WO2001038392A1 - Nouveau facteur de transcription et son adn - Google Patents

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WO2001038392A1
WO2001038392A1 PCT/JP2000/008257 JP0008257W WO0138392A1 WO 2001038392 A1 WO2001038392 A1 WO 2001038392A1 JP 0008257 W JP0008257 W JP 0008257W WO 0138392 A1 WO0138392 A1 WO 0138392A1
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polypeptide
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salt
seq
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PCT/JP2000/008257
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Koji Yoshimura
Yuichi Hikichi
Kenichi Noguchi
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Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel transcription factor, its DNA, a recombinant vector, a transformant, a production method, an antibody, or a use thereof.
  • gene transcription is regulated by the interaction between chromosomal sequences (cis-elements) such as promoters and the transcription factors that bind to them.
  • Promote consists of a core (basic) sequence composed of the TATA box and transcription start site, and a gene-specific expression control region.
  • the transcriptional regulator bound to the expression control region activates RNA polymerase II I holoenzyme (a complex of shakuhachi polymerase 11 I and a basic transcription factor group) that binds to the core sequence, and promotes gene transcription.
  • the basic transcription factor that binds to the core sequence is involved in the transcription of many genes and has no gene specificity.
  • transcriptional regulators that bind to the expression control region are activated when cells proliferate or differentiate or respond to external stimuli such as hormones and cytokins, and promote transcription of selected genes. For this reason, transcription factors are sometimes called gene-specific transcription factors. In humans, there are expected to be about 3,000 gene-specific transcription factors, which are expected to be drug targets as well as cell surface receptors (Mol. Med. Today, 358, 1998).
  • ChM-I Human chondromodulin-I promotes chondrocyte DNA synthesis by Hiraki et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 175: 371, 1991). Purified and cloned from fetal epiphyseal cartilage as a factor. Purified ChM-I weakly promoted chondrocyte DNA synthesis, and its activity was enhanced in the presence of bFGF. It was also shown that it promotes proteodalican synthesis. ChM-I is synthesized from the cDNA sequence as a precursor consisting of 335 amino acids, and the mature form consists of 121 C-terminal amino acids. It became clear.
  • ChM-I This mature form of ChM-I was obtained from J. Neame et al. (J. Biol. Chem. 265: 9628-9633, 1990). Purified from nasal septum cartilage. 18 Kd whose physiological function was unknown. Glycoproteins. Northern blot analysis showed that ChM-I expression was cartilage-specific. Thereafter, ChM_I promoted chondrocyte colony formation (Biochem. Biophys. Res. Co., un. 241: 395, 1997), and inhibited vascular endothelial cell proliferation (J. Biol. Chem.
  • ChM-I is expressed in the growth plate cartilage in the avascular proliferative cartilage layer, etc., and promotes cartilage proliferation and matrix production, and prevents the invasion of blood vessels, thereby controlling the replacement of cartilage with bone. (J. Biol. Chem. 272: 32419, 1997). As described above, ChM-I is a regulator of cartilage differentiation and growth having angiogenesis inhibitory action.
  • chondrocytes in the growth plate cartilage continue to differentiate from stationary cartilage to proliferating, hypertrophic, and calcified cartilage, and osteoblasts are supplied by blood vessel invasion, replacing bone.
  • cartilage cells emerge after an inflammatory response, and the fracture is repaired through a similar pathway. Therefore, it is clear that chondrocyte differentiation and proliferation are important in the healing process of bone disease and cartilage disease.
  • Suzuki et al. Clarified the sequence of the human ChM-I gene, and since human ChM-I protein has cartilage growth activity and vascular endothelial cell growth inhibition, fractured human ChM-I protein, various cartilage diseases, cancer, etc.
  • An application to a therapeutic agent for tumors is described (JP-A-7-138295). However, the regulation of ChM-I gene expression has not been clarified.
  • Transcriptional regulators have the effect of regulating their activity, expression and stability, and various diseases based on their activity, expression and stability, such as joint diseases such as osteoarthritis and rheumatoid arthritis, and fractures. Enables the development of new drugs that are useful for the prevention and treatment of bone diseases and cancer. Therefore, in this field, it has been desired to find a new transcription regulatory factor and to develop a method for mass production.
  • ChM_I A novel transcriptional regulator that binds to the promoter of a gene has been found.
  • the present inventors have further studied based on these findings, and have completed the present invention.
  • polypeptide or a salt thereof according to the above (1) which comprises the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
  • polypeptide according to (1) or a polypeptide thereof comprising the polypeptide according to (1) or a salt thereof, the DNA according to (5) or the transformant according to (7).
  • the medicament according to (14) which is an agent for treating or preventing rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, fracture, cancer, intervertebral disc herniation, sciatica or ectopic cartilage formation.
  • a cell having the ability to produce the polypeptide or its salt according to (1) above is cultured in the presence of a test compound, and a DNA encoding the polypeptide according to (1) or its complementary DNA or a portion thereof is obtained.
  • a screening method for the salt
  • a medicament comprising a compound capable of promoting or inhibiting the expression of DNA encoding the polypeptide according to (1) or a salt thereof, which can be obtained by using the screening method according to (16);
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the human C ′ hM — I promoter.
  • the upper row shows the sequence obtained in Example 1, and the lower row shows the sequence described in JP-A-7-138295.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of the plasmid pTB275.
  • FIG. 3 shows the DNA sequence and amino acid sequence of the human transcription factor gene.
  • FIG. 4 shows the DNA sequence and the amino acid sequence of the mouse transcription factor gene.
  • Figure 5 shows a comparison of the amino acid sequences of human and mouse transcription factors.
  • polypeptide of the present invention containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (hereinafter sometimes referred to as human polypeptide), the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 Peptides (hereinafter sometimes referred to as mouse-type polypeptides) and polypeptides having substantially the same amino acid sequence as human-type polypeptides (hereinafter, human-type polypeptides, mouse-type polypeptides and human-type polypeptides) Polypeptides containing substantially the same amino acid sequence as the polypeptide may be collectively referred to as the polypeptide of the present invention.
  • Human warm-blooded animals eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, and egrets
  • Cells eg, hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, glandular i3 cells, bone marrow cells, Sangium cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, Neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, or stromal cells, or precursors of these cells Cells, stem cells, cancer cells, etc.) or any tissue in which these cells are present, such as the brain, parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdal
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 includes about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 Is an amino acid sequence having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, and the like.
  • polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or the substantially identical amino acid sequence include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or the substantially identical amino acid And polypeptides containing the sequence.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 includes about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 50% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and the like.
  • polypeptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 include, for example, an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 described above.
  • polypeptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 examples include, for example, amino acids substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 5 Having the sequence, represented by SEQ ID NO: 5
  • Polypeptides and the like having substantially the same properties as polypeptides having an amino acid sequence are preferred, and specific examples include a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19.
  • substantially the same properties include, for example, acting as a transcription regulatory factor. Substantially the same means that those properties are qualitatively the same. Therefore, properties such as binding to the ChM_I gene promoter and transcription regulation are equivalent (eg, about 0.1 to 100 times, preferably about 0.5 to 10 times, more preferably 0 to 10 times). (5 to 2 times), but the degree of these properties and the quantitative factors such as the molecular weight of the polypeptide may be different.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited, but is as follows: (1) each of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7 Positions other than the amino acid sequence common to the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (2) Positions other than the amino acid sequence common to the amino acid sequences represented by the respective SEQ ID NOs: 4 and 5 No.
  • the polypeptide has an N-terminal (amino terminal) at the left end and a C-terminal (capillary terminal) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • polypeptides of the present invention including the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, usually have a C-terminus of a carboxyl group (one COOH) or a carboxylate (_COO—).
  • the terminus may be amide (_C ⁇ NH 2 ) or ester (one COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le, C i _ 6 alkyl groups such as isopropyl or n _-butyl, cyclo pentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group cyclohexyl, etc.
  • cyclohexylene for example, phenyl, shed - 1 2 Ariru group, e.g., benzyl, phenylene Lou such phenethyl ( ⁇ _ 2 alkyl or ⁇ - flying one-naphthyl naphthylmethyl etc. - - C Bok 2 alkyl radical C 6 of naphthyl in addition to C 7 _ E 4 Ararukiru group such, Viva Roy Ruo carboxymethyl group that will be universal, is used as an oral ester.
  • polypeptide of the present invention has a lipoxyl group (or lipoxylate) other than at the C-terminus
  • a polypeptide in which the lipoxyl group is amidated or esterified is also included in the polypeptide of the present invention.
  • ester for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the amino group of the amino acid residue at the ⁇ -terminal is protected by a protecting group (eg, an acyl group of alkanol such as formyl group or acetyl group).
  • a protecting group eg, an acyl group of alkanol such as formyl group or acetyl group.
  • Protected, N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamine-oxidized, Substituent on the side chain of amino acid in the molecule eg, 1H, —SH, amino group, Those in which an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.
  • a protecting group for example, a Ci- 6 acyl group such as a C i_ 6 alkanol group such as a formyl group and an acetyl group
  • a sugar also included are complex polypeptides such as so-called sugar polypeptides with chains attached.
  • polypeptide of the present invention or a salt thereof, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or an organic acid) or a base (eg, an alkali metal salt) is used. Acceptable acid addition salts are preferred.
  • a physiologically acceptable acid eg, an inorganic acid or an organic acid
  • a base eg, an alkali metal salt
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (For example, salts with acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids for example, salts with acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid
  • the polypeptide of the present invention or a salt thereof can be produced from a cell or tissue of a human warm-blooded animal by the above-mentioned method for purifying a polypeptide (protein) known per se, or encodes a polypeptide described below. It can also be produced by culturing a transformant containing DNA. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Purification and isolation can be achieved by combining the chromatography.
  • a commercially available resin for polypeptide (protein) synthesis can be usually used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'dimethoxyphenyl F moc amino Ethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid appropriately protected with a amino group and a side chain functional group is condensed on the resin in accordance with the sequence of the objective polypeptide according to various known condensation methods.
  • the polypeptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target polypeptide or an amide thereof. .
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, H ⁇ B t, HOOB t), or may be pre-formed as a symmetrical anhydride or HOB t ester or H ⁇ OB t ester. It can be added to the resin after activation of the protected amino acid.
  • a racemization inhibitor additive eg, H ⁇ B t, HOOB t
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin may be appropriately selected from solvents known to be usable for the polypeptide (protein) condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or an appropriate mixture thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a polypeptide (protein) bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 to 50.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C1_Z, Br—Z, and adaman. Tiloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl such as an alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl).
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl.
  • Esterification Esterification
  • aralkyl esterification for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester
  • Benzyl ester, benzhydryl esterification phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for the esterification for example, a group derived from carbonic acid such as a lower (dialkanol group, an aroyl group such as a benzoyl group) such as an acetyl group, a benzyloxycarponyl group, and an ethoxycarponyl group can be used.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz 1, C 1 2
  • protecting group for histidine imidazole for example, Tos, 4-methoxy2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • activated raw oxypoxyl groups include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5_trichloromouth phenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with H ⁇ Bt).
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5_trichloromouth phenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with H ⁇ Bt.
  • a method for removing (eliminating) the protecting group for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid,
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is replaced with 1,2-ethanedithiol, 'In addition to deprotection by acid treatment in the presence of 4-butanedithiol, etc., it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia, etc.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the elimination of the protective group and its protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • a peptide (polypeptide) chain is added to the amino group side with a desired chain length
  • a polypeptide was obtained by removing only the protecting group of the ⁇ -amino group at the ⁇ -terminal of the peptide chain
  • a polypeptide was obtained by removing only the protecting group of the C-terminal carbonyl group.
  • the polypeptide is condensed in a mixed solvent as described above. The details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude polypeptide is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain a desired polypeptide amide.
  • an ester of the polypeptide for example, after condensing a strong alcohol group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, in the same manner as the amide of the polypeptide, An ester form can be obtained.
  • the polypeptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the desired peptide is produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the partial peptide of the present invention with the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5. (M. Bodanszky and MA OndettK Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
  • the polypeptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the polypeptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the polypeptide is obtained by a salt, it is a known method or Can be converted into a free form or another salt by a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention may be any DNA as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the polypeptide of the present invention. Further, it may be any of genomic DNA, cDNA derived from the above-mentioned cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Further, Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter, abbreviated as RT-PCR method) is directly performed using a preparation of tota1 RNA or mRNA fraction from the above-described cell'tissue. ).
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • Examples of the DNA encoding the polypeptide of the present invention include, for example, DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 18 or the base sequence of SEQ ID NO: 18 under high stringency conditions.
  • DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the like is used.
  • Examples of a DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 under high stringency conditions include, for example, about 60% or more, and preferably about 70%, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18. As described above, more preferably, DNA or the like containing a nucleotide sequence having a homology of about 80% or more is used.
  • the polypeptide of the present invention eg, transcriptional regulatory activity, DNA that encodes a polypeptide having the same properties as the polypeptide of the present invention (eg, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 or Such as DNA containing the base sequence represented by No. 20).
  • Hybridization can be performed by a method known per se or a method analogous thereto, for example, by Molecular Cloning .2nd (J. Sambrook et a., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). It can be carried out according to the method described. When a commercially available library is used, the procedure can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • High stringent conditions refer to, for example, a condition in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. .
  • Examples of the DNA encoding the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 include DNA having the 1st to 1212th base sequences in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the like.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence represented by 5 is represented by SEQ ID NO: 18.
  • the DNA having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 encodes the polypeptide of the present invention, and the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 includes 364 to 1887 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • Examples of the DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 include DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20, and the like. Used.
  • the DNA incorporated in an appropriate vector is selected by hybridization with a DNA fragment encoding a partial or entire region of the polypeptide of the present invention or labeled with a synthetic DNA.
  • Hybridization can be performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted using PCR or a known kit, for example, Mutan TM —Super Exress Km (Takara Shuzo), Mutan TM —K (Takara Shuzo), or the like. ODA-LA PCR method, Gapped edlex method, Kunke 1 method and the like, or a method similar thereto.
  • the DNA encoding the cloned polypeptide can be used as it is depending on the purpose, or it can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the polypeptide of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the polypeptide of the present invention, and (mouth) converting the DNA fragment into a promoter in an appropriate expression vector. By connecting downstream of Can be manufactured.
  • the vector examples include a plasmid derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), a plasmid derived from yeast ( For example, pSH19, pSH15), pacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pA11_1, ⁇ 1, pRC / CMV , pRcZRSV, pcDNAIeo and the like are used.
  • E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast e.g, pSH19, pSH15
  • pacteriophages such as
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SR promoter when animal cells are used as the host, SR promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter, ⁇ -actin and the like can be mentioned.
  • CMV cytomegalovirus
  • SRa promoter cytomegalovirus
  • the host is Eshierihia genus bacterium, trp promoter, lac promoter, re cA pro seventy-one evening one, lambda P L promoter Isseki one, l pp promoter, T 7 promoter etc.
  • the promoter is preferably SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc.
  • yeast PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • an expression vector containing, if desired, an enhancer, a splicing signal, a poly (A) addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori) and the like may be used.
  • the selection marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp 1 ) , neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o F, Geneticin resistance) Hitoshigakyo up.
  • dh fr dihydrofolate reductase
  • Amp 1 ampicillin resistance gene
  • Ne o F neomycin resistance gene
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the polypeptide of the present invention.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a Pti oA signal sequence, an OmpA * signal sequence, and the like
  • the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus
  • the ⁇ -amylase signal sequence when the host is an yeast, MFa signal sequence, SUC2 signal sequence, etc.
  • the host is an animal cell, insulin signal sequence, ⁇ _interferin signal sequence, antibody molecule, signal An array or the like can be used respectively.
  • a transformant can be produced using the thus constructed vector containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
  • Escherichia include, for example, Escherichia coli.
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95] Vol. 87 (1 984)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, ⁇ 87-11A, DKD—5D, 20 ⁇ —12, Schizosaccharomyces pombe NCYC 1913, NCYC 2036, (Pichia pastoris) KM 71 or the like is used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, High derived from egg of Trichoplusia ni Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like. Used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), and dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter CHO (dh fr—) cell).
  • CHO cell Chinese hamster cell CHO
  • dh fr— Chinese hamster cell CHO
  • mouse L cells mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • Transformation of Bacillus spp. can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Molecular & General Genetics, vol. 168, 111 (1979).
  • a liquid medium is suitable as a medium for culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, casein, yeast extract, meat extract, Inorganic or organic substances such as soybean meal and potato extract, and inorganic substances include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acids As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids (Miller, Journal of Ex-limen-in-Molecular-Genetics (Journal of Experiments) in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, an agent such as 3] 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 "C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the ⁇ of the medium is adjusted to about 5-8. Culture is usually about
  • the ⁇ of the culture medium is adjusted to about 6.2 to 6.4. Cultivation is usually performed at about 27 for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring are applied.
  • polypeptide of the present invention can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
  • polypeptide of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and After disrupting cells or cells by freezing and thawing, etc., a method of obtaining a crude extract of the polypeptide by centrifugation or filtration is suitable.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • Purification of the polypeptide contained in the culture supernatant or extract thus obtained can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a method utilizing the difference in hydrophobicity such as isoelectric point electrophoresis and a method utilizing the difference in isoelectric point are used.
  • the polypeptide thus obtained when obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the polypeptide is obtained as a salt, a method known per se or The compound can be converted into a free form or another salt by an analogous method.
  • the polypeptide produced by the recombinant may be appropriately modified or partially removed by the action of a protein modifying enzyme or a protease.
  • a protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the thus produced polypeptide of the present invention or a salt thereof can be measured by, for example, Enzymimnoatse ⁇ Western blot analysis using a specific antibody.
  • the antibody against the polypeptide of the present invention or a salt thereof may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the polypeptide of the present invention or a salt thereof.
  • Antibodies against the polypeptide of the present invention or a salt thereof can be produced by using the polypeptide of the present invention as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known per se. Can be.
  • the polypeptide of the present invention or a salt thereof is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or a diluent at a site capable of producing an antibody upon administration.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • warm-blooded animals to be used include monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, with mice and rats being preferred.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer from a mouse, and collect the spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization and include them in them.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled polypeptide described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS_1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) is used at a concentration of about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding the mixture and incubating at about 20 to 40, preferably about 30 to 37 for about 1 to 10 minutes.
  • polypeptide antigens are adsorbed directly or together with a carrier.
  • the hybridoma culture supernatant is added to the solid phase (eg, microplate), and then an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme (anti-mouse immunization if the cells used for cell fusion are mice) Globulin antibody is used) or protein A is added, and the monoclonal antibody bound to the solid phase is detected.
  • the hybridoma culture supernatant is added to the solid phase to which anti-immune globulin antibody or protein A is adsorbed.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in an animal cell culture medium supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing about 1 to 20%, preferably about 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing about 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually about 20 to 40, preferably about 37.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE) Absorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method in which only antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain the antibody. You can do it.
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE) Absorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method in which only antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain the antibody. You
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the immunizing antigen polypeptide antigen itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and the above monoclonal A method of immunizing a warm-blooded animal in the same manner as in the method for producing an antibody, collecting the antibody-containing substance of the polypeptide of the present invention or a salt thereof from the immunized animal, and separating and purifying the antibody.
  • the immunizing antigen polypeptide antigen
  • a complex thereof with a carrier protein is formed, and the above monoclonal
  • a method of immunizing a warm-blooded animal in the same manner as in the method for producing an antibody, collecting the antibody-containing substance of the polypeptide of the present invention or a salt thereof from the immunized animal, and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier to hapten are determined by the efficiency of antibodies against hapten immunized by cross-linking with carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio.For example, ⁇ serum albumin ⁇ ⁇ cysiloglopurine, hemocyanin, etc., in a weight ratio of about 0 to hapten 1 per hapten 1. A method of coupling at a rate of 1 to 20 and preferably about 1 to 5 is used.
  • Various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde ⁇ carposimide a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the antisense DNA having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to DNA encoding the polypeptide of the present invention includes the DNA of the present invention. Any antisense DNA may be used as long as it has a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to NA and has an action capable of suppressing the expression of the DNA.
  • the base sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, the entire base sequence of the base sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). Or about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the partial base sequence.
  • about 70% of the total nucleotide sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention is complementary to the complementary sequence of the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal site of the polypeptide of the present invention (for example, the nucleotide sequence near the start codon).
  • Antisense DNA having a homology of at least about 80%, more preferably at least about 90%, most preferably at least about 95% is preferred. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • the polypeptide of the present invention or a salt thereof hereinafter sometimes abbreviated as the polypeptide of the present invention
  • a DNA encoding the polypeptide of the present invention hereinafter sometimes abbreviated as the DNA of the present invention
  • a transformant transformed with a recombinant vector containing a DNA encoding the polypeptide of the present invention hereinafter sometimes abbreviated as the transformant of the present invention
  • the polypeptide of the present invention or a salt thereof Antibodies (hereinafter sometimes abbreviated as the antibodies of the present invention), and uses of antisense DNA.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention has abnormalities. If present or missing, various diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, fractures, and cancer are likely to develop.
  • the polypeptide of the present invention and the DNA of the present invention can be used, for example, as a medicament such as an agent for treating or preventing various diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, bone fracture, and cancer. .
  • the polypeptide of the present invention when there is a patient in which the polypeptide of the present invention is reduced or deficient in a living body, (a) administering the DNA of the present invention to the patient and expressing the polypeptide of the present invention in the living body (Mouth) inserting the DNA of the present invention into cells, expressing the polypeptide of the present invention, and then transplanting the cells into a patient; or (8) administering the polypeptide of the present invention to the patient.
  • the role of the polypeptide of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, the DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus-associated virus vector, and the like. According to the means, it can be administered to humans or warm-blooded animals.
  • the DNA of the present invention can be administered as such or with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered with a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • polypeptide of the present invention When used as the above therapeutic or prophylactic agent, it is purified to at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 98%, and even more preferably at least 99%. It is preferred to use
  • the polypeptide of the present invention can be used, for example, as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, if necessary, orally, or water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions or suspensions.
  • the polypeptide of the present invention is mixed with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, etc. in a unit dosage form required for a generally accepted formulation. By doing so, it can be manufactured.
  • the amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, and the like.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose are used.
  • the unit dosage form is a capsule
  • the above-mentioned dinner material may further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • Sterile compositions for injection should be formulated according to standard pharmaceutical manufacturing methods, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil or coconut oil. Can be.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D_mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents for example, alcohol (eg, ethanol, etc.), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 TM , HCO-50, etc.) Is also good.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • buffers for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents for example, benzalkonium chloride, proprochlorinate, etc.
  • stabilizers for example, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants antioxidants and the like.
  • the prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule.
  • the vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bushes, dogs, dogs, Cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • warm-blooded animals for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bushes, dogs, dogs, Cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dose of the polypeptide of the present invention may vary depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.For example, when the polypeptide of the present invention is orally administered for the purpose of treating rheumatoid arthritis, it is generally used. In adults (as 6 O kg), about 0.1 mg to 10 O mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the polypeptide is administered per day. When administered parenterally, a single dose of the polypeptide may vary depending on the administration subject, target disease, and the like.For example, for the purpose of treating rheumatoid arthritis, the polypeptide of the present invention may be in the form of an injection.
  • the activity of the polypeptide of the present invention eg, the binding activity to the ChM-I gene promoter, — A compound or its salt that promotes the transcriptional activity of the I gene, the activity of promoting the expression of the type II collagen gene, etc.
  • the activity of the polypeptide of the present invention can be used as medicine.
  • the compound or its salt that inhibits the activity of the polypeptide of the present invention can be used as a medicament such as a therapeutic or prophylactic agent for disc herniation, sciatica, ectopic cartilage formation and the like.
  • the polypeptide of the present invention can be used as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention.
  • the DNA of the present invention or a transformant transformed with the DNA has an ability to produce the polypeptide of the present invention, a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention. Can be used as a reagent for screening.
  • the present invention provides a method for screening for a compound that inhibits MAP (hereinafter sometimes abbreviated as an inhibitor). More specifically, for example, (2) (i) the cis- comparison between the case where the DNA containing the element is contacted and the case where (ii) the DNA of the present invention is brought into contact with the DNA containing the cis-element of the ChM-I gene promoter and the test compound. And a method of screening for an accelerator or an inhibitor.
  • the polypeptide of the present invention is transferred to the ChM-I gene promoter. Are compared with each other.
  • the DNA containing the cis-element of the ChM-I gene promoter those labeled with, for example, a radioisotope or a dye are preferably used.
  • a radioisotope for example, 32 P, 3 H or the like is used.
  • the dye for example, fluorescein, FAM (manufactured by PE Biosystems), JOE (PE), PE
  • the DNA containing the cis-element of the ChM-I gene promoter is, for example, six or more (preferably 6 to 6) consecutive nucleotides identical or substantially identical to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17
  • a single-stranded or double-stranded DNA having a sequence composed of 20 (more preferably, 8 to 20, more preferably 10 to 20) bases. can be prepared.
  • base sequence substantially the same as the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 for example, about 1 to 3 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 are substituted with other bases Base sequence. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 (JP-A-7-138295) and the like can be mentioned.
  • the amount of the polypeptide of the present invention bound to the cis-element-containing DNA of the ChM-I gene promoter is determined by the amount of the cis-element-containing promoter of the ChM-I gene bound to the polypeptide of the present invention.
  • A can be quantified, for example, by measuring the activity of the labeled body as an indicator, and a method known per se, for example, the-gel shift assay method (New Genetic Engineering Handbook, 3rd revised edition, edited by Masami Muramatsu et al., Sheep (Published by Tsuchiya, p. 150, 1999).
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, and animal tissue extracts, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • the present invention also relates to a method for screening for an accelerator or an inhibitor, which comprises using the DNA of the present invention or the transformant of the present invention.
  • the present invention relates to the DNA of the present invention and a cis-element of the ChM-I gene promoter.
  • Yeasts e.g., Sacc aromyces cerevisiae transformed with a DNA linked to a reporter gene downstream of E. coli are cultured in the presence and absence of a test compound, and the expression of the reporter gene is detected and compared.
  • Reporter genes include, for example, Fudenkos that complement nutritional requirements such as HIS3, TRP1, and URA3; drug resistance genes such as aureobasidin A resistance gene; for example, 1acZ (0-galactosidase gene) ) And the like.
  • a yeast having an auxotrophy for histidine was transformed with the DNA of the present invention and a DNA in which the HIS3 gene was linked as a reporter gene downstream of the cis-element of the ChM-I gene promoter.
  • the activity of the polypeptide of the present invention is promoted by culturing the transformant in a medium lacking histidine in the presence of the test compound and measuring the viability (promotion or inhibition of growth) of the transformant.
  • Compounds or salts thereof that promote or inhibit can be screened.
  • a test compound that promotes the growth of the transformant can be selected as a compound that promotes the activity of the polypeptide of the present invention, and a test compound that inhibits the growth of the transformant is the activity of the polypeptide of the present invention.
  • a transformant obtained by transforming a yeast with the DNA of the present invention and a DNA in which an aureobasidin A resistance gene was linked as a repo overnight gene downstream of the cis-element of the ChM_I gene promoter was tested.
  • a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention by culturing in a medium containing the compound and o-leobasidin A and measuring the viability (promotion or inhibition of growth) of the transformant Can be screened.
  • a test compound that promotes the growth of the transformant can be selected as a compound that promotes the activity of the polypeptide of the present invention, and a test compound that inhibits the growth of the transformant can be selected as the activity of the polypeptide of the present invention.
  • the transformant is cultured in the presence of a test compound and, for example, a reagent serving as a substrate for a / 3-galactosidase such as 5_bromo_4_cloth—3—indolyl / 3 / 3-galactovyranoside (X—gal).
  • a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention can be screened. If the transformant cultured in the presence of the test compound stains darker blue than when cultured in the absence of the test compound, the test compound is selected as a compound that promotes the activity of the polypeptide of the present invention.
  • a test compound can be selected as a compound that inhibits the activity of the polypeptide of the present invention when it is stained lighter blue or no stain at all.
  • a test compound that increases the amount of a reporter gene product can be used as a test compound to increase the activity of the polypeptide of the present invention.
  • a test compound that reduces the amount of a reporter gene product can be selected as a compound that inhibits the activity of the polypeptide of the present invention.
  • the cis-element of the ChM_I gene promoter used in the above-mentioned screening method includes, for example, a nucleotide sequence identical or substantially identical to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, A DNA containing a base sequence composed of 6 or more consecutive (preferably 6 to 20, preferably 10 to 20, more preferably 10 to 20) bases is exemplified.
  • Examples of the base sequence substantially identical to the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 include, for example, about 1 to 3 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 17
  • Substituted nucleotide sequences are exemplified. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 7-138295) and the like can be mentioned.
  • the number of bases between the ChM-I gene promoter and the translation initiation codon of the repo overnight gene linked downstream thereof is not particularly limited, but is usually 0 to 100 bases, preferably 10 to 100 bases. It is 50 bases, more preferably 10 to 30 bases.
  • the culture of the transformant can be performed in the same manner as the culture of the transformant described above.
  • the screening kit of the present invention contains the polypeptide of the present invention, the DNA of the present invention, or the transformant of the present invention.
  • the po It contains a repeptide, the DNA of the present invention or the transformant of the present invention and a DNA containing the cis-element of the promoter of the ChM-I gene.
  • a transformant transformed with a DNA containing the DNA of the present invention and a cis-element of a ChM-I gene promoter may be used.
  • a cell encoding the polypeptide of the present invention which is characterized by culturing cells having the ability to produce the polypeptide of the present invention in the presence of a test compound, and measuring the amount of mRNA encoding the polypeptide of the present invention.
  • Examples of the cell capable of producing the polypeptide of the present invention include the above-mentioned transformant of the present invention and known warm-blooded animal cells capable of producing ChM-I.
  • Known warm-blooded animal cells having the ability to produce ChM-I include, for example, animal cells that produce ChM-I with an expression inducer such as insulin, and more specifically, mouse ATDC5 cells and the like. Is raised.
  • the culturing of cells having the ability to produce the polypeptide of the present invention is performed in the same manner as the culturing of the above-described transformant of the present invention.
  • the animal cell can be cultured in the presence or absence of the expression inducer.
  • the amount of mRNA encoding the polypeptide of the present invention is measured by contacting RNA extracted from cells with the DNA of the present invention or its complementary DNA in accordance with a method known per se, and then contacting the DNA of the present invention or its complement. This is done by measuring the amount of mRNA bound to DNA.
  • the complementary DNA of the DNA of the present invention or its partial DNA with, for example, a radioisotope, a dye, or the like.
  • the present invention The amount of mRNA encoding the polypeptide of the present invention bound to the complementary DNA of the above DNA can be easily measured.
  • the radioisotope and dye those similar to those used for labeling the DNA containing the cis-element of the ChM-I gene promoter described above are used.
  • the amount of mRNA encoding the polypeptide of the present invention is determined by converting RNA extracted from cells into cDNA by reverse transcriptase and then priming the DNA of the present invention or its complementary DNA or a partial DNA thereof. The measurement can be performed by measuring the amount of cDNA to be amplified depending on the PC scale used as the sample.
  • the complementary DNA to the DNA of the present invention used for measuring the amount of mRNA encoding the polypeptide of the present invention includes a DNA (lower strand) having a sequence complementary to the DNA of the present invention (upper strand). .
  • the partial DNA of the DNA of the present invention is composed of, for example, about 10 to 2200, preferably about 10 to 300, and more preferably about 10 to 30 bases in the base sequence of the DNA of the present invention.
  • Examples of the partial DNA of the DNA complementary to the DNA of the present invention include a DNA having a sequence complementary to the partial DNA of the DNA of the present invention.
  • Particularly preferred examples of primers used for PCR include, for example, DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 and DNA having the nucleotide sequence ′ represented by SEQ ID NO: 9.
  • a test compound that increases the amount of mRNA encoding the polypeptide of the present invention can be selected as a compound that promotes the expression of the DNA of the present invention, and the mRNA of the mRNA encoding the polypeptide of the present invention can be selected.
  • a test compound that reduces the amount can be selected as a compound that inhibits the expression of the DNA of the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include the test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, and plants.
  • a compound selected from extracts, animal tissue extracts, plasma, etc., and the activity of the polypeptide of the present invention eg, binding activity to ChM-I gene promoter, transcription activity of ChM-I gene, type II collagen gene Or a compound that promotes or inhibits the expression of the DNA of the present invention.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the polypeptide of the present invention can be used. Used.
  • the activity of the polypeptide of the present invention eg, the activity of binding to the ChM_I gene promoter, the transcription activity of the ChM-I gene, the activity of promoting the expression of the type II collagen gene, etc.
  • the compound that promotes the expression of the DNA of the present invention is for example, it can be used as a drug for treating or preventing diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, bone fracture, and cancer. .
  • compounds that inhibit the activity of the polypeptide of the present invention or the expression of DNA of the present invention are useful as medicaments such as therapeutic and prophylactic agents for diseases such as herniated disc, sciatica, and ectopic cartilage formation. is there.
  • a compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out according to conventional means.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing the polypeptide of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, such as, for example, human or warm-blooded animals (eg, mouse, rat, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.
  • the activity of the polypeptide of the present invention or the activity of the polypeptide of the present invention for the purpose of treating rheumatoid arthritis is intended.
  • a compound that promotes the expression of DNA When a compound that promotes the expression of DNA is administered orally, generally, in an adult (with a body weight of 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 0.1 to 100 mg of the compound per day is administered. Or about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose of the compound may vary depending on the administration subject, target disease, etc., for example, the activity of the polypeptide of the present invention or the DN of the present invention for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • a compound that promotes the expression of A is administered to an adult (as 6 O kg) in the form of an injection, usually about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg of the compound per day, More preferably, about 0.1 to 1 Omg is conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a compound that inhibits the activity of the polypeptide of the present invention or the expression of the DNA of the present invention is orally administered for the treatment of intervertebral disc herniation, generally, in an adult (assuming a body weight of 60 kg), the daily dose is The compound is administered in about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-5 Omg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • the single dose of the compound may vary depending on the administration subject, target disease, etc., for example, the activity of the polypeptide of the present invention or the DN of the present invention for the treatment of herniated disc herniation.
  • a compound that inhibits the expression of A is usually administered to an adult (as 6 O kg) in the form of an injection, about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg of the compound per day is administered. More preferably, about 0.1 to 1 Omg is administered by intravenous injection. For other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • polypeptide of the present invention specifically binds to a cis-element having the same or substantially the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, and thus is represented by SEQ ID NO: 17.
  • SEQ ID NO: 17 Promotes transcription of a gene having a cis-element having the same or substantially the same base sequence as the base sequence. Therefore, the polypeptide of the present invention, the DNA of the present invention or the transformant of the present invention has, in addition to the ChM_I gene, the same or substantially the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17. It can also be used for screening for a compound that promotes or inhibits the transcription of another gene having a cis-element.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the polypeptide of the present invention, it may be used for quantification of the polypeptide of the present invention in a test solution, particularly for quantification by a sandwich immunoassay. Can be.
  • a method for quantifying the polypeptide of the present invention in a test wave which comprises:
  • one antibody may be an antibody that recognizes the N-terminal of the polypeptide of the present invention, and the other antibody may be an antibody that reacts with the C-terminal of the polypeptide of the present invention. desirable.
  • a monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention may be used to measure the polypeptide of the present invention, and may be detected by tissue staining or the like. You can also.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the polypeptide of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution.
  • Any method can be used as long as it is a method for detecting the amount of the enzyme by chemical or physical means and calculating the amount from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of the antigen.
  • nephelometry, a competition method, an immunometric method, and a sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope for example, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the above enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • 3-galactosidase, 3-dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • Carriers include agarose, dextran, and cellulose Examples include insoluble polysaccharides, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass.
  • a test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at a later time.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is an antibody having a different site to which the polypeptide of the present invention binds. Is preferably used.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the polypeptide of the present invention, the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, such as the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • the competition method after the antigen in the test wave and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated ( BZF separation), measure the amount of B, F labeling, and determine the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • B / F separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody or a solid phase immobilized as the first antibody.
  • a solid-phase method using a soluble antibody as the first antibody and using a solid-phased antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test wave and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of the labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody. After binding the antibody to the solid phase, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • nephelometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test wave is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the measurement system for the polypeptide of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, etc.
  • the polypeptide of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the polypeptide of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the polypeptide of the present invention preparation of an antibody column used for purifying the polypeptide of the present invention, detection of the polypeptide of the present invention in each fraction at the time of purification, and behavior of the polypeptide of the present invention in the test cells. It can be used for analysis and the like.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, horses, cats, dogs) by using them as probes. , Monkeys, chimpanzees, etc.) can be detected for abnormalities (genetic abnormalities) in the DNA or mRNA encoding the polypeptide of the present invention, such as, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA. It is useful as a diagnostic agent for a gene such as an increase or excessive expression of the DNA or mRNA.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (11989)). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1 989) Year))).
  • a decrease in expression is detected by Northern hybridization, it is possible to diagnose that the disease is likely to be a disease such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, bone fracture, and cancer. .
  • DNA mutation is detected by PCR-SSCP method, for example, disc herniation, sciatica or ectopic cartilage formation, or rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, fracture or cancer May be a disease such as It can be diagnosed that the efficiency is high.
  • the antisense DNA capable of binding complementarily to the DNA of the present invention and suppressing the expression of the DNA can suppress the function of the polypeptide of the present invention or the DNA of the present invention in vivo, For example, it can be used as an agent for treating and preventing intervertebral disc herniation, sciatic nerve pain, and ectopic cartilage formation.
  • the above-mentioned antisense DNA is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out in the same manner as the aforementioned therapeutic / prophylactic agent for various diseases containing DNA of the present invention.
  • the antisense DNA when using the antisense DNA, may be used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by a conventional method. it can.
  • the antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hide mouth gel catheter.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of its expression.
  • the antibody of the present invention which has the activity of neutralizing the activity of the polypeptide of the present invention, is used as a medicament such as an agent for treating or preventing various diseases such as disc herniation, sciatica, and ectopic cartilage formation. be able to.
  • the therapeutic or prophylactic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, rabbit, egret, sheep, bush, pig, etc.). , Cats, dogs, monkeys, etc.) can be administered orally or parenterally.
  • the dosage varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route, and the like.For example, when used for the treatment or prevention of an intervertebral hernia in an adult, the antibody of the present invention is usually administered as a single dose.
  • OmgZkg body weight preferably 0.1-; L OmgZkg body weight, more It is convenient to administer preferably about 0.1 to 5 mg Z kg body weight by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased accordingly.
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the above administration contains the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules and the like). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the field of formulation.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories and the like are used.
  • Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections and the like. Is included.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, and suitable solubilizing agents, for example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HC ⁇ -50 (polyoxythylene (5 Omol) adduc t of hydrogenated cas tor oil)), etc. Is also good.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • a suppository for rectal administration is prepared by mixing the above antibody or a salt thereof with a usual suppository base.
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is compatible with the dosage of the active ingredient. It is convenient to prepare such dosage unit forms. Examples of the dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories and the like, and usually 5 to 500 mg, especially 5 to 100 mg for each dosage unit. However, other dosage forms preferably contain 10 to 250 mg of the above antibody.
  • compositions may contain other active ingredients as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the present invention relates to a DNA encoding the exogenous polypeptide of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (when abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method, and the ribofection method It can be produced by transferring the desired DNA by a method such as a coagulation method, a coagulation method, a microinjection method, a particle gun method, or a DEAE-dextran method.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA transgenic animal of the present invention can also be produced by fusing the cells with the above-mentioned germ cells by a cell fusion method known per se.
  • Non-human mammals include, for example, reeds, pigs, sheep, goats, reefs, Nu, cat, guinea pig, hams, mouse, rat, etc. are used.
  • the system is preferably a BGCS Fi system, a BDFi system, a BSDS Fi system, a BALBZc system, an ICR system, etc.) or a rat (eg, Wistar, SD, etc.).
  • Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans and the like in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal, not the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal.
  • DNA having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc. DNA that has been used is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal polypeptide of the present invention.
  • a DNA that expresses a protein that suppresses the function of a normal polypeptide of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal of the same or different species as the animal of interest.
  • DNs derived from various mammals eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • having the DNA of the present invention having a high homology to the human DNA are transferred.
  • the present invention is achieved by microinjecting a DNA construct (eg, vector 1) to which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing A into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • a DNA construct eg, vector 1
  • various promoters capable of expressing A into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • expression vectors for the polypeptide of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as ⁇ phage, retroviruses such as Moroni monoleukemia virus, and vaccinia virus. Animal viruses such as Rus or Baculovirus are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate the expression of DNA include: (1) promoters of DNA derived from viruses (eg, Simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.) , 2 Promoters derived from various mammals (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.), for example, albumin, insulin II, ⁇ roplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle Creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor) 3, keratin Kl, K10 and ⁇ 14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase) 3 I sub Unit, dystrophin Tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endo
  • cytomegalovirus promoters capable of high expression throughout the whole body, human polypeptide chain elongation factor 1 (EF-1 ⁇ ) promoter, human and chicken 3 actin promoters and the like are preferable.
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of the target messenger RII in a DNA-transferred mammal (generally referred to as Yuichi Minei Yuichi). For example, it is derived from viruses and various mammals. And preferably, the SV40 virus of Simian virus One or the like is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of the eukaryotic DNA, etc. are placed 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or Connection to the 3 'downstream of the translation area is also possible depending on the purpose.
  • the normal translation region of the polypeptide of the present invention may be a liver, a kidney, a thyroid cell, a fibroblast derived from a human or various mammals (eg, a heron, a dog, a cat, a guinea pig, a hamster, a rat, a mouse, etc.).
  • the foreign abnormal DNA can be used to produce a translation region obtained by mutating the normal polypeptide translation region obtained from the above-described cells or tissues by the point mutagenesis method.
  • the translation region can be produced as a DNA construct that can be expressed in a transposed animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the aforementioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the animal after the transfer of the DNA indicates that the progeny of the animal from which the exogenous DNA of the present invention is present in all its germinal cells and somatic cells. Means to keep.
  • the progeny of such an animal that inherits the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. be able to.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer indicates that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells. It means having an excess of DNA.
  • Progeny of animals of this species that have inherited the exogenous DNA of the present invention will have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and eventually promotes the function of the endogenous normal DNA by promoting the function of the endogenous normal DNA. It may cause hypertension and can be used as a model animal for the disease.
  • the normal DNA transgenic animal of the present invention is used to elucidate the pathological mechanism of hyperactivity of the polypeptide of the present invention and the disease associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. It is possible.
  • the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released polypeptide of the present invention, it can also be used for screening tests for therapeutic drugs for diseases related to the protein of the present invention. It is. '
  • a non-human mammal having the foreign abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the foreign DNA is stably retained by mating. it can. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a source substance.
  • the DNA construct with Promo Yoichi can be created by ordinary genetic engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention expresses the abnormal DNA of the present invention at a high level, and eventually inhibits the function of the endogenous normal DNA to thereby finally produce the polypeptide of the present invention. In some cases, it becomes functionally inactive refractory, and it can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the polypeptide of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention is useful for inhibiting the function of a normal protein by the abnormal protein of the present invention (dominant negative effect) in the inactive refractory disease of the polypeptide of the present invention. ).
  • the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released polypeptide of the present invention
  • screening for a therapeutic drug for a functionally inactive type refractory disease of the polypeptide of the present invention can also be used for testing.
  • the present invention can be used to determine the specificity of the polypeptide-producing cell of the present invention, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or its signal transduction mechanism, and its abnormalities. It is an effective research material for elucidation. Furthermore, in order to use the DNA transgenic animal of the present invention to develop a therapeutic agent for a disease associated with the polypeptide of the present invention, including a refractory inactive type of the polypeptide of the present invention, the above-mentioned test method It is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic agent for the disease by using the method and the quantitative method. In addition, using the DNA transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a method for treating a DNA associated with the polypeptide of the present invention. (8) Knockout animal
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the DNA is inactivated by introducing a repo overnight gene (eg, a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the repo overnight gene controls a promoter for the DNA of the present invention.
  • a repo overnight gene eg, a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention, which is characterized by detecting the presence of the promoter.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated refers to a DNA that is non-human mammal and has the DNA of the present invention artificially mutated to suppress the DNA expression ability, Alternatively, by substantially losing the activity of the polypeptide of the present invention encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express the polypeptide of the present invention (hereinafter, the present invention This may be referred to as knockout DNA of non-human mammal embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
  • ES cells non-human mammal embryonic stem cells
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique.
  • the sockout DNA of the present invention may be produced by, for example, shifting the reading frame of a codon or disrupting the function of a promoter or exon by these mutations.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, a lacZ (/ 3-galactosidase enzyme), a cat ( A DNA sequence that disrupts exon function by inserting a reporter gene or the like represented by chloramphenicylacetyltransferase gene) or terminates gene transcription in the intron between exons (eg, polyly A signal, etc.) to prevent synthesis of the complete messenger RNA
  • a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene is introduced into the chromosome of the animal by, for example,
  • the original ES cells for inactivating the DNA of the present invention by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used. It may be newly established according to the method of ufma.
  • mouse ES cells currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, an alternative pure immunological and genetically
  • C57BLZ6 mice or BDFi mice in which the number of eggs collected by C57BLZ6 has been reduced by crossing with DBAZ2 (using C57BLZ6 and DBAZ2) BDFi mice have the advantage of high number of eggs collected and robust eggs, and also have the C57BL / 6 mouse as a background.
  • the obtained ES cells can be advantageously used when a pathological model mouse is created, because the genetic background can be replaced by C57.BLZ6 mice by backcrossing with C57BLZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. Embryos can be obtained.
  • Either male or female ES cells may be used, but male ES cells are generally more convenient for producing breeding line chimeras. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • a method for determining the sex of ES cells a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR is mentioned.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, than suffices ES cell number of about 1 colony (about 50),
  • the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by discriminating between males and females, and the early stages of culture can be greatly reduced by enabling early selection of male cells.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative properties, but must be carefully subcultured because they tend to lose their ontogenetic potential.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen
  • LIF 1-1 000 OU / ml
  • 5% CO 2, 90% air at about 37.
  • trypsin ZEDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin 0.1-5 mM EDTA, preferably Can be converted into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / ImM EDTA
  • Such subculture is usually carried out every 113 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscles, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • MJ Evans and MH Kaufman Nature 292, 154, 1981; GR Martin proceedings of National Academy of Sciences 'Science'. Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of emblemology and experimental morphology, 87, 27, 1985
  • the DNA-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention are useful in the cell biological examination of the protein of the present invention in the mouth of an in vivo.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • non-human mammal those similar to the aforementioned can be used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention may be prepared, for example, by introducing the targeting vector prepared as described above into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells.
  • the DNA of the present invention can be knocked out.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out are subjected to Southern hybridization analysis using a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, or to a DNA sequence on a evening-targeting vector, and And the DNA sequence of a neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used for the targeting vector can be determined by PCR-based analysis using a primer.
  • the DNA-inactivated cell line of the present invention is cloned by gene homologous recombination, and the cells are used at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of non-human cells.
  • the chimeric embryo is injected into a mammalian embryo or a blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudo-pregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both a normal cell having the DNA locus of the present invention and an artificially mutated cell having the DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially obtained from the population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the DNA locus of the present invention with mutation added thereto, for example, by judging coat color or the like.
  • the individual thus obtained is usually an individual having a heterozygous expression of the polypeptide of the present invention, which is crossed with an individual having a heterozygous expression of the polypeptide of the present invention. Can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a chromosome into which a getter vector has been introduced can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of an egg by a microinjection method. Compared to these transgenic non-human mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
  • the individual in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used to confirm that the DNA of the individual animal obtained by the crossing is also knocked out.
  • the breeding passage can be performed in a normal breeding environment.
  • the acquisition and maintenance of the germ line may be performed according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygote animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygotes are obtained. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the polypeptide of the present invention, it may be caused by inactivation of the biological activity of the polypeptide of the present invention. It can be used as a model for such diseases, and is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is used for treating diseases (eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, bone fractures, cancer, etc.) caused by the DNA deficiency or damage of the present invention.
  • diseases eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, bone fractures, cancer, etc.
  • ⁇ Can be used for screening for compounds having a prophylactic effect.
  • the present invention comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and observing and measuring changes in the animal.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / preventive effect on a disease caused by the disease.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include the same as described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound. Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and changes in organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are used as indices. The test compound can be tested for its therapeutic and prophylactic effects.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection, or the like is used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is subjected to glucose tolerance treatment.
  • the test compound is administered before or after the treatment, and the blood glucose level and weight change of the animal are measured over time.
  • the blood glucose level of the test animal decreases by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, bone fracture or cancer.
  • the compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound selected from the test compounds described above, and is a disease caused by deficiency or damage of the polypeptide of the present invention (eg, rheumatoid arthritis, It has therapeutic and prophylactic effects against osteoarthritis, osteoporosis, fractures, cancer, etc., and can be used as a drug for safe and low-toxic therapeutic and prophylactic agents for such diseases. Further, compounds derived from the compounds obtained by the above-mentioned screening can be used in the same manner.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals). And the like, and particularly preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids, etc.
  • bases eg, alkali metals
  • physiologically acceptable acid addition salts examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic, tartaric, citric, malic, oxalic, benzoic, methanesulfonic, benzenesulfonic, etc.) And the like.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the drug containing the polypeptide of the present invention described above.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, higgs, bushus, dogs, dogs, cats, dogs, Monkeys).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like. For example, when the compound is orally administered for the purpose of treating rheumatoid arthritis, generally the adult (body weight) is used.
  • the compound is administered from about 0.1 to: L0 Omg per day, preferably from about 1.0 to 50 mg, more preferably from about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the subject of administration, the target disease, and the like.
  • the compound is usually administered in the form of an injection to adults (6) for the purpose of treating rheumatoid arthritis.
  • As O kg about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day by intravenous injection. It is more convenient to administer. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the present invention relates to a compound which promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention and detecting the expression of a reporter gene. Or, provide a method for screening the salt.
  • the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention may be the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactive by introducing a reporter gene.
  • a gene which can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • reporter gene the same one as described above is used. Preferred is the casease gene (1acZ), soluble alkaline phosphatase gene or luciferase gene.
  • the reporter gene is under the control of a promoter for the DNA of the present invention, the substance encoded by the reporter gene By tracing the expression of the promoter, the activity of the promoter can be detected.
  • the tissue of the present invention that originally expresses the polypeptide of the present invention may -Galactosidase is expressed in place of this polypeptide. Therefore, staining with a reagent such as) 3-galactosidase, such as, for example, 5-bromo-4-monocloth-3- ⁇ -n-drill-1 / 3-galactopyranoside ( ⁇ -gal) Thereby, the expression state of the polypeptide of the present invention in an animal body can be easily observed.
  • the polypeptide-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with daltaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the / 3-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue sample with ImM EDTAZPBS solution, and the coloration may be observed.
  • mRNA encoding 1acZ may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity of DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids). And the like, and particularly preferably a physiologically acceptable acid addition salt.
  • 'Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, maleic acid Acids, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fuma
  • the compound or its salt of the present invention that promotes the promoter activity for DNA can promote the expression of the polypeptide of the present invention and promote the function of the polypeptide.
  • rheumatoid arthritis For example, rheumatoid arthritis, osteoarthritis It is useful as a safe and low toxic therapeutic and prophylactic agent for diseases such as osteoporosis, bone fracture and cancer.
  • the compound or its salt of the present invention that inhibits the promoter activity against DNA can inhibit the expression of the polypeptide of the present invention and inhibit the function of the polypeptide. It is useful as a safe and low toxic therapeutic and prophylactic agent for diseases such as neuralgia and ectopic cartilage formation.
  • a compound derived from the compound obtained by the above screening can also be used.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the polypeptide of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in humans or mammals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, higgs, bushes, horses, cats, cats, Dogs, monkeys, etc.).
  • the dosage of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.For example, for the purpose of treating rheumatoid arthritis, a compound that promotes the promoter activity of the DNA of the present invention for oral administration is administered. If you do, generally adult
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • a compound that promotes the promoter activity of DNA of the present invention for the purpose of treating rheumatoid arthritis may be used.
  • the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 2 Omg. It is convenient to administer about 1 to 1 Omg by intravenous injection.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a compound of the present invention which inhibits the promoter overnight activity against DNA for the purpose of treating a herniated disc generally, in an adult (as a body weight of 60 kg), the compound is administered daily. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg is administered.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.For example, it inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention for the purpose of treating a herniated disc.
  • the compound to be administered When the compound to be administered is usually administered to an adult (60 kg) in the form of an injection, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. It is convenient to administer about 0.1 to about 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for DNA of the present invention
  • the present invention can greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused by DNA expression deficiency or the development of preventive and therapeutic drugs.
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal ( Creating a transgenic animal) would allow the protein to be specifically synthesized and its effects on the living body could be examined.
  • DNA Deoxylipo nucleic acid C DNA complementary deoxylipo nucleic acid
  • HONB 1-hydroxy-5-norporene-2,3-dicarboximide DCC N, N'-dicyclohexylcarposimide
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of the synthetic cis-element DNA (upper chain) of cis-element used in Example 1.
  • Example 1 shows the base sequence of cis-eleInent synthetic DNA (lower chain) used in Example 1.
  • 1 shows the nucleotide sequence of a human transcription factor gene.
  • 1 shows the amino acid sequence of a human transcription factor.
  • 1 shows the nucleotide sequence of a mouse transcription factor gene.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a mouse-derived transcriptional regulator.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of 90 amino acid residues on the C-terminal side of a mouse transcription factor.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 4.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 4.
  • Example 7 shows one base sequence used in Example 5.
  • Example 7 shows one base sequence used in Example 5.
  • Example 7 shows one base sequence used in Example 6.
  • [SEQ ID NO: 27] 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 6.
  • Escherichiacoli TOP 10 / pTB 2074 carrying the vector pTB 2074 obtained in Example 2 described below has been used since September 22, 1999 by Fermentation Research Institute (NIBH) 2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japan, deposited as FERM BP-6886 from July 21, 1999 under the deposit number FERM BP-6886. (IF ⁇ ) and deposited under IFO 16299.
  • Escherichiacoli JM109ZpTB2075 carrying the plasmid pTB2075 obtained in Example 1 described below has been used since September 22, 1999 in Tsukuba, Higashi, Ibaraki, Japan. No. FERM BP-6887 at the National Institute of Fermentation (IF ⁇ ), 2-17-17-85, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka, Japan from 21 July 1999 Deposit number IF # 16300 has been deposited respectively.
  • IF ⁇ National Institute of Fermentation
  • a DNA having the sequence (SEQ ID NO: 2) was synthesized and annealed. The resulting double-stranded DNA is inserted into the EcoRI-Xbal site of the plasmid pHISi attached to the Matchmaker one-hybrid system (Clontech) to create the yeast repo one-hybrid pHISi-56 of the yeast one-hybrid method. did. pHISi-56 was introduced into the yeast (Saccharomyces cerevisiae) YM4271 strain attached to the Matchmaker one hybrid system (Clontech) to transform His3 +.
  • PTB2075 (Fig. 2) was constructed by improving the reporter plasmid.
  • PTB2075 was obtained by (1) EcoRI-BamHI fragment of pHISi-56 (1.4 kb fragment containing GCTGGAAGGGGTGGGGACCG sequence and HIS3 gene repeated three times) on EcoRI-BamHI site of pBR322, and (2) blunting of PBR322.
  • the Sphl-PvuII site was obtained by inserting a smoothed Sphl-PvuII fragment (1.0 kb fragment containing the TRP1 gene) from PBD-GAL4 Cam (Stratagene) into the respective sites.
  • the plasmid PTB2075 was digested with XhoI and then introduced into the yeast strain YM4271 to obtain a ⁇ 1 + transformant (YM4271:: pTB2075).
  • YM4271 Human chondrocyte matchmaker cDNA 1 ibrary (Clontech) was introduced into: pTB2075, and yeasts exhibiting His + and Leu + phenotypes were selected. After the plasmid DNA was recovered from this yeast, the recovered plasmid DNA was again introduced into YM4271 :: pTB2075, whereby the phenotypes of His + and Leu + were confirmed in the four clones.
  • the nucleotide sequence of the plasmid DNA of each clone was determined. As a result, they were found to be derived from one gene, although the lengths of the inserts were different. Among these, the nucleotide sequence of the longest DNA was represented by SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the protein encoded by this DNA was represented by SEQ ID NO: 4 (FIG. 3). The DNA represented by SEQ ID NO: 3 lacked the gene portion encoding the N-terminal region It was a partial gene.
  • YM4271 :: pTB2075 was transformed with the plasmid (PHT56-H6) into which the shortest DNA (SEQ ID NO: 18) was inserted among the plasmid DNAs of the four clones obtained, showing the Leu + phenotype.
  • Ten transformants were arbitrarily selected. All of these strains exhibited a His3 + phenotype.
  • SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 Two kinds of primers (SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9) were designed based on SEQ ID NO: 4, and using these primers against Fetal Mouse Library Master DNAPlate (OriGene Technologies, Inc. Lot # 004). PCR was performed according to the protocol. As a result, it was found that the 4F gel contained a mouse homolog of the transcription regulatory factor gene obtained in Example 1. According to the protocol, a subplate (Fetal mouse library plate 4F Lot # 001) was obtained, and it was confirmed that a 7A-well of the subplate had a mouse transcription factor gene. As a result of determining the sequence of the DNA contained in the 7A well by the 5'-RACE method and the 3'-RACE method, it was found that the 7A well contained the full length of the mouse transcription factor gene.
  • SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 Two kinds of primers (SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9) were designed based on
  • SEQ ID NO: 10 Based on the obtained sequence information, two types of primers (SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11) were designed, PCR was performed on the 7 A well of the subplate, and the obtained amplified fragment was pCRII ( Invitrogen). Determine base sequence As a result, it was found that the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 encodes a protein consisting of 508 amino acid residues (SEQ ID NO: 7) (FIG. 4).
  • ChM-I chondromodulin-I
  • the plasmid having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 When PCR (2, 8 cycles) was performed using primers having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, strong mRNA expression was observed in liver and heart, and skeletal muscle, fetus on days 1 and 15 On the 17th day, the second strongest mRNA expression was observed.
  • mice fibroblast cell line C 3 HZ 10 T 1 Z 2 on cartilage differentiation induced by pTB 2074
  • Mouse fibroblast cell lines C3H / 10T1 / 2, Clone 8 (ATCC Accession No. CCL-226) were cultured in DMEM (GIBC0) containing 10% FBS. Approximately 150,000 cells per well are seeded on a 24-well plate, and the next day, PTB2074 or pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) obtained in Example 2 and Fugene6 (Beilinger) are mixed. Was added to perform transfection. On the second day after transfection, RNA was extracted using RNeasy mini kit (Qiagen) and subjected to DNase treatment using message clean kit (genhunter) to obtain an RNA sample.
  • RNeasy mini kit Qiagen
  • DNase treatment using message clean kit (genhunter)
  • RNA sample as type III, a primer (SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23) prepared based on the sequence of mouse Typell B collagen gene (Col2al) and RT-PCR kit (Takara Shuzo) were used. Performed CR. After agarose gel electrophoresis, target bands were compared using Gel image (Genomic solutions).
  • Transfection was carried out by adding a mixture of (Invitrogen) and Fugene6 (Boehringer). After obtaining an RNA sample according to the method described in Example 4, RT-PC was performed using a primer (SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25) designed based on the human Type II collagen gene (C0L2A1). R performed.
  • PCDNA3.1 (+) was introduced into normal human chondrocytes, no expression of C0L2A1 was observed, whereas when PTB2074 was introduced into normal human chondrocytes, expression of C0L2A1 was observed.
  • RNA sample was obtained according to the method described in Example 4, a primer (SEQ ID NO: 2) designed based on a dried typell collagen type gene (Biochimica et Biophysica Acta vol. 1350, PP253-258 (1997); Col2al) : 26 and SEQ ID NO: 27) were used for RT-PCR.
  • SEQ ID NO: 2 designed based on a dried typell collagen type gene (Biochimica et Biophysica Acta vol. 1350, PP253-258 (1997); Col2al) : 26 and SEQ ID NO: 27) were used for RT-PCR.
  • the polypeptide of the present invention specifically binds to the cis-element of the ChM-I gene promoter and has an activity to promote the transcription of the ChM-I gene. Therefore, the polypeptide of the present invention or the DNA of the present invention is useful as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, bone fracture and cancer.
  • polypeptide of the present invention can be used for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention.
  • the compound or its salt that promotes the activity of the polypeptide of the present invention or the expression of the DNA of the present invention can be used, for example, as an agent for preventing or treating diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, bone fracture, and cancer.
  • Useful as The compounds or salts thereof that inhibit the activity of the polypeptide of the present invention or the expression of DNA of the present invention are useful as agents for preventing or treating diseases such as intervertebral disc herniation, sciatica, and ectopic cartilage formation. .
  • the antibody of the present invention can be used for quantification of the polypeptide of the present invention, and can be used as a diagnostic agent for diseases related to the present invention.

Description

明 細 書 新規転写因子およびその D N A 技術分野
本発明は新規転写因子、 その DNA、 組換えベクター、 形質転換体、 製造法 もしくは抗体またはその用途に関する。 背景技術
真核細胞では遺伝子の転写はプロモー夕一ゃェンハンサ一などの染色体上 の配列 （シス—エレメント， cis-element) とそれに結合する転写因子の相互 作用により転写量が制御されている。 プロモー夕一は TATAボックスや転写 開始部位から構成されるコア （基本） 配列と遺伝子特異的な発現制御領域から なっている。 発現制御領域に結合した転写調節因子はコァ配列に結合する R N Aポリメラ一ゼ I Iホロ酵素 （尺 八ポリメラ一ゼ1 Iと基本転写因子群の複 合体） を活性化し、 遺伝子の転写を促進する。 コア配列に結合する基本転写因 子は多くの遺伝子の転写に関与し、 遺伝子特異性がない。
一方、 発現制御領域に結合する転写調節因子は、 細胞が増殖あるいは分化の 際やホルモン、 サイト力インなどの外界の刺激に応答し活性化され、 決められ た遺伝子の転写を促進する。 このため、 転写調節因子は遺伝子特異的転写因子 と呼ばれることがある。 ヒトでは遺伝子特異的転写因子は約 3， 000種類存 在すると予想されおり、 細胞表層の受容体と同様に薬剤ターゲットとして期待 されている (Mol. Med. Today, 358, 1998) 。
ヒトコンドロモジュリン— I (Chondromodulin- 1；以下、 ChM— Iと略記 する場合がある） は Hirakiら (Biochem. Biophys. Res. Commun. 175:371, 1991) により軟骨細胞の DNA合成を促進する因子としてゥシ胎仔骨端軟骨から精製、 クローニングされた。 精製された ChM— Iは軟骨細胞の DNA合成を弱く促 進し、 その活性は bFGF存在下で増強された。 またプロテオダリカン合成も 促進することが明らかにされた。 cDNA配列から ChM— Iは 335ァミノ 酸からなる前駆体として合成され、 成熟型は C末端の 121アミノ酸からなる ことが明らかになった。この成熟型 ChM— Iは、 Ρ· J. Neameら（J. Biol. Chem. 265:9628 - 9633， 1990) がゥシ鼻中隔軟骨から精製 ·部分アミノ酸配列を決定 した生理機能が不明な 18 Kdの糖タンパク質と同一であった。 また、 ノザン ブロット解析により、 ゥシ ChM— Iの発現は軟骨特異的であることが示され た。その後、 ChM_ Iは軟骨細胞のコロニー形成促進作用（Biochem. Biophys. Res. Co議 un. 241:395, 1997) 、 血管内皮細胞の増殖抑制作用 (J. Biol. Chem. 272:32419, 1997、 FEBS Letters 415:321, 1997) 、 骨芽細胞の増殖促進 -分 化抑制作用 （FEBS Letters 406:310, 1997) などが報告されている。 ChM— Iは成長板軟骨では、 無血管の増殖軟骨層などで発現しており、 軟骨の増殖と 基質産生を促進し、 血管の侵入を防ぐことにより、 軟骨から骨への置換を制御 していると考えられている （J. Biol. Chem. 272:32419, 1997) 。 このように、 ChM- Iは、血管新生阻害作用を有する軟骨の分化'増殖の制御因子である。 内軟骨性骨化では、 成長板軟骨における軟骨細胞は静止軟骨から増殖軟骨、 肥大軟骨、 石灰化軟骨と分化を続け、 血管が侵入することにより、 骨芽細胞が 供給され、 骨に置換する。 骨折の治癒過程においても、 炎症反応の後に軟骨細 胞が出現し、 同様の経路を経て骨折が修復される。 従って、 骨疾患や軟骨疾患 の治癒過程において、 軟骨細胞の分化 ·増殖が重要なことは明らかである。 鈴木らはヒト ChM-I遺伝子の配列を明らかにし、 ヒト ChM— Iタンパク質 が軟骨増殖作用および血管内皮細胞増殖抑制を有するため、 ヒト ChM— Iタ ンパク質を骨折、 各種軟骨疾患、 及びガンなど腫瘍の治療薬への応用を述べて いる （特開平 7- 138295号公報） 。 しかし、 ChM— I遺伝子の発現制御に関し ては明らかにされていない。
転写調節因子は、その活性 ·発現 ·安定性を調節する作用を有し、その活性， 発現，安定性に基づく種々の疾患、 例えば変形性関節症、 慢性関節リウマチな どの関節疾患、 骨折などの骨疾患、 及びガンなどの予防や治療に役立つ新たな 医薬品の開発を可能にする。 したがって、 本分野においては、 新たな転写調節 因子を見出し、 大量に生産する方法の開発が望まれていた。 発明の開示 '
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、 ChM_ I 遺伝子のプロモーターに結合する新規な転写調節因子を見出した。 本発明者ら は、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに 至った。
すなわち、 本発明は
(1) 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩、
( 2 )配列番号： 5で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列が、 配列番号： 19で表されるアミノ酸配列である上記 （1) 記載のポリペプチド またはその塩、
(3) 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する上記 （1) 記載のポリペプチドまたはその塩、
( 4 )配列番号： 4で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列が、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列である上記 （1) 記載のポリペプチドま たはその塩、
(5) 上記 （1) 記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含有する DNA を含有する DNA、
(6) 上記 （5) 記載の DN Aを含有する組換えベクター、
(7) 上記 （6) 記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体、
(8) 上記 （7) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載のポリペプチド を生成せしめることを特徴とする上記 （1) 記載のポリペプチドまたはその塩 の製造法、
(9) 上記 （1) 記載のポリペプチドまたはその塩に対する抗体、
(10) 上記 （9) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(1 1) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはその塩、 上記 （5) 記載の D N Aまたは上記（7)記載の形質転換体を用いることを特徴とする、 上記 （1) 記載のポリペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物または その塩のスクリーニング方法、
(12) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはその塩、 上記 （5) 記載の D N Aまたは上記 （7) 記載の形質転換体を含有してなる、 上記 （1) 記載のポ リぺプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩の スクリーニング用キッ卜、
(13) 上記 （1 1) 記載のスクリーニング方法または上記 （12) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 上記 （1) 記載のポリペプチドま たはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
(14) 上記 （1 1) 記載のスクリーニング方法または上記 （12) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 上記 （1) 記載のポリペプチドま たはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる
(15) 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折、 癌、 椎間板ヘル ニァ、 坐骨神経痛または異所性軟骨形成の治療 ·予防剤である上記 （14) 記 載の医薬、
(16) 上記 （1) 記載のポリペプチドまたはその塩を産生する能力を有する 細胞を試験化合物の存在下に培養し、 上記 （1) 記載のポリペプチドをコード する DNAもしくはその相補 DNAまたはその部分 DNAを用いて上記 （ 1 ) 記載のポリペプチドをコードする mR N Aの量を測定することを特徴とする、 上記 （1) 記載のポリペプチドをコードする DNAの発現を促進または阻害す る化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(17)上記（16)記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、上記（1) 記載のポリペプチドをコードする DN Aの発現を促進または阻害する化合物 またはその塩、
(18)上記（16)記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、上記（1) 記載のポリペプチドをコードする DN Aの発現を促進または阻害する化合物 またはその塩を含有してなる医薬、
(19) 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折、 癌、 椎間板ヘル 二了、 坐骨神経痛または異所性軟骨形成の治療 ·予防剤である上記 （18) 記 載の医薬などを提供する。
また、 本発明は、
(20) 上記 （1) 記載のポリペプチドまたはその塩を含有してなる剤、 (21) 上記 （1) 記載のポリペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、 な ども提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト C' h M _ Iプロモーターの塩基配列を示す。 上段は実施例 1で 得られた配列を、 下段は特開平 7— 1 3 8 2 9 5号公報に記載の配列をそれぞ れ示す。
図 2は、 プラスミド p T B 2 0 7 5の概略図を示す。
図 3は、 ヒト由来転写調節因子遺伝子の D N A配列とアミノ酸配列を示す。 図 4は、 マウス由来転写調節因子遺伝子の D N A配列とァミノ酸配列を示す。 図 5は、 ヒト由来転写調節因子とマウス由来転写調節因子のアミノ酸配列の 比較を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド （以 下、 ヒト型ポリペプチドと称することがある） 、 配列番号： 1 9で表されるァ ミノ酸配列を含有するポリペプチド （以下、 マウス型ポリペプチドと称するこ とがある） およびヒト型ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るポリペプチド （以下、 ヒト型ポリペプチド、 マウス型ポリペプチドおよびヒ ト型ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを 総称して本発明のポリペプチドと称することもある） は、 ヒトゃ温血動物 （例 えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サル等） の細胞 （例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 滕臓 i3細 胞、骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロ ファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩 基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破 骨細胞、 乳腺細胞、 もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞 もしくはガン細胞等）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大 脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状 腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 fl市、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 唾液腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 軟骨、 関節、 骨格筋等に由来するポリペプチドであってもよく、 組換えポリべ プチドであってもよく、 合成ポリペプチドであってもよい。
配列番号： 5で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列として は、配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、好ましくは約 6 0 % 以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好 ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列等が挙げられる。
配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として 具体的には、例えば、配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含有するポリペプチドとして具体的には、 例えば、 配列番号： 4で表される ァミノ酸配列もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリべプチド 等が挙げられる。
配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、好ましくは約 6 0 % 以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好 ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列等が挙げられる。
配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として 具体的には、 例えば、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有す るポリペプチドとしては、 例えば、 前記の配列番号： 4で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配 列を有するポリぺプチドと実質的に同質の性質を有するポリぺプチド等が好 ましく、 具体的には、 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を有するポリべ プチドなどが挙げられる。
また、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 を有するポリペプチドとしては、 例えば、 前記の配列番号： 5で表されるアミ ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 5で表されるアミ ノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリべプチド 等が好ましく、 具体的には、 配列番号： 1 9で表わされるアミノ酸配列を有す るポリペプチドなどが挙げられる。
実質的に同質の性質としては、 例えば、 転写調節因子として作用すること等 が挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が定性的に同質であることを 示す。 したがって、 C h M _ I遺伝子プロモーターへの結合や転写調節等の性 質が同等 （例、 約 0 . 1〜 1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜 1 0倍、 より好ま しくは 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの性質の程度、 ポリべ プチドの分子量等の量的要素は異なっていてもよい。
また、 配列番号： 4または配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドとしてより具体的には、 例えば、 ①配列番号： 4または配列番号： 5で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個 以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ま しくは数個 （1〜5個） ) のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 4または配列番号： 5で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましく は、 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1 〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 4または配列番 号： 5で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個 程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のァ ミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 ④配列番号 .： 4または配列番号： 5で表さ れるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 好ま しくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のアミノ酸が他 のァミノ酸で置換されたァミノ酸配列、 または⑤それらを組み合わせたァミノ 酸配列を含有するポリペプチド等のいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿 入、 欠失または置換の位置としては、 特に限定されないが、 ①配列番号： 4お よび配列番号： 7のそれぞれの配列番号で表されるアミノ酸配列に共通するァ ミノ酸配列以外の位置、 ②配列番号： 4および配列番号： 5のそれぞれの配列 番号で表されるアミノ酸配列に共通するアミノ酸配列以外の位置等が挙げら れる。 本明細書におけるポリペプチドは、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末 端 (アミノ末端) 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 5 で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをはじめとする、 本発明のポ リペプチドは、 C末端が通常カルボキシル基 （一 C O O H) またはカルボキシ レート（_ C O O— ) であるが、 C末端がアミド （_ C〇NH 2) またはエステ ル （一 C O O R) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピルもしくは n _ブチル等の C i _ 6アルキル基、 例えば、 シクロ ペンチル、 シクロへキシル等の C 3 _ 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひ—ナフチル等の C 6— 1 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチル等のフエ 二ルー（^ _ 2アルキル基もしくは α—ナフチルメチル等のひ一ナフチル— C卜 2アルキル基等の C 7 _ェ 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用され るビバロイルォキシメチル基等が用いられる。
本発明のポリペプチドが C末端以外に力ルポキシル基 （または力ルポキシレ ート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されて いるものも本発明のポリぺプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステル等が用いられる。
さらに、 本発明のポリペプチドには、 Ν末端のアミノ酸残基 （例、 メチォ二 ン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基等の ァ ルカノィル等の ァシル基等） で保護されているもの、 生体内で切断され て生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内の アミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば一〇H、 — S H、 アミノ基、 イミダゾール 基、 インドール基、 グァニジノ基等） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基等の C i _ 6アルカノィル基等の C i— 6ァシル基等） で保護されてい るもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ポリペプチド等の複合ポリべプチ ド等も含まれる。
本発明のポリペプチドまたはその塩としては、生理学的に許容される酸（例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） 等との塩が用いられ、 とりわ け生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 (例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒 石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンス ルホン酸） との塩等が用いられる。
本発明のポリペプチドまたはその塩は、 前述したヒトゃ温血動物の細胞また は組織から自体公知のポリペプチド （タンパク質） の精製方法によって製造す ることもできるし、 後述するポリペプチドをコードする D N Aを含有する形質 転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のぺプチ ド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸等で抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロ マトグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組 み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のポリペプチドまたはその塩、 またはそのアミド体の合成には、 通常 市販のポリペプチド （タンパク質） 合成用樹脂を用いることができる。 そのよ うな樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベン ズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4 _ベンジルォキシベンジルアル コール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒドロ キシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4 - ( 2 ' , 4 '—ジメトキシフエ二ル一ヒドロキシメチル）フエノキシ樹脂、 4一 ( 2 ' , 4 'ージメトキシフエ二ルー F m o cアミノエチル） フエノキシ 樹脂等を挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひ—ァミノ基と側鎖官 能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするポリペプチドの配列通りに、 自 体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からポ リぺプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分 子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目的のポリペプチドまたはそれらの アミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 ポリペプチド合成に使用できる各 種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カル ポジイミド類としては、 D C C、 N, N ' ―ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチルー N ' — （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミド等が用い られる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H〇B t， H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水 物または H O B tエステルあるいは H〇O B tエステルとしてあらかじめ保 護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ポリぺプ チド （タンパク質） 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選 択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセ トアミド， N—メチルピロリ ドン等の酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホル ム等のハロゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノール等のアルコール類、 ジ メチルスルホキシド等のスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒド ロフラン等のエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリル等の二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチル等のエステル類ある はこれらの適宜の混合物等が用 いられる。 反応温度はポリペプチド （タンパク質） 結合形成反応に使用され得 ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常約— 2 0〜5 0 の範囲か ら適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用 いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には 保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を 行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾ一ルを用いて未反応アミノ酸をァセチル化 することによって、 後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t 一ペンチルォキ シカルボニル、 イソポルニルォキシカルボニル、 4 _メトキシベンジルォキシ カルボニル、 C 1 _ Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフル ォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ二ル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 F m o c等が用いられる。
カルボキシル基は、例えば、 アルキルエステル化（例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 tーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへ プチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチル等の直鎖状、 分枝状もしくは環状 アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4—ニトロべンジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4一クロ口べ ンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルポニルヒドラジド化、 t—ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化等によって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基等の 低級 （じ アルカノィル基、 ベンゾィル基等のァロイル基、 ベンジルォキ シカルポニル基、 エトキシカルポニル基等の炭酸から誘導される基等が用いら れる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒ ドロビラニル基、 t—ブチル基等である。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz 1、 C 12
— B z l、 2—ニトロベンジル、 B r—Z、 t—ブチル等が用いられる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 To s、 4—メトキ シー 2， 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメ チル、 Bum、 Bo c、 T r t、 Fmo c等が用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、 ペンタクロロフエノール、 2, 4， 5 _トリクロ口フエノール、 2, 4—ジニトロフエノール、 シァノメ チルアルコール、 パラニトロフエノール、 H〇NB、 N—ヒドロキシスクシミ ド、 N—ヒドロキシフタルイミド、 H〇B t)とのエステル〕等が用いられる。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミド が用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素 等の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メ タンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいは これらの混合液等による酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチル ァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジン等による塩基処理、 また液体アンモニア中ナ トリウムによる還元等も用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約 — 20〜4 Ot:の温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一 ル、 フエノール、 チオア二ソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ジメチ ルスルフイ ド、 1, 4—ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオール等のよ うなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保 護基として用いられる 2， 4ージニトロフエニル基はチォフエノール処理によ り除去され、 トリプトファンのィンドール保護基として用いられるホルミル基 は上記の 1， 2—エタンジチオール、 1， ' 4—ブタンジチオール等の存在下の 酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニア等による アルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化等は公知の基または公知の手段か ら適宜選択しうる。
ポリペプチドのアミド'体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキ シ末端アミノ酸の α _カルボキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側 にペプチド （ポリペプチド） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の Ν末端の α—ァミノ基の保護基のみを除いたポリぺプチドと C末端の力ルポ キシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、 この両ポリべプチ ドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記 と同様である。 縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、 上記方法 によりすべての保護基を除去し、 所望の粗ポリぺプチドを得ることができる。 この粗ポリべプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結 乾燥することで所望のポリぺプチドのアミド体を得ることができる。
ポリペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸の ひ一力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした 後、 ポリペプチドのアミド体と同様にして、 所望のポリペプチドのエステル体 を得ることができる。
本発明のポリペプチドまたはその塩は、 自体公知のペプチドの合成法に従つ て製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の部分ペプチドを構成 し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護 基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造するこ とができ 。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤ に記載された方法が挙げられる。 ( M. Bodanszky および M.A. OndettK ペプチド ·シンセシス （Peptide Synthesis) , Interscience Publ ishers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、 ザ'ペプチド（The Pept ide)， Academic Press, New York (1965年)
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出，蒸留 ·カラムクロマトグ ラフィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶等を組み合わせて本発明のポリべ プチドポリぺプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られるポリぺ プチドが遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって 適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができ る。
本発明のポリペプチドをコードする DNAとしては、 前述した本発明のポリ ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであつ てもよい。 また、 ゲノム DNA、 前記した細胞'組織由来の c DNA、 合成 D NAのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コ スミド、 ファージミド等いずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織よ り t o t a 1 RNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 R e v e r s e T r an s c r i p t a s e Po l yme r a s e Ch a i n Re a c t i on (以下、 RT-P C R法と略称する） によって増幅すること もできる。
本発明のポリペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 1 8で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 18で表される塩 基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有 し、 本発明のポリペプチドと実質的に同質の性質 （例、 免疫原性等） を有する ポリペプチドをコードする DNA等を有し、 本発明のポリペプチドと実質的に 同質の性質を有するポリペプチドをコードする DN Aであれば何れのもので もよい。
配列番号： 18で表される塩基配列を含有する DNAとしては、 例えば、 配 列番号： 3で表される塩基配列を含有する DNA等が用いられる。
配列番号： 18で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 18で表される塩基配 列と約 60%以上、 好ま くは約 70%以上、 さらに好ましくは約 80%以上 の相同性を有する塩基配列を含有する DN A等が用いられる。
配列番号： 18で表される塩基配列を有する DNAとハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズできる DNAとして、 具体的には、 配列番号： 18 で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 18で表される塩基 配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を有し、 本発明のポリペプチドと実質的に同質の性質 （例、 転写調節活性、 ChM— I 遺伝子プロモーターへの結合性等） 有するポリペプチドをコードする D N A等 を有し、 本発明のポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチドを コードする DNA (例、 配列番号： 3、 配列番号： 6または配列番号： 20で 表わされる塩基配列を含有する DN A等） 等があげられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例 えは、、 モレキュラー ·クロ一ニンク (Molecular Cloning) .2nd (J. Sambrook et aし， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法等に従って行 なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説 明書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリ ンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜40 mM、 好ましくは約 19〜 20 mM、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは約 6 0〜65 °Cの条件を示す。
配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする D NAとしては、 配列番号： 3で表される塩基配列において第 1〜1212番目 の塩基配列を有する DNA等が、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を有す る本発明のポリペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 18で表さ れる塩基配列を有する DNA等が、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を有 する本発明のポリペプチドをコードする DN Aとしては、 配列番号： 6で表さ れる塩基配列において第 364〜1887番目の塩基配列を有する DNA等 が、 配列番号： 19で表されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドを コードする DNAとしては、 配列番号： 20で表される塩基配列を有する DN A等が用いられる。
本発明のポリペプチドを完全にコードする DN Aのクローニングの手段と しては、 本発明のポリペプチドをコードする D N Aの塩基配列の部分塩基配列 を有する合成 DNAプライマーを用いて PC R法によって増幅するか、 または 適当なベクターに組み込んだ D N Aを本発明のポリペプチドの一部あるいは 全領域をコードする DN A断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものと のハイブリダイゼーシヨンによつて選別することができる。 ハイブリダイゼー シヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー ·クローニング （Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載 の方法等に従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する 場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
DN Aの塩基配列の変換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 Mu t anTM — Sup e r Ex r e s s Km (宝酒造 （株） ） 、 M u t a n TM— K (宝 酒造 （株） ） 等を用いて、 ODA— LA PCR法、 Gapp e d du l e x法、 Kunk e 1法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従つ て行なうことができる。
クローン化されたポリペプチドをコードする DN Aは目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用する ことができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを 有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TA Gを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な 合成 DN Aアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のポリぺプ チドをコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DN A断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより 製造することができる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， pBR 3 25， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 1 0, pTP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19， p SH 15) 、 λファージ等のパクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアゥ ィルス，バキュロウィルス等の動物ウィルス等の他、 p A 1 _ 1 1、 ρΧΤ 1、 p R c/CMV, pRcZRSV、 p c D N A I e o等が用いられる。 本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモー夕一であればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞 を宿主として用いる場合は、 SRひプロモーター、 SV40プロモーター、 L TRプロモ一夕一、 CMVプロモ一夕一、 HS V-TKプロモー夕一、 β -ァク チン等が挙げられる。
これちのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 SRaプロ モーター等を用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモーター、 r e cAプロ七一夕一、 λ PLプロモ 一夕一、 l ppプロモーター、 T 7プロモーター等が、 宿主がバチルス属菌で ある場合は、 SPOlプロモー夕一、 SPO 2プロモーター、 p e nPプロモ 一夕一等、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモー ター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター等が好ましい。 宿主が昆虫細 胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーター等が好まし い。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシング シグナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー、 S V40複製オリジン（以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） 等を含有しているものを用いることが できる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 ァ ンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp1"と略称する場合がある） 、 ネオマイシ ン耐性遺伝子 （以下、 Ne oFと略称する場合がある、 Geneticin耐性） 等が挙 げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて d h f r遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、 組換え体細胞をチミジンを 含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のポリペプチド の N端末側に付加する。 宿主がェシェリヒア属菌である場合は、 P ti o A ·シ グナル配列、 OmpA*シグナル配列等が、宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列等が、 宿主が酵 母である場合は、 MFa ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列等、 宿主が 動物細胞である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 α_インタ一フエ口 ン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列等がそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードする DN Αを含 有するベクタ一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、ェシエリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞等が用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア 'コリ
(Escherichia coli) K 12 · DH 1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショ ナル'アカデミー'ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ 'ザ 'ュ一エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 60巻， 160 (1968)〕 ， J M 103 〔ヌクイレ ック 'ァシッズ · リサーチ， （Nucleic Acids Research) ， 9卷， 309 (1 981)], JA221〔ジャーナル'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー（Journal of Molecular Biology) 〕 ， 120卷， 517 (1978)〕 ， HB 101 〔ジ ャ一ナル ·ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕， C 600 〔ジェネティックス （Genetics) , 39巻， 440 (1954)〕 等が 用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス ·サブチルス (Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)〕 ， 207 - 21 〔ジャーナ ル ·ォブ 'バイオケミストリ一 （Journal of Biochemistry) ， 95巻， 87 (1 984)〕 等が用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R— , ΝΑ 87 - 11 A, DKD— 5D, 2 0Β— 12、 シゾサッカロマイセス ポンべ (Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1913， NCYC 2036、 ピキア パストリス（Pichia pastoris) KM 71等が用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia ni の中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞等が用いら れる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyxmori N細胞； BmN細胞）等が用いられる。該 S f細胞としては、例えば、 S f 9細胞（ATCC CRL1711)、 S f 21細胞（以上、 Vaughn, J.L.ら、イン ·ヴイボ (In Vivo) ,13， 213-217, (1977)) 等が用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫等が用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー (Nature) ， 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Ve r o， チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤ ィニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 20, マウスミエローマ細胞， ラッ'ト GH3, ヒト FL細胞等が用いられる。
' ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ 'ォブ'. ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスェ 一 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69巻， 21 10 (1972) やジーン (Gene) , 17巻， 107 (1982 )等に記載の方法に従って行なうことがで さる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジエネ ラル 'ジエネティックス （Molecular & General Genetics) , 168巻， 1 11 (1979)等に記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メソッズ'イン ·ェンザィモロジ一
(Methods in Enzymology) , 194巻， 182 - 187 (1991) 、 プロ シージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ · ォブ 'ザ*ュ一エスエー （Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1978) 等に記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 (Bio/Technology) ，6， 47-55 (1988)) 等に記載の方法に従って行なうことが できる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プ ロトコール. 263 267 ( 1 995) (秀潤社発行） 、 ヴィロロジ一 (Virology) , 52巻， 456 ( 1 973)に記載の方法に従って行なうことが できる。
このようにして、 ポリペプチドをコードする DN Aを含有する発現べクタ一 で形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖等、 窒素源 としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 酵母エキス、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液等の 無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水 素ナトリウム、 塩化マグネシウム等が挙げられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進因子等を添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M9培地 〔ミラ一 （Miller) , ジャーナル ·ォブ ·ェクスぺリメ ンッ ·イン -モレキュラー -ジェネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) ， 43 1—433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働か せるために、 例えば、 3 ]3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えること ができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜43"Cで約 3〜24時 間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜40 で約6〜24時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホールダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 プロシージングズ' ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー''ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユー エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 77巻， 4505 (1980)〕 や 0.5%カザミノ酸を含有する SD培地 〔BiUer, G. A. ら、 プロシ一ジング ズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ユーエスエー （Pro atl. Acad. Sci. USA) , 81卷， 5330 (1984) 〕 が挙げられる。 培地の ρΗは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約
20〜35でで約24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、
Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C.,ネィチヤ一 (Nature) , 195, 788 (1962)) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたもの等が用いられる。 培 地の ρΗは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27でで 約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約
5〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) , 122 巻， 501 ( 1952)〕. ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) , 8巻，
396 (1959)] , RPM I 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·ァメ リカン ·メディカル ·ァソシェ一ション （The Journal of the American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシージング' ォブ 'ザ'ソサイエティ ·フォー 'ザ'バイオロジカル ·メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73卷， 1 (1950)〕 等 が用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30〜4 0 で約15〜60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のポ リぺプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、 例えば、 下記の 方法により行なうことができる。
本発明のポリぺプチドを培養菌体ぁるいは細胞から抽出するに際しては、 培 養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破 壊したのち、 遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法等が適 宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジン等の蛋白質変性剤や、 トリ トン X— 1 0 0 TM等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリぺプ チドが分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは 細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるポリべプチ ドの精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができ る。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法等の溶解度を利 用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリル アミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換ク 口マトグラフィ一等の荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティーク口マトダラ フィ一等の特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィ一等 の疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方 法等が用いられる。
かくして得られるポリペプチドが遊離体で得られた場合には、 自体公知の方 法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得ら れた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または 他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するポリペプチドを、 精製前または精製後に適当よ蛋 白修飾酵素または蛋白分解酵素等を作用させることにより、 任意に修飾を加え たり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。これらの酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロ ティンキナーゼ、 グリコシダーゼ等が用いられる。
かくして生成する本発明のポリペプチドまたはその塩の存在は、 特異抗体を 用いたェンザィムィムノアツセィゃウエスタンプロット解析等により測定す ることができる。
本発明のポリペプチドまたはその塩に対する抗体は、 本発明のポリペプチド またはその塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナ ル抗体の何れであってもよい。
本発明のポリぺプチドまたはその塩に対する抗体は、 本発明のポリぺプチド を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造するこ とができる。
〔モノク口一ナル抗体の作製〕
(a) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドまたはその塩は、 温血動物に対して投与により抗体産 生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に 際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイ ントアジュバン'トを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2 〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に 脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異 種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノク口一ナル抗体産生ハイブ リドーマを調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記 の標識化ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の 活性を測定することにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例え ば、 ケーラーとミルスタインの方法 〔ネイチヤー （Nature), 256、 495 (1975)) に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレング リコール （PEG) やセンダイウィルス等が挙げられるが、 好ましくは PEG が用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS_ 1、 P 3U1、 S P 2/0, AP— 1 等の温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6 000) が 10〜80 %程度の濃度で添加され、 約 20〜40 、 好ましくは 約 30〜37 で約1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細 胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法 が使用できるが、 例えば、 ポリペプチド抗原を直接あるいは担体とともに吸着 させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次 に放射性物質や酵素等で標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられ る細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプ 口ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免 疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培 養上清を添加し、 放射性物質や酵素等で標識したポリペプチドを加え、 固相に 結合したモノクローナル抗体を検出する方法等が挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って 行なうことができる。 通常 HA T (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジ ン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地 としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても 良い。 例えば、 約 1〜2 0 %、 好ましくは約 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 約 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光 純薬工業（株） )あるいはハイプリドーマ培養用無血清培地（S F M— 1 0 1、 日水製薬（株））等を用いることができる。培養温度は、通常約 2 0〜4 0 ：、 好ましくは約 3 7 である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週 間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイ プリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして 測定できる。
( b ) モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロプリ ンの分離精製法〔例、塩析法、 アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原 結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン G等の活性吸着剤により 抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行な うことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に 従って製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （ポリペプチド抗原） 自体、 あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル 抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のポリ ぺプチドまたはその塩に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行な うことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複 合体に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリア一とハプテンとの混合比 は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清ァ ルブミンゃゥシサイログロプリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対 し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いら れる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができるが、ダルタルアルデヒドゃカルポジイミド、マレイミド活性エステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与しても よい。投与は、通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、計約 3〜 1 0回程度行なわれる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水等、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定 と同様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なう ことができる。
本発明のポリペプチドをコードする D N A (以下、 本発明の D NAと称する こともある） に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセ ンス D NAとしては、 本発明の D NAに相補的な、 または実質的に相補的な塩 基配列を有し、 該 D NAの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いず れのアンチセンス D N Aであってもよい。
本発明の D N Aに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の D N A に相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の D NAの相補鎖） の全塩基配列ある いは部分塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは 約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列等が挙 げられる。 特に、 本発明の DNAの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明のポリべ プチドの N末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の 塩基配列等） の相補鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好まし くは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセン ス DNAが好適である。 これらのアンチセンス DNAは、 公知の DNA合成装 置等を用いて製造することができる。 以下に、 本発明のポリペプチドまたはその塩 （以下、 本発明のポリペプチド と略記する場合がある） 、 本発明のポリペプチドをコードする DNA (以下、 本発明の DNAと略記する場合がある） 、 本発明のポリペプチドをコードする DNAを含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体 （以下、 本発明 の形質転換体と略記する場合がある。 ） 、 本発明のポリペプチドまたはその塩 に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） 、 およびアンチセ ンス DN Aの用途を説明する。
( 1 ) 本発明のポリぺプチドが関与する各種疾病の治療 ·予防剤
本発明のポリペプチドは ChM— I遺伝子のプロモーターに結合し、 該遺伝 子の転写を促進し、 また I I型コラーゲン遺伝子の発現を促進するので、 本発 明のポリペプチドをコードする DNAに異常があったり、 欠損している場合、 例えば、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折、 癌などの種々の 疾病が発症する可能性が高い。
したがって、 本発明のポリペプチドおよび本発明の DN Aは、 例えば、 慢性 関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折、 癌などの種々の疾病の治療- 予防剤などの医薬として使用することができる。
例えば、 生体内において本発明のポリペプチドが減少あるいは欠損している 患者がいる場合に、 （ィ） 本発明の DNAを該患者に投与し、 生体内で本発明 のポリペプチドを発現させることによって、 （口） 細胞に本発明の DNAを挿 入し、 本発明のポリペプチドを発現させた後に、 該細胞を患者に移植すること によって、 または （八） 本発明のポリペプチドを該患者に投与することなどに よって、 該患者における本発明のポリペプチドの役割を十分に、 あるいは正常 に発揮させることができる。
本発明の D N Aを上記の治療'予防剤として使用する場合は、 該 D N Aを単 独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウィル スァソシェ一テッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常 套手段に従って、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。 本発明の D N Aは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認めら れる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテ —テルによって投与できる。
本発明のポリペプチドを上記の治療，予防剤として使用する場合は、 少なく とも 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好ま しくは 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のポリペプチドは、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセ ル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水も しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤など の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明のポリペプチドを生理 学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤 などとともに一般に認められた製剤に要求される単位用量形態で混和するこ とによって製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示され た範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼ ラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性 セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよ うな膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖または サッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のよう な香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記夕 ィプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のた めの無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油な どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤製 造法に従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D_マンニトール、 塩化ナトリウ ムなど） などが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノールなど） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリエ チレングリコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0TM、 HCO— 50など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが挙げられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩 酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレング リコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプ ルに充填される。
本発明の DNAが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、 通常、 非 経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは温血動物（例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与する ことができる。
本発明のポリペプチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 慢性関節リウマチの治療目的で本発明のポリぺプ チドを経口投与する場合、 一般的に成人 （6 O kgとして） においては、 一日 にっき該ポリペプチドを約 0. lmg〜 10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 0mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場 合は、 該ポリペプチドの 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異な るが、 例えば、 慢性関節リウマチの治療目的で本発明のポリペプチドを注射剤 の形で成人 （体重 60 kgとして） に投与する場合、 一日につきポリペプチド を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ま しくは約 0. 1〜1 Omg程度を患部に注射することにより投与するのが好都. 合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することが できる。
(2) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のポリペプチドは、 ChM— I遺伝子の転写促進活性および I I型コ ラーゲン遺伝子の発現促進活性を有するため、 本発明のポリペプチドの活性 (例、 ChM— I遺伝子プロモーターへの結合活性、 ChM— I遺伝子の転写 活性、 I I型コラーゲン遺伝子の発現促進活性など） を促進する化合物または その塩は、 例えば慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折、 癌など 疾病の治療 ·予防剤などの医薬として使用できる。
一方、 本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩は、 例え ば椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 異所性軟骨形成などの治療 ·予防剤などの医 薬として使用できる。
したがって、 本発明のポリペプチドは、 本発明のポリペプチドの活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として用 いることができる。
また、 本発明の DNAまたは該 DNAで形質転換された形質転換体は、 本発 明のポリペプチドを産生する能力を有することから、 本発明のポリペプチドの 活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試 薬として用いることができる。
すなわち、 本発明は、
①本発明のポリぺプチドを用いることを特徴とする本発明のポリぺプチドの 活性を促進する化合物もしくはその塩（以下、促進剤と略記する場合がある）、 または本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物 （以下、 阻害剤と略記す る場合がある） のスクリーニング方法を提供し、 より具体的には、 例えば、 ②（ i )本発明のポリペプチドに ChM— I遺伝子プロモーターの cis-element を含有する DNAを接触させた場合と （ii) 本発明のポリペプチドに ChM— I遺伝子プロモーターの c is- elementを含有する DN Aおよび試験化合物を接 触させた場合との比較を行なうことを特徴とする促進剤または阻害剤のスク リーニング方法を提供する。
具体的には、 上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （ i ) と （ii) の場合における、 本発明のポリペプチドの ChM— I遺伝子のプロモーターへ の結合量を比較することを特徴とするものである。
ChM— I遺伝子プロモーターの cis- elementを含有する DNAは、 例えば 放射性同位元素または色素などで標識されたものが好ましく用いられる。 放射 性同位元素としては、 例えば32 P、 3Hなどが用いられ、 色素としては、 例え ば f l u o r e s c e i n、 F AM (PE Biosystems社製） 、 JOE (PE
Biosystems社製） 、 TAMRA (PE Biosystems社製） 、 R〇X (PE Biosystems 社製） 、 Cy 5 (Amersham社製） 、 Cy 3 (Amersham社製） などの蛍光色素が 用いられる。 ChM— I遺伝子プロモーターの cis-elementを含有する DNA は、 例えば、 配列番号： 17で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一 の塩基配列の中の連続した 6個以上 （好ましくは 6〜20個、 さらに好ましく は 8〜20個、 より好ましくは 10〜20個） の塩基から構成される配列を含 有する一本鎖または二本鎖 D N Aがあげられ、 該 D N Aは自体公知の化学合成 法により調製することができる。
配列番号： 17で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列としては、 例 えば、 配列番号： 17で表される塩基配列中の 1〜 3個程度の塩基が他の塩基 で置換された塩基配列があげられる。 より具体的には配列番号： 21で表され る塩基配列 （特開平 7 _ 138295号公報） などがあげられる。
ChM- I遺伝子プロモー夕一の cis-elementを含有する DNAへの本発明 のポリペプチドの結合量は、 本発明のポリペプチドに結合した ChM— I遺伝 子のプロモーターの cis-elementを含有する DN Aを例えば標識体の活性を指 標にして測定することによって定量することができ、 自体公知の方法、例えば、 - ゲルシフトアツセィ法（新遺伝子工学ハンドブック改訂第 3版、村松正實ら編、 羊土社発行、 150頁、 1999年） に従って測定することができる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙 げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。
また、 本発明は、 本発明の DNAまたは本発明の形質転換体を用いることを 特徴とする、促進剤または阻害剤のスクリーニング方法に関する。具体的には、 本発明は、 本発明の DNAと、 ChM— I遺伝子プロモーターの cis- element の下流にレポーター遺伝子を連結させた DN Aで形質転換した酵母 （例えば、 Sacc aromyces cerevisiae) を試験化合物の存在下および非存在下で培養し、 レポーター遺伝子の発現を検出し比較することを特徴とする、 促進剤または阻 害剤のスクリーニング方法を提供する。
レポーター遺伝子としては、 例えば H I S 3、 TRP 1、 UR A 3などの栄 養要求性を相補する阜伝子、 例えばオーレォバシジン A耐性遺伝子などの薬剤 耐性遺伝子、 例えば 1 ac Z (0—ガラクトシダ一ゼ遺伝子） などの染色マー 力一遺伝子等などが用いられる。
例えば、 ヒスチジンに対する栄養要求性をもつ酵母を、 本発明の DNAと、 ChM— I遺伝子プロモーターの cis-elementの下流にレポーター遺伝子とし て H I S 3遺伝子を連結させた DNAで形質転換し、 得られた形質転換体を試 験化合物の存在下、ヒスチジンを欠いた培地で培養し、形質転換体の生育性（増 殖促進または阻害） を測定することによつて本発明のポリぺプチドの活性を促 進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。 形 質転換体の生育を促進する試験化合物を本発明のポリペプチドの活性を促進 する化合物として選択することができ、 また形質転換体の生育を阻害する試験 化合物を本発明のポリぺプチドの活性を阻害する化合物として選択すること ができる。
また、 酵母を本発明の DNAと、 ChM_ I遺伝子プロモーターの cis-elementの下流にレポ一夕一遺伝子としてオーレォバシジン A耐性遺伝子 を連結させた DN Aで形質転換し得られた形質転換体を、 試験化合物およびォ 一レオバシジン Aを含有する培地で培養し、 形質転換体の生育性 （増殖促進ま たは阻害） を測定することによって本発明のポリべプチドの活性を促進または 阻害する化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。 形質転換体 の生育を促進する試験化合物を本発明のポリペプチドの活性を促進する化合 物として選択することができ、 また形質転換体の生育を阻害する試験化合物を 本発明のポリぺプチドの活性を阻害する化合物として選択することができる。 また、 酵母を本発明の DNAと、 ChM— I遺伝子プロモー夕一の cis- elementの下流にレポーター遺伝子として )3 _ガラクトシダーゼ遺伝子 ( 1 a c Z) 遺伝子を連結させた DNAで形質転換し得られた形質転換体を試 験化合物および例えば、 5 _ブロモ _ 4 _クロ口— 3—インドリル— /3—ガラ クトビラノシド （X— g a l ) のような /3—ガラクトシダーゼの基質となる試 薬の存在下培養し、 形質転換体の染色度を測定することによつて本発明のポリ ペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニング することができる。 試験化合物の非存在下で培養した場合に比べ、 試験化合物 の存在下で培養した形質転換体がより濃い青色に染色されれば試験化合物を 本発^のポリペプチドの活性を促進する化合物として選択でき、 逆に、 より淡 い青色に染色されるか、 または全く染色されない時には試験化合物を本発明の ポリべプチドの活性を阻害する化合物として選択できる。
また、 レポ一夕一遺伝子産物 （例、 mR N A、 タンパク質） の量を自体公知 の方法を用いて測定することによって、 レポーター遺伝子産物の量を増加させ る試験化合物を本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物として選択で き、 逆に、 レポーター遺伝子産物の量を減少させる試験化合物を本発明のポリ ぺプチドの活性を阻害する化合物として選択することができる。
上記のスクリーニング方法で用いられる C h M _ I遺伝子プロモーターの c is-elementとしては、 例えば、 配列番号,： 1 7で表される塩基配列と同一ま たは実質的に同一の塩基配列中の連続した 6個以上 （好ましくは 6〜2 0個、 'さらに好ましくは 8〜 2 0個、 より好ましくは 1 0〜2 0個） の塩基から構成 される塩基配列を含有する D NAがあげられる。 配列番号： 1 7で表される塩 基配列と実質的に同一の塩基配列としては、 例えば、 配列番号： 1 7で表され る塩基配列中の 1〜 3個程度の塩基が他の塩基で置換された塩基配列があげ られる。 より具体的には配列番号： 2 1で表される塩基配列 （特開平 7— 1 3 8 2 9 5号公報） などがあげられる。
C h M - I遺伝子プロモーターとその下流に連結されるレポ一夕一遺伝子 の翻訳開始コドンとの間の塩基数には特に制限はないが、 通常 0〜 1 0 0塩基、 好ましくは 1 0〜5 0塩基、 さらに好ましくは 1 0〜3 0塩基である。
また、 形質転換体の培養は、 前述の形質転換体の培養と同様に行うことがで さる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のポリペプチド、 本発明の D N Aまたは本発明の形質転換体を含有するものである。 好ましくは、 本発明のポ リペプチド、 本発明の DNAまたは本発明の形質転換体および ChM— I遺伝 子のプロモータ一の cis-elementを含有する DNAを含有するものである。 ま た、 本発明の形質転換体を用いる場合には、 本発明の DNAおよび ChM— I 遺伝子のプロモーターの cis- elementを含有する DN Aで形質転換された形質 転換体を用いてもよい。
また、 本発明は、
①本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下 に培養し、 本発明のポリペプチドをコードする mRNA量を測定することを特 徴とする、 本発明のポリペプチドをコードする DN Aの発現を促進または阻害 する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供し、 より具体的には、
② （i) 本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞を培養した場合の 本発明のポリペプチドをコードする mRNAの発現量と、 （ii) 本発明のポリ ペプチドを産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下に培養した場合 の本発明のポリペプチドをコードする mRNAの量との比較を行うことを特 徴とする、 本発明のポリペプチドをコードする DN Aの発現を促進または阻害 する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前記 の本発明の形質転換体、 ChM— Iを産生する能力を有する公知の温血動物細 胞などがあげられる。 ChM— Iを産生する能力を有する公知の温血動物細胞 としては、 例えば、 インシュリンなどの発現誘導剤で ChM— Iを産生する動 物細胞があげられ、 より具体的にはマウス ATDC 5細胞などがあげられる。 本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞の培養は、 前記した本発 明の形質転換体の培養と同様にして行われる。 発現誘導剤を接触させることに よって ChM— Iを産生する動物細胞を用いる場合には、 該動物細胞を発現誘 導剤の存在下または非存在下で培養することができる。
本発明のポリペプチドをコードする mRNAの量の測定は、 自体公知の方法 に従って細胞から抽出した RN Aと本発明の DN Aまたはその相補 DN Aと を接触させ、 本発明の DN Aまたはその相補 DN Aに結合した mRNAの量を 測定することによって行われる。 本発明の D N Aの相補 D N Aまたはその部分 DNAを、 例えば放射性同位元素、 色素などで標識することによって、 本発明 の DNAの相補 DNAに結合した本発明のポリペプチドをコードする mRN Aの量が容易に測定できる。 放射性同位元素、 色素としては、 前記した ChM 一 I遺伝子プロモーターの cis-elementを含有する DNAを標識するために用 いられるものと同様なものが用いられる。
また、 本発明のポリペプチドをコードする mRN Aの量は、 細胞から抽出し た RNAを逆転写酵素によって c DNAに変換した後、 本発明の DNAもしく はその相補 DNAまたはその部分 DNAをプライマーとして用いる PC尺に よって、 増幅される c DNAの量を測定することによって行うことができる。 本発明のポリペプチドをコードする mRNAの量の測定に用いられる本発 明の DNAの相補 DNAとしては、 本発明の DNA (上鎖） に相補的な配列を 有する DNA (下鎖） があげられる。 本発明の DNAの部分 DNAとしては、 例えば本発明の DNAの塩基配列中、 連続した 10〜2200個程度、 好まし くは 10〜 300個程度、 さらに好ましくは 10〜 30個程度の塩基から構成 される塩基配列があげられる。 本発明の D N Aの相補的 D N Aの部分 D N Aと しては、 例えば前記した本発明の DNAの部分 DNAに相補的な配列を有する DNAがあげられる。 PCRに用いられるプライマーとしては特に好ましくは、 例えば配列番号： 8で表される塩基配列を有する DN Aおよび配列番号： 9で 表される塩基配列'を有する D N Aがあげられる。
本発明のポリペプチドをコードする mRNAの量を増加させる試験化合物 を、 本 明の DN Aの発現を促進する化合物として選択することができ、 また 本発明のポリペプチドをコ一ドする mRN Aの量を減少させる試験化合物を、 本発明の DN Aの発現を阻害する化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパ ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物であり、 本発明のポリペプチド の活性 （例、 ChM— I遺伝子プロモーターへの結合活性、 ChM— I遺伝子 の転写活性、 I I型コラーゲン遺伝子の発現促進活性など） または本発明の D N Aの発現を促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが 用いられる。
本発明のポリペプチドの活性 （例、 ChM_ I遺伝子プロモーターへの結合 活性、 ChM— I遺伝子の転写活性、 I I型コラーゲン遺伝子の発現促進活性 など） または本発明の DNAの発現を促進する化合物は、 例えば、 慢性関節リ ゥマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折、 癌などの疾病に対する治療，予防剤 などの医薬として使用できる。 .
一方、 本発明のポリペプチドの活性または本発明の DN Aの発現を阻害する 化合物は、 例えば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 異所性軟骨形成などの疾病 に対する治療 ·予防剤などの医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物を上述の治療 ·予防剤として使用する場合、 常套手段に従って実施 することができる。 例えば、 前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と 同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性 溶液、 懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。 該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ル —トなどにより差異はあるが、 例えば、 慢性関節リウマチの治療目的で本発明 のポリペプチドの活性または本発明の DN Aの発現を促進する化合物を経口 投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につき 該化合物を約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ま しくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 慢性関節 リゥマチの治療目的で本発明のポリぺプチドの活性または本発明の DN Aの 発現を促進する化合物を注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与する 場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1 〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投 与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を 投与することができる。 一方、 椎間板ヘルニアの治療目的で本発明のポリペプチドの活性または本発 明の DN Aの発現を阻害する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患など によっても異なるが、 例えば、 椎間板ヘルニアの治療目的で本発明のポリぺプ チドの活性または本発明の DN Aの発現を阻害する化合物を注射剤の形で通 常成人 （6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01 〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場 合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
また、 本発明のポリペプチドは， 配列番号： 17で表される塩基配列と同一 または実質的に同一の塩基配列を有する cis-elementに特異的に結合すること から、 配列番号： 17で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配 列を有する cis-elementを有する遺伝子の転写を促進する。 したがって、 本発 明のポリペプチド、 本発明の DNAまたは本発明の形質転換体は、 ChM_ I 遺伝子に加えて配列番号： 17で表される塩基配列と同一または実質的に同一 の塩基配列を有する cis-elementを有する他の遺伝子の転写を促進または阻害 する化合物のスクリーニングに用いることもできる。
(3) 本発明のポリペプチドまたはその塩の定量
本発明の抗体は、 本発明のポリぺプチドを特異的に認識することができるの で、 被検液中の本発明のポリペプチドの定量、 特にサンドイッチ免疫測定法に よる定量などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
(i) 本発明の抗体と、 被検波および標識化された本発明のポリペプチドとを 競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のポリペプチドの割 合を測定することを特徴とする被検波中の本発明のポリぺプチドの定量法、 お よび
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の 活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリぺプチドの定量法 を提供する。
上記 （i i) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のポリペプチドの N端 部を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のポリペプチドの C端部に反応する 抗体であることが望ましい。
また、 本発明のポリペプチドに対するモノクロ一ナル抗体 （以下、 本発明の モノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のポリぺプチドの定 量を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目 的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法は、 特に制限される べきものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した 抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検 出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出す る測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感 度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。 標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、'例えば、 放射性同位 元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、 例えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記 酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 ）3—ガラクト シダーゼ、 3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パーォキシダ一 ゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フル ォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物 質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲ ニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビォチ ンーアビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用 いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成榭 脂、 あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検 液を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗 体を反応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定するこ とにより被検液中の本発明のポリぺプチド量を定量することができる。 1次反 応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をず らして行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じる ことができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体 あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測 定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 本発明のサンドィツチ法による本発明のポリぺプチドの測定法においては、 1次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のポ リぺプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる 抗体が、 本発明のポリペプチドの C端部を認識する場合、 1次反応で用いられ る抗体は、好ましくは C端部以外、例えば N端部を認識する抗体が用いられる。 本発明のモノク口一ナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができ る。
競合法では、 被検波中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ たのち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離 し （B Z F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定 量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B / F分離をポリェチ レングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化坊体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用 い第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検波中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検波中の抗原量が僅かであり、 少量の 沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメ トリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測 定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、.総説、 成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、昭和 49年発行）、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 54年発行) 、 石川栄 治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 62年発行） 、 「Methods in ENZYM0L0GYJ Vol. 70 (I誦 unochemical Techniques (Par t A))、 同書 Vol.
73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同書 Vol. 84(Imm画 chemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays)), 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)) , 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 ァカデミックプレス社発行）などを参照することができる。 以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のポリぺプ チドを感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドの濃度を定量するこ とによって、①本発明のポリペプチドの濃度の減少が検出された場合、例えば、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折、 癌などの疾病である、 ま たは将来罹患する可能性が高 と、 また②本発明のポリペプチドの濃度の増加 が検出された場合、 例えば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 異所性軟骨形成な どの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリ ペプチドを検出するために使用することができる。 また、 本発明のポリべプチ ドを精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明の ポリペプチドの検出、 被検細胞内における本発明のポリペプチドの挙動の分析 などのために使用することができる。
(4) 遺伝子診断剤
本発明の DN Aは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明の ポリペプチドをコードする DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出 することができるので、 例えば、 該 DN Aまたは mRNAの損傷、 突然変異あ るいは発現低下や、 該 DN Aまたは mRNAの増加あるいは発現過多などの遺 伝子診断剤として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザン ハイブリダィゼーシヨンや PC R— S S CP法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5巻， 874〜 879頁 （ 1 989年） 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナ ショナル'アカデミー'ォブ ·サイェンシィズ 'ォブ 'ユーエスエー（Proceedings of the Natinal Academy of Sciences of the United States of America) , 第 86巻， 2766〜2770頁 （1 989年） ） などにより実施することが できる。
例えば、 ノーザンハイプリダイゼーシヨンにより発現低下が検出された場合 は、 例えば、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折、 癌などの 疾病である可能性が高いと診断することができる。 .
一方、 ノーザンハイブリダィゼ一シヨンにより発現過多が検出された場合は、 例えば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 異所性軟骨形成などの疾病である可能 性が高いと診断することができる。
また、 PCR— S S CP法により DNAの突然変異が検出された場合は、 例 えば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛もしくは異所性軟骨形成など、 または慢性 関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折もしくは癌などの疾病である可 能性が高いと診断することができる。
(5) アンチセンス DNAを含有する医薬
本発明の DNAに相補的に結合し、 該 DN Aの発現を抑制することができる アンチセンス DNAは、 生体内における本発明のポリペプチドまたは本発明の DNAの機能を抑制することができるので、 例えば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神 経痛、 異所性軟骨形成の治療 ·予防剤として使用することができる。
上記アンチセンス DNAを上記の治療 ·予防剤として使用する場合、 前記し た本発明の DN Aを含有する各種疾病の治療 ·予防剤と同様にして実施するこ とができる。
例えば、 該アンチセンス DNAを用いる場合、 該アンチセンス DNAを単独 あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルス ァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套 手段に従って実施することができる。 該アンチセンス DNAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに 製剤化し、 遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投 与できる。
さらに、 該アンチセンス DNAは、 組織や細胞における本発明の DNAの存 在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして 使用することもできる。
(6) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明のポリペプチドの活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、 例え ば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 異所性軟骨形成などの種々の疾病の治療 · 予防剤などの医薬として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療 ·予防剤は、 そのまま液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非 経口的に投与することができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与 ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の椎間板ヘルニアの治療 ·予防 のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0.0 1〜2 OmgZkg体重程度、 好ましくは 0. 1〜； L OmgZkg体重程度、 さらに 好ましくは 0 . l〜5 m g Z k g体重程度を、 1日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投 与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特 に重い場合には、 その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することがで きる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と薬理学的に許 容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤 形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒 剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁 剤などがあげられる。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤 分野において通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものであ る。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、. 蔗糖、 ステア リン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤など の剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上記 抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶 解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例 えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性 剤〔例、ポリソルベート 8 0、 H C〇—5 0 (po lyoxye thyl ene ( 5 O mo l) adduc t of hydrogenated cas tor o i l) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当 なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその 塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示さ れ、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5〜 100mg、 その他の剤形では 10〜250 m gの上記抗体が含有されて いることが好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
(7) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のポリペプチドをコードする DN A (以下、 本発 明の外来性 DN Aと略記する） またはその変異 DN A (本発明の外来性変異 D NAと略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、 '
(i) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、
(ii) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （i)記載の動物、
(iii) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （ii) 記載の動物、 および (iv) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物におい て発現しうる組換えべクタ一を提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒ卜哺乳動物 （以下、 本発明の DN A転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその 始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生に おける胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でか つ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフェク シヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DE AE—デキストラン法などにより目的とする DN Aを転移することによって 作出することができる。また、該 DN A転移方法により、体細胞、生体の臓器、 組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培 養などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公 知の細胞融合法により融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出 することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィ ヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス夕一、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なか でも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的 短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、純系として、 C 57BLZ6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 BGCS Fi系統， BDFi系統， BSDS Fi系統， BALBZc系統， I CR系統など） または ラット （例えば、 Wi s t a r, SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えべクタ一における「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが挙げられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DN Aではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。 本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例え ば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基 への置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。 該異常 DN Aとしては、 異常な本発明のポリペプチドを発現させる DN Aを 意味し、 例えば、 正常な本発明のポリペプチドの機能を抑制するタンパク質を 発現させる DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺 乳動物由来のものであってもよい。 本発明の DN Aを対象動物に転移させるに あたっては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合し た DNAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明 のヒト DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DNAを有する 各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスなど） 由来の DN Aを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本 発明のヒト DNAを結合した DNAコンストラクト （例、 ベクタ一など） を対 象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションする ことによって本発明の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出するこ とができる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリ オファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウイ ルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも， 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミ ドなどが好ましく用いられる。
上記の DN A発現調節を行なうプロモー夕一としては、 例えば、 ①ウィルス (例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロ モーター、 ②各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス タ一、 ラッ卜、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 アルブミン、 イン スリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセ リン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質ク、 グル夕チオン S—トランスフェラーゼ、 血小板由来成長因子) 3、 ケラチン Kl， K10およ び Κ14、 コラーゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質 キナーゼ) 3 Iサブユニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスフ ァターゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮レセプ夕一チロシンキナーゼ （一 般に T i e 2と略される）、ナトリゥムカリゥムアデノシン 3リン酸化酵素（N a， K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iお よび I IA、 メタ口プロティナーゼ 1組織インヒビター、 MHCクラス I抗原 (H- 2 L) 、 H_ r a s、 レニン、 ド一パミン) 3—水酸化酵素、 甲状腺ペル ォキシダーゼ （TP O) 、 ポリペプチド鎖延長因子 1ひ （EF— 1ひ） 、 βァ クチン、 αおよび /3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎夕 ンパク質、 チログロブリン、 Thy_ l、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VN P) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑 筋 αァクチン、 プレプロエンケフアリン Α、 バソプレシンなどのプロモーター などが用いられる。 なかでも、 全身で高発現することが可能なサイトメガロウ ィルスプロモー夕一、 ヒトポリペプチド鎖延長因子 1ひ (EF- 1 α) のプロ モーター、 ヒトおよびニヮトリ 3ァクチンプロモーターなどが好適である。 上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー R ΝΑの転写を終結する配列 （一般に夕一ミネ夕一と呼ばれる） を有しているこ とが好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DN Αの配 列を用いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40夕一ミネタ 一などが用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのス プライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DNAのイントロンの一部な どをプロモーター領域の 5 ' 上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻 訳領域の 3' 下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のポリペプチドの翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例え ば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由 来の肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DN Aライブラリーよりゲノム DN Aの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相 補 DNAを原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DNAは、 上記の細胞または組織より得られた正常なポリべプチドの翻訳領域を点突然 変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、 前 記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる 通常の DN A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DN A転移後の作 出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DNAが存在することは、 作出動 物の後代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを保持することを意味する。 本発明の外来性 DN Aを受け継いだこの種の動 物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを有 する。
本発明の外来性正常 DNAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 DN Aを安定に保持することを確認して、 該 DN A保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 DNA転移後 の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在すること は、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこ の種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有する。
導入 D NAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌 雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するよう に繁殖継代することができる。
本発明の正常 D N Aを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D N Aが高発 現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に 本発明のポリぺプチドの機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動 物として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D N A転移動物を用い て、 本発明のポリペプチドの機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾 患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可 能である。
また、 本発明の外来性正常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明 のポリペプチドの増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する 疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。 '
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外 来性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の 飼育環境で継代飼育することができる。 さらに、 目的とする外来 D N Aを前述 のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。 プロモー夕一との D NAコンストラク卜は、 通常の遺伝子工学的手法によって作製することがで きる。 受精卵細胞段階における本発明の異常 D NAの転移は、 対象哺乳動物の 胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の 子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有する ことを意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D NA を相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の動物を交 配することによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代すること ができる。 本発明の異常 D NAを有する非ヒ卜哺乳動物は、 本発明の異常 D N Aが高発 現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に 本発明のポリぺプチドの機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデ ル動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を 用いて、 本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明および この疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本 発明のポリペプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質 による正常タンパク質の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデ ルとなる。
また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の ポリぺプチドの増加症状を有することから、 本発明のポリぺプチドの機能不活 性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、 例えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
②本発明の D N A転移動物の組織中の D NAもしくは R N Aを直接分析する か、 または D NAにより発現されたタンパク質組織を分析することによる、 本 発明のポリペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との 関連性についての解析、 ，
③ D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用 して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
④上記③記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のス クリーニング、 および
⑤本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のポリペプチドの機能不 活性型不応症などを含む、 本発明のポリペプチドに関連する疾患の臨床症状を 調べることができ、 また、 本発明のポリペプチドに関連する疾患モデルの各臓 器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらに は、 該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。 また、 本発明の DNA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、
などのタンパク質分解酵素により、 遊離した DNA転移細胞の取得、 その培養 またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のポ リペプチド産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることな どができ、 本発明のポリペプチドの作用解明のための有効な研究材料となる。 さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明のポリペプチドの機能不 活性型不応症を含む、 本発明のポリペプチドに関連する疾患の治療薬の開発を 行なうために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患 治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DN A転移動物または本発明の外来性 DN A発現ベクターを用いて、 本発明のポリ ペプチドが関連する疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能である。 (8) ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(i) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(ii) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の /3—ガラクトシダーゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化された第 （i) 項記載の胚幹細胞、 (iii) ネオマイシン耐性である第 （i) 項記載の胚幹細胞、
(iv) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （i) 項記載の胚幹細胞、
(V) ゲッ歯動物がマウスである第 （iv) 項記載の胚幹細胞、
(vi) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
(vii) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の) 3—ガラクトシダー ゼ遺伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポ一夕一遺伝子が本発明 の DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 （vi) 項記載の非ヒト 哺乳動物、
(viii)非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（vi)項記載の非ヒト哺乳動物、
(ix) ゲッ歯動物がマウスである第 （viii) 項記載の非ヒト哺乳動物、 および (X) 第 （vii) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対するプロモータ一活性を 促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 本発明の DNAが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺 乳動物が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 DNAの 発現能を抑制するか、 もしくは該 DN Aがコードしている本発明のポリべプチ ドの活性を実質的に喪失させることにより、 D N Aが実質的に本発明のポリぺ プチドの発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称すること がある） 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。 非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学 的手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを挿入または置換 させることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コド ンの読み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊す ることにより本発明のソックアウト DN Aを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の DNA不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の 具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNA を単離し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐 性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l a c Z (/3—ガラクトシダ —ゼ遺伝子） 、 c a t (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ遺 伝子） を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能 を破壊するか、 あるいはェキソン間のィントロン部分に遺伝子の転写を終結さ せる DNA配列 （例えば、 po l y A付加シグナルなど） を挿入し、 完全なメ ッセンジャー RN Aを合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊 するように構築した DNA配列を有する DNA鎖 （以下、 夕ーゲッティングべ クタ一と略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について本発明の DN A上あるいはその近傍の DN A配列 をプローブとしたサザンハイブリダイゼ一ション解析あるいはターゲッティ ングベクター上の DN A配列と夕ーゲッティングべク夕一作製に使用した本 発明の DNA以外の近傍領域の DNA配列をプライマーとした PCR法によ り解析し、 本発明のノックアウト E S細胞を選別することにより得ることがで さる。
また、 相同組換え法等により本発明の DN Aを不活化させる元の ES細胞と しては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 の E V a n sと Ka u f m aの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例 えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用 されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で 免疫学的に遺伝的背景が明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 BLZ6マウスや C 57 BLZ6の採卵数の少なさを DBAZ2との交 雑により改善した BDFiマウス （C 57 BLZ6と DBAZ2との を用 いて樹立したものなども良好に用いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利点に加えて、 C 57BL/6マウスを背景に持 つので、 これを用いて得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57 BLZ 6マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景を C 57.B LZ 6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用 するが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより 効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生 殖系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減する ためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の 性決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例として挙げることがで きる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数 を要していたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むの で、 培養初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうこ とが可能であり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間 は大幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染 色体数の確認等により行うことができる。 得られる ES細胞の染色体数は正常 数の 1 00%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色 体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体 発生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例えば、 STO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1 - 1 000 OU/m l ) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5 %炭酸ガス、 95%空気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 で培養す るなどの方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶液 （通 常 0.00 1— 0.5%トリプシン 0. 1 - 5mM EDTA、 好ましくは約 0. 1 %トリプシン/ ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意した フィーダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1 一 3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受 けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または 細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋など の種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufman, ネィチヤ一 （Nature) 第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Martin プ ロシーディングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ 'サイエンス 'ユー エスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナル ·ォブ ·ェンブリオロジー ·アンド ·ェクスペリ メンタル ·モルフォロジ一、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の ES細胞を分 化させて得られる本発明の DN A発現不全細胞は、 インビト口における本発明 のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法 を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別 することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製 したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入 し、 導入によりターゲッティングベクターの本発明の D N Aが不活性化された D N A配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の 染色体上の本発明の D N Aと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発 明の D NAをノックアウトさせることができる。
本発明の D N Aがノックアウトされた細胞は、 本発明の D N A上またはその 近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハィブリダイゼ一ション解析また は夕ーゲッティングベクター上の D N A配列と、 夕ーゲッティングベクターに 使用したマウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とをブラ イマ一とした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚 幹細胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D NAが不活性化 された細胞株をクローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の 非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該 非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座 をもつ細胞と人為的に変異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構 成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場合、 こ のようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全 ての組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された 個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このようにして得られた個体は、 通常、 本発明のポリペプチドのヘテロ発現不 全個体であり、 本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体同志を交配し、 そ れらの産仔から本発明のポリべプチドのホモ発現不全個体を得ることができ る。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション 法で D NA溶液を注入することにより夕一ゲッティングベクタ一を染色体内 に導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのト ランスジエニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D N Aがノックアウトされている個体は、 交配によ り得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通 常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N A を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザ ィゴート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1 , ホモザィゴート複数になる ような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴ一 ト動物の雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴート およびへテロザィゴ一ト動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のポリペプチドに より誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のポリペプチドの生 物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の 原因究明及び治療法の検討に有用である。
( 8 a ) 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防 効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷な どに起因する疾病 （例、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折、 癌など） に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いるこ とができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物 を投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NA の欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物また はその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒト 哺乳動物としては、 前記と同様のものが挙げられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な どが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物 であってもよい。 具体的には、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理 し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変 化を指標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注 射などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選 択することができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の 性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折または癌に対し て治療 ·予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、 本発明の D N A 発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、 糖負荷処置前または処置後に 試験化合物を投与し、 該動物の血糖値および体重変化などを経時的に測定する。 該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該 試験動物の血糖値が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましくは 約 5 0 %以上低下した場合、該試験化合物を慢性関節リウマチ、変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折または癌に対して治療 ·予防効果を有する化合物として選択す ることができる。
発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合 物から選ばれた化合物であり、 本発明のポリぺプチドの欠損や損傷などによつ て引き起こされる疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨 折、 癌など） に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で低 毒性な治療 ·予防剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記ス クリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることが できる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 (例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容さ れる酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩 酸、 リン酸、臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸（例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） と の塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして製造することがで きる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは哺乳動物（例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。 該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 慢性関節リウマチの治療目的で該化合物を経口投 与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき該 化合物を約 0.1〜： L 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好まし くは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1 回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 慢性関節リ ゥマチの治療目的で該化合物を注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投 与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜 10 m g程度を静脈注射に より投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算し た量を投与することができる。
(8 ) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化 合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対す るプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー ニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DN A発現不全非ヒ卜哺乳動物 としては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明 の DN Aがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポ一夕 —遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるもの が用いられる。
試験化合物としては、 前記と同様のものが挙げられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 /3—ガラクトシ ダーゼ遺伝子 （ 1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファタ一ゼ遺伝子またはル シフエラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DNAをレポ一夕一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全 非ヒト哺乳動物では、 レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモータ 一の支配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレ —スすることにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の 3—ガラクトシダーゼ遺伝子 （1 a c Z) で置換している場合、 本来、 本発明 のポリぺプチドの発現する組織で、 本発明のポリぺプチドの代わりに ーガラ クトシダーゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモー 4一クロ口— 3—^ Γ ンドリル一 /3—ガラクトピラノシド （Χ—ga l) のような )3 _ガラクトシダ 一ゼの基質どなる試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のポリぺプ チドの動物生体内における発現状態を観察することができる。 具体的には、 本 発明のポリペプチド欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドな どで固定し、 リン酸緩衝生理食塩液 （PBS) で洗浄後、 X— g a lを含む染 色液で、 室温または 37で付近で、 約 30分ないし 1時間反応させた後、 組織 標本を ImM EDTAZPB S溶液で洗浄することによって、 /3—ガラクト シダ一ゼ反応を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコ一ドする mRN Aを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した 試験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の DN Aに対するプロモーター 活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有 機酸など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が 好ましい。 'この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭 化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （ えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピ オン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚 酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用 いられる。 本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩 は、 本発明のポリペプチドの発現を促進し、 該ポリペプチドの機能を促進する ことができるので、 例えば、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨 折、 癌などの疾病に対する安全で低毒性な治療 ·予防剤などの医薬として有用 である。
一方、 本発明の DN Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはそ の塩は、 本発明のポリペプチドの発現を阻害し、 該ポリペプチドの機能を阻害 することができるので、 例えば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 異所性軟骨形 成などの疾病に対する安全で低毒性な治療 ·予防剤などの医薬として有用であ る。
さらに、 上記スクリ一ニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様 に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のポリぺプチドを含有する医薬と同様にして製造することがで きる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物（例えば、 ラット、 マウス、 モルモッ卜、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 慢性関節リウマチの治療目的で本発明の DNAに 対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人
(体重 6 O kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0.1〜100 mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投 与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象 疾患などによっても異なるが、 例えば、 慢性関節リウマチの治療目的で本発明 の DN Aに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成 人 （6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜 1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。 一方、 例えば、 椎間板ヘルニアの治療目的で本発明の DNAに対するプロモ 一夕一活性を阻害する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき該化合物を約 0.1〜100mg、 好まし くは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経 口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによ つても異なるが、 例えば、 椎間板ヘルニアの治療目的で本発明の DNAに対す るプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人 （60 kgとし て） に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ま しくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を静 脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たり に換算した量を投与することができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物は、 本発明の DN Aに 対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスク リ一二ングする上で極めて有用であり、 本発明の D N A発現不全に起因する各 種疾患の原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。 また、 本発明のタンパク質のプロモー夕一領域を含有する DN Aを使って、 その下流に種々の夕ンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞 に注入していわゆるトランスジエニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、 特異的にその夕ンパクを合成させ、 その生体での作用を検討することも可能と なる。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 こ れが発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明のポリペプチドそのものの体 内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の 探索系として使用できる。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸等を略号で表示する場合、 I UP AC- I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あ るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 ま たアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示 すものとする。
DNA ：デォキシリポ核酸 C DNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
. T チミン
G グァニン
C シ卜シン
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸 d ATP デォキシアデノシン三リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグアノシン三リン酸 d CTP デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸 SD S ドデシル硫酸ナトリウム G 1 y グリシン
A 1 ァラニン
Va .1 バリン
Le u
I 1 e
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン T r p ： トリブトファン
P r o ：プロリン
A s n ：ァスパラギン
G i n ： ダル夕ミン
pG 1 u ： ピログルタミン酸
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表 記する。
Me メチル基
E t ェチル基
B u ブチル基
Ph フエニル基
TC チアゾリジン— 4 (R) 一力ルポキサミド基
To s P-トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1
C 12-B z 1 2, 6—ジクロ口べンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル
C 1 -z 2—クロ口べンジルォキシカルポニル
B r - Z 2—ブロモベンジルォキシカルポニル
B o c t—ブトキシカルボニル
DNP ジニトロフエニル
T r t トリチル
Bum t一ブトキシメチル
Fmo c N- 9 _フルォレニルメトキシカルボニル
HOB t 1—ヒドロキシベンズトリアゾール
H〇〇B t 3， 4ージヒドロ一 3—ヒドロキシ一4—ォキソ
1, 2, 3一べンゾトリアジン
HONB 1—ヒドロキシ— 5—ノルポルネン— 2, 3 - ジカルボキシイミド DCC ： N， N' —ジシクロへキシルカルポジイミド 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
[配列番号： 1 ]
実施例 1で用いられた cis-elementの合成 DN A (上鎖）の塩基配列を示す。
[配列番号： 2 ]
実施例lで用ぃられたcis-eleInentの合成DNA (下鎖）の塩基配列を示す。
[配列番号： 3 ]
ヒト由来転写調節因子遺伝子の塩基配列を示す。
[配列番号： 4]
ヒト由来転写調節因子のアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 5 ]
ヒト由来転写調節因子の C末端側の 90アミノ酸残基のアミノ酸配列を示 す。
[配列番号： 6]
マウス由来転写調節因子遺伝子の塩基配列を示す。
[配列番号： 7 ]
マウス由来転写調節因子のアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 8 ]
実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 9 ]
実施例 2で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
[配列番号： 10]
実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 1 1]
実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 12]
実施例 3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 13]
実施例 3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。 [配列番号： 14] "
ヒト ChM— Iプロモーターの塩基配列を示す。
[配列番号： 15]
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 16]
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 17]
ヒト ChM— I遺伝子プロモーターの cis- elementを示す。
[配列番号： 18]
配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする D N Aの塩基配列を示す。
[配列番号： 19]
マウス由来転写調節因子の C末端側の 90ァミノ酸残基のァミノ酸配列を 示す。
己列番号： 20]
配列番号： 19で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DN Aの塩基配列を示す。
[配列番号： 21]
ヒト ChM— I遺伝子プロモーターの cis- elementを示す。
[配列番号： 22]
実施例 4で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 23]
実施例 4で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 24]
実施例 5で用いられた 一の塩基配列を示す。
[配列番号： 25]
実施例 5で用いられた 一の塩基配列を示す。
[配列番号： 26]
実施例 6で用いられた 一の塩基配列を示す。
[配列番号： 27] 実施例 6で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。 後述の実施例 2で得られたベクター pTB 2074を保持する E s c h e r i c h i a c o l i TOP 10/pTB 2074は 1999年 9月 2 2日から日本国茨城県つくば市東 1一 1一 3の通商産業省工業技術院生命ェ 学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM BP— 6886として、 1999年 7月 21日から日本国大阪府大阪市淀川区十三本町 2 _ 17— 8 5の財団法人 ·発酵研究所 （ I F〇） に寄託番号 I F O 16299としてそ れぞれ寄託されている。
後述の実施例 1で得られたプラスミド pTB 2075を保持する E s c h e r i c h i a c o l i JM109ZpTB2075は 1999年 9月 22日から日本国茨城県つくば巿東 1一 1一 3の通商産業省工業技術院生命 工学工業技術研究所（N I BH)に寄託番号 FERM BP- 6887として、 1999年 7月 21日から日本国大阪府大阪市淀川区十三本町 2— 17— 8 5の財団法人 ·発酵研究所 （I F〇） に寄託番号 I F〇 16300としてそ れぞれ寄託されている。 以下に、 実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、 本発明はそれらに限 定'されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー · クローニング （Molecular cloning) に記載されている方法に従った。 実施例 1
ヒト ChM— I遺伝子プロモーターに結合するヒト軟骨由来転写調節因子 遺伝子のクロ一ニング
特開平 7— 138295号公報に記載のヒト C h M— Iゲノム遺伝子配列 に基づいて設計したプライマー（配列番号： 15および配列番号： 16)と Human GenomeWalker kit (Clontech) を用いてキット記載の方法に従ってヒト C hM 一 Iプロモ一夕一を取得した。その塩基配列を一部決定した（配列番号： 14) 結果、 図 1に示すように特開平 7— 138295号公報記載の配列と 1塩基が 異なっていた。 この異なる塩基を含む塩基配列 GCTGGAAGGGGTGGGGACCG (配列番 号： 1 7) を有する DNAを cis- elementとして選択した。 以下、 特に記載し ない限り、 Matchmaker one-hybrid system (Clontech社） に添付されているュ 一ザ一マニュアルおよびハンドブックに従つて実験を行なつた。
GCTGGAAGGGGTGGGGACCG (配列番号： 1 7) で表される塩基配列を 3回繰り返 した塩基配列を含む塩基配列（配列番号： 1 )を有する DN Aおよび配列番号： 1で表される配列に相補的な配列 （配列番号： 2) を有する DNAを合成し、 ァニールした。 得られた 2本鎖 DNAを、 Matchmaker one-hybrid system (Clontech社） に添付されているプラスミド pHISi の EcoRI— Xbal サイトに 挿入し、 yeast one- hybrid法のレポ一夕一プラスミド pHISi-56を作成した。 pHISi-56 を Matchmaker one hybrid system (Clontech社） に添付されている 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) YM4271株に導入し His3+の形質転換体
(YM4271: :pHISi-56) を得た。 しかし、 YM4271： :pHISi-56 は 60 mMの
3-amino triazole 存在下でも増殖が完全には抑制されなかつた。
そこで、 レポータープラスミドの改良を行い、 PTB2075 (図 2) を構築した。 PTB2075は （1) pBR322の EcoRI-BamHIサイ卜に pHISi-56の EcoRI- BamHI断 片 （ 3回繰り返した GCTGGAAGGGGTGGGGACCG配列と HIS3遺伝子を含む 1. 4 k b断片） と、 （2) PBR322 の平滑化した Sphl-PvuII サイトに平滑化した PBD-GAL4 Cam (Stratagene社） 由来の Sphl-PvuII 断片 （TRP1 遺伝子を含む 1. O kb断片） をそれぞれ挿入したものである。
プラスミド PTB2075 を Xho I で切断後、 酵母 YM4271株に導入することによ つて Ίϊρ1+の形質転換体（YM4271: :pTB2075)を得た。 YM4271: :pTB2075に human chondrocyte matchmaker cDNA 1 ibrary (Clontech社)を導入し、 His+および Leu+ の表現形を示す酵母を選択した。 この酵母からプラスミド DNAを回収後、 回 収したプラスミド DNAを再度 YM4271::pTB2075 に導入することにより、 4 つのクローンで His+および Leu+ の表現形が確認できた。 各クローンのプラ スミド DNAの塩基配列を決定した。 その結果、 これらは挿入断片長は異なる が、 1つの遺伝子に由来することが明らかになった。 このうち、 最長の DNA の塩基配列は配列番号： 3で表されるものであり、 この DNAでコードされる タンパク質のアミノ酸配列は配列番号： 4で表わされるものであった（図 3)。 配列番号： 3で表される DNAは N末端領域をコードする遺伝子部分が欠けた 部分遺伝子であった。
得られた 4クローンのプラスミド DNAのうち、 最も短い DNA (配列番 号： 1 8) が挿入されたプラスミド （PHT56-H6) で、 YM4271： :pTB2075 を形質 転換し、 Leu+の表現形を示す形質転換株 10株を任意に選択した。 これらの株 は全て His3+ の表現形を示した。
以上のことから、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質 は、 用いた cis-elementである GCTGGAAGGGGTGGGGACCG (配列番号： 1 7) で表 される塩基配列を有する D N Aに結合することが明らかになり、 その結合に必 要な領域は C末端側 90アミノ酸 （配列番号： 5) で良いことが明らかになつ た。
以上より、 PHT56-H6 を導入した酵母 YM4271: :pTB2075株を用い、 ヒスチジン 添加培地での増殖阻害 （抗真菌作用） を示さず、 ヒスチジン非存在培地で増殖 阻害を示す化合物を選択することにより、 転写調節因子の活性阻害剤などの探 索を行うことができる。 実施例 2
マウス由来全長 c D N Aの取得と動物細胞発現べクタ一の構築
配列番号： 4を基に 2種のプライマー （配列番号： 8および配列番号： 9) を設計し、 これらのプライマ一を用いて Fetal Mouse Library Master DNAPlate (OriGene Technologies, Inc. Lot #004) に対し、 プロトコールに従って P CRを行った。 その結果、 4Fゥェル中に、 実施例 1で得られた転写調節因子 遺伝子のマウスホモログが含まれていることがわかった。 プロトコールに従つ て、 サブプレート （Fetal mouse library plate 4F Lot#001) を入手し、 サブ プレートの 7 Aゥエルにマウス由来の転写調節因子遺伝子が存在することを 確認した。 この 7 Aゥエルに含まれる の配列を 5' — RACE法および 3 ' 一 RACE法によりそれぞれ決定した結果、 7 Aゥエルはマウス由来転写 調節因子遺伝子の全長が含まれていることがわかった。
得られた配列情報に基づき、 2種のプライマ一 （配列番号： 10および配列 番号： 1 1) を設計し、 サブプレートの 7 Aゥエルに対し、 PCRを行い、 得 られた増幅断片を pCRII (Invitrogen) にクローニングした。 塩基配列を決定 したところ、 配列番号： 6で表される塩基配列を有する DNAは、 508アミ ノ酸残基からなるタンパク質（配列番号： 7)をコードすることがわかった（図 4) 。 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を有するヒト由来転写調節因子の 部分タンパク質と、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を有するマウス由来 転写調節因子のアミノ酸配列を比較したところ、 88%の相同性を有していた c 次に、 508アミノ酸残基からなるタンパク質をコードする塩基配列を有す るプラスミドを制限酵素 Hindlll および Notl で消化し、 得られた約 230 0 bpの断片を、 同様に制限酵素消化した pcDNA3.1(+) (Invitrogen) にライ ゲーシヨンした。 PCDNA3.1(+) の CMVプロモーターの下流に本遺伝子の蛋白 コード領域が連結された動物細胞発現用べクタ一 PTB2074 を取得した。 実施例 3
PCR法にょる本遺伝子のmRNAの検出
マウス ATDC 5細胞をインシユリン存在下に培養することによってコン ドロモデュリン- I (ChM— I) の発現が起こる （Int. J. Dev. Biol.
43:39, 1999) 。 この報告に従い、 ATD C 5細胞を培養し、' ChM— Iが発現 していると思われる時期に細胞を回収し、 RNeasy (Qiagen) を用いて t o t a 1 RNAを抽出した。 次に Message clean kit (GenHunter) を用いて DNasel 処理した後、 RNA PCR kit (宝酒造）のプロトコールに従い、 この RNAを逆転 写することによって c DNAを得た。 この c DNAを铸型として PCRを行つ た。マウス C hM— Iの c DNA配列（Int. J. Dev. Biol.43:39, 1999、 Genbank accession number U43509) を基に設計した 2種のプライマー （配列番号： 1 2および配列番号： 13) を用いた場合、 ChM_ I遺伝子由来のバンド （2 01 bp) がァガロースゲル電気泳動にて検出され、 同様に配列番号： 8で表 される塩基配列を有するプライマーおよび配列番号： 9で表される塩基配列を 有するプライマー.を用いると、 配列番号： 6で表される塩基配列を有する遺伝 子の発現（567bp)が検出され、 両者は同時期に発現していることを確認した。 さらに、 Mouse Multiple Tissue cDNA Panel I (CLONTECH) を使用し、 配列 番号： 6で表される塩基配列を有する遺伝子の発現臓器を解析した。 添付プロ トコールに従い、 配列番号： 8で表される塩基配列を有するブラ'イマ一および 配列番号： 9で表される塩基配列を有するプライマーを用いて PCR (2、 8サ ィクル） を行ったところ、 肝臓、 心臓で強い mRNAの発現が、 骨格筋、 胎仔 1 1日、 1 5日、 1 7日でそれに次ぐ mRNAの強い発現が認められた。
このように、 転写調節因子遺伝子の DN A配列から設計したプライマーを用 いることにより、 転写調節因子遺伝子の発現 （mRNA) を検出することがで き、 転写調節因子遺伝子の発現促進薬や発現阻害薬などの探索に用いることが できる。 実施例 4
pTB 2074導入によるマウス繊維芽細胞株 C 3 HZ 10 T 1 Z 2の軟 骨分化に及ぼす影響
マウス繊維芽細胞株 C3H/10T1/2, Clone 8 (ATCC Accession No. CCL-226) を、 10% FBSを含む DMEM (GIBC0) にて培養した。 ゥエルあたり約 1 5万個の 細胞を 24ゥエルプレートに播き、 翌日、 実施例 2で得られた PTB2074 また は pcDNA3.1(+) (Invitrogen) と Fugene6 (ベ一リンガー） とを混和したもの を添加することにより、 トランスフエクシヨンした。 トランスフエクシヨン後 2日目に RNeasy mini kit (Qiagen) を用いて RNAを抽出し、 message clean kit (genhunter) で DNase処理し、 RNAサンプルとした。
この RNAサンプルを铸型として、 マウス Typell B collagen遺伝子 (Col2al)の配列を基に作製したプライマ一（配列番号： 22および配列番号： 23) および RT—PCRキット （宝酒造） を用いて RT— P CRを行った。 ァガロースゲル電気泳動後、 Gel image (Genomic solutions) を用いて目的の バンドの比較を行った。
その結果、 PTB2074 を C3H/10T1/2, Clone 8 細胞株に導入した場合の軟骨 分化マ一力一である Col2alの発現は、 pcDNA3.1 (+) を C3H/10T1/2, Clone 8細 胞株に導入した場合に比べ、 約 2. 5倍向上していた。 実施例 5
PTB 2074導入によるヒト脱分化軟骨細胞の軟骨分化に及ぼす影響 ヒト正常軟骨細胞 （東洋紡より購入） を、 ヒト正常軟骨細胞培養キットに含 まれる Chondrocytes growth mediumを用いて、 細胞培養ディッシュ （Falcon) で培養した。 この細胞はディッシュで培養しているため脱分化しており、 軟骨 細胞マーカーである Typell collagen遺伝子は発現しなくなつていた （脱分化 軟骨細胞） 。 この細胞をゥエルあたり約 1 5万個の細胞を 24ゥエルプレート に播き、 翌日、 実施例 2で得られたベクター PTB2074または pcDNA3.1(+)
(Invitrogen) と Fugene6 (ベーリンガー） とを混和したものを添加することに より、 トランスフエクシヨンした。 実施例 4に記載の方法に準じて RN Aサン プルを取得後、 ヒト Type II collagen遺伝子 （C0L2A1) を基に設計したプライ マー（配列番号： 24および配列番号： 25)を用いて RT— PC Rを行った。 その結果、 PCDNA3.1(+) をヒト正常軟骨細胞に導入した場合、 C0L2A1の発現 は全く認められなかったのに対し、 PTB2074をヒト正常軟骨細胞に導入した場 合、 C0L2A1の発現が認められた。 実施例 6
pTB 2074導入によるゥサギ軟骨細胞の軟骨基質産生に及ぼす影響 ゥサギ （日本白色ゥサギ、 ォス、 30日齢） から採取した関節軟骨を細かく 刻み、0.1% EDTAで 20分 2回、 1.25% トリプシンで 60分 1回洗浄後、 0.2% コラーゲナーゼで軟骨基質を分解し、 関節軟骨細胞を回収した。 この細胞をゥ エルあたり約 10万個 24ゥエルコラーゲンコートプレート（Falcon)に播き、 10% FBSを含む α-MEM (GIBC0)で 5日間培養した。その後培地交換を行い、 翌日、実施例 2で得られたベクター ΡΤΒ2074または pcDNA3.1(+) (Invitrogen) と Fugene6 (ベ一リンガー） とを混和したものを添加することにより、 トラン スフエクシヨンした。 実施例 4記載の方法に準じて RNAサンプルを取得後、 ゥサ干 Typell collagen逾伝子 (Biochimica et Biophysica Acta vol. 1350, PP253-258 (1997) ； Col2al) を基に設計したプライマー （配列番号： 26およ び配列番号： 27) を用いて RT— PC Rを行った。
その結果、 PTB2074を上記ゥサギ軟骨細胞に導入した場合、 Col2alの発現は、 PCDNA3.1 (+) を上記ゥサギ軟骨細胞に導入した場合の約 2倍に向上していた。 また、 上述の培地交換時に 10ng/mlの IL-1 /3 (ジェンザィムテック） を添加 し、 上述と同様の方法でトランスフエクシヨンおよび RN Aサンプルの取得を を行い、 ゥサギ Type 11 colleen遺伝子 （Col2al) の発現を RT— PCRで比 較した。
その結果、 pcDNA3.1(+)を上記ゥサギ軟骨細胞に導入した場合、 Col2alの発 現は全く認められなかったのに対し、 PTB2074を上記ゥサギ軟骨細胞に導入し た場合、 Col2al の発現が認められた。 産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドは ChM— I遺伝子プロモ一夕一の cis-elementに特 異的に結合し ChM— I遺伝子の転写を促進する活性を有する。 したがって、 本発明のポリペプチドまたは本発明の DN Aは、 例えば、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折、 癌などの疾病の予防 ·治療剤として有用であ る。
また、本発明のポリペプチド、本発明の DN Aまたは本発明の形質転換体は、 本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のス クリーニングに用いることができる。
本発明のポリペプチドの活性または本発明の DN Aの発現を促進する化合 物またはその塩は、 例えば、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨 折、 癌などの疾病の予防 ·治療剤として有用である。 本発明のポリペプチドの 活性または本発明の DN Aの発現を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 異所性軟骨形成などの疾病の予防，治療剤とし て有用である。
本発明の抗体は、 本発明のポリペプチドの定量に用いることができ、 本発明 関与する疾患の診断剤として用いることができる。

Claims

請求の範囲
I. 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩。
2. 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、 配列番号： 19で表されるアミノ酸配列である請求項 1記載のポリペプチドま たはその塩。
3. 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する請求項 1記載のポリペプチドまたはその塩。
4. 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列である請求項 1記載のポリペプチドまた はその塩。
5. 請求項 1記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含有する DN Aを含 有する DNA。
6. 請求項 5記載の DNAを含有する組換えベクター。
7. 請求項 6記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
8. 請求項 7記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のポリペプチドを生成 せしめることを特徴とする請求項 1記載のポリぺプチドまたはその塩の製造 法。
9. 請求項 1記載のポリペプチドまたはその塩に対する抗体。
10. 請求項 9記載の抗体を含有してなる診断薬。
I I. 請求項 1記載のポリペプチドもしくはその塩、 請求項 5記載の DNAま たは請求項 7記載の形質転換体を用いることを特徴とする、 請求項 1記載のポ リペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩の スクリーニング方法。
12. 請求項 1記載のポリペプチドもしくはその塩、 請求項 5記載の DNAま たは請求項 7記載の形質転換体を含有してなる、 請求項 1記載のポリぺプチド またはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー二 ング用キット。
13. 請求項 1 1記載のスクリーニング方法または請求項 12記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる、 請求項 1記載のポリぺプチドまたはその 塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩。
1 4. 請求項 1 1記載のスクリーニング方 ¾または譫求項 1 2記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られうる、 請求項 1記載のポリペプチドまたはその 塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
1 5 . 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折、 癌、 椎間板ヘル二 ァ、 坐骨神経痛または異所性軟骨形成の治療 ·予防剤である請求項 1 4記載の 医薬。
1 6 . 請求項 1記載のポリペプチドまたはその塩を産生する能力を有する細胞 を試験化合物の存在下に培養し、 請求項 1記載のポリペプチドをコードする D'
N Aもしくはその相補 D N Aまたはその部分 D N Aを用いて請求項 1記載の ポリペプチドをコードする mR N Aの量を測定することを特徴とする、 請求項 1記載のポリペプチドをコードする D N Aの発現を促進または阻害する化合 物またはその塩のスクリーニング方法。
1 7 . 請求項 1 6記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、 請求項 1記 載のポリペプチドをコードする D N Aの発現を促進または阻害する化合物ま たはその塩。
1 8 . 請求項 1 6記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、 請求項 1記 載のポリペプチドをコードする D N Aの発現を促進または阻害する化合物ま たはその塩を含有してなる医薬。
1 9 . 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 骨折、 癌、 椎間板ヘル二 ァ、 坐骨神経痛または異所性軟骨形成の治療 ·予防剤である請求項 1 8記載の
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