例えば pUC 19、 pHSG298, pBR322、 pKF3 (いず れも宝酒造社製） 等が挙げられる。
先に調製した合成プローブとハイブリ ダィズする染色体消化 D N A断 片と開環プラスミ ドを D N Aリ ガ一ゼで連結し、 染色体ライブラ リ一を 得る。 これらのプラスミ ドを用い、 常法に従って適当な宿主細胞を形質 転換し、 形質転換体を得る。 次いで、 コロニーハイブリ ダィゼ一シヨ ン を行い、 陽性形質転換体を得る。 陽性形質転換体よ り、 常法に従い、 プ ラスミ ドを調製する。 このよう にして、 本発明の組み換え体 D N Aを得 る。
このよう にして得られた組み換え体 D N Aを何種類かの制限酵素で切 断して制限酵素開裂地図を作製する。 例えば、 図 1 に示される制限酵素 開裂地図を有する約 1. 9kbpの D N A断片にコレステロール .エステラー ゼの構造遺伝子が含まれる。
さ らに組み換え体 D N Aをジデォキシ法を用いて塩基配列を決定する ことができる。 決定されたキサン トモナス sp . No. 8卜 13 由来のコ レステ ロール ' エステラーゼ構造遺伝子は 、 具体的には配列番号 1 記載のアミ ノ酸配列をコー ドする塩基配列を含む遺伝子である。
なお、 配列番号 1 に示されるアミ ノ酸配列において、 1 も しく は複数 のアミ ノ酸が欠失、 置換、 付加、 またはシャッフリ ングされており、 か つ、 コ レステロール ' エステラーゼ活性をもたらすアミ ノ酸配列をコ一 ドするコ レステロール ' エステラーゼ遺伝子は、 全て本発明に含まれる。 配列番号 1 に示されるアミ ノ酸配列において、 1 も しく は複数、 好ま しく は、 数個のアミ ノ酸が欠失、 置換、 付加、 またはシャッフ リ ングさ れており、 かつ、 コ レステロール ' エステラーゼ活性をもたらすァミ ノ 酸配列を コードする コ レステロール · エステラーゼ遺伝子を得るには、 如何なる方法でもよ く、 例えば、 遺伝子に点変異または欠失変異を生じ させるための周知技術である部位特定変異誘導法、 遺伝子を選択的に開 裂し、 次いで、 選択されたヌク レオチドを除去または付加し、 遺伝子を 連結する方法、 オリ ゴヌクレオチ ド変異誘導法等が挙げられる。
また、 シャッフ リ ングを生じさせるための周知技術と しては、 例えば、 Willem P. C. Stemmer, Proc. Nat 1. Acad. Sci . , Vol.91， pp.10747- 10751 ( 1994)、 Willem P. C. Stemme r, NATURE, VOL.370■ 4( 1994)等が挙げ られる。
また、 決定した遺伝子配列及びァミ ノ酸配列から Genome Net WWWサー ノヽ一の BLAST 索 (Sequence similarity search)を用 ヽて、 データべ一 ス上の D N A配列、 アミ ノ酸配列との相同性を検索する。 このようにし て、 本発明のコ レステロール · エステラーゼ遺伝子の D NA配列及びァ ミ ノ酸配列は、 既知の配列と相同性が低い新規なものであるこ とを確認 した。
次いで、 決定された塩基配列をもとに、 N末端、 C末端のアミ ノ酸に対 応する塩基、 さ らに制限酵素部位を付加したオリ ゴヌク レオチドを合成 し、 これらをプライマーと して、 上記で得られた陽性形質転換体のコ レ ステロール · エステラ一ゼ遺伝子を含むプラスミ ドを錡型と したポリ メ ラーゼ連鎖反応 （以下 PCR と略する） を行い、 両端に適切な制限酵素部 位を有したコ レステロール · エステラーゼを コー ド した D NAを得る。 この D N A断片も し く は、 先に作製した約 1.9kbpの D N A断片を、 例え ば大腸菌ラク トースオペロン等に由来するプロモーター、 オペレーター 及びリ ボゾーム結合部位等の発現領域を含む D N A配列 （The Operon, P227, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980 年を参照；） を保有するべ クタ一 D N Aの制限酵素部位に挿入する。 用いられるベクタ一 D NAと しては、 例えば、 プラスミ ド D N A、 パクテリオファージ D N A等が挙 げられる。
次いで、 得られた組み換え体 D N Aを用いて、 適当な宿主中に導入し、 形質転換体または形質導入体を作製する。 宿主細胞は、 特に限定される ものではなく、 例えばエツシェリ シァ属、 バチルス属、 シユー ドモナス 属、 リ ゾビゥム属等に属する細菌、 サッカロミセス · セレビシェ等の酵 母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等が挙げられ、 それぞれ当分野にお いて公知の技術を用いて形質転換または形質導入を行う こ とができるが、 細菌を宿主とする場合には、 好ましく は大腸菌 K- 12、 特に好ましく は大 腸菌 JM 109 (宝酒造社製）、 または Xい B l ue (フナコシ（株）製） 等を宿主 と して形質転換または形質導入を行い、 夫々の菌株を得るこ とができる。 形質転換または形質導入の方法は、 当分野において通常用いられるも のを適宜使用でき、 例えばエレク トロボレ一シヨ ン法、 リ ン酸カルシゥ ム法、 スフエロプラス ト法、 リポフエクシヨ ン法等を挙げるこ とができ る。
上記のよ う にして得られたコ レステロール · エステラーゼ生産能を有 するエツシェリ シァ属に属する菌株を用いてコ レステロール · エステラ
—ゼを生産するには、 下記のようにして行うことができる。
上記形質転換体または形質導入体を培養するには、 通常の固体培養法 で培養してもよいが、 なるべく液体培養法を採用して培養するのが好ま しい。
また、 上記形質転換体または形質導入体を培養する培地と しては、 例 えば、 酵母エキス、 ペプトン、 肉エキス、 コーンスティ一プリ カ一ある いは大豆も しく は小麦麹の浸出液等の 1種以上の窒素源に、 リ ン酸ニ水 素カ リ ウム、 リ ン酸水素二カリ ウム、 硫酸マグネシウム、 塩化第 2鉄、 硫酸第 2鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の 1種以上を添加し、 さ らに必要によ リ糖質原料、 ビタ ミ ン等を適宜添加したものが用いられる。 なお、 培地の初発 pH は、 6〜9 に調整するのが適当である。 ま 培養 は、 25〜45°C、 好ま しく は 30°C前後で 6〜24時間、 通気撹拌深部培養、 振と う培養、 静置培養等によ り実施するのが好ましい。 培養終了後、 該 培養物よ リ コ レステロール ' エステラーゼを採取するには、 通常の酵素 採取手段を用いるこ とができる。
培養物から、 例えば、 濾過、 遠心分離等の操作によ リ菌体を分離し、 洗菌する。 この菌体からコ レステロール ' エステラーゼを採取するこ と が好ましい。 この場合、 菌体をそのまま用いるこ ともできるが、 超音波 破砕機、 フレンチプレス、 ダイナミル等の種々の破壊手段を用いて菌体 を破壊する方法、 リ ゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁 を溶解する方法、 ト リ トン X- 100等の界面活性剤を用いて菌体から酵素 を抽出する方法等によ リ、 菌体からコ レステロール · エステラーゼを採 取するのが好ま しい。
このよう にして得られた粗酵素液からコ レステロール · エステラーゼ を単離するには、 通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。 例え ば、 硫安塩析法、 有機溶媒沈澱法、 イオン交換クロマ トグラフ法、 ゲル 濾過クロマ トグラフ法、 吸着クロマ トグラフ法、 電気泳動法等を適宜組 み合わせて行うのが好ましい。
得られたコ レステロール ' エステラーゼは、 特開平 1卜 56355号に記載 の通りの、 以下の理化学的性質を有していた。
( 1 ) 作用 ： コ レステロール ' エステルを加水分解して脂肪酸とコ レス テロールを生成する。
( 2 ) 基質特異性 ： コ レステロール ' リ ノ レート、 コレステロール ' ォ レエ一ト、 コ レステロール ' ノ ルミテー ト、 コ レステロール ' ォクタノ ェ一ト、 及びコ レステロール ' ステアレートに作用し、 中でも コ レステ ロール 'ォレエ一トに対して最も強く作用する。 また、 コ レステロール ' アセテートにもわずかに作用する。
( 3 ) 至適 p H及び安定 p H範囲 ： 至適 p Hは 6. 5付近である。 また、 安定 p H範囲は、 5. 5〜8. 5である。
( 4 ) 作用適温の範囲 ： 4 5〜 5 0 °C
( 5 ) p H、 温度などによる失活の条件 ： 本酵素は、 3 7 °C、 6 0分間 の処理では、 ρ Η 5 · 5〜8. 5で安定である。 また、 5 0 mMのへべ ス—水酸化ナト リ ゥム緩衝液 （ p H 7. 0 ) を用いて、 各温度で 3 0分 間処理した場合、 5 5 °Cまで安定であり、 6 5 °Cで約 4 0 %失活する。
( 6 ) 阻害、 活性化及び安定化 ： 本酵素は、 H g C 1 2で強く阻害され、 また Z n S 04と C u S 04で 1 5 ~ 2 5 %程度阻害される力 活性化及 び安定化に特別に寄与する金属塩は見当たらない。
( 7 ) 分子量 ： S D S —ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動法による本酵 素の分子量は、 約 5 5 ， 0 0 0である。
本酵素の活性の測定は、 下記条件下で行った。 なお、 1分間に 1 マイ クロモルのコ レステロールエステルを加水分解する酵素量を 1 単位とす る。
(原理）
コ レステロール ' エステラーゼは、 下記のように基質であるコ レステ ロールエステルを加水分解してコ レステロールと脂肪酸を生成させる。 生成されたコ レステロ一ルは、 コ レステロールォキシダ一ゼの作用で酸 化されて、 4-コ レステン一 3 —オン及び過酸化水素となる。 続いて、 過 酸化水素と 4 -ァミ ノアンチピリ ン及びフエノールをペルォキシダ一ゼ存 在下で反応させ、 生成するキノ ンィ ミ ン色素を比色定量する。 コ レステロ一ル · エステラーゼ
コ レステロ一ルエステル ^コ レステロール +脂肪酸 コ レステロールォキシダーゼ
コ レステロール ► 4 —コ レステン一 3 —オン +H202
02
ペルォキシダーゼ
2H202+4-ァミ ノ アンチピリ ン +フェノ 一ル ^キノ ンイ ミ ン色素 +4H20
(反応液の調製）
1 10 mM リ ン酸カリ ゥム緩衝液（ρΗ7 · 0 )、 0. 20 mM コレステロールリ ノ レ —ト、 0. 68% イソプロパノール、 0. 34% ト リ トン X- 100、 0. 2% コール酸 ナト リ ウム、 1 . 5 mM 4-ァミ ノアンチピリ ン、 22 mM フエノール、 5 U /m l コレステロールォキシダーゼ、 5 U /m 1 ペルォキシダーゼの組成で混合す る。 酵素希釈は、 氷冷した蒸留水にて行う。
(測定手順）
1 )反応液 2.85 ml を 37°Cにて 5分間プレインキュベーショ ンする。
2)酵素液 （0.1〜0.5 U/ml 程度に調整） 0.1 ml を混合し、 水を対照と し て 500 nm の吸光度の変化を 37°Cで 3 分間測定し、 直線部分から 1 分間 の吸光度変化を求める（A0Dsample)。
3)ブランク値の測定は、 反応液 2.85 ml を 37°Cにて 5分間プレイ ンキュ ベ一シヨ ンした後、 蒸留水を 0.1 ml 混合し、 上記と同様に操作を行い、
1 分間の吸光度変化を求める（A0Dblank)。
(活性の計算）
(AODsample - AODblank) 2.95 (ml)
U/ml= 希釈倍率
*13.78 0.5 1.0 0.1 (ml)
*13.78 ： キノ ンィ ミ ン色素のミ リモル吸光度係数， 0.5： 酵素反応で生 成した 2分子の過酸化水素から形成するキノ ンィ ミ ン色素が 1 分子であ るこ とによる係数， 1.0 : 光路長 （cm)
以下、 実施例によ り本発明を更に具体的に説明する。
実施例
(1)キサン トモナス sp. No.81- 13の染色体の調製
キサントモナス sp. No.81-13(FERM P- 16369)を下記の LB培地 200ml に 接種して、 30°Cで 24時間振と う培養し、 培養物を得た。
(LB培地）
1.0% ト リ ブトン
0.5% 酵母エキス
1.0% 塩化カ リ ウム
この培養物を 6， 000r. p.m.で 10分間遠心分離することによ リ集菌して 菌 体 を 得 た 。 こ の 菌 体 よ り Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Intersciense, 1989)記載の方法に従い、 染色体 D N A 1.5mgを得た。
(2)プローブの合成
キサントモナス sp. No.81-13由来の精製コレステロール . エステラー ゼ 150Aig をプロティンシークェンサ一（Applied Biosystems 473A)に供 し、 N末端アミノ酸配列を決定した。 さらに、 1.5mgのコレステロール - エステラーゼを 37°C、 20時間リジルエンドべプチダ一ゼで消化して、 逆 相 HPLC(Spectra Physics Model No. SP8800-010)でペプチ ド断片を分取 し、 473A Peptide Sequencer (アプライ ドバイオシステム社製） に供し、 内部ァミ ノ酸配列を決定した。 この配列をもとに縮重の少ない領域を選 び、 配列番号 3に記載したプローブを DNA 合成機（Appl ied Biosystems 392)で合成した。
(3)サザンハイプリダイゼ一ション
(2)で合成したプローブを D N A 5'ェンドラベリ ングキッ ト （ベ一リン ガー社製） を使用して DIG標識した。 サザンハイブリダィゼ一シヨンの 膜は、 染色体 D NAをで SauIIIAIで部分消化したものを 1.2%ァガ口一 スゲル電気泳動で分離し、 これを Hybond-N+ (アマシャム社製） に常法 を用いて転写して作製した。
サザンノヽイブリ ダィゼ一シヨ ンは、 DIG - Luminescent Detection kit (ベ一リ ンガー社製） を用いて行った。 その結果、 部分分解した染色体 D NAの約 2.0kbp付近にバンドが検出された。
(4)コロニーハイブリダイゼーション及び組み換え体 D N Aの取得
染色体 D NAの SauIIIAI 部分消化物を泳動したァガロースゲルより
2kbp 付近の D N A断片を回収し、 pHSG298(宝酒造社製）の BamHI サイ ト に組み込んだものを 5,000 株作製し、 コロニ一を Hybond-N+に転写し、 コロニ一ハイブリダィゼ一シヨ ンを上記サザンハイブリ ダィゼーシヨン と同様の方法で行ったところ、 1株が陽性形質転換体であった。 このよ うにして得られた陽性形質転換体、 大腸菌 （E.coli) DH5a (pX310P) (プ ラスミ ド pX310P を用いて大腸菌 （E.coli) DH5a (東洋紡社製） を常法 によリ形質転換して得られた株である。） より、 常法に従い、 プラスミ ド を調製し、約 1.9kbpの D N A断片を含む組み換え体 D N A (pX310P)を得 た。
(5)制限酵素開裂地図の作製
このようにして得られた組み換え体 DNA(pX310P)を NotI、 Pvul I、 Pstl 及び Sail で切断して図 1 に表される制限酵素開裂地図を作製した。
(6)塩基配列の決定
次いで、 370D NA Sequencing System (アプライ ドバイオシステム社 製） を用いて塩基配列の決定を行った。 塩基配列から予想されるァミ ノ 酸配列は、先にプローブとして用いた N末端アミノ酸配列を含んでいた。 得られた染色体断片の塩基配列には前記の N末端ァミ ノ酸配列をコード するフレームと同一のフレーム上に終止コ ドンが確認され、 また、 先に 決定した内部アミノ酸配列とも一致しており、 完全にコレステロール · エステラーゼ遺伝子が含まれていることが確認された。 尚、 ここで確認 されたコレステロール · エステラ一ゼ遺伝子は、 全長 1， 581bp、 526アミ ノ酸をコードしていた。 （配列番号 1及び 2 )
(7)相同性の確認
Genome Net WWWサ一ノ 一の BLAST検索（Sequence similarly search) を用いて、 D N A配列の相同性を検索したところ、 本発明に係る D N A 配列と相同性のある配列は確認できなかった。
一方、 ァミノ酸配列の相同性を検索した結果、 部分的に低い相同性（27 〜37%) があるものが確認されたが、 全体で相同性のあるアミノ酸配列は 確認されなかった。 すなわち、 本発明の DN A配列及びアミ ノ酸配列は、 新規でユニークなものであった。
(8)活性の確認
上記で確認された塩基配列情報をもとに、 Ndel 部位及び Spel 部位を 付加した配列番号 4及び 5記載のプライマ一を作製した。 P C R 法にて、 前記で作製したプライマ一を用いて構造遺伝子のみを増幅し、 pUTE500K' (特開平 8-205861号公報記載） の Ndel 部位及び Spel 部位に T4Ligase (宝酒造社製） を用いて連結した。 このプラスミ ドを pCHE-XE と命名し た。 得られたプラスミ ド pCHE- XE を用い大腸菌 DH5a (東洋紡社製）を常 法にょリ形質転換し、 形質転換体、 大腸菌 DH5a (pCHE-XE)を得た。 なお、 大腸菌 DH5a (pCHE- XE)は、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号の通 商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に 1999年 12月 13日付けで FERM BP- 6968 として寄託されている。
先に得られた大腸菌（E. col i)DH5a (pX310P)及び大腸菌（E. col i)DH5a (pCHE-XE)を 50A6g/mlのカナマイシンを含む LB培地（1%トリブトン、 0.5% 酵母エキス、 1.0%塩化ナトリ ウム、 pH7.0) 10ml にて 30°C、 16時間振と う培養した後、 培養液を超音波処理にて破砕、 遠心分離後、 その上清に ついて前述した酵素活性測定法によリ コレステロール . エステラーゼ活 性を測定したところ、 それぞれ 1.0及び 3.2 U/mlであった。 原株のキサ ントモナス sp. No.8卜 13 の生産性が、 0.2 U/ml であるのと比較して、 5 及び 16倍と生産性が飛躍的に向上した。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 キサントモナス sp. No.81-13 由来のユニークなコレ ステロール · エステラーゼ遺伝子が得ることができ、 該遺伝子を含む D N A断片をべクターに組み込んだ組み換え体 D N Aによリ形質転換され た新規微生物は、 コレステロール . エステラーゼの生産能が顕著に優れ ており、 コレステロール · エステラーゼを効率よく生産することができ る。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参 考と して本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の（ a )または（b )のタ ンパク質を コードする コ レステロ一 ル · エステラーゼ遺伝子。
( a )配列番号 1 に示されるアミ ノ酸配列からなるタンパク質
( b )アミ ノ酸配列（ a )において、 1 も し く は複数のアミ ノ酸が欠失、 置 換も し く は付加されたアミ ノ酸配列からなり、 かつコ レステロール ■ ェ ステラ一ゼ活性を有するタンパク質
2. 配列番号 1記載のァミ ノ酸配列を コードするコ レステロール · ェ ステラ一ゼ遺伝子をも とにシャツフリ ング等の変異を導入して得られる コ レステロール · エステラーゼ遺伝子。
3. キサン トモナス sp. No.81- 13 に由来し、 下記の制限酵素開裂地図 で規定されるコ レステロール · エステラーゼ遺伝子。
Sal I Sal I
Sau3A I Pvull Not I (Hinc II) Pst I (Hindi) Sau3A I
コレステロール 'エステラーゼ遺伝子 +
0.14 0.19 0.24 0.33 0.39 0.32 0.11' 0.14
(kbp)
4. 請求項 1 ~ 3のいずれか 1項に記載のコ レステロール · エステラ —ゼ遺伝子をべクタ一 D N Αに挿入したこ とを特徴とする組み換え体 D N A。
5. 請求項 4記載の組み換え体 D N Aを含む形質転換体または形質導 入体。
6. 請求項 5記載の形質転換体または形質導入体を培地に培養し、 培 養物からコ レステロール . エステラーゼを採取することを特徴とするコ レステロール · エステラーゼの製造法。
PCT/JP2000/007968 1999-12-14 2000-11-10 Genes de cholesterol-esterase, adn recombine et procede de production de cholesterol-esterase WO2001044451A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP35379599A JP2001161375A (ja) 1999-12-14 1999-12-14 コレステロール・エステラーゼ遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びコレステロール・エステラーゼの製造法
JP11/353795 1999-12-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001044451A1 true WO2001044451A1 (fr) 2001-06-21

Family

ID=18433280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2000/007968 WO2001044451A1 (fr) 1999-12-14 2000-11-10 Genes de cholesterol-esterase, adn recombine et procede de production de cholesterol-esterase

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2001161375A (ja)
WO (1) WO2001044451A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109022393A (zh) * 2018-08-08 2018-12-18 福建师范大学 热稳定胆固醇酯酶突变体ope-d136p及其制备方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5993229B2 (ja) * 2012-06-29 2016-09-14 オリエンタル酵母工業株式会社 コレステロールエステラーゼを可溶化発現させる方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991018987A1 (de) * 1990-06-06 1991-12-12 Boehringer Mannheim Gmbh Cholesterinesterasen mit variabler substrat-spezifität
JPH1156355A (ja) * 1997-08-21 1999-03-02 Kikkoman Corp コレステロール・エステラーゼの製造方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991018987A1 (de) * 1990-06-06 1991-12-12 Boehringer Mannheim Gmbh Cholesterinesterasen mit variabler substrat-spezifität
JPH1156355A (ja) * 1997-08-21 1999-03-02 Kikkoman Corp コレステロール・エステラーゼの製造方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109022393A (zh) * 2018-08-08 2018-12-18 福建师范大学 热稳定胆固醇酯酶突变体ope-d136p及其制备方法
CN109022393B (zh) * 2018-08-08 2022-01-04 福建师范大学 热稳定胆固醇酯酶突变体ope-d136p及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2001161375A (ja) 2001-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5126256A (en) Process for the preparation of glucose dehydrogenase from bacillus megaterium
US5229286A (en) Cloning and overexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase from leuconostoc dextranicus
JP3887600B2 (ja) Ｄ−ミオ−イノシトール１−エピメラーゼをコードするｄｎａ
US5250415A (en) Process for the preparation of glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium
WO2001044451A1 (fr) Genes de cholesterol-esterase, adn recombine et procede de production de cholesterol-esterase
JPH08196281A (ja) 水生成型ｎａｄｈオキシダーゼをコードするｄｎａ
JP2003533166A (ja) オイゲノールおよびフェルラ酸の異化作用の特異的不活性化遺伝子による置換フェノール生産のための生産株の構築
JP3850557B2 (ja) 新規遺伝子及びその遺伝子を保有する形質転換細胞
JP4405324B2 (ja) 改変型ザルコシンオキシダーゼ、改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法
JP4880859B2 (ja) 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
JP2003289868A (ja) 酢酸耐性遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
WO2005123921A1 (ja) 新規グリセロール脱水素酵素、その遺伝子、及びその利用法
WO2007099994A1 (ja) 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、ベクター、形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法
JP4312608B2 (ja) 酢酸菌のスクアレン−ホペンサイクラーゼ遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JPH11318438A (ja) 組換え微生物３―ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナ―ゼ、その製造方法およびその使用
JP4679785B2 (ja) 新規な（ｒ）−２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸（ｄ−フェニル乳酸）脱水素酵素およびそれをコードする遺伝子
JPH10248574A (ja) 新規な乳酸酸化酵素
JP4161236B2 (ja) 新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼおよびその製造方法
JP3330670B2 (ja) アルケンモノオキシゲナーゼ、これをコードする遺伝子及び形質転換微生物並びにアルケンのエポキシ化方法
KR100629773B1 (ko) 대장균에서 발현가능한 ｇｕａＡ 유전자를 포함하는 벡터,이를 포함하는 에스케리키아 속 미생물, 및 상기 미생물을이용하여 ５＇－구아닐산 합성효소를 배지 중에축적시키는 방법
JP3829950B2 (ja) 新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ
JPH099973A (ja) ロードコッカス属細菌由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子およびアミダーゼ遺伝子
JP3113947B2 (ja) 胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び胆汁酸硫酸サルファターゼの製造法
US7618800B2 (en) Glycerol kinase, which has high resistance against preservative
JPH10262674A (ja) アルカリホスファターゼをコードする遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
122 Ep: pct application non-entry in european phase
DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)